Recherche fondamentale

Trois interventions chirurgicales d'une heure à une heure trente chacune, sous anesthésie générale : 6 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leurs vaisseaux sanguins. Avant ces opérations, ils reçoivent une alimentation enrichie en cholestérol destinée à faire apparaître des plaques d'athérome dans leurs artères, et sont hébergés en cages individuelles. L'enjeu déclaré est de tester un prototype de sonde d'imagerie endovasculaire miniaturisée, dont le porteur affirme que la validation in vivo reste "indispensable" malgré les essais préalables sur explants et sur fantômes d'artères. Ces lapins pèseront environ 3 kg et auront 10 à 12 semaines, poids minimum retenu par le porteur pour y introduire les cathéters expérimentaux.

Objectifs

L’objectif principal est de tester et valider in vivo un nouveau système d'imagerie optique miniaturisé pour observer les vaisseaux sanguins dans des conditions proches de l’usage clinique. Il s'agit de démontrer la faisabilité d’imagerie intravasculaire in vivo avec une sonde chez le lapin porteur de plaques d’athérosclérose induites par un régime alimentaire spécifique. Cela permettra de caractériser la composition biologique de ces lésions à l’aide des différentes modalités de microscopie développées (dépôts lipidiques, architecture tissulaire, calcifications éventuelles, signes d'inflammation). Cette étude nous permettra de comparer la qualité de cette imagerie innovante avec celles utilisées en clinique, en particulier en évaluant la robustesse, la reproductibilité et la compatibilité opératoire du dispositif (maniabilité, sécurité mécanique, acquisition d’images exploitables), en vue d'une application future en clinique et plus particuilèrement en cardiologie. Le projet se réalisera sur 2 établissements distincts pour sa réalisation.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont multiples. À court terme, cette étude pilote fournira des preuves de concept essentielles concernant la fiabilité, la sécurité d’utilisation et la performance du prototype miniaturisé. Les données obtenues permettront d’évaluer sa capacité à détecter et à caractériser de manière précise les lésions athérosclérotiques, notamment les dépôts lipidiques, l’inflammation et les éventuelles calcifications. Ces informations sont cruciales pour mieux comprendre les mécanismes d’évolution des plaques et identifier plus précocement les lésions à risque. À plus long terme, les résultats du projet pourraient contribuer au développement d’outils diagnostiques plus sensibles et plus spécifiques que ceux disponibles aujourd’hui en clinique (les maladies cardiovasculaires sont la 2ème cause de mortalité en France). Une imagerie intravasculaire plus fine et plus informative pourrait améliorer le dépistage, affiner les indications thérapeutiques et favoriser une médecine cardiovasculaire plus personnalisée, dans un contexte où l’athérosclérose est un processus qui demeure silencieux avant de déclencher des complications.

Procédures

Les animaux recevront une alimentation particulière, riche en cholestérol, destinée à provoquer progressivement la formation de plaques d’athérome dans leurs artères, susceptible de créer des nuisances aux animaux. Le régime enrichi en cholestérol peut entraîner des nuisances modérées et progressives, incluant une prise de poids, une diminution de l’activité, des troubles digestifs légers et une altération métabolique modérée. La formation de plaques d’athérome est attendue mais ne génère pas de douleur spontanée. Ces effets feront l’objet d’une surveillance clinique régulière avec des critères d’arrêt prédéfinis. Ils subiront également 3 interventions chirurgicales, réalisées sous anesthésie générale et analgésie d’environ 1 h à 1 h 30.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir du stress ou de l’inconfort pendant les phases préparatoires et les manipulations expérimentales. Les interventions sont associées à des nuisances modérées, pouvant engendrer douleur, lésion ou inconfort local au niveau des sites opératoires, ainsi qu’une détresse temporaire liée à l’anesthésie et aux procédures de contention. Les animaux peuvent également ressentir de la peur et du stress en lien avec les manipulations ou la nouveauté de l’environnement. Le régime alimentaire imposé pour induire la formation de plaques d’athérome est susceptible de provoquer des nuisances physiologiques telles que modification du métabolisme, prise de poids, troubles digestifs ou risque accru de maladies systémiques. Enfin, le fait d’être hébergés individuellement peut occasionner des nuisances environnementales, telles qu’un isolement social relatif ou une adaptation limitée à l’environnement de la cage, et des contraintes mineures sur la liberté de mouvement.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour la nécessité des études histologiques sur les vaisseaux sanguins.

Remplacement

L’utilisation d’animaux dans ce projet est justifiée par l’objectif scientifique : évaluer in vivo un prototype de sonde endovasculaire miniaturisée, comparable aux sondes utilisées en routine clinique, pour caractériser les lésions athérosclérotiques. Ce type d’évaluation nécessite un modèle physiopathologique dynamique, intégrant le flux sanguin, la réponse de la paroi artérielle, l’inflammation locale et la cicatrisation vasculaire après lésion ou intervention. Ces phénomènes ne peuvent être reproduits de manière fiable in vitro, sur explants ou sur modèles artificiels de vaisseaux. Avant toute expérimentation animale, des travaux préliminaires ont été réalisés pour limiter le recours aux animaux : essais sur explants ex vivo, tests sur fantômes d’artères et analyses sur lames histologiques. Ces étapes ont permis d’optimiser les paramètres optiques et techniques du dispositif, et de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Malgré ces précautions et méthodes alternatives, l’étude in vivo reste indispensable pour valider le fonctionnement du dispositif endovasculaire dans des conditions physiologiques réelles et garantir la pertinence des résultats pour des applications cliniques futures.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est strictement limité à cinq lapins expérimentaux et un témoin. Cet effectif a été déterminé en tenant compte de plusieurs critères : le minimum statistique nécessaire pour obtenir des résultats fiables, la variabilité interindividuelle connue du modèle lapin, la nécessité de recueillir des données longitudinales cohérentes tout au long de l’expérimentation. D’après le design expérimental dans le cadre d’une étude pilote, les mêmes individus serviront tout au long de l’étude : ils permettront d’abord de confirmer le développement des plaques d’athérome sous régime riche, puis seront utilisés pour la phase d’imagerie avec le dispositif expérimental. Ce schéma expérimental permet de maximiser la quantité et la qualité des informations obtenues tout en limitant au strict minimum le recours aux animaux, conformément au principe de réduction des expérimentations animales.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages individuelles, mais non étanches et possédant des parois translucides, permettant aux animaux de maintenir des stimuli visuels, olfactifs et auditifs avec leurs congénères. Avant toute procédure, chaque animal bénéficiera d’une période d’acclimatation d’au moins cinq jours, afin de réduire le stress lié au nouvel environnement. Les cages seront aménagées avec un enrichissement adapté, comprenant notamment des bûchettes à ronger et du foin, pour stimuler les comportements naturels et améliorer le confort. Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien, portant sur leur état de santé et leur bien-être tout au long du protocole expérimental, avec un suivi particulier de leur comportement du fait de l’hébergement individuel. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie, et les animaux seront surveillés en continu pendant l’intervention. Un suivi renforcé sera mis en place pendant les premiers jours après chaque procédure pour détecter et traiter rapidement tout signe de douleur ou de malaise. Si nécessaire, des analgésiques seront administrés pour soulager la douleur, et des antibiotiques pourront être utilisés en cas d’infection. Dans le cas où un animal présenterait une souffrance, une maladie ou une altération physique incompatible avec un bien-être acceptable, et qu’aucune mesure de soulagement efficace ne peut être appliquée, l’animal sera retiré de l’expérimentation et mis à mort. Pour les transferts vers l'établissement 2/2, les animaux seront transportés dans un véhicule climatisé dans des cages adaptées à l'espèce, en prenant soin de vérifier les conditions de circulation et météorologiques et sous surveillance du vétérinaire.

Choix des espèces

Le lapin a été choisi comme modèle animal en raison de sa pertinence scientifique et technique pour les études de navigation intravasculaire. La taille de ses vaisseaux est suffisamment proche de celle de certains vaisseaux humains ciblés par le projet, permettant d’évaluer le positionnement et le fonctionnement du cathéter endovasculaire dans des conditions comparables à la pratique clinique. De plus, le lapin est un modèle bien établi pour l’athérosclérose induite par l’alimentation, reproduisant de manière fiable la formation de plaques d’athérome et leur progression, telle que décrite dans de nombreuses publications scientifiques. Le choix du lapin répond également à des critères éthiques et réglementaires, car il permet d’obtenir des données pertinentes avec un nombre réduit d’animaux, tout en limitant le risque de douleurs ou de dommages durables grâce à sa taille adaptée. Les animaux utilisés seront des jeunes lapins pesant environ 3 kg, généralement âgés de 10 à 12 semaines. Ce poids correspond au minimum recommandé pour réaliser les procédures de navigation intravasculaire et l’introduction des cathéters expérimentaux. Le choix de ce stade de développement permet de garantir des vaisseaux de taille adaptée.

Identifiées par tatouage d'une phalange une semaine après leur arrivée, 456 souris reçoivent une injection de cellules tumorales ou une greffe de fragments de tumeur, puis vivent seules dans une cage équipée d'une roue pendant quatorze ou vingt et un jours. Elles passent cinq tests de préhension sur grille, quatre analyses de leur démarche sur un tapis filmé et trois échocardiographies sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce un affaiblissement musculaire, une baisse possible de la fonction cardiaque, une douleur modérée liée au développement de la tumeur et un stress social lié à l'hébergement seul, et qualifie le test de préhension et l'analyse de la démarche de gestes qui ne provoquent "aucune douleur". Toutes seront tuées pour prélever tumeurs, cœur et muscles, quand les retombées annoncées, des cibles contre la fonte musculaire et des molécules qui imiteraient l'exercice physique, sont situées à plus long terme.

Objectifs

Le muscle squelettique et cardiaque sont des tissus qui peuvent adapter leur taille et leur fonction à l'environnement et à la demande fonctionnelle. Ainsi, la surcharge de travail, l’activité neuronale, les hormones et la disponibilité en nutriments sont des facteurs qui influencent le fonctionnement des muscles. Comprendre les mécanismes moléculaires qui régulent la masse musculaire et le remodelage cardiaque est crucial pour traiter des conditions de fonte musculaire et d'insuffisance cardiaque associées au cancer et à d’autres maladies chroniques. D’un point de vue clinique, plusieurs conditions pathologiques sont caractérisées par une diminution de l’activité musculaire due à la fonte musculaire et à la fatigue. Une altération de la fonction cardiaque aboutit aussi à la détérioration de la fonction musculaire et affecte la qualité de vie des patients. En effet, il a été montré que l’activité physique décline chez les patients atteints de cancer. L’activité physique améliore le pronostic de ces patients. Ces atteintes musculaires et cardiaques associées à des maladies chroniques sont responsables de la mort de 20 pour cent de patients atteints de cancer. Ainsi, l'objectif de ce projet est de comprendre l'impact du cancer sur le muscle et le coeur au niveau fonctionnel, moléculaire et morphologique. L'effet bénéfique de l'exercice physique sera aussi évalué dans le cadre du projet.

Bénéfices attendus

Les maladies cardiovasculaires et le cancer sont les 2 principales causes de mortalité par maladie non-transmissible à travers le monde et représente un enjeux majeurs de santé. La cachexie liée au cancer est un syndrome multifactoriel caractérisé par une fonte de la masse musculaire et le remodelage cardiaque. Elle aggrave le pronostic vitale des patients atteints de cancer et est la cause directe du décès de 2 millions de patients par ans. Ainsi, la mise en évidence des mécanismes moléculaires impliqué dans la cachexie musculaire et cardiaque permettront d'identifier des cibles thérapeutiques pour contrer la cachexie et améliorer le pronostic vital de patients atteints de cancer. L'identification de facteurs secrétés par l'exercice permettront aussi de développer à plus long terme des molécules mimétiques de l'exercice physique et améliorer ainsi l'état des patients cachexique. Ces découverte pourront aussi avoir un impact pour des patients âgés souffrant de sarcopénie (fonte de la masse musculaire) et/ou atteints d'insuffisance cardiaque.

Procédures

Les interventions sur les animaux seront 1-Injection de cellules sur une partie des animaux (réalisés en quelque seconde sur animaux vigiles), les animaux seront par la suite euthanasiés par une méthode réglementaire pour prélèvement de tumeurs et organes 1fois. 2- Implantation des fragments de tumeurs sur une partie des animaux (réalisés en quelques secondes sur animal anesthésié ayant reçu de l'analgésique) 1fois 3-Exercice physique volontaire en continu (animaux vigiles dans cage équipée de roue) pendant 14 et 21 jours 4- Test de préhension (Fréquence 5; Durée 2 minutes) qui consiste à mesurer la capacité de la souris à s'agripper sur une grille et de ce fait nécessite que l'animal soit éveillé. Cet examen n'est pas invasif et ne provoque donc aucune douleur chez l’animal. 4- Echocardiographie permettant d'analyser la fonction cardiaque, réalisée sous anesthésie (fréquence 3, durée 20 minutes). 5- Analyse de la démarche pour analyser la marche des souris sur un tapis équipé de caméra et senseurs pour détecter les pas et de ce fait nécessite que l'animal soit éveillé. Cet examen n'est pas invasif et ne provoque donc aucune douleur chez l’animal (Fréquence 4; Durée 2-3 minutes). 6- Prélèvement sanguin réalisé en fin de procédure sous anesthésie profonde suivi d'euthanasie par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables consistent en l'affaiblissement musculaire et une réduction modérée possible de la fonction cardiaque. L'implantation tumorale et son développement pourraient engendrer une douleur modérée avec une altération de l’état général des animaux. L'hébergement individuel pour analyser les bénéfices de l'exercice volontaire peut générer un stress social. L'anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Les injections pourront induire une douleur de courte durée aux animaux.

Devenir

A l'issue des expériences, l'ensemble des souris sera euthanasié par une méthode réglementaire et ceci afin de récolter les croissances tumorales ainsi que les différents tissus (coeur, muscles) pour procéder à l'examen histologique et moléculaire de ces tissus et recueillir ainsi les donnés indispensables pour évaluer l'efficacité de l'exercice physique sur le muscle et le coeur dans le contexte de la cachexie.

Remplacement

Pour le présent projet, le choix de l’expérimentation animale se justifie par le fait qu’il n’est pas possible de reproduire en culture la fonction musculaire et cardiaque, telle qu’elle se retrouve dans l’animal entier (organisation structurale, régulations neuro-hormonale, thermorégulation, influence de la dépense énergétique globale de l’organisme, interaction cellule-matrice extracellulaire). Il n'est pas, non plus, possible actuellement de déterminer l'impact bénéfique de l'exercice physique dans des systèmes de culture cellulaire, en intégrant les signaux (facteurs, vésicules) provenant de différents tissus (muscle, foie, coeur). En parallèle à cette partie in vivo, nous mettrons en place un système de co-culture en 3D entre cellule tumorale et cellules cardiaques ou musculaires pour analyser l'impact direct des cellules tumorales sur les cellules musculaires et cardiaques. A long terme, ce système de co-culture pourrait devenir un outil fiable pour explorer le phénomène de cachexie par une approche in vitro et contribuer ainsi à remplacer ou réduire le nombre d'animaux pour étudier le phénomène de cachexie.

Réduction

Toutes les interventions sur les souris seront réalisées dans des conditions de reproductibilité maximale afin de minimiser la variabilité et donc le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total de souris utilisé sera de 456. La taille des effectifs de souris par groupe a été établie grâce à un calcul de puissance. Suite à l'analyse des données, des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. L’utilisation du même matériel biologique pour 3 types d’analyse permet de diviser par trois le nombre de souris nécessaire.

Raffinement

Les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. L’hébergement individuel est limité au maximum, en effet une partie des souris sera en hébergement individuel et ceci afin de récolter les données liées à l'exercice physique pour chaque souris et pouvoir déterminer de manière claire l'effet bénéfique de l'exercice. Dans ce cadre, les souris concernées par l'exercice seront hébergées en cage individuelle équipée d'une roue. Cette dernière représente un enrichissement environnemental et peut compenser le fait que chaque souris sera seule dans la cage pour la durée de l'expérience. Pour l'ensemble des souris, le milieu est enrichi avec deux enrichissements au minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. En cas de besoin (affaiblissement musculaire constaté) de la nourriture hydratée sera déposée au fond de la cage pour permettre aux souris de se nourrir plus facilement. Lors des anesthésies, les souris seront maintenues sur une plaque chauffante afin de maintenir leur température corporelle. Une administration d'analgésique sera envisagée si nécessaire. Ainsi, la douleur et le stress sont limités en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

Pour atteindre notre objectif, nous sommes amenés à utiliser des souris car aucun système in vitro ne permet de reproduire la complexité de la réponse intégrée de l'organisme à la cachexie. En effet, il n’est pas possible à l'heure actuelle de reproduire en culture la fonction musculaire et cardiaque, telle qu’elle se retrouve dans l’animal entier (organisation structurale, régulations neuro-hormonale, thermorégulation, influence de la dépense énergétique globale de l’organisme, interaction cellule-matrice extracellulaire). Il n'est pas, non plus, possible actuellement de détérminer l'impact bénéfique de l'exercice physique dans des systèmes de culture cellulaire, en intégrant les signaux (facteurs, vésicules) provenant de différents tissus (muscle, foie, coeur). L'utilisation de la souris est liée au fait qu'elle permet la croisssance tumorale et la cachexie qui s'en suit. Cette espèce est pértinente aussi en raison de sa propension naturelle à faire de l'exercice de manière volontaire. Les animaux utilisés auront 8 à 10 semaines d'âge en début de protocole. En effet, à partir de 2 mois, les souris sont considérées comme ayant accompli leurs croissances cardiaques. Une semaine après leur arrivée, les animaux seront identifiés (numérotés) par tatouage à une phalange spécifique pour chaque souris selon le système de codage utilisé à l'animalerie

L'objet du projet est un instrument, un prototype de sonde d'imagerie optique miniaturisée à valider dans des conditions proches de l'usage clinique. 6 lapins, 5 exposés et 1 témoin, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour l'examen histologique de leurs vaisseaux. Ils reçoivent une alimentation enrichie en cholestérol destinée à faire apparaître des plaques d'athérome, puis subissent trois opérations sous anesthésie d'une heure à une heure et demie chacune, hébergés seuls en cage et transportés d'un établissement à l'autre. Le porteur retient le lapin parce que la taille de ses vaisseaux approche celle des vaisseaux humains visés, et parce qu'un poids d'environ trois kilos, atteint vers dix à douze semaines, correspond au minimum permettant d'introduire les cathéters.

Objectifs

L’objectif principal est de tester et valider in vivo un nouveau système d'imagerie optique miniaturisé pour observer les vaisseaux sanguins dans des conditions proches de l’usage clinique. Il s'agit de démontrer la faisabilité d’imagerie intravasculaire in vivo avec une sonde chez le lapin porteur de plaques d’athérosclérose induites par un régime alimentaire spécifique. Cela permettra de caractériser la composition biologique de ces lésions à l’aide des différentes modalités de microscopie développées (dépôts lipidiques, architecture tissulaire, calcifications éventuelles, signes d'inflammation). Cette étude nous permettra de comparer la qualité de cette imagerie innovante avec celles utilisées en clinique, en particulier en évaluant la robustesse, la reproductibilité et la compatibilité opératoire du dispositif (maniabilité, sécurité mécanique, acquisition d’images exploitables), en vue d'une application future en clinique et plus particuilèrement en cardiologie. Le projet se déroulera sur 2 établissements distincts pour sa réalisation.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont multiples. À court terme, cette étude pilote fournira des preuves de concept essentielles concernant la fiabilité, la sécurité d’utilisation et la performance du prototype miniaturisé. Les données obtenues permettront d’évaluer sa capacité à détecter et à caractériser de manière précise les lésions athérosclérotiques, notamment les dépôts lipidiques, l’inflammation et les éventuelles calcifications. Ces informations sont cruciales pour mieux comprendre les mécanismes d’évolution des plaques et identifier plus précocement les lésions à risque. À plus long terme, les résultats du projet pourraient contribuer au développement d’outils diagnostiques plus sensibles et plus spécifiques que ceux disponibles aujourd’hui en clinique (les maladies cardiovasculaires sont la 2ème cause de mortalité en France). Une imagerie intravasculaire plus fine et plus informative pourrait améliorer le dépistage, affiner les indications thérapeutiques et favoriser une médecine cardiovasculaire plus personnalisée, dans un contexte où l’athérosclérose est un processus qui demeure silencieux avant de déclencher des complications.

Procédures

Les animaux recevront une alimentation particulière, riche en cholestérol, destinée à provoquer progressivement la formation de plaques d’athérome dans leurs artères, susceptible de créer des nuisances aux animaux. Le régime enrichi en cholestérol peut entraîner des nuisances modérées et progressives, incluant une prise de poids, une diminution de l’activité, des troubles digestifs légers et une altération métabolique modérée. La formation de plaques d’athérome est attendue mais ne génère pas de douleur spontanée. Ces effets feront l’objet d’une surveillance clinique régulière avec des critères d’arrêt prédéfinis. Ils subiront également 3 interventions chirurgicales, réalisées sous anesthésie générale et analgésie d’environ 1 h à 1 h 30.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir du stress ou de l’inconfort pendant les phases préparatoires et les manipulations expérimentales. Les interventions sont associées à des nuisances modérées, pouvant engendrer douleur, lésion ou inconfort local au niveau des sites opératoires, ainsi qu’une détresse temporaire liée à l’anesthésie et aux procédures de contention. Les animaux peuvent également ressentir de la peur et du stress en lien avec les manipulations ou la nouveauté de l’environnement. Le régime alimentaire imposé pour induire la formation de plaques d’athérome est susceptible de provoquer des nuisances physiologiques telles que modification du métabolisme, prise de poids, troubles digestifs ou risque accru de maladies systémiques. Enfin, le fait d’être hébergés individuellement peut occasionner des nuisances environnementales, telles qu’un isolement social relatif ou une adaptation limitée à l’environnement de la cage, et des contraintes mineures sur la liberté de mouvement.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour la nécessité des études histologiques sur les vaisseaux sanguins.

Remplacement

L’utilisation d’animaux dans ce projet est justifiée par l’objectif scientifique : évaluer in vivo un prototype de sonde endovasculaire miniaturisée, comparable aux sondes utilisées en routine clinique, pour caractériser les lésions athérosclérotiques. Ce type d’évaluation nécessite un modèle physiopathologique dynamique, intégrant le flux sanguin, la réponse de la paroi artérielle, l’inflammation locale et la cicatrisation vasculaire après lésion ou intervention. Ces phénomènes ne peuvent être reproduits de manière fiable in vitro, sur explants ou sur modèles artificiels de vaisseaux. Avant toute expérimentation animale, des travaux préliminaires ont été réalisés pour limiter le recours aux animaux : essais sur explants ex vivo, tests sur fantômes d’artères et analyses sur lames histologiques. Ces étapes ont permis d’optimiser les paramètres optiques et techniques du dispositif, et de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Malgré ces précautions et méthodes alternatives, l’étude in vivo reste indispensable pour valider le fonctionnement du dispositif endovasculaire dans des conditions physiologiques réelles et garantir la pertinence des résultats pour des applications cliniques futures.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est strictement limité à cinq lapins expérimentaux et un témoin. Cet effectif a été déterminé en tenant compte de plusieurs critères : le minimum statistique nécessaire pour obtenir des résultats fiables, la variabilité interindividuelle connue du modèle lapin, la nécessité de recueillir des données longitudinales cohérentes tout au long de l’expérimentation. D’après le design expérimental dans le cadre d’une étude pilote, les mêmes individus serviront tout au long de l’étude : ils permettront d’abord de confirmer le développement des plaques d’athérome sous régime riche, puis seront utilisés pour la phase d’imagerie avec le dispositif expérimental. Ce schéma expérimental permet de maximiser la quantité et la qualité des informations obtenues tout en limitant au strict minimum le recours aux animaux, conformément au principe de réduction des expérimentations animales.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages individuelles, mais non étanches et possédant des parois translucides, permettant aux animaux de maintenir des stimuli visuels, olfactifs et auditifs avec leurs congénères. Avant toute procédure, chaque animal bénéficiera d’une période d’acclimatation d’au moins cinq jours, afin de réduire le stress lié au nouvel environnement. Les cages seront aménagées avec un enrichissement adapté, comprenant notamment des bûchettes à ronger et du foin, pour stimuler les comportements naturels et améliorer le confort. Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien, portant sur leur état de santé et leur bien-être tout au long du protocole expérimental, avec un suivi particulier de leur comportement du fait de l’hébergement individuel. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie, et les animaux seront surveillés en continu pendant l’intervention. Un suivi renforcé sera mis en place pendant les premiers jours après chaque procédure pour détecter et traiter rapidement tout signe de douleur ou de malaise. Si nécessaire, des analgésiques seront administrés pour soulager la douleur, et des antibiotiques pourront être utilisés en cas d’infection. Dans le cas où un animal présenterait une souffrance, une maladie ou une altération physique incompatible avec un bien-être acceptable, et qu’aucune mesure de soulagement efficace ne peut être appliquée, l’animal sera retiré de l’expérimentation et mis à mort. Pour les transferts vers l'établissement 2/2, les animaux seront transportés dans un véhicule climatisé dans des cages adaptées à l'espèce, en prenant soin de vérifier les conditions de circulation et météorologiques et sous surveillance du vétérinaire.

Choix des espèces

Le lapin a été choisi comme modèle animal en raison de sa pertinence scientifique et technique pour les études de navigation intravasculaire. La taille de ses vaisseaux est suffisamment proche de celle de certains vaisseaux humains ciblés par le projet, permettant d’évaluer le positionnement et le fonctionnement du cathéter endovasculaire dans des conditions comparables à la pratique clinique. De plus, le lapin est un modèle bien établi pour l’athérosclérose induite par l’alimentation, reproduisant de manière fiable la formation de plaques d’athérome et leur progression, telle que décrite dans de nombreuses publications scientifiques. Le choix du lapin répond également à des critères éthiques et réglementaires, car il permet d’obtenir des données pertinentes avec un nombre réduit d’animaux, tout en limitant le risque de douleurs ou de dommages durables grâce à sa taille adaptée. Les animaux utilisés seront des jeunes lapins pesant environ 3 kg, généralement âgés de 10 à 12 semaines. Ce poids correspond au minimum recommandé pour réaliser les procédures de navigation intravasculaire et l’introduction des cathéters expérimentaux. Le choix de ce stade de développement permet de garantir des vaisseaux de taille adaptée.

Les souris dont le score d'évaluation reste élevé, ou qui ne se rétablissent pas malgré un score plus faible, sont mises à mort avant la fin du protocole. 120 souris hémophiles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une aiguille est introduite dans leur genou pour provoquer un saignement intra-articulaire reproduisant celui des patients, sous gaz anesthésiant et avec un analgésique administré une demi-heure avant puis les trois jours suivants, l'observation se prolongeant jusqu'à vingt-trois jours, avec deux prises de sang. Le porteur indique que l'atteinte articulaire peut rendre les déplacements difficiles, donc l'accès à la nourriture et à l'eau, et que les pattes arrière seront prélevées après la mise à mort pour observer les tissus par coupes fines.

Objectifs

L’hémophilie A et B sont des maladies avec lesquelles on naît. Elles empêchent le sang de s’arrêter facilement lorsqu’on se blesse. Normalement, le sang forme un caillot pour arrêter le saignement. Chez les personnes hémophiles, ce caillot se forme difficilement parce qu'il manque une substance dans le sang qui favorise sa formation. Les saignements durent alors plus longtemps et peuvent parfois arriver sans raison. En France, environ 7 000 personnes sont atteintes d’hémophilie, et la moitié d’entre elles ont une forme grave de la maladie. Les traitements actuels consistent surtout à remplacer la substance qui manque dans le sang. Un gros problème chez les personnes hémophiles, ce sont les saignements répétés dans les articulations, comme les genoux ou les coudes. À force, cela abîme les articulations et peut rendre les mouvements difficiles. Aujourd’hui, l’un des principaux objectifs est de prévenir les saignements dans les articulations afin de les préserver. Nous proposons une nouvelle approche : étudier une molécule qui, en temps normal, limite la coagulation du sang. En bloquant cette molécule, le sang pourrait alors former plus facilement un caillot. Chez des souris atteintes d’hémophilie, l’absence de cette molécule a permis de réduire les saignements. Nous voulons maintenant savoir si cela peut aussi protéger leurs articulations. Dans un précédent projet, nous avons suivi des souris pendant une courte période — jusqu’à 14 jours — après un saignement intra-articulaire. Nous avions constaté que les souris dépourvues de notre molécule d’intérêt semblaient mieux récupérer que celles qui la possédaient. Nous souhaitons désormais prolonger l’observation jusqu’à 23 jours afin de mieux comprendre les mécanismes de réparation de l’articulation. Nous répéterons également certaines analyses au 14e jour pour confirmer nos résultats initiaux.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d'établir si le ciblage de notre molécule d'interêt pour soigner l'hémophilie pourrait également permettre de diminuer les complications articulaires .

Procédures

L'intervention consiste en l'introduction d'une aiguille dans le genou pour provoquer des saignements reproduisant ceux observés chez l'homme. De plus, les souris auront des prélèvements sanguins en début (J2) et à la fin de l'expérimentation (J14 ou J23). Les souris seront endormies grace à un gaz et soulagées de la douleur grâce à un produit administré 30 min avant l'intervention. L'intervention ne prendra que quelques minutes (3 à 5 min). Le produit permettant de soulager la douleur sera aussi administré durant les 3 jours qui suivent l’intervention. De plus, cette administration sera poursuivie si l’état de l’animal le nécessite.

Impact sur les animaux

À cause des problèmes aux articulations, les animaux pourront avoir des difficultés pour se déplacer qui pourraient entrainer une difficulté pour s’alimenter et s’hydrater. Toute manipulation pourra générer un stress. Il est possible également que les animaux perdent du poids.

Devenir

À la fin de l’expérience, tous les animaux seront euthanasiés. Les pattes arrières seront ensuite prélevées et étudiées afin d’observer les tissus à l’intérieur grâce à des coupes fines et des colorations spéciales.

Remplacement

Pour comprendre le rôle de notre molécule d'interët dans les problèmes d’articulations liés à l’hémophilie, il est indispensable de faire l’étude sur un être vivant entier. Il n’est pas possible de remplacer cette étude par des expériences sur ordinateur ou sur des cellules seules, car l’articulation est un système très complexe. Grâce à notre expérience et aux études déjà publiées, nous utiliserons des souris spéciales qui sont hémophiles, avec ou sans notre molécule afin de comparer leurs articulations.

Réduction

Nous avons calculé le nombre de souris nécessaires à cette étude pour être sûrs que nos résultats soient fiables, grace à des tests statistiques.

Raffinement

Les cages des animaux seront enrichies, avec du papier doux pour qu’ils puissent faire leur nid. Pour chaque intervention,les animaux seront endormis avec un gaz et auront un médicament pour ne pas ressentir de douleur. Nous surveillerons régulièrement leur poids et leur comportement pour vérifier qu’ils vont bien (par exemple, s’ils ne restent pas isolés ou agressifs). Les animaux vivront en groupe dans un environnement enrichi pour réduire leur stress. En plus de l’observation quotidienne par le personnel, les animaux seront suivis de près après chaque intervention aux jours 2, 5, 10, 14 et 23 pour s’assurer qu’ils se rétablissent correctement. Nous observerons les animaux en nous basant sur des critères précis, comme une perte de poids ou une diminution de leur mobilité. À l’aide d’une grille d’évaluation, chaque critère sera noté afin de repérer facilement d’éventuels signes de douleur ou d’inconfort. Si de tels signes sont repérés, un médicament sera administré pour limiter la douleur. En cas d’atteinte d’un score élevé ou si pas d’amélioration de l’état général de la souris avec un score intermédiaire ou faible, l'animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Ce modèle de souris met en évidence des anomalies comparables à celles constatées chez les patients. Les expériences seront faites sur des souris adultes, âgées de 12 à 20 semaines correspondant à l'âge adulte chez l'humain.

Une solution de chlorure de fer ou d'aluminium est appliquée sur l'artère cérébrale moyenne, au terme d'une chirurgie de la tête de quinze à vingt minutes, pour provoquer l'occlusion de l'artère et un accident vasculaire cérébral. 924 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, hébergées seules, avec cinq passages en IRM à 7 teslas jusqu'à quarante-cinq minutes et une batterie de trois tests comportementaux, non nommés, répartis sur trois semaines. Le porteur qualifie les déficits fonctionnels de "léger" à court et moyen terme et écrit que l'animal "peut aisément continuer à s'alimenter, s'abreuver et se fabriquer un nid", tout en décrivant des pertes d'équilibre, une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion, et une mise à mort par dislocation cervicale en cas de dépassement des points limites. Toutes finissent ouvertes du ventre au thorax pour une ponction cardiaque, puis tuées pour le prélèvement du cerveau.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique causée par la formation d’un caillot (thrombus) entraînant l’occlusion partielle ou totale d’une artère cérébrale. Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA ainsi que de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Bénéfices attendus

Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi riches en fibrine, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA et de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Procédures

Les 924 animaux de cette demande d’autorisation de projet seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête pour appliquer une solution de chlorure de fer ou de chlorure d'aluminium au niveau de l’artère cérébrale moyenne (ACM) pour aboutir à l’occlusion de l’ACM. Cet acte chirurgical, se déroulant à J0, durera 15 à 20 minutes et l’animal restera endormi environ 1 heure. La pose d’un cathéter dans la veine caudale sera nécessaire pour tous les animaux afin d’administrer un ou plusieurs traitements en intraveineux ainsi que les agents de contraste nécessaires à la réalisation de séquences IRM s’intéressant à la neuroinflammation et l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. La pose de cathéter prendra environ 5 minutes. À J0, J1, J2, J5 et J14, les animaux seront soumis à l'IRM-7T sous anesthésie générale, pour une durée variant de 15 à 45 minutes en fonction des séquences réalisées. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Les animaux passeront également une batterie de test comportementaux indolores visant à tester les déficits et la récupération sensorimotrice au cours du temps, jusque 7 jours avant l’induction de l’AVC pour déterminer l’activité basale, puis à J1, J2, J3, J5, J7, J14 et J21. Chaque animal passera moins de 10 minutes pour chacun des trois tests. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au cœur et faciliter le prélèvement sanguin par ponction cardiaque. Viendra ensuite soit une perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant son prélèvement soit un prélèvement du cerveau frais. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC ischémique, à savoir des déficits sensorimoteurs induits par les lésions cérébrales au niveau du cortex somatosensoriel et prémoteur. Les déficits fonctionnels sont considérés comme léger à court et moyen terme dans ce modèle d’AVC, mais peuvent occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion chez l’animal. A long-terme les déficits fonctionnels ne sont plus que légèrement perceptibles. Tout au long de l’étude l’animal peut aisément continuer à s’alimenter, s’abreuver et se fabriquer un nid avec les enrichissements mis à disposition dans la cage.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations réalisées in vitro par les industriels financeurs. Actuellement il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font de la souris le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, mus musculus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ischémique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.

Réduction

Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées surtout à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 18 par groupes dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux dues à des erreurs techniques ou à de la mortalité, l’augmentation de l’effectif de 22 par groupes expérimentaux est obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 18 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les souris arriveront au laboratoire en groupes sociaux puis seront stabulés à une par cage le temps de l’expérimentation pour éviter les conflits entre les souris et faciliter la phase de récupération post-opératoire. Au sein de chaque cage, les animaux auront accès à divers types d’enrichissements : sizzle-dri kraft, BUCHETTE EN BOIS et demi-sphère de cellulose ainsi qu’accès illimité à la nourriture et à l’eau. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Les animaux seront pesés 2 fois par semaine au minimum. Le jour de l’induction de l’AVC (J0), les animaux seront pesés et installés dans une armoire ventilée permettant de maintenir leur rythme nycthéméral. Pendant l’opération chirurgicale induisant l’AVC ischémique, l’animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique à base de buprénorphine administrée en s.c ENTRE 30 MINUTES ET 1 HEURE AVANT LA PREMIERE INCISION CHIRUGICALE. L’ADMINISTRATION SERA REPETEE EN FIN DE JOURNEE DE FACON A PROLONGER LA DUREE D’ACTION JUSQU’AU LENDEMAIN MATIN OU UNE TROISIEME ADMINISTRATION SERA REALISEE. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. Chaque site d’incision sera précédé d’une tonte du pelage et d’une désinfection à la CHLORISEPTINE ET D’UNE INJECTION EN SOUS CUTANEE DE LUROCAINE (5mg/kg). La température corporelle de l’animal sera maintenue à 37.5 ± 0.5°C grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée et à une couverture isothermique placée sur le dos de la souris EN CAS d’HYPOTHERMIE. Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une plus grande résistance que le surjet par exemple, et limitant le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil et pendant les jours suivant l’opération chirurgicale. En cas de constatation post-opératoire de dépassement des points limites de souffrance ou de stress fixés en amont de l’étude, l’animal sera mis à mort par dislocation cervicale.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) occupe une place prépondérante dans la recherche sur les maladies neurodégénératives, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs comme les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et la souris, la facilité de manipulation génétique, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font de la souris un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Dans le contexte spécifique de l'AVC ischémique, l'utilisation de la souris devient incontournable car elle offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats avec ceux obtenus dans notre laboratoire et ailleurs, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. Les animaux utilisés seront âgés d’environ 10 semaines le jour de l’induction de l’AVC pour un poids moyen de 45g. Nous effectuerons notre modèle sur des jeunes adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles déjà disponible dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine.

De quatre à douze semaines de croissance tumorale, selon les lignées de cellules cancéreuses humaines greffées : 896 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est anesthésiée au gaz pour recevoir l'injection dans le flanc, puis pesée et mesurée au pied à coulisse trois fois par semaine, avec un contrôle quotidien du frottement de la tumeur quand elle se développe dans la région ventrale et peut saigner ou gêner les déplacements. Le projet cherche à savoir si la surexpression, puis l'invalidation, d'une liste réduite de gènes augmente ou diminue la capacité de ces cellules à déclencher une tumeur, ce que le porteur dit ne pas pouvoir reproduire en culture cellulaire. Les xénogreffes sont pratiquées sur des souris immunodéficientes de huit semaines, et le porteur écrit que toutes vont développer des tumeurs "qui ne permettent pas la survie de l'animal après la fin du projet".

Objectifs

Ce projet vise à caractériser les cellules souches cancéreuses (CSC) mammaires afin de mieux comprendre leur nature et leurs mécanismes d'action. Les CSC jouent un rôle majeur dans l'initiation et la progression des cancers du sein. Elles sont également impliquées dans la résistance aux traitements et, par conséquent, dans les rechutes observées chez les patientes. Comparées aux autres cellules tumorales, les CSC possèdent une capacité nettement supérieure à initier une tumeur, propriété qui constitue leur principale caractéristique fonctionnelle. L'évaluation de ce potentiel tumorigène nécessite une approche expérimentale in vivo reposant sur la greffe de cellules dans des souris receveuses. Lors de travaux antérieurs, nous avons identifié une liste de gènes dont l'expression est augmentée dans une population de CSC mammaires isolées chez la souris. Cette surexpression suggère que certains de ces gènes pourraient contribuer aux propriétés biologiques des CSC, notamment à leur capacité d'initiation tumorale. L'objectif du présent projet est d'évaluer, pour un nombre limité de gènes issus de cette liste, leur implication dans le potentiel tumorigène des cellules cancéreuses. Plus précisément, nous déterminerons si la surexpression de chacun de ces gènes dans une lignée de cellules cancéreuses mammaires humaines augmente leur capacité à initier une tumeur après greffe chez une souris receveuse. À l'inverse, nous évaluerons si l'invalidation de ces mêmes gènes réduit cette capacité. L'identification de gènes capables de moduler le potentiel tumorigène des cellules cancéreuses permettra de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles et de sélectionner les gènes les plus prometteurs pour des études fonctionnelles ultérieures.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d'identifier des gènes dont l'expression est spécifique des cellules souches cancéreuses (CSC) mammaires et de déterminer leur rôle dans les propriétés biologiques de ces cellules. Les connaissances acquises permettront de mieux comprendre les mécanismes qui confèrent aux CSC leur capacité d'auto-renouvellement, leur potentiel d'initiation tumorale ainsi que leur résistance aux traitements anticancéreux. L'identification de ces gènes pourrait également conduire à la mise en évidence de nouveaux marqueurs moléculaires, notamment de marqueurs de surface permettant une meilleure identification et caractérisation des CSC. Ces gènes constituent par ailleurs des candidats susceptibles de représenter de nouvelles cibles thérapeutiques visant spécifiquement cette population cellulaire, considérée comme responsable de la persistance de la maladie et des rechutes après traitement. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de stratégies thérapeutiques plus ciblées, destinées à améliorer l'efficacité des traitements du cancer du sein en limitant la survie des CSC. Les résultats obtenus dans ce projet viendront alimenter la sélection des gènes les plus pertinents pour des études précliniques ultérieures. L'évaluation du rôle de ces gènes dans le potentiel tumorigène des cellules cancéreuses nécessite une analyse dans un organisme vivant, permettant d'étudier les interactions entre les cellules tumorales et leur microenvironnement. À ce jour, cette propriété ne peut pas être reproduite de manière suffisamment fidèle par les modèles expérimentaux in vitro. Le recours au modèle murin constitue donc une étape indispensable pour établir le rôle fonctionnel de ces gènes dans les propriétés des CSC.

Procédures

Tous les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse afin de procéder à l’injection (aiguille 29G - 0,33 x 12,7 mm) des cellules tumorales au niveau de leur flanc (durée de l’anesthésie: 10 minutes). Toutes les souris seront pesées 3 fois par semaine (1 minute) et la croissance des tumeurs sera mesurée 3 fois par semaine avec un pied à coulisse (2 minutes). Le développement tumorale se déroule entre 4 et 12 semaines, selon les lignées cancéreuses humaines utilisées

Impact sur les animaux

Le type de greffe de cellules tumorales se fait par injection sous-cutanée . Les tumeurs qui se développent peuvent potentiellement gêner la mobilité des souris si la tumeur se développe dans la région ventrale. Une fois la tumeur apparue, les souris concernées seront suivies plus régulièrement que les autres et l’on vérifiera journellement que le frottement de la tumeur n’induit pas de saignement ni de gène sévère à la mobilité. Si c’est le cas, l’expérience sera arrêtée et l’animal mis à mort. Au regard de notre expérience acquise au cours de plusieurs années d'utilisation de ce type de souris, ce type de nuisance est rare, mais ne doit pas être sous-estimée.

Devenir

Toutes les souris vont développer des tumeurs qui ne permettent pas la survie de l'animal après la fin du projet.

Remplacement

À ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant de remplacer totalement l'utilisation de l'animal pour évaluer le potentiel tumorigène des cellules cancéreuses mammaires. Cette propriété correspond à la capacité des cellules à initier et développer une tumeur dans un organisme vivant. Ce type de propriété ne peut pas être reproduites de manière satisfaisante par les modèles expérimentaux in vitro. L'équipe utilise néanmoins de façon systématique des approches alternatives en culture cellulaire avant toute expérimentation animale. Les effets de la modulation des gènes étudiés sont d'abord évalués sur des cultures cellulaires afin de sélectionner uniquement les gènes présentant un phénotype d'intérêt. Les expériences de xénogreffe chez la souris ne sont réalisées qu'en dernière étape, pour valider les observations obtenues in vitro et déterminer leur impact sur le potentiel tumorigène.Cette stratégie expérimentale, développée et optimisée par l'équipe grâce à sa longue expérience des modèles de xénogreffe, permet de limiter le recours à l'animal aux seules expériences indispensables et contribue ainsi à l'application du principe de remplacement chaque fois qu'une méthode alternative est scientifiquement appropriée.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé de manière à répondre aux objectifs scientifiques du projet tout en respectant le principe de réduction. Cette estimation s’appuie sur l’expertise de l’investigateur principal, sur les données de la littérature obtenues avec des modèles cellulaires et animaux similaires, ainsi que sur les résultats générés dans le cadre de notre précédent projet. L’expérience acquise au cours de ces travaux a permis d’optimiser le plan expérimental, de limiter le nombre de groupes et d’estimer le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats fiables et statistiquement exploitables.

Raffinement

Le projet sera conduit dans des conditions d’hébergement optimales afin de limiter le stress et de préserver le bien-être des animaux. Les souris seront maintenues en animalerie SOPF, dans des cages appropriées et réglementaires, avec un enrichissement adapté de leur environnement et un suivi sanitaire permanent assuré par le personnel qualifié de l’animalerie. Le développement des tumeurs sous la peau au niveau de la région mammaire sera suivi régulièrement par inspection visuelle, palpation et mesure au pied à coulisse. Les animaux seront également pesés régulièrement afin de détecter précocement toute altération de leur état général. L’expérience acquise avec ces modèles nous permet de connaître l'évolution des tumeurs, ce qui facilite l’adaptation du suivi des animaux et l’application précoce des critères d’arrêt prédéfinis. Les animaux feront l’objet d’une surveillance renforcée afin de détecter rapidement tout signe de douleur, de souffrance ou d’altération de l’état général, conduisant, si nécessaire, à l’interruption de l’expérience conformément aux critères d’arrêt établis. Lorsque des procédures susceptibles d’induire une douleur ou un inconfort seront réalisées, une prise en charge analgésique adaptée sera mise en œuvre conformément aux recommandations vétérinaires. Afin de réduire le stress lié aux manipulations expérimentales, les animaux seront progressivement habitués à la présence et aux manipulations de l’expérimentateur au cours des semaines précédant l’étude. Les manipulations seront réalisées préférentiellement selon une méthode non aversive (prise à l’aide d’un tunnel ou dans le creux de la main), afin de limiter le stress associé à la contention.

Choix des espèces

La souris est le modèle d’étude du potentiel tumorigène des cellules du cancer du sein. Combiné avec toutes les approches in vitro, les xénogreffes dans des souris immunodéficientes est le modèle de référence pour les cellules cancéreuses humaines. Animaux adulte âgés de 8 semaines ; c’est l’âge choisi classiquement pour des xénogreffes tumorales, pour avoir des souris jeunes adultes qui permet une bonne prise de greffe.

Tuées à des points définis du développement pour prélever leurs tissus musculaires, 72 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souriceau reçoit peu après la naissance une injection dans les muscles d'une patte arrière, contenant soit du sérum salé, soit une substance qui bloque la contraction musculaire. L'atteinte annoncée est une paralysie des membres postérieurs à cinq jours de vie, dont le porteur ne précise ni la durée ni la prise en charge, tout en affirmant qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit les interactions entre contraction, attache tendineuse et maturation des tissus. Les retombées annoncées, mieux comprendre les maladies musculaires et les lésions tendineuses, sont renvoyées au conditionnel et au long terme, quand la paralysie des souriceaux est l'objet même du protocole.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment une région spécialisée du muscle, appelée jonction myotendineuse, se forme après la naissance. Cette jonction relie le muscle au tendon et assure la transmission des forces lors des mouvements. Bien que cette structure soit essentielle au fonctionnement normal du muscle, les mécanismes de son développement au début de la vie restent encore mal connus. Nos observations préliminaires montrent que des changements moléculaires importants surviennent dans cette région au cours des deux premières semaines après la naissance, période correspondant également au moment où les jeunes animaux commencent à se déplacer et à utiliser leurs muscles. Nous émettons l’hypothèse que la contraction musculaire elle-même joue un rôle clé dans le déclenchement de la formation et de la maturation de la jonction myotendineuse. Pour tester cette hypothèse, nous bloquerons temporairement la contraction musculaire chez des souris nouveau-nées et analyserons les conséquences de cette perturbation sur le développement de cette jonction, aux niveaux moléculaire et structural.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur la manière dont les muscles s’adaptent aux contraintes mécaniques au cours du développement précoce. Comprendre comment la jonction myotendineuse se forme pourrait aider à expliquer pourquoi cette région est particulièrement vulnérable aux lésions et aux maladies. À plus long terme, ces résultats pourraient contribuer à une meilleure compréhension des maladies musculaires, des lésions tendineuses et des pathologies dans lesquelles les connexions muscle–tendon sont fragilisées, et ainsi orienter le développement de futures stratégies thérapeutiques.

Procédures

Les animaux recevront une unique injection intramusculaire dans les muscles du membre postérieur peu après la naissance. Cette injection contiendra soit une solution de NaCl, soit une substance permettant de bloquer transitoirement la contraction musculaire. Aucune procédure chirurgicale ne sera réalisée. Les animaux seront ensuite suivis au cours du développement normal, puis euthanasiés à des points temporels définis, afin de permettre le prélèvement des tissus pour analyse.

Impact sur les animaux

Notre expérience induira une paralysie des membres postérieurs chez des souriceaux au stade néonatal (P5).

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure expérimentale afin de prélever les tissus musculaires nécessaires aux analyses moléculaires et structurales. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées sur des animaux vivants et sont indispensables à l’atteinte des objectifs scientifiques du projet.

Remplacement

Actuellement, aucun modèle alternatif sans recours aux animaux ne permet de reproduire les interactions complexes entre la contraction musculaire, l’attache tendineuse et la maturation tissulaire qui se produisent au cours du développement précoce. Les systèmes de culture cellulaire in vitro ne permettent pas de générer une jonction myotendineuse fonctionnelle. Par conséquent, l’utilisation d’animaux est nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été soigneusement réduit au minimum grâce à l’optimisation du design expérimental. Les deux membres postérieurs de chaque animal sont utilisés pour différentes analyses, ce qui diminue le nombre total d’animaux nécessaires. De plus, les analyses les plus coûteuses en ressources ne sont réalisées que lorsque les résultats préliminaires justifient des investigations supplémentaires.

Raffinement

Toutes les procédures sont conçues pour minimiser la douleur et le stress. Les injections sont réalisées rapidement par du personnel formé, à l’aide d’aiguilles fines adaptées aux souriceaux. Les animaux sont étroitement surveillés afin de détecter tout signe d’inconfort ou de modification du comportement, et des points limites sont appliqués lorsque cela est nécessaire. Les conditions d’hébergement et de soins respectent les normes institutionnelles et réglementaires afin de garantir le bien-être des animaux tout au long du projet.

Choix des espèces

Les souris sont utilisées dans ce projet car elles constituent un modèle bien établi pour l’étude du développement musculaire, et les analyses antérieures de l’expression génique et de la structure tissulaire ont été réalisées chez cette espèce. Cela permet une comparaison directe avec les données existantes. L’étude se concentre sur les stades postnataux précoces, car il s’agit d’une période critique au cours de laquelle la jonction myotendineuse subit une maturation rapide. Ces stades ont été sélectionnés sur la base d’observations préliminaires précises mettant en évidence d’importants changements moléculaires et structuraux durant cette fenêtre temporelle.

500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort pour le prélèvement de leurs reins. 128 d'entre elles enchaînent l'administration d'une molécule dans l'eau de boisson, une injection suivie d'un prélèvement sanguin de trois minutes sous anesthésie locale, dix jours de récupération, sept jours de surcharge en bicarbonate et cinq jours seules dans une cage métabolique, posées sur une grille pour la collecte quotidienne de leur urine. 168 autres reçoivent une molécule activant un gène, puis une surcharge en acide ou en bicarbonate pendant sept jours. Le porteur annonce 500 souris comme un plafond et écrit qu'il est "certain que le nombre réel d'animaux utilisé sera inférieur", sans donner d'estimation.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment des cellules rénales, régulent l’équilibre acido-basique de l’organisme. Cet équilibre est essentiel pour le bon fonctionnement des organes et des réactions biochimiques. Les reins jouent un rôle clé en ajustant la quantité d’acide ou de base excrétée dans l’urine, en réponse aux variations de l’alimentation ou du métabolisme. Nous étudierons spécifiquement le rôle d’une protéine en réponse à une surcharge de base. Des résultats préliminaires dans des cellules en culture suggèrent que cette protéine est impliquée dans la réponse des cellules du rein aux bases et plus généralement dans la régulation de l’équilibre acido-basique. Pour cela, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées, dont le gène codant pour cette protéine est inactivé. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent cet équilibre, et pourrait identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour les troubles acido-basiques qui peuvent survenir dans certaines maladies rénales ou métaboliques. Le projet se déroule dans 2 animaleries distinctes.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet améliorera la compréhension des mécanismes régulant l’acidité du sang, un processus vital pour la santé. D’autre part, ils pourraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter les désordres de l’état acido-basiques visibles chez un nombre important de patients en réanimation, chez des malades sous dialyse ayant une maladie chronique du rein. Ces prises en charge représentent un coût important pour la société en raison des hospitalisations prolongées, des traitements lourds et de la diminution de la qualité de vie des patients. À plus long terme, une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait contribuer au développement de traitements plus efficaces, permettant de réduire les complications médicales, d’améliorer la qualité de vie des patients et de diminuer les dépenses de santé associées. Ces résultats contribueront également à la recherche fondamentale sur le fonctionnement du rein et et le maintien de l’équilibre des ions dans l’organisme.

Procédures

Nombre total d’animaux : 500 souris (adultes, mâles et femelles). Les souris seront soumises aux interventions suivantes : -> 84 souris vigiles subissent une injection (durée de l’injection quelques secondes) ainsi qu’un prélèvement de sang (30 secondes) sous anesthésie générale chimique (durée 10 minutes). (EU 2/2 ou EU 1/2) -> 56 souris vigiles subissent un traitement dans l’eau de boisson pendant 7 jours, un prélèvement de sang (30 secondes) sous anesthésie générale chimique (durée 10 minutes). (EU 2/2 ou EU 1/2) -> 64 souris transgéniques vigiles subissent l’administration d’une molécule dans l’eau de boisson (5 ou 10 jours) (EU 2/2 ou EU 1/2) -> 128 souris transgéniques vigiles auront l’ensemble des manipulations suivantes : (EU 2/2 ou EU 1/2) - administration d’une molécule dans l’eau de boisson pour inactiver un gène - injection d’une solution (quelques secondes) suivie d’un prélèvement sanguin (3minutes) sous anesthésie locale. - Après une récupération de 10 jours, une surcharge plus longue (7 jours) en bicarbonate est entreprise. Des mesures urinaires en cages métaboliques pendant 5 jours et prise de poids quotidienne sont réalisées. Un prélèvement sanguin (3minutes) sous anesthésie locale est ensuite réalisé à la fin de cette période. -> 168 souris transgéniques vigiles auront l’ensemble des manipulations suivantes : (EU 2/2 ou EU 1/2) - administration d’une molécule dans l’eau de boisson ou par lors d’une injection (quelques secondes) pour activer un gène. - une surcharge en acide ou bicarbonate (7 jours) sera entreprise. Toutes les souris sont mises à mort sous anesthésie générale chimique (10 minutes). (EU 2/2 ou EU 1/2)

Impact sur les animaux

Le stress est modéré lors des prélèvements sanguins, atténué par l’utilisation d’anesthésiques locaux (collyre) ou lors d’une anesthésie générale. L’inconfort est transitoire après des prélèvements sanguins, avec surveillance post-opératoire pour détecter tout signe de souffrance (prostration, perte de poids importante). La perte de poids lors de l’habituation aux cages métaboliques est temporaire et limitée. De plus, les souris sont isolées de leurs congénères dans ces cages et placées sur une grille permettant la collecte quotidienne d’urine. La molécule permettant l’inactivation du gène ou la stimulation d’un autre gène est mélangée à une eau légèrement sucrée pour que les souris la boivent sans difficulté. La pesée des souris pour le suivi de leur poids ou avant une anesthésie n’induira qu’un stress minime. Une anesthésie générale est réalisée par du personnel expérimenté, la douleur générée est modérée au point d’injection.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin de chaque procédure. Un prélèvement des tissus rénaux pour plusieurs types d’analyses est effectué pour l’ensemble des animaux de chaque procédure. Aucune réutilisation, adoption ou remplacement n’est possible, car les prélèvements nécessitent la mise à mort de l’animal. Les prélèvements de tissus (rein) et sanguins sont nécessaires pour analyser l’impact des traitements sur l’équilibre acido-basique et l’implication de la protéine que nous étudions.

Remplacement

Ce projet nécessite l'utilisation d'animaux car il est actuellement impossible de reproduire la complexité des interactions cellulaires dans le rein, ni la réponse systémique à une surcharge alcaline et à la perturbation de l’état acido-basique.

Réduction

Le nombre total de souris prévues pour ce projet est de 500. Ce nombre maximal a été calculé afin d’obtenir une puissance statistique suffisante pour détecter des différences biologiquement significatives entre les groupes expérimentaux. Cet effectif permet également de comparer les effets chez les mâles et les femelles. Néanmoins, il est certain que le nombre réel d'animaux utilisé sera inférieur à ce nombre maximal. Nous prévoyons de valoriser au maximum les animaux utilisés, en constituant des banques de matériel biologique qui pourront être utilisées pour répondre à d'autres questions biologiques sur ces mêmes modèles et en réalisant une étude statistique de nos résultats.

Raffinement

Les 500 souris seront pesées au moment de leur arrivée à l’animalerie. Les souris seront suivies avec un soin particulier, elles seront observées 3 fois par semaine au minimum. Les points limites sont clairement définis, afin de détecter précocement tout signe de souffrance. Pour minimiser leur stress, les souris sont progressivement adaptées aux cages métaboliques pour limiter la perte de poids (pesée quotidienne). Un enrichissement de l’environnement dans ces cages limite l’inconfort des souris. Une anesthésie chimique locale est réalisée pour certains prélèvements sanguins. D’autres prélèvements sont réalisés sous anesthésie chimique générale. Une analgésie adaptée sera systématiquement mise en œuvre pour les procédures susceptibles d’entraîner de la douleur ou de l’inconfort. Des collectes d’urine non invasives seront réalisées chez un maximum de 268 souris afin de limiter le recours aux cages métaboliques, qui peuvent être source de stress pour les animaux. Selon la nature des prélèvements sanguins réalisés, une anesthésie locale ou une anesthésie générale sera utilisée. Lorsque certains traitements sont administrés dans l’eau de boisson, un agent sucrant pourra être ajouté afin d’améliorer l’acceptabilité de l’eau traitée et de maintenir une consommation normale. Lorsque les objectifs scientifiques le permettent, la perfusion des tissus sera réalisée après la mort de l’animal plutôt que sous anesthésie terminale avant le décès, afin de réduire les interventions pratiquées sur l’animal vivant.

Choix des espèces

Les modèles murins, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier le fonctionnement du rein. Cette espèce possède un fonctionnement du rein proche de celui de l'Homme et permet d'étudier cette fonction par les mêmes techniques, tout en complétant l'analyse jusqu'aux étages cellulaire et moléculaire. De plus, ce projet inclut des expériences utilisant des modèles animaux modifiés génétiquement disponibles uniquement chez la souris et permettant l’inactivation d’un gène. Cette inactivation sera déclenchée à deux âges différents car l’efficacité de cette méthode peut varier selon le stade de développement de la souris. Tester deux périodes permettra de déterminer les conditions les plus adaptées pour obtenir une inactivation efficace du gène dans les cellules rénales étudiées. Nous explorerons la fonction rénale chez des souris âgées minimum de 11-12 semaines pour lesquelles le rein est complètement développé.

Opérées trente minutes pour recevoir un cathéter dans la veine jugulaire et une pompe programmable, une partie des souris est ensuite perfusée en hormone de croissance pendant cinq jours, le débit changeant toutes les trois heures. Au total 108 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 62 nouvelles souris transgéniques et 26 issues d'un autre protocole. La glycogénose est induite chez l'adulte par cinq jours d'injections, la glycémie est mesurée après section de l'extrémité de la queue, et une partie des souris est soumise pendant un mois et demi à un régime qui provoque une fibrose du foie. Le porteur indique que l'induction à l'âge adulte évite les hypoglycémies sévères "qui peuvent être fatales", et rapporte par ailleurs 1 à 2 % de décès, généralement nocturnes, liés à ces hypoglycémies. Toutes seront tuées pour prélever leur foie, leur hypophyse, leur hypothalamus et leurs testicules.

Objectifs

Modif.11/05/26] Alors que le diabète se caractérise par trop de sucre (hyperglycémies) dans le sang, la glycogénose de type 1 est une maladie métabolique rare qui entraine des hypoglycémies (baisse du sucre dans le sang) pouvant être fatales. Elle est due à des mutations génétiques qui empêchent l’organisme de produire du sucre entre les repas, pour maintenir une glycémie stable. Une prise en charge nutritionnelle est basée sur la consommation de sucres complexes comme la Maïzena et sur une prise alimentaire régulière y compris la nuit. Ces patients développent aussi un foie gras, et environ 80% de ces patients présentent des tumeurs du foie, quel que soit le sexe. Cependant, la maladie hépatique n’évolue pas vers le stade de cirrhose (fibrose importante du foie) alors que 80% des tumeurs se développent sur un foie cirrhotique chez les patients diabétiques, avec une prédominance chez les hommes. Grâce au développement d’un modèle de souris viables reproduisant fidèlement la pathologie hépatique de la glycogénose, il a été montré un défaut de sécrétion de l’hormone de croissance. Cette hormone, produite par l’hypophyse, présente une sécrétion différente selon le sexe biologique, ce qui influence son action sur le foie. Notre projet consiste à évaluer l’effet de la libération contrôlée de l’hormone de croissance chez des souris mâles atteintes de glycogénose, afin d’étudier son impact sur l’évolution de la maladie hépatique. Ceci sera réalisé grâce à une mini-pompe programmable délivrant régulièrement l’hormone dans la circulation sanguine ou par des injections quotidiennes sous-cutanées, similaires aux traitements administrés chez l’humain. Les premières observations montrent que ce traitement permet de rétablir partiellement certaines caractéristiques d’un foie sain, et ce, quel que soit le protocole de traitement utilisé. En revanche, ce traitement n’a pas agi sur les gènes liés à l’inflammation ou la fibrose. Pour aller plus loin, de nouvelles expériences ajoutées à ce projet [Modif.11/05/26] incluront des souris soumises à un régime alimentaire déséquilibré connu pour favoriser la fibrose du foie, en comparaison à un régime normal. Les objectifs sont 1) de vérifier si le traitement par injections quotidiennes reste efficace dans ces conditions et peut moduler le développement de la fibrose, et 2) observer les effets après une durée de traitement prolongée.

Bénéfices attendus

Les résultats issus de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la maladie hépatique associée à la glycogénose. A partir de nos données préliminaires démontrant un défaut de sécrétion de l’hormone de croissance, nous avons émis l’hypothèse que le rétablissement de sa sécrétion à des rythmes physiologiques devrait permettre de retrouver un contexte hépatique similaire à ce qui est observé chez les patients diabétiques obèses qui présentent aussi un foie gras. Dans le cadre de la glycogénose, quelques rares données suggèrent des perturbations hormonales, en particulier une diminution de la sécrétion de l’hormone de croissance. Ceci explique les retards de croissance observés chez ces patients. Notre étude devrait mettre en évidence que ces perturbations hormonales ont un impact plus large, en particulier sur la progression de la maladie hépatique. Nos résultats pourraient être importants pour la prise en charge d’autres pathologies puisque la pulsatilité de la sécrétion de l’hormone de croissance n’est jamais prise en compte dans les traitements chez l’homme. Une délivrance plus physiologique de cette hormone pourrait éviter les effets secondaires liés à son injection chronique à des doses supra-physiologiques.

Procédures

Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, un petit morceau (1mm) de tissu sera prélevé à l’extrémité [Modif.11/05/26] de la pina de l’oreille pour caractériser leurs gènes. La durée du geste est de quelques secondes. A l’âge de 6-8 semaines, les souris subiront une injection tous les jours pendant 5 jours (quelques secondes/souris). Environ 4 mois après le développement de la glycogénose, une partie des souris subira une chirurgie afin de poser un cathéter en veine jugulaire et une pompe programmable permettant la délivrance pulsatile d’hormone de croissance. La chirurgie devrait durer au maximum 30 min. Après une période de récupération post-opératoire d’au moins 1 semaine, les souris seront perfusées soit avec une solution d’hormone de croissance, soit avec du sérum physiologique, de façon pulsatile (changement de débit toutes les 3h), pendant 5 jours. [Modif.11/05/26]: Un autre lot de souris subira 1 injection quotidienne d’hormone de croissance pendant 5 jours ou 15 jours (quelques secondes/souris). Un groupe de souris saines et un groupe de souris atteintes de glycogénose seront injectés avec du sérum physiologique et constitueront les groupes de référence (quelques secondes/souris). L’étude sera réalisée sur des animaux nourris en régime standard et sur des animaux nourris pendant 1,5 mois avec un régime connu pour induire de la fibrose au niveau du foie (stade avant le développement de la cirrhose). En fin de protocole, les souris seront mises à jeun pendant 6h avant leur mise à mort. Une prise de sang sera réalisée juste avant la mise à mort. Le prélèvement durera environ 15 secondes.

Impact sur les animaux

A l’âge de 7 jours, les souris transgéniques subissent une biopsie [Modif.11/05/26] de la pina de l’oreille afin de les génotyper. Ceci entraine une légère douleur et un stress lié à la contention des nouveau-nés. L’induction de la glycogénose sera obtenue après une série d’injections en sous-cutané pendant 5 jours, à l’âge de 6-8 semaines, pouvant engendrer une légère douleur. L’immobilisation de la souris ne nécessite pas de contention en main mais peut induire un léger stress. Ces souris peuvent développer des hypoglycémies sévères si elles ne s’alimentent pas régulièrement. Dans ce cas, les souris présentent un mal-être important lié à l’hypoglycémie. Actuellement, la gestion de l’élevage permet de limiter les décès liés aux hypoglycémies sévères, mais 1 à 2% de décès peuvent être rencontrés généralement durant la nuit. Les hypoglycémies peuvent être plus fréquentes lors de l’anesthésie et lors de la mise à jeun en fin de protocole. La glycémie sera mesurée à partir d’une goutte de sang obtenue après section de l’extrémité de la queue ce qui entraine de la douleur Au-delà de 15 mois de maladie, ces souris peuvent développer des tumeurs du foie. Dans ce projet, les souris seront mises à mort au plus tard 6 mois après l’induction de la maladie. Après 4 mois d’induction de la maladie, certaines souris subiront une chirurgie permettant la pose d’un cathéter en veine jugulaire et d’une pompe programmable permettant la délivrance pulsatile d’hormone de croissance. Le risque d’hémorragie lors de la chirurgie est très faible et la chirurgie est susceptible de provoquer de la douleur. [Modif.11/05/26] Un autre lot de souris subira 1 injection/jour pendant 5 ou 15 jours, ce qui peut induire une légère douleur. Le régime qui induit une fibrose du foie peut entrainer une légère perte de poids et, au-delà de 3 mois, ce régime peut avoir des effets délétères sur les fonctions du foie, entrainant un mal-être important chez la souris. L’immobilisation de la souris pour ces injections ne nécessite pas de contention en main mais peut induire un léger stress. Une prise de sang sera réalisée juste avant la mise à mort. La piqure entraine une légère douleur et la contention de l’animal entraine un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement du foie, de l’hypophyse, du cerveau (hypothalamus) et les testicules afin de réaliser des analyses anatomo-pathologiques et moléculaires

Remplacement

Même s’il est maintenant possible de produire des petits organes en culture qui intègrent les différents types de cellules du foie, la pathologie hépatique de la glycogénose met en jeu un dialogue complexe entre ces cellules du foie et les cellules du système immunitaires de la circulation sanguin ainsi que des régulations hormonales. Une étude préliminaire réalisée in vitro sur des cellules du foie de souris traitées avec de l’hormone de croissance de façon cyclique a permis de valider notre hypothèse de travail. Cependant, il est important maintenant de conserver la physiologie de l'organisme pour comprendre les mécanismes initiés par la pulsatilité de l’hormone de croissance sur le foie. Ce projet nécessite donc de travailler avec un modèle animal permettant de maintenir les interactions inter organes. Dans le cadre de cette étude, l’hypothalamus, l’hypophyse, les testicules, le foie et le sang seront prélevés pour étudier en détail l’ensemble des régulations à l’échelle de l’organisme

Réduction

-Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances de la pathologie étudiée, des modèles animaux, du métabolisme et grâce aux connaissances acquises par les études précédentes. Afin de réaliser une analyse statistique, des groupes de 10 souris maximum, permettront de réaliser à la fois les études moléculaires et histologiques. Des tests statistiques permettront de comparer les différents groupes de souris entre eux. -Dans le but de réduire le nombre d’animaux à produire, certains animaux sont des souris déjà utilisées dans un autre protocole, sans avoir subi de procédures sévères entrainant un mal-être ou une douleur importante. [Modif.11/05/26] -Au total, ce projet réalisé sur 5 ans nécessitera au maximum 108 souris, incluant l’obtention de 62 nouvelles souris transgéniques et de 26 souris « réutilisées ».

Raffinement

-La pathologie est induite uniquement dans le foie des souris à l’âge adulte ; ceci permet d’éviter les hypoglycémies sévères qui peuvent être fatales et de passer la période néonatale. -Contrôle des risques d’hypoglycémie en limitant les efforts des souris pour accéder à la mangeoire (croquettes dans la cage et tétines de biberon longue). En cas d’hypoglycémie, une solution de sucre (glucose) sera administrée à la souris et une partie de la cage sera placée sur une plaque chauffante pour maintenir sa température corporelle. Les animaux seront entraînés à recevoir du glucose à la pipette par voie orale avant l’induction de la maladie. -Afin de limiter la douleur, une crème anesthésiante sera appliquée sur les zones qui peuvent être douloureuses. -Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et antalgique adapté pendant plusieurs jours afin de limiter la souffrance, la douleur et le stress de l’animal pendant et après cette chirurgie. Elle sera réalisée dans des conditions d’asepsie afin d’éviter tout risque d’infection. Afin de limiter au maximum le risque d’hypothermie pendant la chirurgie, un module permettant de chauffer la boîte à induction et un tapis chauffant seront utilisés. La glycémie sera aussi contrôlée régulièrement afin d’intervenir au plus tôt pour administrer une solution de sucre. Enfin, tout le suivi post-opératoire se fera dans une pièce permettant de garder les souris à thermoneutralité. [Modif.11/05/26] Un suivi de poids mensuel, puis quotidien pendant la période post-opératoire ou bihebdomadaire lors du changement de régime permettra d’identifier une perte de poids anormale de l’animal. La durée du régime induisant une fibrose du foie sera limitée dans le temps afin de prévenir la survenue de dommages hépatiques et d’un mal-être important. La mise en place d’une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés a permis de déterminer les critères d’arrêt de souffrance à tout moment du projet.

Choix des espèces

En ce qui concerne la régulation de la glycémie, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson, montrent que les régulations ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux, comme la souris, dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Le modèle de souris transgéniques reproduit toute la pathologie humaine de la glycogénose, y compris le développement de tumeurs. Le protocole sera débuté chez des souris adultes âgées d’au minimum 6 à 8 semaines. L’induction de la glycogénose sera réalisée à l’âge adulte ce qui permet d’éviter l’apparition de retard de croissance dû à la maladie et de passer la période périnatale sans phénotype dommageable. Les perfusions [Modif.11/05/26] ou les traitements à l’hormone de croissance seront réalisés 4 mois après le développement de la glycogénose. Seule la biopsie de la pina de l’oreille [Modif.11/05/26] pour génotypage sera réalisée chez les nouveau-nés âgés de 7 jours.

Une partie des souris utilisées est immunodéficiente, donc plus exposée aux infections et maintenue sous couvercle filtrant. 1 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous anesthésie une injection de cellules tumorales dans les deux flancs, puis des molécules fluorescentes et des anesthésies répétées pour l'imagerie, avec deux tumeurs pouvant atteindre 250 mm3, des nécroses traitées au spray cicatrisant et une mise à mort déclenchée au-delà de deux millimètres de nécrose ou de 15 % de perte de poids. Toutes seront tuées pour observer la fluorescence de leurs tumeurs et de leurs organes, dans un projet où cinq souris sont prévues par molécule testée et dont le porteur annonce que ces agents pourraient "réduire le nombre d'animaux utilisés dans les expériences précliniques".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester des molécules couplées à des sondes fluorescentes permettant de détecter par imagerie de fluorescence les tumeurs. Ces agents pourront ensuite permettre le suivi de la prise tumorale chez la souris et pourront également servir pour réaliser de la chirurgie assistée par fluorescence ou délivrer des agents thérapeutiques. Dans ce projet, nous testerons la capacité de ces molécules à cibler et permettre la détection des tumeurs sous-cutanées. Il s’agit ici de faire la preuve de concept de l’utilisation de ces molécules.

Bénéfices attendus

Ce projet est la partie preuve de concept (POC) de projets de plus grandes ampleurs. Il permet de tester aussi bien la possibilité des molécules imageantes à reconnaitre leur cible que leur capacité à être imagées. L’étape suivante sera de tester les meilleurs agents dans des modèles plus proches de l’Homme avant de pouvoir envisager leur utilisation chez l’Homme. Ces agents pourront également faciliter le suivi de la progression tumorale chez les souris et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés dans les expériences précliniques.

Procédures

Les animaux recevront l’injection de cellules tumorales dans les deux flancs (100 µl en 30 secondes) après avoir été anesthésiés. Ils recevront également une injection de molécules imageantes (maximum 200 µl en 1 minute)

Impact sur les animaux

- Les souris seront anesthésiées lors de l’injection des cellules tumorales - La contention des souris lors de la mesure de la taille des tumeurs pourrait provoquer un léger stress. - La présence de deux tumeurs sur les flancs pouvant atteindre jusqu’à 250 mm3 pourrait générer une légère gêne au mouvement et donc impacter légèrement leur état général. - Des nécroses peuvent apparaitre sur les tumeurs. - L’injection des agents imageants (

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure et les tumeurs et les organes seront alors récupérés pour visualisation de la fluorescence ex-vivo.

Remplacement

La preuve de concept de l’utilisation de ces molécules imageantes pour visualiser les tumeurs nécessite de pouvoir se rapprocher le plus possible de ce qui est retrouvé chez l’animal et l’Homme et donc d’avoir des tumeurs. Le but est de montrer que ces agents sont capables d’aller jusqu’à la tumeur, de reconnaitre leur cible et d’être visualisable. Cette preuve de concept ne peut donc être faite que sur des animaux porteurs de tumeurs exprimant les cibles des molécules testées. Tous les tests in vitro préalables ont déjà été faits.

Réduction

Pour chaque molécule imageante à tester, 1 groupe de 5 souris sera constitué afin de générer un groupe avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer leurs capacités à reconnaitre la tumeur et à être imagé. L’implantation de tumeurs porteuses de la cible ou non sur le même animal permet de réduire le nombre d’animaux utilisés en évitant de devoir faire des expériences supplémentaires.

Raffinement

L’hébergement des souris se fera en groupe pour éviter le stress et ces souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée. Du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement. Les différentes lignées de cellules tumorales seront injectées par voie sous-cutanée dans le flanc de souris anesthésiées. Les animaux seront suivis tous les 2-3 jours pour vérifier leur bien-être et déterminer la progression tumorale par mesure du volume de la tumeur. En cas d’apparition de nécrose les tumeurs seront traitées avec un spray cicatrisant, si la nécrose dépasse 2 mm de diamètre ou si d’autres signes de souffrance apparaissent (ex : perte de 15% du poids de la souris), les animaux seront mis à mort. Les animaux immunodéficients étant plus sensibles aux infections, ils seront maintenus sous couvercle filtrant.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles utilisés pour tester facilement les nouvelles molécules imageantes utilisées en cancérologie. Nous utiliserons des souris immunocompétentes ou immunodéficientes selon la cible de la molécule et donc les cellules tumorales à implanter. Les souris sont largement utilisées lors de la greffe sous-cutanée de ces cellules cancéreuses. Des souris adultes d’au moins 6 semaines seront utilisées pour permettre une bonne prise tumorale et l’obtention d’un système immunitaire fonctionnel dans le cas des souris immunocompétentes