Recherche fondamentale

Cinq séances hebdomadaires de neurostimulation par ultrasons, doublées d'une électromyographie, puis dix minutes d'échographie cérébrale avec agent de contraste et d'imagerie photoacoustique : 320 souris et 320 rats mâles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tués après la cinquième semaine. Le projet compare des sondes ultrasonores pour trouver la configuration la plus efficace, l'espoir déclaré étant de stimuler le cerveau "sans générer de lésions". Le groupe témoin reçoit de la cocaïne, dont le porteur indique qu'elle peut provoquer des troubles locomoteurs, une modification de la prise alimentaire et une hausse de l'anxiété. La pose d'un cathéter et la suture de la peau du crâne apparaissent seulement dans la liste des douleurs attendues, sans figurer dans la description des procédures.

Objectifs

Dans le cadre de cette étude nous souhaitons évaluer différentes sondes ultrasonores pour réaliser une stimulation ultrasonore non-invasive, précise et efficace chez la souris et le rat.

Bénéfices attendus

Nous espérons trouver une configuration de sondes et paramètres ultrasonores donnant le plus d'efficacité de stimulation cérébrale, sans générer de lésions.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs interventions comme la neurostimulation ultrasonore, pour une durée de 5 minutes, répétee 5 fois à raison de 1 fois par semaine. L'electromyographie sera réalisée en parallèle de cette neurostimulation avec la même durée et fréquence. Une échographie cérébrale avec agents de contraste ainsi qu'une imagerie photoacoustique seront réalisées successivement après la neurostimulation pendant 10 minutes et en suivant la même fréquence de 1 fois par semaine pendant 5 semaines. Enfin, l'injection de puces d'identification sera effectuée une fois pour une durée de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Parmi les nuisances ou effets indésirables, il est possible que l'animal ait des douleurs au réveil suite à la pose du cathéter. Une gêne peut aussi être ressentie après l'apposition de la sonde ultrasonore de stimulation. Il est aussi possible que la suture de la peau sur le crâne soit douloureuse. L'injection de cocaïne au groupe contrôle afin de vérifier la capacité de l'imagerie ultrasonore d'observer les modifications vasculaires peut induire des problèmes locomoteurs, une modification de la prise de nourriture et une augmentation de l'anxiété des animaux.

Devenir

Nous conservons les animaux en vie jusqu'à la 5ème semaine de traitement par neurostimulation ultrasonore. Après les dernières imageries échographique et photoacoustiques, les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Dans une première approche expérimentale, nous avons mis en place et validé un dispositif expérimental permettant la stimulation ultrasonore. Dans la continuité de ce projet, nous souhaitons évaluer différentes sondes ultrasonores pour réaliser une stimulation ultrasonore précise et efficace chez la souris et le rat. Par conséquent, à cette étape du projet, le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle d'étude in-vitro ou in-silico.

Réduction

Sur la base de nos études antérieures et en raison des variables mesurées, notre étude nécessite 320 souris et 320 rats. Les groupes contrôles et expérimentaux seront constitués de 8 animaux. Nous réaliserons une étude statistique pour déterminer si les effets de la neurostimulation induisent une modification significative des variables mesurées.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe de 8 pour les souris et par 2 pour les rats en présence d'un ou plusieurs objets d'enrichissement. L'ensemble des stimulations et imagerie sur animaux endormis seront faites sous anesthésie gazeuse pour réduire les douleurs des animaux. Des points limites adaptés à chaque intervention seront suivis au cours du temps.

Choix des espèces

Le choix de ces deux espèces se justifie pour l'analogie des zones cérébrales et de la neurobiologie entre le rongeur et l'humain. Certains aspects de la stimulation ultrasonore chez la souris et le rat ont également été validés dans la littérature. Des animaux de sexe mâle seront utilisées afin d’éviter toute altération des résultats par le cycle menstruel femelle. Les souris BALB/cByJRj et les rats Sprague-Dawley seront adultes (âgées de 9 semaines) à J0 de l'expérimentation afin de comparer les effets d’une stimulation ultrasonore chez des animaux dont le phénotype comportemental est stabilisé (période neuro-développementale terminée).

Immunodéprimées pour accepter la greffe de cellules cancéreuses humaines, 80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de carcinome à cellules de Merkel leur sont injectées sous la peau, suivies d'une injection intrapéritonéale quotidienne pendant quatre semaines, molécule testée ou solvant. Le porteur affirme que ces tumeurs ne sont pas douloureuses chez l'humain et qu'aucun signe de douleur n'a été observé lors des études précédentes. Toutes sont tuées à l'issue, la pesée finale des tumeurs imposant leur mise à mort.

Objectifs

Le carcinome à cellules de Merkel (CCM) est un cancer cutané agressif avec une survie estimée à 50 ans de seulement 40%. Il survient principalement chez le sujet agé de plus de 65 ans et le patient immunodéprimé (hémopathies, greffes d'organe, infection par le VIH). Dans 80% des cas les CCM sont dit viro-positifs et sont dus à l'intégration du Polyomavirus à cellules de Merkel (MCpV), les 20 % restants sont dis viro-négatifs et sont principalement dus aux expositions UV. Actuellement, au stade métastatique inopérable, une seule option thérapeutique efficace est disponible, l'Avelumab, mais des phénomènes de résistances primaires et acquises à ces traitements entrainent une réponse objective durable chez seulement 25% des patients, soulignant la necessité d'identifier des nouvelles stratégies thérapeutiques dans ce domaine. Des méthylations abérrantes de l'ADN ont été démontré comme étant des modifications importantes et fréquemment retrouvées dans les cellules cancéreuses. Il a été démontré dans plusieurs types de cancers que l'utilisation de molécules hypométhylant l'ADN permettait de reprogrammer les cellules tumorales vers un état "normal", re sensibilisant ces cellules à la chimiothérapie et à l'immunothérapie. Par exemple, les premières générations d'agent hypométhylant l'ADN, tel que l'azacitabine et la decitabine sont utilisés en routine pour le traitement des leucémies myeloïdes. Une nouvelle molécule hypométhylante, la guadecitabine, est actuellement en essai clinique. Nos données préliminaires démontrent que cette molécule est capable in vitro de diminuer la prolifération cellulaire et la viabilité des CCM. L'objectif de ce projet est donc d'évaluer in vivo l'efficacité anti tumorale de cette molécule sur les CCM.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre d'évaluer l'efficacité anti tumorale d'un agent hypométhylant, la guadecitabine, dans l'indication Carcinome à cellules de Merkel. Actuellement, au stade métastatique inopérable, seul l'immunothérapie, Avelumab est efficace, mais l’utilisation de ce traitement, du fait des mécanismes de résistance innés ou acquis, ne permet d’obtenir une réponse objective durable que chez 25% des patients. La capacité à ré induire une expression des immunes check point, tel que PDL-1, cible de l'immunothérapie par l'Avelumab, sera également évaluée. Ainsi la guadecitabine pourra ensuite être évaluée en combinaison avec des inhibiteurs d'immune checkpoint (Avelumab) dans le cas du CCM.

Procédures

Les souris recevront par voie sous-cutanée des cellules de CCM (carcinome à cellules de Merkel) afin d'établir le modèle tumoral. Les animaux seront injectés 1 fois par jour en intrapéritonéal avec la molécule ou le véhicule pendant 4 semaines. Ces deux types de gestes ne durent que quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir un stress lors des différentes contentions pratiquées : une contention pour l’injection des cellules tumorales en sous cutané et une contention quotidienne pour l'injection en intrapéritonéale. Une gêne ou légère douleur pourra être subies par les souris lors des injections en sous cutanées ou en intrapéritonéale. Les tumeurs étudiées sont non douloureuses chez l’Homme, chez la souris aucun signe de douleurs n’a été observé durant les études in vivo précédentes. Une sédation avec injection en intrapéritonéal d'acépromazine sera effectuée avant la mise à mort par élongation cervicale afin de limiter toutes douleurs chez l'animal.

Devenir

L'évaluation de la masse finale des tumeurs impose la mise à mort de l'ensemble des souris tumorisées.

Remplacement

L’efficacité de la guadécitabine a été préalablement démontrée in vitro en lignées cellulaires de CCM. L'obtention de l'efficacité de la molécule sur ces différentes lignées et les données déjà publiées sur des molécules similaires de première génération dans l'indication des CCM, limitent le nombrer de souris à utiliser, en nous permettant de tester une dose unique de guadécitabine. Cette étude apportera des informations clés pour la détermination de l'efficacité de cette nouvelle molécule sur la réponse anti-tumorale et sur sa capacité à re sensibiliser les cellules à de l'immunothérapie. Ces éléments, essentiels pour la validation de l'utilisation de cette molécule dans l'indication CCM nécessitent le passage par un modèle in vivo.

Réduction

La détermination du nombre de groupes et les doses testées sont basées sur les résultats des tests de cytotoxicité in vitro préalablement réalisés au laboratoire réduisant ainsi le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les injections en intrapéritonéales sont rapides et peu douloureuse, le geste technique est déjà maitrisé par les personnes qui manipuleront les souris. De plus, bien que les injections soient quotidiennes, elles se feront en alternance entre le côté gauche et le côté droit pour éviter d'engendrer des douleurs répétées au même point d'injection. Une friandise sera proposée aux souris après chaque injection en intrapéritonéal. Tout au long de l'étude, le bien être des animaux sera évalué à l'aide d'une grille de score, si les animaux atteignent les points limites définis antérieurement, ils seront sortis de l'étude afin de limiter toutes souffrances. De plus, pour éviter tout stress inutile, lors de la mise à mort un sédatif, sera injectée en intrapéritonéal avant l'euthanasie.

Choix des espèces

Le seul modèle disponible étant des lignées carcinomateuses humaines, l’utilisation d’un modèle murin immunodéficient est indispensable. Les souris utilisées sont un modèle de référence dans les études de xénogreffes. Les souris seront receptionnées à 6 semaines de vie, et utilisées à 7 semaines après 1 semaine d’acclimatation. Elles seront ainsi dans un stade physiologique de croissance, stade utilisé usuellement dans ce modèle de carcinome et optimal pour évaluer toute toxicité pouvant être liée au traitement par la molécule.

Colite provoquée par un produit dans l'eau de boisson, par sensibilisation de la peau suivie d'une administration rectale, ou par injections répétées pendant douze semaines : 6 840 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement d'organes entiers. Certaines lignées ont un système immunitaire déficient, ce qui les rend plus sensibles aux infections. La douleur liée à l'inflammation intestinale est estimée "légère à modérée au maximum", dans un texte qui décrit par ailleurs un risque de péritonite lié à la répétition des injections abdominales. Le porteur indique recourir en première intention aux organoïdes et aux systèmes d'intestin artificiel, puis conclut qu'un modèle animal est "totalement indispensable".

Objectifs

Les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI) sont caractérisées par une inflammation intestinale inappropriée. Elles représentent un fardeau majeur pour les populations occidentalisées. En effet, leur incidence et prévalence ont augmenté de façon spectaculaire au cours des dernières décennies. Les thérapies actuelles ne sont que partiellement efficaces et principalement basés sur des immunosuppresseurs (médicaments affaiblissant le système immunitaire). Celles-ci sont associés à des effets secondaires, notamment des infections et des cancers. Il est donc urgent de mieux comprendre leur origine et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous avons observé chez les patients atteint de MICI, une altération dans l’une des voies métaboliques qui est directement corrélé à l’inflammation. L'hypothèse principale du projet est de caractériser l'effet de cette enzyme dans les MICI afin de pouvoir développer l’enzyme humaine comme un candidat thérapeutique. Ces résultats ouvriront la voie au développement de nouveaux traitements pour les MICI.

Bénéfices attendus

Ce projet représente un programme de recherche complet et ciblé sur le métabolisme dans le contexte de la santé et des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). En France, les MICI concernent aujourd’hui près de 300 000 personnes (données 2021). L'approche que nous proposons est complètement nouvelle et basée sur des découvertes concernant le rôle des certains métabolites dans les processus inflammatoires. Notre approche est basée sur la modulation de certaines voies métaboliques, perturbées dans les maladies inflammatoires, afin de restaurer la production normale de métabolites anti-inflammatoires tout en diminuant la production de métabolites pro-inflammatoires. Ce projet multidisciplinaire intègre plusieurs facettes de l'immunité et métabolisme. Les études décrites dans le projet devraient améliorer notre compréhension des mécanismes délétères impliqués dans les MICI tout en identifiant une nouvelle stratégie thérapeutique utilisable chez les patients.

Procédures

Certains modèles subiront un traitement préalable pour induire le modèle transgénique à raison d’une injection intrapéritonéale quotidienne sur animal vigile (moins de 10 secondes) pendant 5 jours consécutifs. Certains modèles animaux utilisés dans le projet dispose d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rends plus sensible aux infections. Par la suite, nous mettrons en œuvre les différents modèles de colites mimant les aspects des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). Les souris pourront être suivre au choix selon les groupes et questions scientifiques : i) Une colite induite par traitement dans l’eau de boisson pendant 7 jours et/ou une injection intrapéritonéale sur animal vigile (moins de 10 secondes) par jour pendant 7 jours à 12 jours. ii) Une colite induite par sensibilisation de la peau sous anesthésie (5 minutes) suivi d’une administration rectale sous anesthésie (5 minutes) et/ou une injection intrapéritonéale sur animal vigile (moins de 10 secondes) ou un gavage intragastrique (moins de 10 secondes) pendant 3 jours. iii) Une colite induite une injection intrapéritonéale de cellules (moins de 10 secondes) et/ou une injection intrapéritonéale sur animal vigile (moins de 10 secondes) au maximum une fois par jour pendant un maximum de 12 semaines. Afin de vérifier la composition du microbiote, les selles fraiches de chaque animal seront recueillies régulièrement sans contrainte pour l'animal. Les animaux seront simplement placés dans des pots transparents permettant aux animaux de bouger librement, et après quelques minutes (maximum 5 minutes) les animaux produisent des fèces spontanément. Afin de vérifier l’état métabolique des souris, les animaux subiront un prélèvent de sang de faible volume sur animal vigile par simple contention par une personne formé avec un matériel adapté en moins de 30 secondes. Les animaux seront ensuite euthanasiés selon une méthode réglementaire au temps prévu pour effectuer les différents prélèvements nécessaires pour répondre aux questions scientifiques du projet.

Impact sur les animaux

Le projet comprend différentes techniques d’administrations (gavages, injections intra-péritonéales) pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste. La répétition des injections au niveau abdominal peut entrainer un risque de péritonite (très rare). Nous réalisons des recueils réguliers de selles fraiches sans contrainte (animal libre de ses mouvements) qui ne devraient induire de nuisance ou tout au plus un léger stress lié au changement d’environnement durant quelques instants. Nous réaliserons également des prélèvements sanguins de faible volume pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie. Les modèles de colites sont associés à des effets indésirables attendus. Dans ces modèles la douleur imposée aux animaux est liée à l’inflammation intestinale qui n'entraîne pas la mort de l'animal. On peut estimer que son intensité sera légère à modérée au maximum. Pour l’un des modèles de colite, une anesthésie est nécessaire et pourrait induire dans de rare cas, une mauvaise réaction (stress thermique, difficulté respiratoire, arrêt cardio-respiratoire). De plus, certains modèles utilisés dans le projet disposent d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rend plus sensible aux infections

Devenir

A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par une méthode réglementaire afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Sur chaque animal, plusieurs organes sont prélevés en entier pour analyse ce qui impose une euthanasie.

Remplacement

Malgré le développement et l’utilisation en première intention de modèle non animaux tels que les organoïdes ou les systèmes d’intestin artificiel, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans les interactions complexes entre le microbiote intestinal et son hôte en situation normale et inflammatoire. A l’heure actuelle il n’est donc pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et microbiens rentrant en jeu, un modèle animal est donc de ce fait totalement indispensable.

Réduction

Ce projet impliquera donc un maximum de 6840 animaux. Nous limiterons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Du fait des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Les nombre d’animaux utilisés par groupe est basé sur notre expérience de plus de 15 ans d’utilisation des modèles en question. Devant la variabilité biologique inhérente à ce type d’expérience, les expériences seront réalisées deux à trois fois pour s’assurer de la robustesse des résultats obtenus. Néanmoins nous ne répéterons l’expérience que si les résultats vont dans le sens de l’hypothèse de travail et que la puissance statistique n’est pas encore atteinte.

Raffinement

permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, suivi, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (grille de suivi, point limite) et des soins adaptés. De plus, les actes mis en œuvre sont parfaitement maitrisés par le personnel et adaptés au modèle animal.

Choix des espèces

Justification de l’espèce/modèle : La souris est une espèce de référence en immunologie, microbiologie et métabolisme, qui sont les thématiques de notre projet. La souris est un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies intestinales humaines. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des souris non transgéniques mais également des lignées murines simples, doubles et triples transgéniques (toutes sur le même fond génétique). Justification des stades : Les souris seront utilisées à l’âge adulte, entre 6 et 12 semaines de vie. Cet âge est couramment utilisé dans la littérature pour les modèles de colites. Justification du sexe : Nous utiliserons des mâles et femelles selon les productions en interne car nous étudierons les deux sexes qui sont relevant pour la pathologie en question.

Une lésion du nerf sciatique ou une injection d'agent inflammatoire installe chez 180 souris une douleur persistant plus de six semaines, avec allodynie mécanique, hyperalgésie au chaud et au froid et douleur spontanée. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tuées à l'issue, aucune réutilisation n'étant envisageable après la chirurgie. Chaque animal passe trois séances d'IRM d'une heure sous anesthésie et des tests comportementaux de deux heures, deux jours par semaine, pour cartographier les régions du cerveau activées selon le type de douleur. Le porteur écrit qu'en dehors de la douleur induite aucune procédure n'entraîne d'effet indésirable majeur, et présente la mise à mort finale comme un moyen d'éviter aux souris "toute souffrance inutile".

Objectifs

Les douleurs chroniques sont très fréquentes et les traitements disponibles souvent peu efficaces. Une des raisons à cet échec est qu’il n’y a pas une mais des douleurs chroniques. En effet, les douleurs chroniques se manifestent par plusieurs symptômes : douleurs spontanées, et douleurs provoquées par une stimulation normalement non douloureuse (allodynie) ou douloureuse (hyperalgésie). Chaque symptôme dépendant de mécanismes distincts, un médicament efficace sur l’un ne le sera donc pas nécessairement sur un autre : d’où la nécessité de traitements spécifiques pour chacun d’eux. Nous nous intéressons aux mécanismes de l’allodynie mécanique, un des symptômes les plus fréquents observés chez les patients douloureux chroniques. Comment le toucher devient-il douleur ? Normalement, ces sensations sont indépendantes. Les nerfs véhiculant les messages douloureux se terminent dans les couches superficielles de la moelle épinière et ceux véhiculant les messages tactiles dans les couches profondes. Cependant, suite à une lésion nerveuse ou une inflammation périphérique, les informations tactiles peuvent accéder aux neurones de la douleur des couches superficielles via un ‘court-circuit’ et provoquer ainsi une allodynie mécanique. Un petit nombre de neurones appartenant à ce circuit a été identifié, mais le manque d’informations concernant le réseau dans son ensemble et ses caractéristiques propres constituent une barrière majeure contre la mise en place d’une thérapeutique ciblée et efficace. Quels sont les structures cérébrales activées ? Diffèrent elles selon si l'origine de la douleur apparait suite à une lésion nerveuse ou une inflammation périphérique? En utilisant de l'imagerie fonctionnelle chez des souris atteint de douleurs neuropathiques ou inflammatoire, nous effectuerons différentes stimulation mécanique ou thermique afin de déterminer les régions cérébrales activées dans ces deux types de douleur chronique selon la nature du stimulus effectué et ainsi déterminer si les circuits cérébraux différent selon l'étiologie de la douleur.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de comprendre les structures cérébrales impliqués dans les douleurs neuropathiques et inflammatoire selon les modalités sensorielles mobilisées.

Procédures

Tous les animaux subiront une analyse par IRM de leur activité cérébrale. Les animaux seront analysés par IRM fonctionnelle pendant toute l'expérimentation afin d'évaluer les changements d'activités neuronales au cours du temps, sur une période de 6 à 12 semaines, chaque séance durant environ 1h. Chaque animal subira 3 sessions d'IRM, espacées de 10 jours chacune, afin d’évaluer la douleur mécanique statique, dynamique et thermique, respectivement. L'ensemble de ces animaux seront également testés pendant 2 jours chaque semaine pour étudier leur comportement avant et après induction des modèles de douleur. Ces tests comportementaux permettront d’évaluer la douleur mécanique statique, dynamique et thermique, respectivement. Chaque session de comportement dure environ 2h. L'induction des modèles de douleur se fera sous anesthésie générale

Impact sur les animaux

Aucune des procédures décrites dans ce projet, en dehors de la douleur induite dans les modèles de douleur, n'induit d'effets indésirables majeurs. Les données de la littérature indiquent néanmoins une comorbidité anxio- dépressive dans les modèles de douleurs utilisés dans ce projet, comme décrit par les patients atteints de douleurs persistantes. La douleur induite par les modèles de douleurs inclut : -une allodynie mécanique statique et dynamique persistante -une hyperalgésie thermique au chaud et au froid persistante -une douleur spontanée persistante. L'expérience du laboratoire avec ces modèles reporte que ces douleurs persistent environ 1 semaine dans le modèle CFA, et plus de 6 semaines dans le modèle SNI.

Devenir

L'ensemble des animaux ayant subi une procédure chirurgicale, il n'est pas envisageable de les réutiliser dans un autre projet. Toutes les souris seront euthanasiées à la fin de chaque procédure afin de leur éviter toute souffrance inutile.

Remplacement

Aucune méthode alternative n'existe pour prévenir l'utilisation d'animaux dans ce protocole : en effet, il est nécessaire de réaliser ces études chez l'animal car l’intégration du toucher et de la douleur implique de nombreux neurones organisés en réseaux complexes et méconnus du système nerveux central et périphérique. Seuls des animaux permettent de visualiser l'activité cérébrale en temps réel par MEMRI.

Réduction

Le nombre de souris par groupe (n=20) est réduit au maximum tout en permettant de discriminer un effet significatif entre les traitements, et calculé par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux sont stabulés dans des cages contenant au maximum 4 males ou 5 femelles dans une pièce thermorégulée (22 ± 1 °C) avec hygrométrie contrôlée ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum ; changement de litière 1 fois par semaine. Les animaux seront hebergés en milieu enrichi (social et environnemental) afin de respecter au mieux leur confort et leur niveau de stress. Les tests comportementaux à la douleur seront réduits au minimum (fréquence et intensité des tests) et réalisés selon des protocoles expérimentaux établis et acceptés par la communauté scientifique de la Recherche sur la douleur. Les expérimentations seront réalisées au sein d'une plateforme d'imagerie ayant une expérience reconnue dans les approches décrites dans ce projet. Aucun des modèles de douleurs décrits dans ce projet n'induit de déficit locomoteur sévère pouvant influer sur les besoins physiologiques de l'animal.

Choix des espèces

L'utilisation du manganèse est proscrite chez l'homme nécessitant de faire cette étude chez l'animal, nous utiliserons le modèle souris en lien avec les données préliminaires obtenues au laboratoire. Nous utiliserons des souris adultes pour comparaison avec les autres données de la littérature

792 souris vont être utilisées, toutes tuées au quatorzième jour pour examens histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit sept injections intrapéritonéales d'anticorps humains, subit un test d'effort, deux microprélèvements sanguins sous anesthésie et une opération du mollet destinée à mesurer la perte de tonus musculaire. La maladie est provoquée par transfert d'autoanticorps prélevés chez des patients atteints de myopathie nécrosante auto-immune, et le porteur souligne que les souris malades ne montrent aucun signe visible, la faiblesse n'étant détectable qu'à l'appareil de mesure. Le compte de 792 découle du protocole retenu, 22 souris rendues malades et 22 témoins par modèle, appliqué aux neuf molécules candidates.

Objectifs

L'objectif de notre projet est de développer de nouveaux anticorps thérapeutiques permettant de soigner des pathologies autoimmunes du muscle. Celles-ci sont dues à un dérèglement du système de défense du corps impliquant des protéines . Il est donc important de neutraliser l'attaque du système immunitaire contre ces deux constituants pour relancer la fabrication de fibres musculaires solides et saines. Dans le cadre du remplacement, les premiers tests ont été effectué sur des modèles in-vitro. Cette approche nous a permis de sélectionner 9 molécules présentant un intérêt thérapeutique dans cette maladie. Aujourd’hui, nous devons confirmer l’aspect préventif et/ou curatif de ces nouvelles biomolécules dans nos modèles murins de la pathologie. Seul un organisme vivant "complet" permettant d'évaluer la bio-distribution, la pharmacocinétique et les interactions du système immunitaire est capable de répondre à nos questions et de montrer l'efficacité de nos traitements.

Bénéfices attendus

L'objectif de notre projet est de développer de nouveaux bio-médicaments permettant de soigner les pathologies autoimmunes du muscle.

Procédures

Chaque animal subira : 7 Injections intra-péritonéales d'anticorps humain d’une durée de 30 secondes chacune, 1 test d'effort d’une durée de 1 à 2 minutes et enfin 1 intervention chirurgicale pour l'évaluation de la perte du tonus musculaire au niveau du gastrocnémien d’une durée maximum de 10 minutes. Les animaux seront soumis à 2 microprélèvements de sang (J0 et J7), prélèvements sous anesthésie, durée de l'acte moins de 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les souris présenteront une perte de force musculaire symptomatique de la maladie. Dans de rare cas une fonte musculaire et donc une perte de poids seront observées.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie jusqu'à j14 où ils seront mis à mort pour examens histologiques.

Remplacement

Dans le cadre du remplacement les premiers tests ont été effectué sur des modèles in-vitro de fibres isolées, d’organoïdes ou de myoblastes en culture. Cette approche nous a permis de sélectionner 9 molécules présentant un intérêt thérapeutique dans les MNAI. Aujourd’hui nous devons confirmer l’aspect préventif et ou curatif de ces nouvelles biomolécules dans nos modèles murins de MNAI. Seul un organisme vivant "complet" permettant d'évaluer la bio-distribution, la pharmacocinétique et les interactions du système immunitaire est capable de répondre à nos questions et de montrer l'efficacité de nos traitements.

Réduction

Nos modèles de maladies du muscle expérimentales chez la souris ont été optimisés et calibrés. Par expérience nous savons qu’il faut utiliser 22 animaux induits et 22 animaux témoins pour obtenir un résultat significatif et fiable pour chaque modèle de maladies du muscle. Les résultats obtenus seront analysés statistiquement . Dans le but de réduire au maximum les animaux utilisés pour chacune de nos 9 molécules d’intérêt thérapeutique nous commencerons le test par le pouvoir préventif dans l’induction de maladies du muscle. En cas d’échec la capacité curative ne sera pas testée. En effet, selon le principe de fonctionnement de nos molécules, notre expertise nous permet de prévoir qu'il n'y aura pas d'effet thérapeutique.

Raffinement

Dans le cadre du raffinement, notre unité a développé deux modèles de maladies du muscle expérimentales modérées en utilisant des autoanticorps issus de patients . La maladie se développe en 7 jours et présente des atteintes modérées au niveau des muscles squelettiques. Les animaux malades ne présentent aucun signe visible de la maladie et nécessite l’utilisation d’appareils de mesure de force non invasif pour détecter la maladie . Pour étudier l’aspect préventif de nos molécules les animaux seront traités à J-1 avant l’induction et la perte de force musculaire sera évaluée à J7 et J14. Pour l’effet curatif les animaux seront traités à J7 post induction et la force sera évaluée à J7 post traitement. La durée de la pathologie ne sera donc que de 7 jours afin de limiter au maximum tout inconfort de l’animal. Les animaux seront hébergés par groupe de 4 dans des cages adaptées avec un enrichissement à base de nids cartonnés et de tampons de ouate. De la nourriture sous forme de bouillie sera distribuée en plus des granulés afin de soulager toute atteinte des muscles masticateurs. Une surveillance quotidienne basée sur le grimace scale sera effectuée du début à la fin de l’expérimentation. Le grimace scale est un système d’évaluation de l’état de stress d’inconfort et de la douleur ressentie pour chaque espèce animale. Il est basé sur l’observation de 5 critères : Contraction orbitaire, gonflement du nez, gonflement des joues, position des oreilles et position des moustaches. Pour chaque item un score de 0 à deux est appliqué en fonction de l’état. Il permet d’obtenir des scores cliniques chiffrés. Au delà de 4 les animaux concernés seront sortis de l'étude et mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie profonde. Un analgésique sera administré 30 minutes avant la mesure de la force musculaire in situ (injection en sous-cutané).

Choix des espèces

La souris est un animal de choix pour l’étude des maladies auto-immunes. Les lignées établies en consanguinités permettent d’obtenir des modèles de pathologies calibrées et reproductibles. De plus un nombre important d’outils tel que les anticorps dirigés contre les différents marqueurs de populations hématopoïétiques nous permettent de « décortiquer » les phénomènes immunologiques qui interviennent dans la maladie. De plus nous avons développé depuis peu un modèle murin standardisé et optimisé de maladies du muscle par transfère d’autoanticorps issus de patients. Les souris seront agées de 8 à 10 semaines (en début de protocole) pour posséder un systême immunitaire complet et pleinement actif.