Recherche fondamentale

Toutes tuées à l'issue, 1 560 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont une perfusion intracardiaque terminale. Les interventions comprennent des injections intracrâniennes de 25 minutes, la pose de canules et de pompes osmotiques sous la peau, puis des tests de mémoire épisodique, contextuelle et spatiale, ce dernier répété quatre fois par jour pendant neuf jours. L'objet déclaré est le lien entre le déclin de certains facteurs de croissance avec l'âge et la baisse des performances de mémoire, étudié sur des souris de 3 et de 16 mois. Le porteur justifie le sort des animaux en une ligne : ils seront mis à mort "selon le respect des 3R".

Objectifs

L'objectif de ce projet est de mettre en évidence et de caractériser le rôle des hormones au niveau des processus de mémorisation du cerveau et de déterminer un lien possible entre le déclin de des facteurs de croissance observe avec l'âge et la diminution des performances de mémoire au cours du vieillissement. Tout comme l’homme, les souris possèdent également ces récepteurs et hormones d’intérêt que nous pouvons suivre et étudier au cours de leur vieillissement.

Bénéfices attendus

En résumé, ce projet pourrait permettre de conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ou préventif pour ralentir et limiter les issues du vieillissement.

Procédures

- Injections intrapéritonéales et/ou sous cutanées. - Injections des hormones par pousse seringue (durée 2 min) - Contention (max = 2 min). - Procédures chirurgicales : injections intracraniennes (25 min par souris) ; pose de canules (10 min par souris); pose de pompes osmotiques sous-cutanée (10 min par souris). - Tests comportementaux : mémoire épisodique : test sur 15 minutes ; mémoire contextuel : test sur 4 minutes ; mémoire spatiale test sur 4 x 2minutes par jour sur 9 jours. - Perfusion intracardiaque.

Impact sur les animaux

Les différentes injections sous cutanées ou intrapéritonéales peuvent induire un stress et une douleur légère de courtes durées. Lors de l’intervention chirurgicale (25 minutes par souris), l’anesthésie conduit à des modifications physiologiques transitoire de l’animal. La mise en cadre stéréotaxique entraine une compression légère et temporaire des tissus cutanés le temps de l’intervention chirurgicale. La perforation et l’ouverture du plan cutané entrainera une nuisance directe de cet acte le temps de la cicatrisation des tissus osseux et cutanés d’une durée de plusieurs jours. Suite à la chirurgie, les plaies chirurgicales peuvent présenter des signes d'infections ou d'inflammation. La pose de pompes osmotiques et de canules d'administrations locales peut entrainer une gêne légère et nécessitera un temps d'adaptation pour les souris. Pour les administrations locales, la contention de l'animal peut générer également un stress transitoire. Lors des tests comportementaux, des changements d’environnement peuvent générer un stress temporaire et très modéré de courtes durées mais nécessaires à la stimulation des processus physiologiques de mémorisation.

Devenir

Les animaux seront mis à mort selon le respect des 3R

Remplacement

Une veille bibliographique a été réalisée pour ce contexte scientifique. A ce jour, il n’existe pas dans la littérature de modèle de remplacement pour étudier le comportement animal. Pour réaliser les tests de comportement, nous devons utiliser des modèles in vivo.

Réduction

Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques après la mise à mort, de biologie cellulaire et moléculaire afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Le nombre de souris par groupe se composeront de 20 souris car pendant les tests de comportement les variabilités inter individuelles sont importantes. Cet effectif pour chacun des groupes a été déterminé afin de pouvoir réaliser une analyse statistique.

Raffinement

La chirurgie sera faite une semaine après la période d'acclimatation des animaux aux conditions d'hébergement, sous anesthésie générale profonde pour éviter toute douleur et des antalgiques sont prévus en pré et post-opératoire. Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cages groupées par 5 individus dans un milieu enrichi pour réaliser une nidification à façonner (matière fibres végétales). Les souris seront sous surveillance journalière et des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.

Choix des espèces

L'objectif de ce projet est de mettre en évidence et de caractériser le rôle des facteurs de croissance au niveau des processus de mémorisation du cerveau et de déterminer un lien possible entre le déclin de des facteurs de croissance observé avec l'âge et la diminution des performances cognitives au cours du vieillissement. Le projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, des explorations fonctionnelles et comportementales sur animal vigile qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro. Des animaux âgés de 3 mois (jeune adulte) et de 16 mois (adulte âgé) seront utilisé pour ce projet axé sur le vieillissement. La souris constitue un excellent modèle pour ce projet : -Les gènes d'intérêt sont exprimés dans le cerveau de la souris comme dans celui de l'homme ; - Nous disposons de nombreux outils spécifiques de la souris ; -La durée de vie des souris et leur capacité reproductive sont particulièrement adaptées à ce projet.

Pour tester deux molécules censées prévenir les troubles du rythme cardiaque, 288 souris porteuses d'une mutation provoquant une cardiomyopathie dilatée vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit sept gavages, douze échocardiographies sous anesthésie, six électrocardiogrammes sur animal vigile et trois prises de sang, entre l'âge de 28 jours et 7 mois. Le porteur décrit un phénotype qui débute à 4 mois par une cardiomyopathie légère, évolue vers l'insuffisance cardiaque à 7 mois et s'accompagne d'une cyphose et d'une perte de poids d'environ 20 %. Aucun point limite intermédiaire n'interrompt cette évolution, les souris étant mises à mort systématiquement à 7 mois pour prélever leurs organes.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de décès dans le monde avec près de 18 millions de morts chaque année et constituent des facteurs de comorbidité pour de nombreuses autres maladies. Malgré l’amélioration des méthodes de diagnostic, de la prise en charge des personnes et de la prévention sur les facteurs de risques tels que la consommation de tabac, les maladies cardiovasculaires restent un groupe d’affections fortement mortelles. Parmi les maladies cardiovasculaires, les cardiomyopathies sont des atteintes du muscle cardiaque qui causent des dysfonctionnements électriques et/ou mécaniques. Parmi les maladies cardiovasculaires, la cardiomyopathie dilatée se caractérise par une augmentation de la masse du coeur, une dilatation des ventricules et une augmentation de la fibrose interstitielle. Avec une incidence estimée supérieure à 1 pour 2500 individus, les principales causes de mortalité de la cardiomyopathie dilatée sont l’insuffisance cardiaque (70 pour cent) et les arythmies cardiaques (30 pour cent). Le but de ce projet est de tester un traitement pharmacologique préventif des arythmies cardiaques. L'inhibition d’une enzyme impliquée dans développement du cœur, prévient la cardiomyopathie dilatée. Bien que ce traitement ait un effet bénéfique sur le remodelage cardiaque, son impact sur les arythmies et les défauts de conduction reste à étudier. Nous supposons qu'un traitement avec un inhibiteur de lenzyme d'interet agirait à la fois sur les défauts de conductions directs et sur ceux induits par la fibrose. Nous proposons dans ce projet de traiter un modèle murin de cardiomyopathie dilaté avec deux molécules inhibitrices de l'enzyme concernée et d’en étudier l’impact, sur la fonction cardiaque, remodelage et activité électrique, in-vivo. Nous étudierons aussi l’impact du traitement sur les voies de signalisations moléculaires et cellulaires qui participent à l’apparition des défauts de conductions et des arythmies associés la cardiomyopathie dilatée.

Bénéfices attendus

Les données générées par ce projet collaboratif contribueront à une meilleure compréhension de la pathogenèse de la cardiomyopathie dilatée. Ces résultats seront utilisés comme une preuve de principe qui permettra de proposer un essai clinique pour les jeunes patients. Étant donné que la cardiomyopathie dilatée partage de nombreuses caractéristiques communes avec d'autres cardiomyopathies à l'éthologie différente, nos résultats ouvriront des perspectives thérapeutiques pharmacologiques pour traiter celles ci.

Procédures

Les animaux subiront 6 interventions différentes. 1. Un gavage sur une période de 3 semaines. Les molécules thérapeutiques sont diluées dans l’eau de boisson. Elles sont bien tolérées par l’organisme et n’entrainent pas d’effets indésirables à la concentration fixée dans ce protocole. Les animaux seront traités 7 fois, de 28 jours à 49 jours d'âge. Chaque intervention dure une trentaine de seconde. 2. Une échocardiographie sous anesthésie gazeuse. Les animaux seront suivis tous les 15 jours à partir de 2 mois jusqu’a 7 mois, soit un total de 12 échocardiographies par animal. Chaque intervention dure entre 5 et 10 minutes. 3. Un électrocardiogramme sur animaux vigiles. Chaque animal sera évalué de 2 mois à 7 mois tous les mois, soit un total de 6 électrocardiogrammes par animal. Chaque intervention dure entre 2 et 4 minutes. 4. Un électrocardiogramme sous anesthésie gazeuse. L’intervention est réalisée une fois et dure 10 minutes. 5. Un prélèvement sanguin. Les animaux seront prélevés trois fois à un moi d’intervalle. L’intervention dure environ 2 minutes. 6. Une chirurgie sous anesthésie. 50 pourcent des animaux subiront une fois cette chirurgie, soit un prélèvement d’organe sous anesthésie et analgésie. 50 pourcent des animaux subiront une fois ce prélèvement.

Impact sur les animaux

Le phénotype dommageable des souris débute à 4 mois avec l’apparition progressive d’une cardiomyopathie dilatée d’abord légère et qui évolue vers 7 mois en insuffisance cardiaque. Cette progression de l’atteinte cardiaque est corrélée à une atteinte progressive et moins sévère des muscles squelettique de type oxydatif, l’apparition d’une cyphose légère et une perte de poids d’environ 20 pour cent par rapport au poids de l’animale à 4 mois (environ 20g). Ce phénotype réduit l’espérance de vie des animaux. L’ensemble des procédures liées à ce projet peuvent générées un stress lié à la manipulation de l’animal. De plus certaines de ces procédures peuvent engendrées de légères irritations, des lésions et des hémorragies avec risque d’infection. Les procédures avec anesthésie comportent un risque de stress thermique (refroidissement de la température de l’animal) et dans de rares cas de détresse respiratoire. La chirurgie peut induire une douleur et des risques d'infection.

Devenir

Tous les animaux (n = 288) seront euthanasiés pour prélèvement d’organe à 7 mois. Le prélèvement d'organe est indispensable pour étudier les mécanismes moléculaires mis en jeu au cours de l'expérimentation.

Remplacement

Les études précliniques nécessitent une validation sur des modèles animaux qui ne peut pas être remplacée par des modèles cellulaires. De plus, les cardiomyocytes (cellules cardiaques) adultes ayant atteint un état de différenciation terminale ne se divise pas. Il est par conséquent impossible d’en dériver une lignée cellulaire stable. Bien qu’il existe des lignées cellulaires, celles ci ne récapitulent la physiologie d’un cœur que partiellement. Elles seront toutefois utilisées pour tester certaine de nos hypothèses qui ne nécessitent pas de modèle animal. D'autre part, aucun modèle cellulaire ne reproduit les conditions physiologiques spécifiques du cardiomyocyte, ni récapitule dans son ensemble les caractéristiques d’un cœur entier dans son environnement physiologique.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous utiliserons les contrôles les mieux adaptés. Nous utiliserons les données acquises sur tous les animaux : mâles et femelles, commerciaux et atteints de cardiomyopathie dilatée. Les fonds génétiques des animaux commerciaux et transgéniques sont identiques. La lignée développant la cardiomyopathie dilatée produisant exclusivement des animaux homozygotes mutés, les animaux commerciaux seront achetés auprès d’un fournisseur agréé. Pour n’utiliser que le nombre d’animaux nécessaire à ce projet (288), nous avons recourt au service d’un biostatisticien pour nous épauler dans l’élaboration de notre plan expérimental.

Raffinement

Les animaux seront observés tous les jours par les membres qualifiés de l'animalerie et tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne responsable du projet. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, 6 par cage maximum. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire au maximum toute douleur, souffrance ou angoisse que pourraient subir les animaux: enrichissement du milieu (lanières de papier Kraft, maisons en carton), acclimatation d'une semaine avant toute manipulation, hébergement en groupe, formation technique des utilisateurs. Afin de diminuer la douleur et le stress des animaux, une analgésie et/ou une anesthésie sera réalisée pour les procédures le nécessitant. L’isolement des animaux est évité au maximum, cependant il est possible que certains animaux se retrouvent isolés de manière imprévue (seul mâle d’une portée, animal arrivé seul d’un fournisseur, agression entre congénères, dernier animal dans la cage…). Dans ce cas, l’animal bénéficiera d’un enrichissement supplémentaire dans sa cage. Le modèle murin de cardiomyopathie à un phénotype dommageable. Le phénotype dommageable débute à 4 mois avec l’apparition progressive d’une cardiomyopathie dilatée d’abord légère et qui évolue vers 7 mois en insuffisance cardiaque. Cette progression de l’atteinte cardiaque est corrélée à une atteinte progressive et moins sévère des muscles squelettique, l’apparition d’une cyphose légère et une perte de poids d’environ 20 pour cent par rapport au poids de l’animale à 4 mois (environ 20g). Ce phénotype réduit l’espérance de vie des animaux. Afin de réduire la contrainte liée au phénotype dommageable, une fiche de scoring est utilisée pour suivre l’évolution du phénotype et les animaux sont mise à mort systématiquement à l’âge de 7 mois.

Choix des espèces

La souris est l’animal choisi pour ce projet en raison des similitudes de son système cardiovasculaire avec celui des humains et de l’existence d’une lignée génétiquement modifiée portant une mutation responsable à l’état homozygote de cardiomyopathie dilatée chez l’humain. De plus, la souris est le modèle animal le plus utilisé dans ce champ de recherche, permettant ainsi des comparaisons avec d’autres études ou d’utiliser les résultats d’autres études afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Pour les traitements, les animaux seront utilisés à 28 jours (âge auquel les animaux passe à une alimentation entièrement solide). Pour obtenir un effet optimum, l’âge de début du traitement doit être le plus précoce possible. Pour l’exploration fonctionnelle du cœur, les animaux sont utilisés entre 2 et 7 mois.

Trois prélèvements de sang dans le sinus rétro-orbitaire, onze mesures de tumeur, trois injections dans la veine de la queue en tube de contention et trois sessions de mesure de l'haleine de 30 à 60 minutes : 63 souris athymiques nude vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trente-neuf d'entre elles reçoivent en plus une greffe sous-cutanée de cellules cancéreuses du col de l'utérus. Le projet teste un promédicament censé libérer un anticancéreux dans la tumeur et, du même coup, une molécule volatile expirée dans l'haleine qui signalerait que le traitement agit. Le porteur écrit que ces souris immunodéprimées ont un phénotype dommageable, tout en affirmant que les conditions d'hébergement empêchent ce phénotype de s'exprimer.

Objectifs

Le cancer représente un problème de santé publique mondial et les outils thérapeutiques actuels ne permettent pas encore d’éradiquer sélectivement et efficacement les tumeurs solides. De plus, il est difficile de suivre l’efficacité d’une molécule anticancéreuse en temps réel, quel que soit la nature du cancer traité. La conception de molécules capables de traiter cette pathologie tout en émettant un signal témoignant de l’efficacité du traitement représente une alternative extrêmement prometteuse. Dans ce projet, nous souhaiterions introduire un nouveau concept qui repose sur un système d’administration d’un promédicament appelé le vecteur 1. Ce dernier est capable de se lier avec certaines molécules du sang de manière stable et il sera sélectivement activé par une enzyme présente en concentration élevée dans l’environnement de la plupart des tumeurs solides, libérant l’agent anticancéreux. L’agent anticancéreux libéré pénètre dans les cellules tumorales pour exercer son effet cytotoxique alors que la substance volatile est exhalée dans l’haleine des animaux. La mesure de la molécule volatile dans l’haleine et le sang des animaux traités pourrait constituer un traceur attestant la libération de l’agent anticancéreux. Afin de connaître le potentiel thérapeutique du vecteur 1, il est nécessaire d’évaluer ce concept sur des modèles animaux sains ou des individus ayant subi une greffe de cellules tumorales. Les modèles animaux sont indispensables à l’application de notre étude car la méthode de détection des substances volatiles dans l’haleine et le sang témoignant de l’efficacité de l’agent anticancéreux n’a nul équivalent in vitro ou in silico. La mesure simultanée du sulfure de carbonyle et une corrélation positive dans l’air expiré et dans le sang permettra de vérifier qu’une augmentation de sulfure de carbonyle libérée dans l’un ou l’autre compartiment est bien liée à l’activation de l’agent anticancéreux. Nous émettons l’hypothèse que l’administration intraveineuse du vecteur 1 permettra (1) le traitement sélectif des tumeurs grâce à la libération intratumorale de l’agent anticancéreux et (2) l’évaluation de l’efficacité du traitement au cours du temps par mesure des niveaux de molécules volatiles dans l’haleine et le sang des animaux. Ces deux aspects devraient uniquement être détectés chez les souris malades possédant un environnement tumoral riche en enzyme retrouvée autour de la plupart des tumeurs solides et absents chez les souris saines.

Bénéfices attendus

Notre étude menée in vivo démontrera à court terme que le suivi de la molécule volatile dans l'haleine et le sang des animaux permettra (1) la discrimination des souris porteuses de tumeurs par rapport aux individus sains, (2) la preuve de l'activation des vecteurs dans les tumeurs par l’enzyme retrouvée dans l’environnement de la plupart des tumeurs solides, (3) la prédiction de l'efficacité du traitement anticancéreux et (4) l'identification des animaux guéris ainsi que ceux avec une tumeur résiduelle tout au long du protocole thérapeutique avec le vecteur 1. Notre étude pourrait être profitable dans le domaine de la santé humaine car la molécule volatile ainsi que l’enzyme intratumorale étudiées dans ce projet constitueront des traceurs caractéristiques de l'état de santé du patient ce qui offrira de nombreux avantages. Ainsi, il sera possible de (1) suivre et d’expliquer les variations des niveaux de substance volatile présente dans l’air expiré des patients et dans la circulation sanguine en fonction du stade d’évolution de la maladie et (2) le concept global sera également étudié à des fins pronostiques.

Procédures

Une injection sous cutanée de cellules tumorales (J0) et 11 mesures de masses tumorales (2 fois par semaine) et 3 prélèvements sanguins seront réalisées sur les animaux greffés (39 souris) sous anesthésie gazeuse avec une durée de 5 min par acte. De plus, la pose d’une bague sur l’oreille (pour l’identification des souris) sera réalisée sur tous les lots d’animaux (63 souris) sous anesthésie gazeuse avec une durée de 5 min par acte. La totalité des animaux vigiles (63 souris) seront pesés 2 fois par semaine avec une durée de moins de 1 min par pesée. De plus, 3 injections intraveineuses dans la veine de la queue seront réalisées sur tous les lots d’animaux vigiles (63 souris) sous anesthésie locale dans des tubes de contention avec une durée de 5 min par acte. La substance volatile retrouvée dans l’haleine des animaux sera mesurée pendant 30 à 60 min 3 fois sur tous les animaux vigiles (63 souris) au cours de l’étude.

Impact sur les animaux

Les souris athymic nude immunodéprimées ont un phénotype dommageable. Néanmoins, les conditions d’hébergement de notre animalerie sont adaptées et compatibles pour le maintien de ces animaux génétiquement modifiés, ce qui permet que le phénotype dommageable ne s’exprime pas. La protubérance de la tumeur sous- cutanée peut être responsable d’une légère gêne dans la locomotion des animaux greffés. Les données récoltées au cours des précédentes études in vivo menées dans le laboratoire révèlent que la greffe de cellules tumorales du col de l’utérus n’entraîne aucune perte de poids chez les animaux. De plus, l’anesthésie gazeuse nécessaire lors de la greffe, des prélèvements sanguins et des mesures de la masse tumorale peut entraîner un stress léger et transitoire au cours du réveil des animaux. Les prélèvements sanguins peuvent provoquer un stress passager et des lésions potentielles du système veineux rétro-orbitaire qui sera réduit par la réalisation du geste sous anesthésie gazeuse et après application d’un anesthésiant local oculaire (tétracaïne 1%) avant le geste et ils seront espacés de 7 jours en alternant l’œil prélevé, permettant 15 jours de repos pour chaque œil. La pesée des animaux vigiles peut également engendrer un léger stress transitoire mais ce dernier n’est pas une nuisance car les animaux vont s’habituer aux manipulateurs pendant 15 jours avant le début de l’étude. Les injections vigiles seront réalisées en utilisant des tubes de contention ce qui pourra entraîner un stress passager pour les animaux. Néanmoins, les injections dureront 3 à 5 min, elles seront espacées au minimum de 7 jours et elles seront réalisées dans la veine de la queue en présence d’un anesthésique local (lidocaïne à 2%).

Devenir

Mise à mort sous anesthésie gazeuse pour prélèvements tissulaires et analyses histologiques.

Remplacement

Nous avons déjà réalisé tous les tests in vitro indispensables à la validation du concept en mesurant la réponse des cellules cancéreuses du col de l’utérus (cellules KB) au vecteur 1. En effet, nous avons stimulé ces cellules avec des doses croissantes de vecteur 1 et les résultats démontrent une baisse importante de la survie des cellules cancéreuses proportionnelle à la concentration de vecteur utilisée. De plus, nous avons pu détecter la présence de la molécule volatile en utilisant une fibre sur des cellules cancéreuses stimulées avec le vecteur 1. Enfin, nous avons identifié la présence de l’agent anticancéreux dans les cellules tumorales lorsque ces dernières sont en présence du vecteur 1. A présent, les expériences in vivo sur souris sont indispensables à la réalisation de notre projet scientifique. En effet, il n’existe pas de test in vivo ou in silico pour confirmer l’action de ce médicament « nouvelle génération ».

Réduction

Certaines études antérieures confirment que les vecteurs sensibles aux enzymes sont stables et non toxiques lorsqu’ils sont dans le sang. De plus, ils sont sélectivement ciblés au contact de l'enzyme retrouvée dans l'environnement de la plupart des tumeurs solides pour permettre la libération des agents anticancéreux. Il n’est donc pas nécessaire de réaliser une étude de toxicité en amont ni d’augmenter le nombre d’animaux nécessaires dans ce projet. Les données recueillies lors de ces précédentes expériences ont été utilisées pour affiner au mieux les procédures expérimentales. La « Règle des 3R » établie par Russel et Burch a été prise en compte et un test statistique a été réalisé afin de réduire au maximum le nombre d'animaux nécessaires à l'expérimentation, tout en assurant un nombre suffisant pour une étude optimale dans le but d’éviter de reproduire ces expériences.

Raffinement

Les souris athymic nude sont des animaux possédant un système immunitaire déficient. Les conditions d’hébergement contrôlées de l’animalerie sont compatibles et adaptées pour le maintien du statut sanitaire de ces animaux immunodéprimés, ce qui va permettre la non expression du phénotype dommageable. De plus, les actes chirurgicaux effectués sur les souris seront réalisés en conditions stériles pour éviter toute contamination. Les souris seront hébergées dans un environnement de température et d’hygrométrie répondant à la réglementation afin de s'assurer du bien-être des animaux tout au long de l’étude. Pour satisfaire leurs interactions sociales, elles seront maintenues en groupe de 5 individus par cage ventilée (500 cm²) dans un milieu enrichi avec des structures (nids...) et des outils adaptés (jouets, rognage de matériaux) afin de satisfaire leurs exigences comportementales. Avant de débuter les expérimentations, une période d’acclimatation de 15 jours permettra d’habituer les animaux aux expérimentateurs et au matériel. La fibre nécessaire à la mesure de la molécule volatile sera située en hauteur dans la cage et elle sera non invasive pour les animaux. Au cours de ce projet, la majorité des actes effectués sur les animaux (implantation des cellules cancéreuses, pose de la bague d’identification à l’oreille, mesure de la masse tumorale, prélèvements sanguins) seront réalisés sous anesthésie gazeuse en condition de température contrôlée (tapis chauffant) afin de réduire au maximum le stress et la douleur ressentis par les animaux. De plus, pour les prélèvements sanguins, un anesthésiant local oculaire sera administré en plus de l’anesthésie gazeuse pour limiter la douleur et ils seront espacés de 7 jours en alternant l’œil prélevé, permettant 15 jours de repos pour chaque œil. Les injections seront réalisées sur les animaux vigiles (veine de la queue) sous anesthésie locale pour minimiser la douleur. En effet, certains tests ont montré que le gaz utilisé lors de l’anesthésie perturbe les mesures de molécules volatiles. Tout au long de l’étude, l’état de chacun des animaux et leur comportement seront scrupuleusement vérifiés lors de visites quotidiennes en se référant à une grille d’évaluation des signes cliniques gradés établie pour chacun des individus permettant de définir des points limites suffisamment précoces pour prendre en charge l’apparition de signes de souffrance et de mal-être.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler avec l’espèce souris car le développement tumoral est rapide et bien caractérisé chez ces animaux. Nous avons choisi de travailler avec le modèle des souris athymic nude car ces animaux se caractérisent par la présence d’une mutation qui engendre une déficience immunitaire, ce qui permet de limiter les réactions de rejet lors de la greffe des cellules tumorales. De plus, c’est un modèle de choix pour ce projet car d’après les résultats obtenus précédemment, ces souris immunodéprimées expriment des concentrations élevées d’enzyme retrouvée dans l’environnement de la plupart des tumeurs solides qui est indispensable à l’activation du promédicament (vecteur 1). Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines que nous allons acclimater aux manipulateurs et au matériel qui sera utilisé lors des expérimentations pendant 15 jours supplémentaires dans l’animalerie. Dans ces conditions et à cet âge de 10 semaines, les animaux auront fini leur croissance et se seront remis du stress du transport permettant ainsi d’avoir un poids stable qui est un critère important témoignant de leur état de santé.

316 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection de cellules tumorales pancréatiques leur donne des métastases au pancréas, aux poumons et au foie, avant jusqu'à neuf scanners sous anesthésie, quatre prises de sang et trois injections intraveineuses sur animal vigile. Le porteur signale une possible insuffisance respiratoire ou hépatique liée aux métastases, ainsi qu'une irritation de l'œil après prélèvement rétro-orbitaire. Sur le remplacement, il écrit que seul un modèle vivant reproduit la complexité de la réponse immunitaire antitumorale et conclut au caractère "nécessaire" du recours aux animaux non-humains.

Objectifs

D’un point de vue épidémiologique, le cancer du pancréas est projeté pour devenir, d’ici à 2040, la 4ème cause de décès par cancer. La majorité des patients présentent donc des pathologies avancées ou avec progression métastatique au moment du diagnostic. La survie globale à 5 ans des patients est inférieure à 10%. La plupart des approches thérapeutiques actuellement disponibles ciblent directement les cellules tumorales. Or d’un point de vue clinique, les cellules tumorales sont entourées par un tissu très dense appelé stroma tumoral, dont l’impact a été sous-évalué. Récemment, la présence de ce stroma massif a émergé en tant qu’acteur et contributeur à la fois à l’initiation et à la progression tumorale. Notre hypothèse est que le remodelage du stroma pourrait représenter une nouvelle opportunité thérapeutique dans le cadre du cancer du pancréas métastatique. Les objectifs de notre étude sont donc les suivants (1) Évaluer la croissance tumorale, caractériser le stroma tumoral et l’infiltrat immunitaire dans deux modèles murins métastatiques (2) Évaluer le potentiel thérapeutique d’une combinaison d’anticorps dans ces modèles métastatiques.

Bénéfices attendus

A court terme, les bénéfices du projet sont multiples : (1) Élucider les mécanismes impliqués dans la formation et le maintien du stroma tumoral dans le cancer du pancréas (2) Démontrer le remodelage du stroma tumoral via l’utilisation d’anticorps thérapeutiques (3) Proposer une nouvelle opportunité thérapeutique dans les cas de cancer du pancréas métastatique en démontrant l’impact du remodelage du stroma dans la prévention des mécanismes d’échappement. A long terme, les objectifs de ce projet ont pour but de conduire au développement de nouvelles thérapies dans le contexte préclinique et clinique appliqué à l’immuno-oncologie. En effet, le développement de modèles murins pour le cancer du pancréas en préclinique permet une meilleure représentativité de la pathologie en clinique et ainsi favorise la transposition d’informations scientifiques entre la préclinique et la clinique.

Procédures

Les animaux pourront subir le(s) effet(s) indésirable(s) suivant(s) : - Injection de cellules tumorales induisant des métastases pouvant entraîner une atteinte des organes cibles (pancréas, poumons, foie) - Prélèvements sanguins, sous anesthésie (durée maximale 2 minutes, une fois par semaine, 4 répétitions maximum) - Examens d’imagerie (scanner), sous anesthésie (durée maximale de 10 minutes, une fois par semaine, 9 répétitions maximum) -Injection intra-veineuse sur animaux vigiles (durée maximale 2 minutes, une fois par semaine, 3 répétitions maximum)

Impact sur les animaux

Les deux anticorps thérapeutiques, déjà utilisés dans de précédents protocoles pour d’autres types tumoraux n’induisent pas d’effet secondaires indésirables. Les nuisances attendues sont l’apparition de métastases pouvant induire une insuffisance respiratoire ou hépatique. Le prélèvement rétro-orbitaire pourra aussi provoquer une irritation de l’œil.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les organes cibles pour analyses histologiques et moléculaires

Remplacement

Seul un modèle in vivo chez l’animal peut permettre d’étudier la capacité tumorigénique et l’impact de traitements. En parallèle des analyses complémentaires seront réalisées in vitro à l’aide de lignées de cancer du pancréas métastatique. Cependant, ces modèles ont des limites et ne permettent pas de reproduire la complexité de la réponse immunitaire antitumorale observée in vivo, c’est pourquoi le recours aux modèles animaux est nécessaire dans notre projet.

Réduction

Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet a été calculé au minimum pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles.

Raffinement

La bonne connaissance des modèles expérimentaux, le suivi adapté de points limites précoces et clairement définis, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum toute douleur ou souffrance des animaux. Dans le cadre du présent projet l'apparition de signes généraux (par exemple : difficultés respiratoires, hypothermie, perte de poids >20% du poids maximal) constituent des points limites qui conduirais à la mise à mort afin de limiter toute souffrance des animaux. Nous évaluerons l’état de bien être ou de souffrance des animaux au minimum 2x/semaine.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour l’étude du cancer du pancréas. Bien qu’il existe des différences entre l’immunologie murine et humaine, de nombreuses découvertes effectuées chez la souris sont transposables chez l’homme. Dans le cadre de ce projet, des souris âgées entre 6 et 7 semaines seront utilisés car ce stade de développement est standard pour les études visant à comprendre des mécanismes au niveau du système immunitaire.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune passant cinq semaines seule en cage à cause de la prothèse fixée sur son crâne. Deux interventions chirurgicales, de 45 à 90 minutes puis de 90 à 120 minutes, ouvrent la peau et le crâne pour une injection stéréotaxique et la pose d'une lentille dans le cerveau. Les souris sont ensuite habituées à porter un appareil d'imagerie sur la tête, puis soumises à une tâche d'apprentissage que le porteur qualifie de légèrement désagréable. L'étude vise la compréhension des mécanismes de la mémoire, les retombées annoncées pour Alzheimer ou Parkinson étant renvoyées à un "à terme" sans échéance.

Objectifs

La mémoire est la clé de notre existence. Les mécanismes fondamentaux de la mémoire ont été étudié depuis plusieurs décennies par les neuroscientifiques, mais c’est seulement récemment que la démonstration expérimentale des conséquences physiologiques de l’expérience vécue et de sa rétention sur le cerveau a été possibles. Il a notamment été montré que des groupes de neurones – les cellules constituant le cerveau et briques élémentaires de la cognition – dispersés dans diverses régions cérébrales étaient nécessaires et suffisants pour permettre l’encodage et le rappel de la mémoire. Ces groupes constituent l’engramme. L’objectif global de notre projet est de comprendre les processus d'encodage et de stockage de la mémoire, chez les mammifères. Pour mener ces études, nous souhaitons étudier, en temps réel, l’activité des neurones du cortex préfrontal impliqués dans une tâche d’apprentissage associatif. Nous analyserons, ensuite, l’activité associé aux différentes phases de la tâche, ainsi que la réactivation de ces neurones dans les jours qui suivent la séance d’apprentissage.

Bénéfices attendus

Notre objectif est la compréhension des mécanismes fondamentaux de la mémoire. Néanmoins, leur bonne connaissance nous permettra à terme de mieux comprendre les pathologies qui sont associées à des troubles de la mémoire, comme les maladies neurodégénératives - Alzheimer, Parkinson – ainsi que les pathologies génétiques liées aux déficits cognitifs.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie : la première durera environ 45 à 90 minutes, et la deuxième durera de 90 à 120 minutes. En outre, ils subiront une intervention sous sédation (sans acte invasif) d'une durée d'environ 60 minutes pour la pose d'une prothèse sur la tête. Pour des raisons techniques liées à la présence d'une prothèse, il est nécessaire d'adapter les conditions d'hébergement. Les animaux seront hébergés individuellement pendant une période de 5 semaines, avec des périodes d'échange entre congénères. Les animaux seront progressivement habitués à accepter la pose d'un appareil d'imagerie sur leur tête au cours de séances d'entraînement, dont la durée augmentera progressivement de 2 à 30 minutes. Par la suite, les animaux effectueront une tâche comportementale légèrement désagréable d'environ 30 minutes en présence de l'appareil d'imagerie, qui sera positionné sur leur tête. Le lendemain, ils seront de nouveau exposés à la tâche comportementale, cette fois pendant environ 20 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie : le risque d'inconfort, de douleur modérée de 2 jours, d'infection et/ou de perte de poids est inhérent suite à l'incision de la peau, la craniotomie, l'injection stéréotaxique, l'installation de la lentille GRIN et la réalisation des points de sutures. Ils seront à nouveau endormis, exposant ainsi un risque d'hypothermie ou de problèmes respiratoires temporaires. Ils seront soumis à une tâche comportementale légèrement désagréable et stressante pour l'animal. Ils seront entraînés à porter un appareil d'imagerie sur leur tête, ce qui représente une contrainte pour la posture de l'animal. La pose d'une prothèse implique également une contrainte pour l'animal, ce qui nous obligera à adapter les conditions d'hébergement par le séparateur en plexiglasse.

Devenir

L'ensemble des animaux est euthanasié à la fin de la procédure afin de réaliser des expériences histologiques.

Remplacement

En l’état actuel de nos connaissances, la recherche proposée ne peut pas être substituée par des approches in silico car le projet traite de fonctions cérébrales complexes à la base de la mise en place de la mémoire chez les mammifères. Il n’y a donc aucune alternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques de réseaux sont modifiées dans ces préparations. Déterminer comment les informations cognitives et sensorielles sont traitées exigent que l'animal soit intact.

Réduction

Nous avons réfléchi à notre projet de recherche de façon à réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés. La conception expérimentale soigneuse de notre projet permettra une stratégie de réduction à minima de nombre des animaux nécessaires à l’exploitation statistique des résultats. Pour estimer correctement le nombre d'animaux nécessaires, nous avons sollicité l'avis de deux experts renommés dans le domaine. Dans une optique de réduction, nous avons également prévu des études pilotes permettant l’évaluation de la faisabilité technique de certains aspects de notre étude. Nous avons également intégré une stratégie permettant une évaluation précoce de nos résultats au fur et à mesure dès leur obtention. Cela nous offrira, si nécessaire, la flexibilité de réduire le nombre d'individus requis pour atteindre nos objectifs scientifiques, tout en garantissant la validité et la robustesse de nos conclusions.

Raffinement

i) Surveillance quotidienne. ii) Vérification de l'état de l'animal avant et après chaque expérience ou manipulation. iii) Perfectionnement des procédures chirurgicales pour réduire le risque de douleur ou de souffrance : utilisation d'une crème pour les yeux et d'un tapis chauffant pour maintenir la température de l'animal. Utilisation d'anesthésiques et d'analgésiques pour chaque intervention chirurgicale. Ajout d'un analgésique local à longue durée d'action et d'un anti-inflammatoire lors de la deuxième intervention chirurgicale. iv) Application de soins préventifs après la chirurgie v) Animaux manipulés quotidiennement avant les séances de comportement afin de réduire le niveau de stress. vi) Entraînement à la porte de l'appareil d'imagerie, vii) Utilisation des techniques de manipulation prévu pour réduire le stress de la manipulation viii) Habituation à la salle de comportement, ix) Définition de points limites spécifiques et de mesures conservatrices pour chaque phase de la procédure. x) Mécanismes d'intégration des nouvelles techniques de perfectionnement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de sites éducatifs en bien être animal, consultation d'experts dans le domaine.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des mammifères. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine afin de mieux comprendre l’importance des mécanismes neuronaux sur l’adaptation comportementale. De plus, les modèles génétiques murins sont des modèles d'expérimentation animale de choix pour l’étude du système nerveux en conditions pathologique. Le projet sera réalisé sur des animaux de 6 à 32 semaines d’âge, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.

289 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie crânienne d'une heure trente, puis deux séances d'imagerie cérébrale d'une heure et demie à deux et quatre jours d'intervalle, certaines sur animal éveillé, d'autres sous anesthésie avec un courant électrique appliqué sur la patte. Le laboratoire évalue ainsi des candidats analgésiques non opioïdes qu'il a lui-même développés et dont il indique qu'ils ont déjà montré un effet chez le rat et la souris. La mise à mort est justifiée en ces termes : "dans un objectif de réduction de la douleur et pour le bien être des animaux, ils ne pourront pas être réutilisés".

Objectifs

Face à la crise des opioïdes largement répandue en Amérique du Nord, et qui menace aussi les pays européens, il est devenu essentiel de développer de nouveaux médicaments analgésiques non opioïdes, plus sûrs et sans risques d’addiction. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité de nouveaux candidats-médicaments non addictifs et de mieux comprendre comment ils traitent la douleur. Les candidats- médicaments développés par le laboratoire ont montré un effet antidouleur significatif chez les rats et les souris. Pour renforcer ces résultats, nous utiliserons des techniques d'imagerie cérébrale pour observer les effets de ces médicaments sur le cerveau. Cette imagerie nous permet de visualiser et de comprendre les effets précis de ces molécules. Dans cette étude, nous utiliserons l'imagerie fonctionnelle pour observer la réponse du cerveau après l'administration des candidats-médicaments en les comparant à des analgésiques de référence. Cette méthode nous aide à mieux comprendre comment ces médicaments agissent sur le cerveau et à confirmer leur potentiel en tant que traitements sûrs et efficaces contre la douleur.

Bénéfices attendus

Les candidats médicaments développés par le laboratoire sont des molécules très affines et sélectives pour leur cible. Leur haute affinité les rend actives à faible dose et leur sélectivité limite les effets indésirables. Ces molécules ont montré des activités thérapeutiques très intéressantes lors d’études pré-cliniques. L’imagerie fonctionnelle permettrait d’apporter des informations complémentaires sur les mécanismes pharmacologiques de ces molécules et ainsi mieux comprendre leurs effets thérapeutiques. Dans ce projet nous nous intéresseront à leur effet analgésique et cela pourra aboutir au développement de potentiels nouveaux analgésiques plus sûrs pour les humains.

Procédures

Dans les deux expériences, chaque animal subira une chirurgie préalable (1h30) aux sessions d’imagerie. Cette chirurgie se fera sous anesthésie générale et sera complétée d’une anesthésie locale, d’une analgésie et d’une injection d’anti-inflammatoires. A J+2 et J+4 de cette chirurgie, 2 sessions d’imagerie d’une heure et demie (30 min de préparation + 1 heure d’acquisition) auront lieu. Les sessions d’imagerie se font chez l’animal éveillé libre des ses mouvements dans l'expérience 1 et sous anesthésie au cours de l'expérience 2. Au cours des sessions d’imagerie de l'expérience 2, le candidat-médicament sera injecté en sous-cutané puis un court stimulus sera appliqué par un courant électrique sur la patte de l'animal.

Impact sur les animaux

La chirurgie nécessaire pour préparer l'animal à l'imagerie, peut occasionner une douleur locale ainsi que du stress physique immédiatement après la procédure. Elle peut également conduire à une réduction temporaire de la prise alimentaire due à l'inconfort lors de la mastication et provoquer une perte de poids. De plus, l'implantation d'un dispositif pour l'imagerie éveillée, le cas échéant, peut engendrer une douleur post-opératoire et une gêne. Au cours de l’acquisition d’imagerie, le stimuli électrique appliqué provoquera une douleur courte et transitoire de la patte

Devenir

Dans un objectif de réduction de la douleur et pour le bien être des animaux, ils ne pourront pas être réutilisés. Ils seront donc euthanasiés à la fin de chaque procédure.

Remplacement

L’objectif du protocole est d’étudier la réponse du cerveau à l’effet analgésique d’un candidat médicament. La douleur étant un processus physiologique complexe, il n’existe pas actuellement de modèle in vitro permettant d’étudier l’intégration et le traitement du message nerveux douloureux dans sa globalité.

Réduction

Les analyses seront effectuées avec 8 animaux par condition, afin d’assurer une puissance statistique suffisante. Pour la procédure 1, ce nombre a été augmenté à 9 du fait d’une possible perte des dispositifs de maintien de la sonde. Pour réduire le nombre d’animaux, chaque animal pourra réaliser jusqu’à trois acquisitions d’imagerie

Raffinement

La douleur sera prise en charge à chaque étape de l’expérience (pré, per et post-opératoire) afin d’être minimisée. Les animaux seront suivis quotidiennement à l’aide d’une grille de score permettant dévaluer leur état général selon différents critères (apparence, comportement, poids). En cas de mal-être constaté, des mesures seront prises pour améliorer l’état de l’animal. Le stress sera minimisé grâce à une habituation aux expérimentateurs, un hébergement en groupe et des enrichissements. Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum selon les résultats de tests statistiques. En cas d'atteinte de points limites, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Le rat est une espèce utilisée très régulièrement dans le développement préclinique de médicaments et l’étude physiopathologique du système nerveux central. Les premières études précliniques caractérisant les effets analgésiques du candidat médicament ont été réalisées chez le rat. Dans un souci de reproductibilité, le rat semble donc l’espèce la plus adapté à notre étude . Il s’agit également d’une espèce bien adaptée à la méthode d’imagerie. Les rats seront âgés de 6 semaines (225-250g) à leur arrivée au laboratoire afin d’étudier l’effet des agents pharmacologiques sur des cerveaux pleinement développés.