Recherche fondamentale
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Etude de l’effet de nouvelles molécules sur des modèles murins mimant la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune buvant pendant quatre mois une eau additionnée des molécules testées, puis nageant dans la piscine de Morris quatre fois par jour pendant cinq jours. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger à modéré. S'y ajoutent deux séjours de deux jours et deux nuits en cage individuelle munie d'une roue, pour mesurer l'activité de souris que le porteur décrit comme apathiques. Ces souris portent des mutations qui provoquent un déficit cognitif et des troubles de la mémoire s'aggravant avec l'âge, et le bénéfice annoncé, une future utilisation de ces molécules dans le traitement clinique de la maladie d'Alzheimer, reste au conditionnel.
Objectifs
Les patients atteints de la maladie d’Alzheimer (MA) présentent dans leur cerveau des aggrégats protéiques toxiques que sont d'une part les dégénérescences neurofibrillaires composée de protéine Tau et les plaques sénilescomposées en majorité du peptide amyloïde (Ab). Selon l'hypothèse amyloïde, l'Ab serait le principal responsable des dysfonctionnements liés à la MA or nos résultats montrent que son précurseur, le fragment C99 contribue aussi à la pathologie. Au laboratoire, nous avons mis en évidence une accumulation très précoce de ce fragment dans le cerveau de souris modèle de la MA ce qui conduit à des dysfonctionnements cellulaires et contribue à un deficit cognitif. En plus de la pathologie liée au peptide Ab et au fragment C99, l'aggrégation de la protéine Tau observée dans les cerveaux des patients Alzheimer conduit à un dysfunctionnement synaptique. De manière interéssante, de nouvelles molécules sont capables de diminuer à la fois la pathologie liée à Tau et celle liée à l'Ab. L'objectif de ce projet est d'explorer l'effet de ces nouvelles molécules sur la pathologie liée au fragment C99 dans plusieurs modèles murins de la MA.
Bénéfices attendus
Ces nouvelles molécules ont été décrites comme améliorant le déficit cognitif des souris en réduisant à la fois la pathologie liée à la protéine Tau et celle liée au peptide Ab. Ce projet a pour but non seulement de confirmer l'effet de ces nouvelles molécules sur un nouveau modèle murin de maladie d'Alzheimer combinant à la fois la pathologie Tau et celle d'Ab mais aussi d'étudier spécifiquement l'effet de ces molécules sur la pathologie liée au fragment C99. Ce projet de recherche fondamentale devrait apporter des informations importantes sur les mécanismes moléculaires que pourraient cibler ces molécules et déterminer si ces molécules sont capables de restaurer des phénotypes pathologiques liés au fragment C99. Il devrait également fournir des perspectives cruciales pour une future utilisation de ces molécules dans le traitement clinique de la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Les animaux subiront au plus 3 interventions: 1-Le traitement par une administration des molécules dans l'eau de boisson pendant 4 mois. 2-Les mesures d'activité et de distance parcourue dans la roue dans des cages métaboliques : pour chaque souris 2 passages sont prévus avant et après le traitement pendant 2jours et 2nuits consécutives. 3-Le test de mémoire qui consiste en 5 jours d'apprentissage avec 4 essais par jour d'une minute, 2 tests d'une minute 24h et 72h après le dernier jour d'apprentissage et un test visible comportant 3 essais d'une minute le même jour .
Impact sur les animaux
Les souris utilisées dans ce projet ont un phénotype dommageable avec un déficit cognitif, des défauts d’apprentissage et de mémorisation qui s’aggravent avec l’âge. Les molécules utilisées dans ce projet ont déja été administrées à des souris sauvages ou transgéniques pendant 4 mois à une concentration de 1mg/kg sans effet indésirable visible sur l'état physiologique des souris conservant un poids stable, une consommation d'eau et de nourriture stable et un comportement normal dans la cage. Au cours du test de la piscine de Morris, les souris sont contraintes à nager dans l’eau qui est un environnement stressant pour les souris mais la durée de chaque passage dans la piscine ne dure qu'une minute, 4 fois par jour pendant 5 jours durant la phase d'apprentissage et une minute pendant la phase de test. Les mesures d'activité dans les cages métaboliques consistent à isoler les souris dans des cages individuelles 2 jours et 2 nuits consécutifs pour comptabiliser les mouvements de chaque souris. Ce test peut éventuellement générer un léger état d’anxiété lié à l’isolement social mais nous estimons que la durée n'est pas suffisament longue pour avoir une quelconque conséquence pour le bien être des animaux. De plus cet isolement est compensé par la présence d'une roue dans la cage considérée comme un enrichissement de l'environnement. Pour les analyses histologiques, certaines souris seront profondément anesthésiés et pour éviter toute douleur à l'animal, avant toute intervention, la profondeur de l'anesthésie sera vérifiée au préalable par l'absence de réaction de l'animal au pincement de la membrane inter-digitale.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mises à mort afin de récupérer leur cerveau et effectuer les analyses biochimiques et histologiques nécéssaire au projet scientifique.
Remplacement
Les expériences de comportement de souris telles que la piscine de Morris ou les mesures d'activités ne peuvent malheureusement pas être remplacées par des expériences in vitro. Cependant toutes nos expériences biochimiques, immunohistologiques et nos analyses des mécanismes moléculaires sont étudiées en parallèle sur des modèles cellulaires exprimant les mêmes mutations ou le fragment C99.
Réduction
Nous utiliserons des tailles d’échantillons garantissant une puissance statistique suffisante tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés dans le respect éthique de la règle des 3R (remplacement, réduction et raffinement). Le nombre de souris pour chaque procédure est ainsi déterminé par une méthode statistique adaptée. Les tests de comportement que nous utilisons ont déjà été testés sur nos modèles de souris et nous avons déjà établi un protocole bien déterminé ce qui évitera de réaliser des expériences préliminaires de mise au point. Notre étude comportementale requière des groupes de 30 à 33 animaux minimum. Cependant, pour réduire le nombre d’animaux, quand cela est possible, les mêmes groupes de souris seront utilisés pour plusieurs test comportementaux et pour les analyses biochimiques et immunohistochimiques.
Raffinement
Nos modèles de souris sont utilisés en routine dans notre laboratoire et sont désormais très bien caractérisés et ont déjà fait l'objet de projet expérimentaux en 2014 et 2017. Ainsi pour chaque modèle, nous connaissons très bien la cinétique d'apparition et d'évolution de la pathologie pour déterminer les âges adéquats et pouvoir traiter nos souris en préventif (4 mois) ou en curatif (12mois). Pour évaluer au mieux le phénotype de type apathique des souris, nous utilisons des cages métaboliques munies d'une roue ce qui nous permet de mesurer leur activité dans la roue et ainsi d'évaluer au mieux le phénotype apathique. Pour atténuer au maximum le stress causé par le test de memoire pour lequel les souris sont contraintes de nager dans l'eau, une phase d’habituation sera réalisée avant le début du test. La température de l'eau utilisée permet un bon équilibre entre motivation et bien-être de l'animal et dès la sortie de l'eau, les souris seront séchées sur un papier absorbant et la cage placée sur un tapis chauffant. Pour limiter le stress, les souris sont hébergées dans des cages comportant une maisonnette ainsi que de la ouate favorisant la nidification. Pour définir le plus objectivement possible le bien être des souris et assurer au mieux leur survaillance tout au long de chaque procédure, nous utiliserons une grille de scores et nous nous référons aux points limites établis préalablement.
Choix des espèces
Pour déterminer in vivo si ces molécules sont bénéfiques dans le traitement contre la maladie d'Alzheimer au niveau comportemental, et pour étudier in vivo les mécanismes moléculaires impliqués dans l'effet bénéfique des molécules, nous sommes contraints d'utiliser des modèles de souris mimant la maladie et présentant des déficits cognitifs. Les données scientifiques générés dans ce projet seront cruciales pour une application thérapeutique future à un stade précoce de la maladie étant donné que le C99 intervient de manière beaucoup plus précoce que l'Ab dans la pathologie. En tenant compte de nos résulats antérieurs, nous avons choisi de tester l'effet des molécules à 2 âges : un âge précoce (2mois) pour voir si les molécules sont capables de retarder le comportement de type apathique; et un âge plus tardif (12mois) pour voir si les molécules sont capables de restaurer les déficits cognitifs et le retard d'apprentissage spatial présent à cet âge.
Gestion du phénotype dommageable de la lignée Aiolos KO durant l’élevage
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Les souris de la lignée utilisée sont privées d'une protéine du système immunitaire et développent un lymphome vers huit à dix mois. 720 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées avant cet âge. Aucune intervention expérimentale n'est décrite sur l'animal vivant, le projet consistant à entretenir la lignée puis à prélever moelle osseuse, ganglions, rate et thymus après la mise à mort. Le porteur affirme n'attendre aucune nuisance, la prévention du phénotype dommageable reposant sur l'utilisation puis la mise à mort des souris bien avant l'âge où le lymphome apparaît.
Objectifs
Notre équipe travaille sur une famille de protéines jouant un rôle crucial dans le développement et la fonction des cellules du système immunitaire. Dans cette famille, l'une d'entre elles, que nous étudions, semble importante pour le développement des cellules T et B, mais beaucoup de questions restent actuellement sans réponses et nécessitent des études supplémentaires. L’objectif de ce projet est de déterminer l'importance de cette protéine dans la vie des cellules T et B, de leur génération à leur localisation dans les organes lymphoïdes secondaires, en utilisant des souris qui ne la possèdent plus. Ces souris mutantes pourraient avoir des effets indésirables en élevage. Des mesures d’élevage spécifiques et l’utilisation des souris avant l’âge d’apparition d’un phénotype potentiellement dommageable seront mises en place pour prévenir l’apparition de nuisances potentielles. Après mise à mort, différents organes seront récupérés afin d'étudier le devenir des cellules T et B dans différentes expériences in vitro et ex vivo.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de comprendre les mécanismes qui contrôlent l'activation et la polarisation des lymphocytes B et T, acteurs principaux de la réponse immunitaire adaptative jouant un rôle crucial dans le développement de cancers et pathologies auto-immunes et inflammatoires. Cela permettra d'établir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.
Procédures
La mutation créée dans les animaux, permettant la suppression d’Aiolos, pourrait entraîner des effets indésirables comme le développement d’un lymphome à l’âge de 8 à 10 mois. Cependant, grâce aux conditions d'hébergement optimale et l’utilisation des animaux bien avant cet âge critique, cela permet de prévenir l’apparition de ces effets indésirables et nous n’attendons donc pas de nuisances dans ce contexte.
Impact sur les animaux
Le phénotype dommageable attendu sur les souris porteuses de la mutation est le développement d’un lymphome à un âge tardif (8-10 mois). Cependant, grâce à nos méthodes de raffinement que nous avons mises en place (conditions d’élevage spécifiques, études avant l’âge critique), nous n’attendons pas l’apparition de ce phénotype.
Devenir
Mise à mort pour gestion du phénotype dommageable et prélèvement d'organes.
Remplacement
Nous travaillons sur l'influence d'une protéine sur le devenir des cellules B et T. Nous étudions le développement des lymphocytes B dans la moëlle osseuse, des lymphocytes T dans les thymus et leur devenir dans les organes lymphoïdes secondaires. Jusqu’à ce jour, les lignées cellulaires disponibles ne permettent pas de suivre le destin de ces cellules de leur "naissance" à leur "mort". Ces cellules doivent être maintenues dans un environnement in vivo pour maintenir leurs caractéristiques spéciales. C'est pourquoi notre projet nécessite d'utiliser un modèle in vivo et qu'il est impossible de remplacer l'utilisation d'animaux dans ce projet. Cependant, au cours de notre expérimentation, nous nous réservons la possibilité d’employer des méthodes alternatives et des modèles in vitro, dès que cela est possible, afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux.
Réduction
Le but de ce projet sera de récupérer les organes permettant d’étudier le devenir des différentes populations des cellules B et T in vitro. Nos prélèverons le maximum d’organes (moëlle osseuse, ganglions lymphatiques, rate, thymus) pour chaque animal afin de collecter le plus d’informations au cours d’une procédure. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs. Au cours de notre expérimentation, nous nous réservons, cependant, la possibilité d’employer des méthodes alternatives et des modèles in vitro, dès que cela est possible, afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux. Des tests statistiques seront effectués pour comparer les expériences générées in vitro.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans une zone d'élevage spécifique seulement accessible par des zootechniciens. Cette zone protège les animaux de pathogènes spécifiques. Les animaux sont élevés dans des cages ventilées, avec de l'eau et de la nourriture à volonté. Des barrières physiques bloquent l'entrée de pathogènes et des contrôles sanitaires sont effectués régulièrement sur animaux sentinelles afin de s'assurer qu'aucune contamination par des pathogènes éventuels ne soit en cours. Les animaux seront utilisés bien avant apparition d’un phénotype potentiellement dommageable. Afin de récupérer les organes d'intérêt, les animaux seront transférés dans une animalerie au statut sanitaire conventionnel. Les animaux seront élevés en groupe, dans des cages ventilées avec le matériel nécessaire pour qu'elles créent leur nid et leur permettre des conditions d'hébergement optimales. Un suivi règlementaire quotidien sera effectué. Dans ces conditions d'hébergement et à l'âge où ils seront étudiés, nous n'attendons aucun phénotype dommageable pour ces animaux.
Choix des espèces
Les souris présentent l’avantage de pouvoir être modifiées génétiquement (souris- knock-out, transgéniques), ce qui permet de contrôler l’expression d’un ou plusieurs gènes soit dans un type de cellule spécifique, soit dans toutes les cellules. Le système immunitaire de la souris se rapproche de l’Homme, ce qui permet de travailler dans un modèle de référence pour l’étude des cellules T et de certaines pathologies comme les maladies auto-immunes associées à une dérégulation des cellules T. Pour ces raisons, les souris représentent un modèle de référence dans l’étude des mécanismes qui sous-tendent la pathogénicité des cancers ou maladies auto-immunes, ce qui est l’objet de notre recherche. Nous utiliserons les animaux entre 5 et 20 semaines maximum afin de s'assurer de ne pas se rapprocher de l'âge (8-10 mois) où elles pourraient développer un phénotype potentiellement dommageable.
Impact de l’activation de cellules immunitaires sur la réponse antitumorale.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Injectées dans la veine de la queue, des cellules tumorales forment des tumeurs dans plusieurs organes chez 120 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal reçoit ensuite entre deux et cinq injections intrapéritonéales de cytokines et d'inhibiteurs, et jusqu'à trois tests d'agrippement consécutifs. L'objet déclaré est de comprendre comment les cytokines activent les cellules Natural Killer et ce qui régule cette activation, les retombées en santé humaine étant renvoyées au conditionnel et au long terme. Le porteur écrit que le modèle est bien caractérisé, ce qui lui permet de limiter la souffrance des animaux, puis dans la phrase suivante que les tumeurs formées dans plusieurs organes sont source de souffrance pour l'animal.
Objectifs
Les cellules Natural Killer sont des cellules immunitaires spécialisées dans la lutte anti-tumorales. Elles peuvent être activées par des protéines appelées cytokines. L'objectif de ce projet est de mieux définir ce que permet l'activation par les cytokines lors d'une réponse antitumorale et de comprendre ce qui la régule. Dans un premier temps, nous étudierons l'effet d'un traitement cytokinique sur les cellules Natural Killer de différents organes. Dans un deuxième temps, nous étudierons l'impact de ce traitement sur la réponse antitumorale dépendante des cellules Natural Killer. Enfin, nous inhiberons un processus que nous supposons impliqué dans l’activation des cellules NK par les cytokines et nous mesurerons l'impact de cette inhibition sur la réponse antitumorale des cellules Natural Killer.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux définir la régulation de l’activité anti-tumorale des cellules Natural Killer. Etant donné le rôle de ces cellules dans la réponse anti-tumorale, ces résultats pourraient à terme conduire à des développements en santé humaine.
Procédures
Les animaux seront greffés avec les cellules tumorales par injection intraveineuse dans la veine de la queue (1 injection par souris, 1 minute). Elles recevront aussi les cytokines et les inhibiteurs de la voie que nous étudions par injection intrapéritonéale (entre 2 et 5 injections par souris, moins de 10 secondes par injection). Des tests d'aggripement (jusqu'à 3 tests consécutifs) seront effectués.
Impact sur les animaux
Le modèle est bien caractérisé, ce qui nous permet de limiter la souffrance des animaux. Lors d'une injection intraveineuse, les cellules injectées forment des tumeurs dans plusieurs organes, ce qui est source de souffrance pour l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Des expériences préliminaires sur des cellules Natural Killer en culture activées à l'aide des cytokines étudiées ont été effectuées. Elles ont mis en évidence une forte augmentation des fonctions antitumorales des cellules Natural Killer et une implication claire d'une voie de signalisation cellulaire dans ce processus. Ces modèles expérimentaux sont cependant limités, ne reproduisant qu’imparfaitement les conditions rencontrées in vivo, notamment la nécessaire migration au sein des organes infiltrés par la tumeur. Il est donc maintenant nécessaire de mettre en place un modèle animal.
Réduction
Des approches statistiques ont été choisies de façon a reduire le nombre d'animaux a minima pour avoir des résultats significatifs robustes. L'utilisation des animaux est optimisée par la réalisation d'analyses multiples sur différents organes d'un même animal. Lorsque cela est possible, la comparaison au sein d’une seule expérience des différentes conditions testées permettra de réduire 1) le nombre de souris utilisées et 2) la variation expérimentale inhérente à la réalisation d’expériences indépendantes. Enfin, les procédures se feront séquentiellement, le résultats des premières déterminant la conduite des suivantes.
Raffinement
Le modèle tumoral et les molécules utilisées sont bien definis et maitrisés par les expérimentateurs. Les animaux sont maintenus en groupes sociaux. Les animaux seront surveillés individuellement et quotidiennement afin de vérifier leur bon état général sur des critères de signes cliniques, d’aspect et de comportement. Des points limites sont bien définis pour éviter toute souffrance animale. Afin de faciliter l’accès à la nourriture et l’eau, des croquettes humidifiées seront déposés sur le sol de la cage aux stades terminaux de la pousse tumorale.
Choix des espèces
Les cellules Natural Killer ne sont présentes que chez les mammifères. Parmi ceux-ci, la souris est un modèle de choix. D'une part, et bien qu'il existe certaines différences entre l'immunologie murine et humaine, d'innombrables découvertes chez la souris sont transposables chez l'homme. D'autre part, la richesse des réactifs disponibles permet une compréhension très approfondie des phénomènes mis en jeu du niveau moléculaire au niveau de l'organisme, un atout déterminant dans notre projet. Des souris âgées de 8 à 28 semaines seront utilisées. En effet, c'est à partir de l'âge de 8 semaine que les souris ont un système immunitaire mature. D'autre part, la réponse anti-tumorale ne varie pas sur la tranche d'âge considérée. Nous serons de cette façon plus flexibles lors des commandes ou s'il est nécessaire de décaler le début d'une expérience, évitant ainsi la mise à mort d'animaux inutiles.
Evaluation de l’effet d’une supplémentation alimentaire en poudre de fruits ou de légumineuses sur le métabolisme, l’inflammation et la résistance à l’insuline dans le modèle d’obésité induite par l’alimentation chez la souris mâle.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Nourries douze semaines avec un régime riche en graisse additionné de poudre de baies de goji ou de lentilles, 72 souris mâles subissent une prise de sang sous contention à la sixième semaine, un test de tolérance à l'insuline à la neuvième, un gavage de glucose à la dixième et un gavage de mesure de perméabilité intestinale à la onzième. Trois recueils de fèces les isolent chacun une trentaine de minutes, les tests de tolérance deux heures. Le porteur reconnaît un stress social lié à ces isolements et des douleurs possibles lors des prises de sang, du marquage, du gavage et de l'injection intrapéritonéale, puis écrit qu'aucune analgésie n'est prévue dans ce protocole. Toutes sont tuées pour prélever les tissus et mesurer l'effet de la supplémentation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré.
Objectifs
L’objectif du projet est de mieux comprendre l’impact des conditions de production et des traitements post-récolte sur la qualité nutritionnelle des fruits ou des légumineuses et les conséquences que cela va engendrer en terme de santé métabolique chez la souris. Plusieurs travaux rapportent un effet protecteur des fruits ou des légumineuses vis-à-vis de l’homéostasie glucidique qui semble en partie lié aux polysaccharides, et est très probablement imputable à un effet sur le microbiote. Pour évaluer les effets santé des fruits ou légumineuses et l'impact des conditions de cultures et de traitements post-récolte, nous comparerons des baies de goji cultivées en plein champ ou en serre (effet des condition de productions), consommées fraiches ou séchées (effet du traitement post-récolte). L'effet des conditions de cultures sera également étudié sur des lentilles (légumineuses) cultivées soit en sol riche en bactéries soit en sol pauvre (effet des conditions de culture). Les différentes modalités de fruits ou légumineuses seront lyophilisés puis administrés à des souris males durant 12 semaines, dans le cadre d'une alimentation riche en graisse. Une prise de sang sera réalisée à 6 semaines, ainsi qu'un test de tolérance à l'insuline à la 9eme semaine et un test de tolérance au glucose à la 10eme semaine. Les fèces seront également récoltés et le microbiote des animaux sera analysé. Les données obtenues permettront d'avancer dans la connaissance et l'objectivation de la contruction de la qualité nutritionnelle des productions végétales et de leurs effets sur la santé métabolique.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer l’impact des conditions de culture (plein champ vs serre, et impact du microbiote du sol) et des traitements post-récolte (frais vs séchés) sur la baie de goji et la lentille et leurs effets sur la santé métabolique des souris et de leur microbiote. Ce projet s’insère dans un projet plus large qui permettra in fine d’améliorer et de mieux caractériser les effets santé de ces aliment dans le cadre de pratiques agricoles plus responsables.
Procédures
Un prélèvement de sang sur animal vigile sera réalisé au début de l'étude et après 6 semaines (2 au total). Pour ce faire les animaux seront mis sous contention durant environ 2 minutes. Un test de tolérance à l'insuline et un test oral de tolérance au glucose seront pratiqués respectivement en 9ième et 10ième semaine. Ces tests necéssitent une mise en contention d'une minute pour réaliser un gavage dans le cas du test de tolérence au glucose, et une injection intrapéritonéale lors du test de tolerance à l'insuline. Le déroulé du test nécessite ensuite une mise en hébergement individuel des animaux de 2 heures afin de suivre l'évolution de leur glycémie. Un test de perméabilité intestinale sera réalisé en semaine 11. Ce test nécessitera une mise en contention d'une minute pour réaliser le gavage avec la solution permettant d'évaluer la perméabilité intestinale. Durant le protocole, 3 recueils de fèces nécessitant d’isoler temporairement (environ 30 minutes) l’animal seront effectués.
Impact sur les animaux
Stress social lié à l'hébergement individuel de l'animal de ses congénères lors du test de tolérance à l'insuline, du test de tolérance au gloucose et du recueil de fecès. Douleurs possibles lors des prises de sang, pour l'identification des animaux, lors du gavage et lors de l'injection intrapéritonéale. Ces nuisances ou effets indésirables sont toutes temporaires et réversibles.
Devenir
Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'interet qui seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques) et de démontrer les effets métaboliques de la supplémentation en poudre de baie de goji ou de lentilles.
Remplacement
L’étude d’une supplémentation en poudre de baie de goji ou de lentilles sur la santé métabolique et le microbiote ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Il n'existe pas de modèle alternatif à l'heure actuelle permettant d'étudier ces paramètres in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux (9 par groupes) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, à l'aide d'un test statistique, notamment en ce qui concerne la prise de poids. Deux protocoles indépendants ont été regroupés en un meme protocole afin de limiter le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cage de 3, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à rétablissement. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en focntion des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arret. Aucune analgésie n'est prévue lors de ce protocole.
Choix des espèces
Le modèle souris est un modèle reconnu pour les études portant sur l’obésité et les pathologies associées. Les mécanismes d’adaptation à une alimentation riche en matière grasse chez la souris sont très proches des mécanismes observés chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.
Etude d’innocuité et d’efficacité de molécules destinées au traitement des accidents vasculaires cérébraux dans un modèle d’ischémie thromboembolique chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Du chlorure de fer à 20 % appliqué sur l'artère cérébrale moyenne provoque un accident vasculaire cérébral chez 924 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un cathéter dans la veine caudale, passe cinq séances d'IRM sous anesthésie entre le jour de l'occlusion et le quatorzième jour, et termine par une ouverture du thorax et de l'abdomen suivie d'une ponction cardiaque. Les molécules testées viennent de partenaires industriels qui financent le projet et attendent, en cas de résultats favorables, un passage en essais cliniques puis une mise sur le marché. Le porteur annonce une batterie de trois tests comportementaux qu'il qualifie d'indolores, répétés à sept dates, sans préciser lesquels.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique causée par la formation d’un caillot (thrombus) entraînant l’occlusion partielle ou totale d’une artère cérébrale. Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA ainsi que de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (
Bénéfices attendus
Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi riches en fibrine, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA et de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (
Procédures
Les 924 animaux de cette demande d’autorisation de projet seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête pour appliquer une solution de chlorure de fer à 20% au niveau de l’artère cérébrale moyenne (ACM) pour aboutir à l’occlusion de l’ACM. Cet acte chirurgical, se déroulant à J0, durera 15 à 20 minutes et l’animal restera endormi environ 1 heure. La pose d’un cathéter dans la veine caudale sera nécessaire pour tous les animaux afin d’administrer un ou plusieurs traitements en intraveineux ainsi que les agents de contraste nécessaires à la réalisation de séquences IRM s’intéressant à la neuroinflammation et l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. La pose de cathéter prendra environ 5 minutes. À J0, J1, J2, J5 et J14, les animaux seront soumis à l'IRM-7T sous anesthésie générale, pour une durée variant de 15 à 45 minutes en fonction des séquences réalisées. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Les animaux passeront également une batterie de test comportementaux indolores visant à tester les déficits et la récupération sensorimotrice au cours du temps, jusque 7 jours avant l’induction de l’AVC pour déterminer l’activité basale, puis à J1, J2, J3, J5, J7, J14 et J21. Chaque animal passera moins de 10 minutes pour chacun des trois tests. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au cœur et faciliter le prélèvement sanguin par ponction cardiaque. Viendra ensuite soit une perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant son prélèvement soit un prélèvement du cerveau frais. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements.
Impact sur les animaux
Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC ischémique, à savoir des déficits sensorimoteurs induits par les lésions cérébrales au niveau du cortex somatosensoriel et prémoteur. Les déficits fonctionnels sont considérés comme léger à court et moyen terme dans ce modèle d’AVC, mais peuvent occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion chez l’animal. A long-terme les déficits fonctionnels ne sont plus que légèrement perceptibles. Tout au long de l’étude l’animal peut aisément continuer à s’alimenter, s’abreuver et se fabriquer un nid avec les enrichissements mis à disposition dans la cage.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.
Remplacement
Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations réalisées in vitro par les industriels financeurs. Actuellement il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font de la souris le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, mus musculus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ischémique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.
Réduction
Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées surtout à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 18 par groupes dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux dues à des erreurs techniques ou à de la mortalité, l’augmentation de l’effectif de 22 par groupes expérimentaux est obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 18 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les souris arriveront au laboratoire en groupes sociaux puis seront stabulés à un par cage le temps de l’expérimentation pour éviter les conflits entre les souris et faciliter la phase de récupération post-opératoire. Au sein de chaque cage, les animaux auront accès à divers types d’enrichissements : sizzle-dri kraft, coton et demi-sphère de cellulose ainsi qu’accès illimité à la nourriture et à l’eau. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Les animaux seront pesés 2 fois par semaine au minimum. Pendant l’opération chirurgicale d’AVC ischémique, l’animal sera profondément anesthésié avec de l’isoflurane dans un mélange d’air sous couverture analgésique 15 minutes avant la première incision cutanée. Sur le cadre stéréotaxique, pour limiter les douleurs liées aux barres d’oreilles, une anesthésie locale sera également appliquée. De plus, chaque site d’incision sera précédé d’une tonte du pelage et d’une désinfection. La température corporelle de l’animal sera maintenue à 37.5 ± 0.5°C grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée et à une couverture isothermique placée sur le dos de la souris. Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une plus grande résistance que le surjet par exemple, et limitant le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. Lors de la phase de réveil, l’anesthésie sera coupée, et le débit d’oxygène sera élevé à 1 L/minute pour permettre une meilleure récupération post-opératoire de la souris au sein de sa cage individuelle. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. En cas de constatation post-opératoire de dépassement des points limites de souffrance ou de stress fixés en amont de l’étude, l’animal sera mis à mort par dislocation cervicale. Pour cela, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant les jours suivant l’opération chirurgicale.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) occupe une place prépondérante dans la recherche sur les maladies neurodégénératives, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs comme les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et la souris, la facilité de manipulation génétique, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font de la souris un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Dans le contexte spécifique de l'AVC ischémique, l'utilisation de la souris devient incontournable car elle offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats avec ceux obtenus dans notre laboratoire et ailleurs, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. Les animaux utilisés seront âgés d’environ 10 semaines le jour de l’induction de l’AVC pour un poids moyen de 35g. Nous effectuerons notre modèle sur des jeunes adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles déjà disponible dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine.
Etat sanitaire des populations d’anguilles européennes de Méditerranée occidentale (rivières et lagunes) et développement d’outils non létaux d’évaluation.
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Les anguilles qui présentent une faible vivacité ou un comportement anormal au réveil sont tuées sur place. Vingt anguilles européennes, espèce classée en danger critique d'extinction, vont être capturées par pêche électrique et utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis relâchées à leur lieu de capture. Chaque individu subit sous anesthésie des mesures biométriques et trois prélèvements, mucus cutané, sang et lavement intestinal, en trois à quatre minutes. Le nombre de vingt individus, dix par an sur deux ans, repose sur l'expertise des spécialistes du projet, le porteur indiquant qu'aucune étude comparable publiée ne permettait de le calculer.
Objectifs
La population de l’anguille européenne, Anguilla anguilla, a subi un fort déclin sur l’ensemble de son aire de répartition depuis les années 1980. Il est en effet estimé que cette population a diminué de plus de 90% lors des dernières décennies. Par suite, bien que non protégée, c’est une espèce classée en danger critique d’extinction depuis 2008. Les causes du déclin de l’anguille sont multiples : perte et dégradation des habitats, pêche, pollution, introduction de parasites exotiques et modification des courants océaniques due aux changements climatiques. Tous ces facteurs impactent simultanément la population de l’anguille européenne, mais l’importance de leur contribution respective ne peut pas encore être déterminée. Ce projet a donc pour objectifs : 1) de décrire l’état sanitaire des sous-populations d’anguilles de Méditerranée occidentale (rivières et lagunes), 2) de développer des outils innovants (non létaux) d’évaluation de cet état, objectif fondamental et essentiel pour autoriser la pérennisation des suivis à long terme sur cette espèce, et 3) de préciser l’état écologique des lagunes et des cours d’eau prévus dans le projet. Ces résultats devraient permettre de faire le lien entre l’état sanitaire des anguilles et le niveau de pressions anthropiques s’exerçant sur les habitats aquatiques continentaux afin de proposer des mesures de restauration adaptées à cette espèce et à ces habitats.
Bénéfices attendus
Les résultats devraient permettre de préciser l'état écologique des lagunes côtières et des cours d'eau prévus dans le projet (i.e. niveau de pression anthropique), et de faire le lien avec l’état sanitaire des anguilles, évalué à partir de méthodes non létales, afin de mieux comprendre les causes de son déclin, et plus généralement de la biodiversité aquatique. L'anguille étant une espèce indicatrice de la qualité du milieu aquatique, particulièrement sensible aux contaminations chimiques et aux infestations parasitaires (parasites introduits), le projet permettra de proposer des mesures pertinentes et spécifiques de gestion de cette espèce et de ses habitats, ciblées sur ces pressions anthropiques. Enfin, la démarche et les résultats obtenus dans le projet pourront être transposés à d’autres habitats similaires de Méditerranée voire même d’Europe.
Procédures
Chaque animal sera soumis à des mesures biométriques et à 3 prélèvements non létaux sous anesthésie (1 seule fois par animal) : mucus cutané, sang et lavement intestinal (durée 3 à 4 minutes maximum en tout).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus seront à priori assez réduits et concernent : 1) la collecte des anguilles par pêche électrique susceptible d’engendrer du stress, et 2) les prélèvements non létaux (mucus cutané, sang et lavement intestinal), effectués sous anesthésie et potentiellement susceptible d’occasionner une légère gêne au réveil des anguilles.
Devenir
Tous les animaux seront relâchés dans leur milieu d’origine au niveau de leur lieu de capture à la fin de la procédure expérimentale après leur réveil.
Remplacement
Le projet visant à décrire l’état sanitaire des sous-populations d’anguilles de Méditerranée occidentale (rivières et lagunes) et de développer des outils innovants (non létaux) d’évaluation de cet état, il n’est pas possible d’utiliser des méthodes de remplacement de cette espèce.
Réduction
Le projet prévoit de collecter, anesthésier et relâcher des individus d’une rivière en vue d’effectuer leur biométrie et de développer des outils non létaux d’évaluation de leur état sanitaire. Nous avons réduit au maximum le nombre d’individus à collecter (en tout 20 anguilles au stade jaune, 10 par an sur 2 années consécutives) pour obtenir des résultats représentatifs et fiables de l’état sanitaire/de stress des anguilles fréquentant cet habitat dans le cas de cette approche innovante. Ce nombre a été déterminé à partir de l’expertise des différents spécialistes impliqués dans le projet en l’absence d’études similaires déjà publiées qui auraient pu être utilisées pour estimer la variabilité attendue des résultats et donc pour calculer la taille minimale de l’échantillon.
Raffinement
Plusieurs mesures seront prises pour limiter l’inconfort, le stress et la souffrance des individus depuis leur collecte jusqu’à leur relâcher. Au moment de la pêche électrique, la collecte des anguilles se fera à l’aide d’une épuisette à maille suffisamment fine et souple pour ne pas les blesser, et en pratiquant des gestes précautionneux pour ne pas les stresser tout en permettant une collecte rapide. Après anesthésie, les anguilles seront toujours maintenues humides (permet la respiration cutanée qui existe chez l’anguille) et leurs yeux seront protégés contre l’exposition à la lumière directe du soleil pour les mesures biométriques et les prélèvements prévus dans le projet. Les anguilles seront ensuite surveillées jusqu’à leur réveil complet avant de les relâcher dans leur milieu d’origine. Cependant, en cas d’apparition de signes suspects au réveil (faible vivacité, comportement anormal), elles seront immédiatement euthanasiées.
Choix des espèces
Bien que non protégée, l’anguille européenne est une espèce classée en danger critique d’extinction depuis 2008. Parmi les multiples causes pressenties à l’origine de son déclin, la perte et la dégradation de ses habitats, notamment par les contaminations chimiques et biologiques, font l’objet des préoccupations actuelles. Dans ce contexte, il convient de faire le lien entre l’état sanitaire des anguilles et le niveau des pressions anthropiques s’exerçant sur les habitats aquatiques continentaux (lagunes et rivières) afin de proposer des mesures de restauration adaptées à cette espèce et à ces habitats. Les individus qui feront l’objet de ces prélèvements sont des anguilles au stade jaune (stade de croissance immature de l'anguille), stade adapté à notre étude car particulièrement exposé aux contaminations chimiques et biologiques en raison d’un comportement benthique et d’un séjour long dans son habitat aquatique continental.
Évaluation de l’effet antalgique d’une crème combinant deux principes actifs dans un modèle murin de neuropathie induite par le paclitaxel
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Une ligature du nerf sciatique sous anesthésie ou des injections répétées d'anticancéreux installent une neuropathie douloureuse chronique chez 648 souris, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Sept fois par animal, un filament est appliqué sur la patte ou la patte est plongée dans un bain à 10 °C, pour mesurer la douleur avant et après l'application d'une crème antalgique. Le porteur décrit ces tests comme entraînant "une douleur de quelques secondes" et précise que l'animal reste libre de retirer sa patte, après avoir écrit que l'induction de la neuropathie constitue une "nuisance à part entière" mais "indispensable" à la conduite de l'étude. Toutes les souris sont tuées, le porteur indiquant que leur souffrance est irréversible.
Objectifs
Nous souhaitons réaliser, chez l’animal, une étude qui permettra de mettre en avant une action additive, potentiellement synergique (c’est-à-dire obtenir un effet supérieur à une simple addition), de deux principes actifs après une application locale sous forme de crème dans des douleurs neuropathiques périphériques. Des données de biologie moléculaire sont également nécessaires afin de localiser l’expression des protéines cibles dans le tissu périphérique.
Bénéfices attendus
Le produit attendu est un nouvel antalgique pour lutter contre les symptômes neuropathiques tels que les douleurs induites par certaines chimiothérapies pour lesquelles il n’existe aucun traitement efficace. Le marché visé est principalement celui des cancers du sein, des cancers colorectaux de stade III (avancé) et IV (métastatique) mais pourrait être ouvert à ceux des cancers ovariens et du tête-cou pour lesquels les mêmes protocoles chimiothérapiques sont prescrits. La forme crème (action topique) permettra de limiter les effets indésirables de ces deux molécules prises par voie orale.
Procédures
Les souris pourront subir, en fonction des procédures, les interventions suivantes : - Induction des modèles de neuropathies chimio-induite : Il s’agit ici d’injection en intrapéritonéal sur animal vigil (durée par animal : 3 secondes) réalisées 2 ou 3 fois par semaines pendant 1 ou 4 semaines, en fonction de l’anticancéreux. - Induction du modèle de neuropathie par ligature du nerf sciatique (modèle SNI ou Spared Nerve Ligation) : une chirurgie sera réalisée chez la souris anesthésiée (durée par animal : 15 min). - Tests comportementaux : ils consistent, soit à appliquer des filaments sur la patte, soit à immerger la patte dans l’eau froide à 10°C. Durée par animal : 5 à 30 secondes). Fréquence : 7 fois par animal : une fois avant l’induction du modèle, puis au jour 7 ou 14 après l’induction du modèle (en fonction du modèle), et enfin 20, 40, 60, 90 et 120 minutes après l’application de la crème. - Application de la crème : elle sera réalisée pendant 5 minutes (fréquence : une fois) sur la patte de l’animal anesthésié sous isoflurane 2,5%.
Impact sur les animaux
L’induction de neuropathie chronique périphérique chez la souris sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. Elle sera associée à des désordres douloureux qui seront évalués dans le cadre du projet. Elle sera aussi responsable d’une diminution du gain de poids des animaux. Le poids des animaux sera suivi régulièrement. Des tests comportementaux pour évaluer la douleur seront réalisés sur souris vigiles. Il s’agira du test du von Frey ou du test d’immersion de la patte. Le test du von Frey consiste à appliquer un filament au niveau de la patte de l’animal et le test d’immersion à immerger la patte de l’animal dans un bain thermostaté. Cela va donc entrainer une douleur de quelques secondes chez l’animal. L’animal est libre de retirer sa patte.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort puisque la souffrance de l’animal est irréversible.
Remplacement
S'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est nécessaire pour explorer et évaluer les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux. Ce type d'étude sur modèle animal de douleurs neuropathiques périphériques n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Il n’y a pas actuellement de système in silico disponible pour l’étude de la douleur qui est un modèle intégré. Ce type d'étude sur modèle animal de douleurs neuropathiques chimio induites est donc pour le moment nécessaire avant le passage en phase clinique chez l’Homme.
Réduction
Une forte expertise du laboratoire s’étendant sur plusieurs années d’expériences concernant les tests comportementaux et modèles animaux permet d’affiner le nombre d’animaux. De plus, le nombre d’animaux de ce projet a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en obtenant des données statistiquement suffisantes. L’ensemble des résultats, y compris négatifs, feront l’objet d’une publication afin d’éviter la reproduction d’expériences. Enfin, si les résultats de chaque procédure sont négatifs (pas d’effet antalgique de chaque composés) alors l’étude s’arrête et les procédures suivantes ne seront pas réalisées.
Raffinement
Des méthodes de raffinement sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet. Pour cela, les conditions d'hébergement seront optimales (température, hygrométrie, luminosité). Le nombre d’animaux est adapté à la taille de la cage et en adéquation avec la règlementation . De plus, le milieu est enrichi par du matériel de nidification (coton), un abri (dôme carton) et des matériaux à ronger (bois tendre). L’hébergement en groupe est maintenu pour le bien-être animal. Une surveillance des conflits sera réalisée. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel de l’animalerie qui est sensibilisé aux différents modèles. Les expérimentateurs sont tous titulaires du niveau « concepteur et réalisateur de projet » ainsi que de la formation de chirurgie sur rongeurs. Après leur arrivée à l’animalerie, une période de repos d’une semaine est observée afin d’acclimater les animaux à leur nouvel environnement. Pour limiter l’anxiété des animaux, ils sont habitués à la contention dès leur arrivée à l’animalerie et à l’appareillage des tests comportementaux pendant 3 jours avant le test. De plus, le personnel de l’animalerie et les expérimentateurs utilisent dès que possible la technique du cupping pour limiter l’anxiété des souris lors du transfert des animaux. Afin de limiter la souffrance liée au tatouage des animaux, ils sont identifiés par un marquage sur la queue réalisé une fois par semaine. Des points limites ont été définis pour cette étude et seront mis en place. Ils sont suffisamment prédictifs et précoces pour limiter la douleur à son minimum. Des points limites ont été définis pour cette étude et seront mis en place. Ils sont suffisamment prédictifs et précoces pour limiter la douleur à son minimum.
Choix des espèces
La souris est habituellement utilisée pour ces travaux portant sur les douleurs neuropathiques périphériques. D’autres travaux antérieurs de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures ainsi que du modèle de neuropathie chimio-induite (choix des doses et du temps de traitement). Enfin, la souris possède une activité et un comportement spontané tout à fait adapté à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de la neuropathie. Les animaux auront 8 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 9 semaines au début des expérimentations. L’âge de 9 semaines est communément choisi pour ce type de projet. Il s'agit du stage "adulte" de la souris pour mimer au mieux une douleur neuropathique aussi au stade adulte chez l'homme et pour éviter tout phénomène biologique aux âges extrêmes de l'animal.
Régénération de tissu adipeux à l’aide de matrices en polymères et d’hydrogels résorbables
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 750
Cochons : 84
Deux heures d'anesthésie par mini-porc pour l'implantation, puis un suivi par IRM à un, trois, six et neuf mois et à un an : 840 souris, 750 rats et 84 mini-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des matrices en polymères et des hydrogels leur sont implantés sous la peau ou dans une chambre d'ingénierie tissulaire, avec un prélèvement sanguin pendant la chirurgie, pour mettre au point une reconstruction du sein et de l'hypoderme destinée à remplacer implants en silicone et transferts de graisse. Le porteur annonce des risques de rejet, d'inflammation locale et de toxicité, et prévoit l'explantation ou la mise à mort selon la gravité de l'état de l'animal. Le choix des espèces tient à la ressemblance de leur peau avec la peau humaine et à leur taille, qui permet de tester plusieurs conditions sur un même individu.
Objectifs
Actuellement, les solutions cliniques pour la reconstruction des couches profondes de la peau et du sein à l'aide de tissu adipeux présentent des limitations significatives. Les procédures de transfert de graisse autologue peuvent entraîner des complications au site donneur et ne garantissent pas des résultats prévisibles. L'introduction de corps étrangers comme les implants mammaires en silicone comporte des risques potentiels pour la santé et nécessite une surveillance à long terme. Les approches de reconstruction cutanée après une atteinte profonde se concentrent sur l'utilisation de greffes de peau, négligeant l'hypoderme et limitant ainsi la reconstruction complète. Ce projet vise à développer une approche novatrice et biocompatible pour la régénération du tissu adipeux. Cette solution repose sur l'utilisation synergique d’une matrice en polymères et d'hydrogels cellularisés, offrant ainsi une alternative esthétique et fonctionnelle prometteuse pour les patient(e)s. Le premier objectif est d'évaluer la biocompatibilité des hydrogels utilisés dans cette approche. Il est essentiel de s'assurer que ces matériaux ne provoquent pas de réactions indésirables et qu'ils favorisent la régénération du tissu adipeux. Utilisant un modèle animal, nous chercherons à comprendre les interactions complexes entre les adipocytes, l'hydrogel, la matrice polymère, et l'organisme hôte. Cette étape est cruciale pour optimiser la compatibilité et l'intégration des matériaux dans le corps. Nous évaluerons également la possibilité d'utiliser des cellules souches humaines dans la combinaison hydrogel/matrice, en utilisant un modèle de souris immunodéprimées. Cette approche permettra de simuler au mieux les conditions humaines et d'évaluer l'efficacité de la régénération tissulaire. Afin d’étudier l’influence des matériaux sur un modèle de rongeur qui permet de tester des matériaux de taille moyenne, le rat sera employé pour une première comparaison des différentes combinaisons. Une fois la meilleure combinaison hydrogel/matrice sélectionnée, nous réaliserons des tests sur le porc, un modèle animal plus proche de l'homme en termes de physiologie et de composition cutanée. Cette étape sera cruciale pour valider l'efficacité clinique. Ce projet est porteur d'un potentiel majeur pour l'innovation en chirurgie plastique et reconstructrice, et il pourrait révolutionner les pratiques à l'échelle mondiale.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche vise à déterminer les combinaisons optimales d'hydrogels et de matrices pour la régénération du tissu adipeux, avec des implications majeures à la fois sur le plan clinique et scientifique. Il offre la possibilité d'améliorer considérablement les options de reconstruction mammaire et cutanée actuellement disponibles, en limitant les inconvénients des méthodes traditionnelles et en garantissant une meilleure biocompatibilité et performance.
Procédures
Ce projet se déroule en plusieurs étapes. Après une période d'acclimatation d'au moins une semaine, tous les animaux (840 souris, 750 rats et 84 mini-porcs) seront anesthésiés par inhalation (15 minutes pour les rongeurs et 1 heure pour les mini-porcs). Pour les rats, le pelage sera tondu dans les zones d'implantation (10 secondes). Pour tous les animaux, les zones d'implantation seront désinfectées à l'aide d'un désinfectant (10 secondes). Pour la procédure ayant pour but d'évaluer la biocompatibilité des hydrogels, une injection en sous-cutanée sera effectuée (10 min, 130 souris et 130 rats). Pour obtenir un tissu adipeux vascularisé reconstruit, une combinaison de chambres d'ingénierie tissulaire (pour la reconstruction du sein, 250 souris, 250 rats, 80 porcs) ou de matrices 3D (pour la reconstruction de l'hypoderme, 250 souris, 250 rats, 24 porcs) sera associée à des hydrogels cellules ou à de la graisse (durée totale de l'anesthésie : 30 minutes par rongeur ou 2 heures par mini-porc). Pendant la chirurgie, un prélèvement sanguin sera effectué. Afin d’avoir un applicatif clinique, il est nécessaire d’évaluer si la cryopréservation des construits permet d’obtenir la même performance que des construits préparés extemporanément, de ce fait 150 souris et 130 rats seront implantées avec des construits ayant bénéficié de différentes méthodes de cryopréservation. Toutefois, la procédure appliquée à ces animaux est identique à celles expliquées précédemment. Pour les souris et les rats, un essai de survie cellulaire in vivo sera suivi longitudinalement par bioluminescence. À cette fin, les animaux seront placés sous anesthésie gazeuse (10 minutes). Pour les rats et les porcs (utilisant une chambre d'ingénierie tissulaire pour la reconstruction du sein), le suivi longitudinal de la croissance du lambeau sera effectué par IRM à 1, 3, 6, 9 mois et 1 an après l'implantation. Pour cela, les animaux seront sous anesthésie gazeuse (durée de la procédure : 30 minutes par animal).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pouvant être constatés sont une irritation ou une inflammation locale à proximité du matériau, des risques de rejet ou de toxicité locale et systémique. Afin de limiter les risques, de nombreuses expériences in vitro ont été effectuées, ne montrant pas de signe de toxicité. De plus, des mesures sont mises en place et les animaux feront l’objet d’une vigilance quotidienne et rigoureuse pour détecter tout signe de souffrance ou d’approchement de point limite. Un contrôle du site opératoire sera réalisé lors de chaque visite quotidienne. La prise pondérale sera évaluée deux fois par semaine. Un traitement antidouleur sera administré, et si nécessaire, des mesures telles que l'explantation ou la mise à mort de l'animal seront envisagées en fonction de la gravité de son état.
Devenir
Du fait de notre protocole, nos animaux ne peuvent pas être replacés. Il est nécessaire de mettre à mort nos animaux pour réaliser nos prélèvements histologiques.
Remplacement
Nous avons employé une variété de techniques in vitro pour évaluer l'impact de nos polymères sur le destin des cellules, y compris leur survie et leur différenciation ainsi que sur l'angiogenèse en utilisant la membrane chorioallantoïque de poulet comme modèle. Toutefois, afin de déterminer pleinement les performances de nos biomatériaux en matière de régénération tissulaire, il est impératif de procéder à des essais in vivo. Ces expériences permettront de prendre en compte la complexité d'un système physiologique réel, incluant notamment les réponses inflammatoires, la formation de tissu cicatriciel, et les processus naturels de guérison. Les études in vivo nous fourniront ainsi des données cruciales pour optimiser notre technique avant de franchir l'étape des études cliniques.
Réduction
Une étude pilote sera réalisée dans un premier temps afin de vérifier que les conditions expérimentales choisies sont adéquates. Les études in vitro précédemment réalisées ont démontré l’efficacité des différents polymères résorbables quant à leur influence sur la survie et la prolifération cellulaire ainsi que sur la différenciation adipocytaire. Elles ont permis une sélection des polymères permettant le maintien des adipocytes et favorisant la néovascularisation. Elles ont également pu donner une idée du temps de résorption des polymères dans un liquide physiologique reconstitué à 37°C. Les expériences seront réalisées de manière séquentielle, ce qui permettra de limiter le nombre de répétition en fonction des résultats des groupes précédents. En fonction des résultats, les tests statistiques adéquats seront utilisés pour analyser les résultats.
Raffinement
Afin de limiter au minimum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de maximum 5 animaux par cage pour les souris et en hébergement unique pour les rats et les mini-pigs. Cet environnement est enrichi (balle pour le mini-pig par exemple) et dans des conditions classiques de stabulation (température régulée, cycle jour/nuit). Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés de 7 à 10 jours dans leur salle d’hébergement. Les animaux seront manipulés individuellement avant la mise en place de l’expérimentation et dans une pièce séparée des autres animaux afin réduire leurs stress et angoisse. Lors de l’expérimentation, les animaux seront anesthésiés avant toute procédure pouvant provoquer un stress, une angoisse ou une souffrance. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement, de manière à pouvoir détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou d’angoisse. En cas de souffrance (modification de l’apparence, prostration, poil hérissé, perte de poids…), un traitement analgésique sera envisagé. Des points limites adaptés pour chaque procédure seront définis avant l’expérimentation et dans le cas où ceux-ci seraient atteints ou que le traitement analgésique n’aurait pas d’effet, les animaux seront mis à mort selon la méthode définie (avec anesthésie au préalable). La mise à mort sera réalisée à distance des autres animaux.
Choix des espèces
Le porc et le rat sont des espèces appropriées pour étudier les processus de régénération de la peau car les structures anatomiques et physiologiques de leurs peaux sont celles qui ressemblent le plus à celle des humains. Le rat est un animal que nous avons fréquemment utilisé dans nos études précédentes et dont le modèle est maitrisé. De plus, notre équipe maîtrise maintenant la levée des lambeaux chez ces espèces pour nos modèles de régénération du sein. La taille du porc et du rat nous permet de tester plusieurs conditions sur un seul animal et ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Notre intérêt s’est porté sur les souris standards, immunodéprimées utilisées dans une étude de reconstruction de la peau humaine et humanisées qui permettent d’évaluer le comportement de cellules/tissus humains en présence de nos biomatériaux. Les souris sont âgées de 8 semaines et pesant 20 à 23 grammes afin que les souris aient atteint leur maturité sexuelle. Utiliser des souris matures permet d'avoir une taille adéquate pour réaliser l'implantation. Les rats adultes sont agêes de 15 semaines minimum afin d'avoir une réserve de graisse sous-cutanée suffisante pour réaliser les implantations et permettre de tester plusieurs conditions expérimentales sur un même animal. Pour les porcs, nous utiliserons deux types d'animaux : des porcs 45 à 55kg pour la reconstruction de la peau afin d’éviter d’avoir un hypoderme trop épais (car la zone à reconstruire serait trop importante et peu représentative d’un hypoderme humain) et des porcs de 70 kg pour la reconstruction du sein afin que la taille de l’animal soit compatible avec l’implantation de chambre équivalente à celle que l’on pourrait implanter chez l’humain.
Evaluation de l’effet antitumoral de vaccins anti-CD40 dans les cancers dérivés d’une infection au Papillomavirus Humains (HPV)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Pour mettre au point un vaccin contre le papillomavirus et les cancers qu'il provoque, 695 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une greffe de 20 000 cellules tumorales sous la peau, puis subit des mesures de tumeur au pied à coulisse tous les deux ou trois jours et jusqu'à huit prélèvements sanguins submandibulaires sur animal vigile. Le porteur décrit une tumeur qui se développe sous la peau sans toucher les organes internes, tout en prévoyant le cas d'un échappement métastatique provoquant perte d'appétit, amaigrissement, agressivité et isolement. Deux points limites sont annoncés, la nécrose de la tumeur et sa taille quand elle gêne la mobilité de l'animal, avec une surveillance tous les deux ou trois jours à partir du vingtième jour après la greffe.
Objectifs
Cette étude fait partie d’un projet de recherche translationnelle (d’une étude pré-clinique vers une évaluation clinique) pour déterminer le meilleur protocole de vaccination contre le papilloma virus et contre les cancers en dérivant. Pour cela, différents paramètres vont être affinés : les voies d’injection, la nécessité d’utiliser ou non un adjuvant et la fréquence d’administration du vaccin. Enfin dans le cadre de l’effet anti-tumoral, l’efficacité de cette vaccination sera testée en prophylaxie, mais également en thérapeutique.
Bénéfices attendus
Ce projet est dans la continuité d’études préexistantes utilisant une technologie particulière pour la vaccination. Le vaccin est un anticorps qui cible des cellules importantes dans la mise en place d’une réponse immunitaire vaccinale. Ce type de vaccin a démontré une bonne efficacité pour d’autres pathologies. Pour certains de ces pathogènes, ce vaccin a permis de générer une réponse immunitaire mémoire protectrice. Cette étude nous permettra d’étudier les réponses immunitaires mémoires générées, et en particulier ces cellules avec un plus haut degré de protection. Bien sûr, de manière plus large, ce projet vise à introduire un nouveau type de vaccin contre le Papillomavirus Humain avec des propriétés thérapeutiques anti-tumorales. Ce type de vaccin cible des populations plus vulnérables dans les pays en voie de développement qui ont une faible couverture vaccinale, associée à un système de prévention et de diagnostic non optimal.
Procédures
Dans ces procédures, les vaccins sont injectés à des moments précis selon la procédure impliquée. Ces injections ne durent que quelques secondes, sur des animaux sous anesthésies, et selon un volume en adéquation avec les limites autorisées ne dépassant pas 50µl. Des prélèvements périodiques de sang sont pratiqués sur les souris au cours des procédures. Il s'agit d'un prélèvement submandibulaire à Jour 0, 8, 15, 21, 28 et 35. (Dans le cadre des expérimentations sur 90 jours, deux autres points de prélèvement sont effectués, à jour 60 et 90). Ces prélèvements ne durent que quelques secondes également, et sont pratiqués avec une fine aiguille sur animaux vigiles. Sur les procédures de croissance tumorale, une greffe de cellules tumorales est effectuée. Les cellules tumorales sont injectées par une seringue avec une fine aiguille. La greffe se fait en sous cutanée, le geste durant 10 à 20 secondes sur animaux vigiles. Enfin la mesure des tumeurs se fait de manière périodique (2-3 jours) par l’intermédiaire d’un pied à coulisse. La mesure dure 30 secondes sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les souris impliquées seulement dans la procédure de vaccination ne subissent pas de nuisances ou d’effets indésirables lourds, outre les injections répétées du vaccin. La réponse immunitaire générée est sans conséquence sur l’animal tout le long de la cinétique expérimentale. En revanche, les animaux impliqués dans les procédures de croissance tumorale sont greffés avec des cellules tumorales via une injection sous-cutanée. Cette greffe produit des lésions cutanées tumorales, puis le développement d’une tumeur. La croissance tumorale est cependant contrôlée à la fois par la quantité de cellules injectées et par la cinétique expérimentale associée à cette dose. La dose de cellules tumorales injectée est de 20 000 cellules, elle a été définie au sein d’un laboratoire partenaire et a fait l’objet d’une publication. La tumeur se développe sous la peau, les organes internes de l’animal ne sont pas touchés. Le mal-être de l’animal issu d’une défaillance d’organes ne peut donc pas être atteint, excepté en cas d’échappement métastatique. Dans ce cas des métastases se forment dans les organes internes de l’animal provoquant des changements physiologiques comme « perte d’appétit » (sans aucun autre signe clinique) et « amaigrissement », puis des changements comportementaux comme « agressivité » et « isolement ». Des nuisances ou effets indésirables apparaissent en fin de cinétique au niveau de la tumeur avec notamment l’apparition de parties nécrosées au sein de la tumeur et sa taille pouvant gêner la mobilité de l’animal. Ces deux points sont alors des points limites expérimentaux.
Devenir
L'ensemble des animaux est mis à mort afin de déterminer l'évolution de la réponse immunitaire sur la totalité de la cinétique expérimentale.
Remplacement
Sur la question du « Remplacement », les expérimentations in vitro ne rendent pas compte de toute la complexité rencontrée dans la mise en place de la réponse immunitaire (multi-cellulaires et multi-organes), et de la relation entre le système immunitaire et la tumeur, notamment à cause des différents organes et types cellulaires impliqués. A l’heure actuelle il n’existe pas de modèles expérimentaux in vitro ou ex vivo qui permettent de suivre la réponse anti-tumorale. L’expérimentation animale reste dans ce cas la solution de référence pour étudier l’effet du vaccin anti-CD40.E6-E7.
Réduction
Dans le cadre de la « Réduction », nous avons calculé le nombre minimal de souris nécessaires pour que les résultats soient significatifs. Ce nombre, impliquant tous les groupes des trois procédures, est estimé à 695 souris et est calculé sur la base d’une formule statistique validée et couramment utilisée dans ce cadre.
Raffinement
Pour les stratégies de « Raffinement », nous allons donner tous les produits nécessaires au bien-être animal, réduisant au maximum la souffrance animale, qu’elle soit physique ou psychique. Au niveau de l’hébergement au cours de l’expérimentation, des produits d’enrichissement sont utilisés comme différents types de neslets, des tubes de carton et des dômes de carton. Au cas où la souffrance animale apparait après échappement métastatique sans que nous puissions la résoudre, nous avons créé une grille regroupant les symptômes caractéristiques. Cette grille nous permet d’évaluer la souffrance de l’animal, et ainsi de définir des points limites. Si ces points limites sont atteints, nous sacrifions l’animal. L’animal sera surveillé sur la base de cette grille à partir du vingtième jour après la greffe tumorale sachant que les symptômes décrits dans la grille ne doivent pas apparaitre sur l’ensemble de la cinétique expérimentale. La surveillance se fera tous les 2-3 jours, jusqu’à la mise à mort.
Choix des espèces
La souris est l’espèce majoritairement utilisée pour les modèles du cancer, et ces modèles se prêtent généralement aisément à un transfert de technologie chez l’Homme. De plus, les modèles murins ont cet avantage d’avoir un catalogue de modifications génétiques et de lignées cellulaires importantes qui permettent un meilleur décryptage des voies de signalisation et mécanismes impliqués dans les effets observés. Ainsi les souris sélectionnées pour cette étude qui sont immunocompétentes et qui présentent donc une réponse immunitaire complète, pourront être comparées dans leurs réponses immunitaires aux souris ayant des modifications génétiques. Les souris sont âgées de 6-12 semaines, afin de limiter la variabilité liée à l’âge qui nécessiterait d’utiliser plus d’animaux.
Etablissement d’une corrélation entre le génotype, la morphologie synaptique, la structure cérébrale et les déficits cognitifs de deux modèles murins porteurs de mutations associées chez l’Homme à de la déficience intellectuelle.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Privées d'eau en dehors de dix minutes par jour du lundi au vendredi pour être "motivées" aux tests d'apprentissage, 135 souris mâles passent trois épreuves comportementales pendant quatre mois. 244 souris sont utilisées au total, 180 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 64 opérées sous anesthésie puis tuées avant tout réveil. Le porteur écrit qu'il y a "très peu d'effets indésirables attendus" et que les tests se font "sans aucune douleur ni peur induite", tout en précisant que la biopsie de queue et le tatouage des pattes sont pratiqués à sept jours sans sédation, au motif que "la nociception n'est pas encore opérationnelle" à cet âge. 100 souris sont déclarées réutilisées, les femelles gardées pour la reproduction restant en vie, les autres étant tuées, les mâles après les tests, l'apprentissage ayant selon lui "probablement modifié de nombreux paramètres cérébraux".
Objectifs
La déficience intellectuelle affecte entre 2 et 3 % de la population et de nombreuses mutations ont été identifiées dans plus de 300 gènes chez les patients. Dans ce contexte, nous nous intéressons particulièrement à un gène situé sur le chromosome X pour lequel une trentaine de mutations différentes ont été rapportées chez l’Homme. Toutes ces mutations mènent toujours à de la déficience intellectuelle (DI) mais aussi à une grande variété de traits physiques ou neuropsychiatriques associés, souvent différents d’un patient à un autre. De nombreux patients présentent par exemple des défauts morphologiques du cerveau et du cervelet (plus gros ou plus petits que la moyenne) ou des structures mal formées. Afin de pouvoir proposer des stratégies thérapeutiques adaptées, il est nécessaire de comprendre cette diversité de signes cliniques. Nous souhaitons donc comparer deux modèles souris qui portent deux mutations différentes d’un même gène. L’une d’entre elle est responsable d’une déficience intellectuelle modérée à sévère sans autre trait clinique, alors que la seconde mutation est responsable d’une déficience sévère associée à des traits autistiques, de l’anxiété, de l’auto-agressivité et des anomalies morphologiques du cerveau. Nous analyserons les différences observées au niveau des capacités d’apprentissage et de mémoire de ces animaux ainsi que les différences morphologiques du cerveau observées par IRM et par microscopie électronique (structure très fine des neurones).
Bénéfices attendus
Dans le domaine de la déficience intellectuelle et des défauts neurologiques associés, les approches thérapeutiques sont assez rares. Il est cependant communément admis qu’une médecine personnalisée est nécessaire afin d’adapter l’approche thérapeutique à chaque cas individuel au vu de la diversité des tableaux cliniques observés. Ce projet nous permettra de faire une véritable étude comparative de deux modèles souris aussi bien au niveau des défauts d’apprentissage et de mémoire qu’au niveau de l’organisation structurelle du cerveau. Cette étude nous permettra d’établir une corrélation précise entre les défauts que nous observons in vitro, les défauts cellulaires ou tissulaires et les défauts d’apprentissage…. Nous pourrons donc mieux comprendre le rôle de notre protéine d’intérêt dans le fonctionnement « normal » du cerveau ainsi que les défauts provoqués par les mutations décrites chez les patients. Nous avons pour but de mieux définir quelques paramètres (capacités d’apprentissage, morphologie de certaines zones du cerveau) qui pourraient nous permettre d’évaluer facilement dans le futur l’efficacité thérapeutique de nouvelles approches, pharmacologiques par exemple.
Procédures
Tous les animaux subissent une biopsie de queue à l'âge de 7 jours afin de réaliser le génotypage. Ainsi les animaux mâles peuvent être répartis en mélangeant les deux génotypes au sein d'une même cage au moment du sevrage. Les animaux mâles seront manipulés pour réaliser les tests d'apprentissage. Nous avons prévu de réaliser 3 tests comportementaux distincts, chacun étant effectué sur un lot de 45 souris (total de 135 souris) et pendant une durée maximale de 4 mois. Ces tests comportementaux nécessitent une restriction hydrique pour que les animaux soient motivés pour réaliser le test. Les souris ont cependant de l’eau à volonté pendant 10 minutes par jour à la fin des essais quotidiens et les biberons d’eau sont remis à disposition chaque vendredi et ré-enlevés le dimanche midi. Une partie des animaux sera anesthésiée à l'âge adulte en vue d'une chirurgie terminale qui a pour but le prélèvement post-mortem du cerveau et son étude anatomique.
Impact sur les animaux
Il y a très peu d’effets indésirables attendus chez les animaux. Les tests comportementaux sont réalisés sans aucune douleur ni peur induite. La seule nuisance légère est la restriction hydrique qui est nécessaire pour garantir un bon niveau de motivation des souris pour les tests cognitifs. Pendant cette période, les biberons sont mis à disposition pendant 10 minutes par jour du lundi au vendredi et pendant toute la journée les samedis et dimanches. En ce qui concerne les lots d’animaux qui seront utilisés pour l’analyse morphologique du cerveau, la chirurgie terminale est réalisée après administration d’analgésique et d’anesthésique. En accord avec notre vétérinaire référent, le prélèvement de queue pour réaliser le génotypage ainsi que l'identification par tatouage des pattes sont réalisés de façon précoce (à 7 jours) sans sédation car le système neurologique se met à peine en place et la nociception n’est pas encore opérationnelle. »
Devenir
A l'issue de la procédure de génotypage, les femelles pouvant servir à la reproduction sont maintenues en vie et celles qui ne peuvent pas être utilisées seront mises à mort. Tous les mâles seront maintenus en vie pour réaliser les tests comportementaux à l’âge adulte ou pour faire partie de l’étude morphologique du cerveau. A l'issue des tests comportementaux, les animaux seront mis à mort car ils ne pourront pas être réutilisés dans une autre étude, les tests d'apprentissage ayant probablement modifié de nombreux paramètres cérébraux. Les analyses morphologiques fines du cerveau nécessitent la fixation des tissus et donc la mise à mort des animaux.
Remplacement
Nous ne pouvons pas analyser la microcéphalie, l’agénésie du corps calleux ou encore l’impact d’une mutation sur les capacités cognitives sans modèle animal ; Aucune expérience in vitro ne peut donner des informations équivalentes. En revanche, toutes les étapes de caractérisation des défauts biochimiques et cellulaires induits par ces mutations sont réalisées au préalable dans des études in vitro (activité enzymatique de la protéine, interactions protéiques avec les partenaires, morphologie et migration cellulaires). Nous conservons l’utilisation des modèles animaux uniquement pour les analyses plus intégrées de type comportement.
Réduction
Pour la procédure des tests comportementaux, sur la base des études publiées et de notre expérience, nous avons estimé à 10 le nombre minimum d’animaux nécessaires par génotype dans chaque groupe (deux génotypes mutés et un groupe de WT issus des deux lignées). Avec ces premiers résultats, nous effectuerons un test de puissance afin de savoir si nous devons augmenter le nombre de souris à 12 puis à 15. Pour l’analyse, nous utiliserons des tests statistiques non paramétriques adaptés aux petits échantillons (
Raffinement
Les animaux sont élevés dans un environnement contrôlé et enrichi. Ils sont visités quotidiennement par l’équipe de zootechnie. Les évaluations des fonctions cognitives ne nécessitent pas d’isolement des animaux, sauf au moment de la tache comportementale. Afin de s’assurer que la restriction hydrique nécessaire n’altère en rien leur santé et leur bien-être, chaque souris est pesée et évaluée chaque jour à l’aide d’une grille individuelle d’observation. Sur cette grille, différents items (apparence, hydratation, poids …) sont scorés. Les performances cognitives des souris pouvant être altérées par un mal-être, si le score total dépasse 5, l’animal est retiré des tests et sa restriction hydrique est terminée.
Choix des espèces
La souris possède un génome relativement identique à celui de l’homme, les mécanismes moléculaires et cellulaires sont similaires, ainsi que de très nombreux mécanismes cognitifs. Par ailleurs, cet animal permet des approches génétiques puissantes. Enfin, les spécificités de notre gène dont deux variants sur quatre n’existent que chez les mammifères nous obligent à choisir comme modèle animal une espèce mammifère. De plus, la transgenèse permettant de reproduire les mutations humaines n’existe actuellement que chez la souris. Nous utiliserons uniquement des souris adultes. Les tests cognitifs commencent lorsque les animaux ont 2,5 mois. Nous cherchons dans un premier temps à corréler les défauts cognitifs au génotype et aux altérations morphologiques du cerveau observées après les étapes de développement. Les animaux utilisés pour l'analyse morphologique du cerveau seront âgés également de 2 à 3 mois.
Test d’efficacité d’un candidat-vaccin sublingual contre le virus de la grippe
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Reçues à l'animalerie à douze mois et gardées jusqu'à vingt-deux, une partie des souris attend dix mois avant d'être infectée, un vieillissement en cage que le porteur associe lui-même à de l'alopécie, à de l'hypothermie et à des blessures de combat. 80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes. Chacune reçoit trois administrations sublinguales ou trois inoculations nasales sous anesthésie, des injections sous la peau ou dans le muscle, un prélèvement de sang à l'œil, puis le virus de la grippe, la perte de poids qui suit servant à mesurer l'efficacité vaccinale. Le porteur présente ces souris comme un passage obligé "avant de passer à des animaux plus pertinents et proche de l'humain", nommément le primate non humain.
Objectifs
Actuellement, la vaccination classique dirigée contre la grippe utilise la voie d’injection par aiguille. Cependant, ce mode d’administration ne procure qu’une immunité partielle (production d’anticorps au niveau sanguin) ce qui n’empêche pas l’entrée des pathogènes dans notre corps. La voie muqueuse nez/bouche/gorge est une voie intéressante car ces muqueuses sont la porte d’entrée du virus de la grippe. Il a été décrit dans la littérature scientifique que la vaccination par cette voie peut permettre l’induction d’une double protection immunitaire dans le sang et dans les muqueuses, et ainsi diminuer le risque d’infection et de transmission du virus. Les objectifs de ce projet sont d’évaluer et de comparer la réponse immunitaire vaccinale dirigée contre le virus de la grippe après un rappel de vaccination par voie sublinguale, sur des animaux jeunes et âgés. En effet, les personnes âgées sont une population particulièrement à risque dans les cas d’infection par le virus de la grippe. Tous les animaux du projet seront infectés par le virus de la grippe afin de comparer l’efficacité de notre candidat sublingual avec un vaccin commercial de référence. Un suivi du poids après l’infection sera effectué afin de mesurer l’efficacité de notre candidat vaccin sublingual. L’objectif au long terme de ce projet est d’élaborer un vaccin capable d’induire une immunité durable dans le sang et les muqueuses à la fois chez les individus jeunes et âgées.
Bénéfices attendus
Les bénéfices scientifiques du projet concernent majoritairement l’évaluation de l’efficacité vaccinale d’un candidat administré par voie sublinguale, en fonction de l’âge. Le bénéfice majeur du projet à long terme est le développement d’un vaccin à administration muqueuse (sublinguale) qui réduira drastiquement l’infection et la transmission des virus respiratoires. En cas de succès, ce projet sera étendu à d’autres virus respiratoires (SARS-Cov-2, Virus Respiratoire Syncytial…).
Procédures
- Administrations par voie sublinguale pouvant générer un stress supplémentaire pour l’animal notamment par la contention, nous effectuerons donc ce geste sous anesthésie gazeuse (3 fois/animal, durée : 15 minutes). Sur 2 lots (20 animaux). - Administrations par voie intranasale (infection virale) sont des actes pouvant générer un stress supplémentaire pour l’animal notamment par la contention. Nous effectuerons donc ce geste sous anesthésie générale (3 fois/animal, durée : environ 30 minutes). Sur tous les lots (80 animaux). - Injections par voie sous-cutanée ne nécessitent pas d’anesthésie au préalable (3 fois/animal, durée : 5 minutes). Sur quatres lots (40 animaux). - Injections par voie intramusculaire ne nécessitent pas d’anesthésie au préalable (2 fois/animal, durée : 5 minutes). Sur deux lots (20 animaux). - Prélèvement sanguin à l’œil est un geste qui dure 30 secondes maximum. Ce geste est une technique pouvant induire un stress supplémentaire à l’animal, notamment par la contention. Nous effectuerons donc ce geste sous anesthésie générale additionnée d’une anesthésie locale (1 seule fois/animal, durée : 5 minutes). Sur tous les lots (80 animaux).
Impact sur les animaux
- Administration sublinguale et intranasale : ces gestes seront réalisés sur l’animal anesthésié et peuvent induire un inconfort léger après leur réveil. - Infection par le virus de la grippe : une perte de poids est attendue, correspondant aux symptomes d’une infection par le virus de la grippe chez la souris. - Injection en sous-cutané et dans l’abdomen : ces gestes seront réalisés sur animaux vigiles sous contention et peuvent générer un stress chez l’animal. - Injection par voie intramusculaire : ces gestes seront réalisés sur animaux vigiles sous contention. Une augmentation de la température corporelle est envisageable après les immunisations. - Immunisation : Une petite fièvre passagère est envisageable après les vaccinations. - Prélèvement de sang à l’oeil : Ces prélèvements sont réalisés sous anesthésie et peuvent induire des lésions au niveau de l’œil ainsi un inconfort léger après leur réveil. - Vieillissement des animaux : les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 12 mois et seront hébergées jusqu’à un âge maximal de 22 mois. Cette durée prolongée d’hébergement peut être la source de stress et d’anxiété chez l’animal pouvant entrainer divers symptômes liés au vieillissement (alopécie, hypothermie, blessure liée au combat…).
Devenir
A l’issue de la procédure, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements d’organes.
Remplacement
Avant l’utilisation des candidats vaccins sur l’animal, des études de toxicité et de réponse inflammatoire ont été menées sur des cultures cellulaires épithéliales et immunitaires. De manière générale, la vaccination repose sur la mise en place d’une réponse immunitaire faisant appel à l’ensemble des organes lymphoïdes, dont les ganglions lymphatiques et la rate, et dans différents organes ciblés. Le recours à l’animal est donc incontournable, nous n’avons donc pas d’autre solutions que d’utiliser l’animal dans son entier pour étudier la réponse immunitaire de nos candidats vaccins.
Réduction
Dans l’ensemble, le nombre d’animaux utilisé a été réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet et la significativité statistique des expérimentations. Il a été évalué pour 2 ans à 80 souris. Pour la procédure, des groupes de 10 souris/lot ont été calculés pour répondre à l’objectif. Les analyses se feront avec des statistiques classiquement décrites pour les études vaccinales.
Raffinement
- Les injections et prelèvements seront réalisés sous anesthésie. Après chaque anesthésie, le bon réveil des souris sera vérifié (mouvement de la souris, comportement, prise de boisson ou de nourriture) avant de les renvoyer dans leur pièce d’hébergement. - Le suivi des animaux après chaque étape des procédures comprend : la réalisation d’une pesée de l’animal et l’observation de l’activité/comportement (isolement, dos vouté, etc…), des modifications physiques (inflammation/rougeur au niveau des sites d’administration : gueule/langue, museau ou abdomen). En complément, une prise de la température de l’animal sera effectuée chaque semaine. En cas de variation importante de la température, une nouvelle mesure sera effectuée toutes les 24h et des moyens seront mis en œuvre pour la rétablir (anti-inflammatoire, armoire chauffante). - En cas de perte de poids importante, de la nourriture se mise à disposition au sol dans la cage. - En cas de lésion cutanée, une pommade nettoyante et cicatrisante sera appliquée sur la zone et si besoin un isolement de l’animal sera effectué.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris qui sont un modèle très adapté aux études de l’immunité car il existe beaucoup d’outils biologiques d’analyses de la réponse immunitaire chez la souris, qui est bien caractérisée. Les souris seront utilisées à partir de 10 semaines de vie (ce qui correspond à un jeune adulte avec une système immunitaire mature) ou entre à partir de 16 mois (ce qui correspond à une population âgée) afin de comparer l’efficacité du vaccin à deux âges différents. De plus, la lignée choisie présente des caractéristiques immunitaires proches de l’humain. Cette faculté est primordiale pour l’analyse de candidat vaccin. Ces modèles sont essentiels avant de passer à des animaux plus pertinents et proche de l’humain dans un contexte d’infection viral, tel que le primate non humain.
Dépletion des pericytes corticaux chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées pour l'analyse post-mortem de leur cerveau, 320 souris vont être utilisées, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, l'autre un niveau léger. Toutes reçoivent une injection intrapéritonéale par jour pendant quatre jours, et une partie subit une chirurgie terminale de quinze minutes sous anesthésie pour le prélèvement d'organes. Le porteur indique que ces injections peuvent provoquer un léger retard de croissance chez les jeunes et rendre les femelles stériles, effets qu'il rapporte sans en tirer de conséquence sur le protocole. Il affirme le recours à la souris "essentiel", sans expliquer comment le nombre de 320 animaux a été établi pour les quatre stades de développement étudiés.
Objectifs
La forme familiale primaire de calcification cérébrale (PFBC) consiste en une calcification progressive des vaisseaux sanguins cérébraux provoquant leur dégénérescence. Les anomalies génétiques responsables de cette maladie ont principalement été trouvées sur la voie Pdgfb. Les modèles murins génétiques ciblant la voie Pdgfb reproduisent partiellement le phénotype de la maladie. Dans ces modèles murins génétiques, la perte totale soit du Pdgfb, soit de son récepteur, entraine la mort des souris avant la naissance, alors que la maladie humaine apparait après plusieurs mois de vie. Une altération partielle de cette voie, par des mutations ciblées soit du Pdgfb ou de son récepteur reproduisent une partie des anomalies de la maladie humaine. Cependant, ils présentent le désavantage de mélanger des mécanismes physiopathologiques différents (développementaux, inflammation, vieillissement), qui empêche une compréhension fine de cette maladie. Nous proposons ici de développer une nouvelle approche pharmacologique à différents stades de développement précis pour décortiquer les différentes composantes cellulaires impliquées à chaque stade. L’efficacité du traitement sera évaluée par le taux de perte des pericytes (une population cellulaire particulière présente sur les vaisseaux sanguins) sur le réseau capillaire cortical comme dans les autres modèles murins déjà étudiés. Ce projet nécessitera un total de 320 souris.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la PFBC et dans le développement de l’unité gliovasculaire du cerveau. Ce projet apportera des éléments de connaissances essentiels sur de nombreuses pathologies cérébrales dans lesquelles ces régulations sont altérées pour in fine proposer de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
L’ensemble des animaux recevra 1 injection intrapéritonéale par jour pendant 4 jours, dont le volume et concentration dépend de l’âge étudié. Une partie des animaux sont soumis à une chirurgie terminale sans réveil pour le prélèvement d’organe, qui dure 15minutes.
Impact sur les animaux
En fonction de l’âge d’administration, et en se basant sur les données connues sur les modèles génétiques, les souris pourraient éventuellement souffrir d’un léger retard de croissance (injections aux stade jeunes) et une stérilité chez les femelles (injections chez les jeunes et les adultes)
Devenir
mise à mort pour des analyses post mortem des cerveaux
Remplacement
L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe tels que les interactions entre les astrocytes, les neurones et les vaisseaux sanguins. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.
Réduction
Une première procédure a pour objectif d’établir la dose optimale sans utiliser trop d’animaux. Pour chaque stade développemental étudié, elle sera effectuée sur seulement 6 animaux/dose/protocole (temoin ou molécule effective). Ce nombre permet de réduire le nombre d’animaux utilisés, tout en vérifiant que l’effet obtenu est suffisamment robuste. Cela nous permettra de conclure sur la dose optimale à utiliser pour la suite de l’étude. Pour la suite, le nombre d'animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs.
Raffinement
Pour vérifier la bonne tolérance des animaux à l’injection répétée du produit chimique, une procédure avec des points limites gradés a été mise en place adaptée à l’âge étudié. Elle est basée sur l'apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé), la mobilité des animaux (prostration), l'absence de lésion ou saignement, la présence d'un nid dans la cage. Ces points limites intermédiaires permettent la mise en place de soins des animaux évitant l'euthanasie des animaux. Pour la la chirurgie terminale sous anesthésie générale et antalgique efficace évite toute sensation douloureuse chez l’animal. Le personnel est formé sur l’ensemble de la prise en charge des animaux (gestion optimale de l’élevage, injection intraperitonéale, gestion de l’anesthésie/analgésie, analyse des points limites).
Choix des espèces
La souris est un mammifère où les règles et les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'homme 4 stades de développement seront étudiés entre 5 et 60 jours après la naissance. Ces stades ont été choisis sur la base d’études préalables (en particulier dans notre laboratoire) qui montrent qu’il existe dès la naissance une altération du réseau vasculaire cérébral en absence de pericytes, mais que les mécanismes mis en jeux dans leur élimination/ remplacements pourraient être différents une fois passée la période développementale postnatale.