Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
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- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
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- Système respiratoire
- Système urogénital
Mise en évidence de l’effet anti-cancéreux d’un vaccin immunothérapeutique dans les tumeurs sous-cutanées de souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une injection de cellules tumorales sous anesthésie, puis quatre injections de vaccin, chacune sous anesthésie : 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs tumeurs. Le porteur décrit une douleur possible au point d'injection, puis des douleurs liées au développement de la tumeur et une dégradation visible de l'état des animaux, absence de toilettage, prostration, lenteur des mouvements. Il attend du vaccin les mêmes effets que chez l'humain, inflammation, fièvre et douleurs musculaires. Il affirme par ailleurs connaître assez bien le modèle pour arrêter chaque expérience "bien avant d'atteindre les points limites", alors que la dégradation qu'il décrit constitue un critère classique de point limite.
Objectifs
Les traitements par l’immunothérapie anti-cancéreuse ont révolutionné le traitement de certains cancers. Cependant de nombreux patients restent non-répondeurs à ces traitements. Les vaisseaux à endothélium épais associés aux tumeurs (TA-HEV) sont des vaisseaux sanguins particuliers qui servent de portes d’entrées majeures à des lymphocytes tueurs. Ces lymphocytes sont des cellules du système immunitaire capable de tuer les cellules cancéreuses. L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet antitumoral d’un vaccin immunothérapeutique qui permettra d'augmenter les vaisseaux TA-HEV, donc d'augmenter les portes d'entrées au sein de la tumeur pour permettre un meilleur recrutement des lymphocytes tueurs.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mettre en évidence un effet anti-tumoral puissant médié par les lymphocytes T et les TA-HEV. Cela permettra donc à court terme d’établir la preuve de concept de l’effet antitumoral du vaccin. Et à plus long terme de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique permettant de traiter des patients non répondeurs aux thérapies anti-cancéreuses actuellement disponibles.
Procédures
Les souris subiront une injection de cellules sous anesthésie (2-3 minutes) et subiront 4 injections de vaccins sous anesthésie (10 secondes à 1 minute)
Impact sur les animaux
L’injection des cellules tumorales peut induire du stress et une douleur légère au site d'injection. Le développement tumoral peut aussi causer des douleurs et une dégradation visible de l’état des animaux (absence de toilettage, prostration, lenteur dans les mouvements…). Les vaccins peuvent avoir des effets indésirables identiques à ceux observés chez l'homme : inflammation, fièvre et douleurs musculaires.
Devenir
L’ensemble des animaux est mis à mort à l'issue de la procédure pour des prélèvements de tumeurs
Remplacement
La procédure réalisée sur l’animal dans le contexte de ce projet ne peut pas être remplacée par des méthodes expérimentales alternatives. En effet, il n’est pas possible à l’heure actuelle de disposer de modèles in vitro permettant d'intégrer à la fois le système immunitaire, le développement d'une tumeur et le système vasculaire sanguin. De plus les vaisseaux auxquels nous nous intéressons dans ce projet ne conservent pas leur caractéristiques en dehors d'un organisme vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque expérience a été déterminé à partir de nos études antérieures et de la littérature scientifique. Il est de 20 animaux pour chaque groupe afin d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives.
Raffinement
La stratégie de raffinement se base premièrement sur une connaissance approfondie du développement tumoral des modèles : les résultats d’expériences précédemment établies et publiés nous permettent de connaître précisément le moment où la réponse immunitaire anti-tumorale est maximale et nous ont permis d'établir le point final de chaque expérience qui se situe bien avant d'atteindre les points limites. Le suivi des animaux sera réalisé quotidiennement par les expérimentateurs et des soigneurs en suivant une grille de scoring conçue spécifiquement pour ce projet. Les injections de vaccins seront réalisées sous anesthésie générale afin de réduire au maximum la douleur et le stress des animaux.
Choix des espèces
La souris est un organisme modèle génétiquement proche de l’être humain, ce qui en fait un modèle préclinique de choix très utilisé dans les domaines de la cancérologie et de l’immunologie. L'étude présentée ici nécessite aussi l'utilisation d'un modèle mammifère car les ganglions lymphatiques sont apparus tardivement au cours de l'évolution. Des souris âgées de 6 à 10 semaines seront utilisées car à ce stade, ces animaux ont un système immunitaire mature.
Changement de métabolisme et de vascularisation cérébral induit par différentes profondeurs d’anesthésie générale chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Comparer les effets de plusieurs agents anesthésiques sur le cerveau, faute d'étude disponible chez les patients cérébrolésés : 42 rats sont opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil, au cours d'une procédure unique de quatre heures. La préparation chirurgicale ouvre un accès au cortex cérébral et pose un cathéter artériel, pendant que la profondeur de l'anesthésie est modifiée et que le débit sanguin et le métabolisme du cerveau sont enregistrés. Le porteur écrit qu'"il n'y aura donc pas de nuisance pour les animaux", la seule gêne retenue étant le transport de dix minutes vers la salle d'expérimentation et l'induction de l'anesthésie. Il assigne un second usage au projet : permettre à des étudiants d'appréhender les étapes d'une démarche de recherche et de gagner en autonomie.
Objectifs
Différents agents sédatifs sont disponibles pour conduire une anesthésie générale : les halogénés ou deux types d’agents intraveineux. Chez les patients cérébrolésés nécessitant une sédation profonde pour réduire le métabolisme et le volume sanguin cérébral, il n’existe pas de recommandation ni d’étude comparant l’effet sur le volume sanguin cérébral et le métabolisme cérébral des différents agents anesthésiques lors de sédation profonde. L’objectif de ce projet est de comparer les changements de métabolisme et du débit sanguin cérébral en fonction des agents anesthésiques.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension des effets des agents anesthésiques lors de sédations profondes permettra d’avoir des arguments pour choisir un agent par rapport à un autre en réanimation ou au bloc opératoire, et pourra servir de base à des travaux de recherche clinique. D’un point de vue pédagogique, ce projet permettra aux étudiants d’appréhender les étapes d’une démarche de recherche et leur permettra de gagner progressivement en autonomie au cours de leur cursus futur.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule procédure expérimentale sous anesthésie générale sans réveil. Au cours de cette procédure d’une durée totale de 4h, une préparation chirurgicale permettra de surveiller la pression artérielle invasive et d’avoir accès au cortex cérébral.
Impact sur les animaux
Les deux procédures indépendantes de ce projet seront réalisées sous anesthésie générale sans réveil. Les animaux seront transférés depuis la cage de stabulation dans une cage similaire. Ils y seront isolés et transportés vers la pièce d’expérimentation jusqu’au début de la première étape de la procédure expérimentale (durée du transfert avant le début de l’anesthésie : 10min): nuisance légère. L’étape de préparation chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale, de même que l’étape d’enregistrement au cours des changements d’anesthésie, avant euthanasie sans réveil. il n’y aura donc pas de nuisance pour les animaux: nuisance légère lors de l'induction de l'anesthésie.
Devenir
En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés par une injection intraveineux.
Remplacement
L’analyse des changements d’activité des structures corticales et sous-corticales ainsi que des modifications physiologiques qui en découlent (changement de fréquence cardiaque, pression artérielle ou fréquence respiratoire), nécessite d’étudier un organisme vivant dans son ensemble. Les connaissances actuelles et la controverse qui existent autour des conséquences des différentes modalités de sédations ne permettent pas d’utiliser des modèles non-animaux.
Réduction
Notre plan d’expérience est prévu avec deux procédures: 1)Procédure pédagogique : Un nombre de 6 animaux est prévu pour la procédure préliminaire à visée pédagogique et préliminaire (2 animaux par ans sur 3 ans). 2) Procédure principale : Un nombre d’animaux minimal de 10 animaux par groupe (Un groupe glucose, un groupe oxygène, un groupe lactate; soit 3*10=30 animaux) permettant d’effectuer des analyses statistiques descriptives (moyenne ou médiane et distribution) fiables. Notre expérience sur les enregistrements électrophysiologiques chez l’animal anesthésié nous montre que certains capteurs peuvent s’endommager au cours de la procédure ne permettant pas une analyse des données. De même la préparation chirurgicale peut dans de rares cas conduire à des lésions corticales ou des vaisseaux fémoraux ne permettant pas de réaliser des mesures fiables. Afin de conserver un nombre de 10 animaux par groupe, une majoration de 20% soit 2 animaux est prévue en cas de problème expérimental rencontré au cours du projet. Ces 2 animaux ne seront pas utilisés en l’absence de problème expérimental. Soit un total maximal de 36+6=42 animaux. Les expérimentations seront réalisées sans réveil. La réutilisation de ces animaux dans d'autres protocoles ne sera donc pas possible puisqu’ils seront euthanasiés en fin de procédure. Si des animaux adultes déjà utilisés par d'autres protocoles comportementaux, ou la reproduction, sans altération de leurs physiologies sont mis à disposition par les utilisateurs de l'animalerie, ils pourront être utilisés dans ce protocole.
Raffinement
Tout au long de leur période de stabulation, les rats seront hébergés en groupes de 3 à 5 animaux dans des cages présentant des éléments d’enrichissement (e.g., nesting cup, tunnel, brique Carfil) avec boisson et alimentation ad libitum ce qui minimisera l’angoisse de ces animaux. Concernant la douleur, une injection sous-cutanée de buprénorphine sera pratiquée avant tout acte chirurgical pour obtenir un effet analgésique et une injection sous-cutanée d’anesthésique local (lidocaïne pour une action rapide + ropivacaïne pour une action prolongée sur l’ensemble de la procédure) sera réalisée au niveau du scalp et en regard des vaisseaux fémoraux pour obtenir un effet analgésique supplémentaire. La profondeur de l’anesthésie sera ajustée au cours de la procédure en fonction de l’étape (sédation dite légère qui correspondent à une sédation habituelle pour ce type d’intervention ou sédation profonde) et d’une grille décrivant les réactions de l’animal au pincement de la patte ou de la queue. En cas de survenue de points limite pendant la procédure, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
Nous avons choisi le rat, car c’est l’espèce la plus utilisée dans l’étude du métabolisme et de la vascularisation cérébrale. De plus, nous avons pu étudier préalablement les changements de concentrations cérébrales de glucose et de lactate engendrés par une dépolarisation corticale envahissante après un traumatisme crânien grave chez le rat sous anesthésie général et avons l'expérience de l'utilisation de nos techniques de monitorage dans cette espèce animale. Le choix de ce modèle nous permettra de comparer nos résultats à ceux obtenus par d’autres équipes. Nous utiliserons des rats adultes de 12 à 14 semaines. Il s’agit d’une étude chez l’animal ayant atteint un stade mature d’un point de vue cérébral et non d’une étude concernant le développement ou le vieillissement.
Rôle du thalamus dans la transmission nociceptive
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
192 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués par exsanguination pour le prélèvement de leur cerveau. Ils subissent une chirurgie cérébrale de deux heures avec injection virale, quatre jours d'hébergement individuel, puis, trois semaines plus tard, des séances où on leur applique des stimuli douloureux pour mesurer leur réaction. Le RNT annonce des tests comportementaux et "différents stimuli douloureux" sans jamais préciser lesquels, alors que toute la mesure repose sur eux. Le porteur affirme le recours à l'animal "indispensable", aucun modèle in vitro ne reproduisant selon lui les conditions étudiées, et présente les résultats obtenus chez le rat comme "très facilement transposables à l'homme".
Objectifs
Notre projet vise à comprendre comment le cerveau traite la douleur. Plus précisément, nous étudions une partie du cerveau appelée thalamus médiodorsal (MD). Nous nous intéressons à la fonction de chaque subdivision du MD dans la transmission et le traitement des différentes composantes de la douleur (sensorielle et émotionnelle), ainsi qu'à la connectivité du MD avec la partie frontale du cerveau et son rôle dans la douleur. Nous voulons comprendre le rôle des connexions du MD avec les autres régions cérébrales impliquées dans la douleur. Pour cela, nous stimulerons ou inactiveros spécifiquement chacune des sous-régions du MD et nous observerons les effets sur le comportement nociceptif de l’animal. Notre objectif est de mieux comprendre les mécanismes de traitement de la douleur dans le cerveau, et de développer de nouvelles solutions pour la diminuer.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de cette étude visent à améliorer le traitement de la douleur, en particulier de la douleur chronique. En effet, nous espérons améliorer notre compréhension des mécanismes par lesquels les trois subdivisions du thalamus médiodorsal (MD) contribuent à la transmission des composantes sensorielles et émotionnelles de la douleur. Ceci nous permettra de développer des traitements plus efficaces contre des symptômes spécifiques de la douleur chronique. La douleur chronique est bien plus qu'un simple inconfort temporaire, elle peut dégrader la qualité de vie de manière significative et entraîner des coûts économiques importants (arrêts de travail, consultations médicales, etc.). De plus, la sensibilisation à la douleur peut amplifier des symptômes psychiques tels que la dépression et l'anxiété, créant un cercle vicieux qui aggrave les conditions médicales des patients. Notre projet vise à décrire les mécanismes précis de ces interactions dans les zones du cerveau et les voies nerveuses qui régulent la transmission de la douleur. Ces mécanismes, qui sont partiellement communs aux douleurs et aux troubles psychiatriques associés, seront la cible des traitements que nous espérons développer. En résumé, notre étude vise à améliorer la compréhension et le traitement de la douleur chronique, en s'attaquant aux mécanismes qui la sous-tendent et à ses interactions avec les troubles psychiatriques.
Procédures
La chirurgie et l'injection virale seront effectuées simultanément chez les rats adultes en une seule intervention d'une durée approximative de deux heures. Après l'intervention, les rats seront hébergés individuellement pendant quatre jours pour favoriser leur récupération et limiter les risques de complications. Trois semaines après les chirurgies, les rats subiront des tests comportementaux pour évaluer leur sensibilité à la douleur. Ces tests permettront de déterminer l'effet de l'activation ou de l'inhibition du noyau d'intérêt sur la perception de la douleur. Chaque test comportemental comporte une phase d'habituation de 30 minutes suivie d'une phase de test de 5 minutes. Au cours de la phase d'habituation, les rats seront familiarisés avec l'environnement et la procédure du test. La phase de test permettra de mesurer la réaction des rats à différents stimuli douloureux.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental 4/ un risque de perte de poids et d'hypothermie à cause de l'injection virale 5/ un risque de légère douleur lors des tests de nociception 6/Hébergement individuel pendant 4 jours pour la récupération post-opératoire
Devenir
Mise à mort de tous les animaux à l’aide d’une exsanguination afin de récupérer le cerveau pour les analyses hsitologiques.
Remplacement
Le rat est une espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Pour vérifier et valider le concept du projet dans des approches plus intégrées, il est nécessaire d’utiliser des approches in vivo avec des animaux de façon à observer le cerveau en fonctionnement. Le recours au modèle animal est indispensable car ce projet demande une évaluation comportementale et aucun modèle in vitro (cellules ou tissus) ne peut reproduire les conditions des pathologies étudiées
Réduction
Dans cette étude, la réduction du nombre d’animaux est prise en compte tout en conservant une signification scientifique statistique (hétérogénéité inter-individuelle), le nombre de rats utilisées dans chacun des groupes expérimentaux ne dépassera pas ainsi 8 animaux par groupe. Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux en utilisant uniquement des rats mâles pour la réalisation de ce projet. La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés (t-test apparié pour des données paramétriques ou le test de Wilcoxon pour des données non paramétriques).
Raffinement
Tous les protocoles sont optimisés pour soulager le stress et la douleur des animaux. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie gazeuse comme indiqué lors des procédures et un anti-douleur sera administré avant et après chirurgie pour éviter les douleurs post-chirurgicales. Les animaux seront surveillés quotidiennement par l'expérimentateur avec une surveillance renforcée après la chirurgie jusqu’à la fin de l’expérimentation avec la mise en place d’une réhydratation, un réchauffement et des traitements vétérinaires si besoin. Nos animaux seront importés dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventilés, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur bien-être sera contrôlé par la cellule de bien-être de l’animalerie. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Des points limites sont définis pour éviter la souffrance des animaux. Dans toutes les procédures où cela sera possible, un antalgique sera donné. Pour les autres procédures, les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne renforcée, et les points limites définis permettront de maîtriser cette douleur.
Choix des espèces
Le rat est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central du rat présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus du rat sont largement transférables à l'homme. Les sous-noyaux du MD sont de très petite taille et nécessitent une grande précision pour y accéder. Cela rend les manipulations impossibles chez les espèces plus petites que le rat. Les injections de virus seront effectuées sur des animaux âgés de deux mois. Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 3 mois, ce qui correspond à l’âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.
Elevage de lignées murines necessaires à la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires de l’immunothrombose
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
Une biopsie d'oreille ou de queue de 2 mm au maximum, sur animal vigile, contention comprise en moins de cinq minutes : c'est l'unique acte que subissent les 440 souris de ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Deux des trois lignées élevées présentent un phénotype dommageable, avec des temps de saignement allongés, ce qui conduit le porteur à prélever à l'oreille plutôt qu'à la queue. Le projet consiste à entretenir ces lignées génétiquement modifiées pour des travaux ultérieurs sur la thrombose, 50 souris étant déclarées réutilisées dans d'autres projets. Pour les autres, le porteur écrit qu'elles servent à la "formation interne à l'équipe" ou sont "rétrocédées à d'autres équipes", sans dire combien ni à quelles fins.
Objectifs
L'objectif essentiel de cette demande de projet est d'assurer la préservation des souches de souris dans un environnement sans pathogènes, visant ainsi à garantir la reproductibilité de nos expériences tout en cherchant à minimiser le nombre d'animaux utilisés. L’utilisation de nos souches génétiquement modifiées nous permet d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la thrombose. La thrombose étant une réaction physiopathologique à un dérèglement ayant lieu dans un vaisseau sanguin, ce vaisseau provoque la formation d’un caillot qui est responsable d’une mauvaise irrigation des membres inférieurs ou d’organes tels que le cerveau, mettant en jeu la survie de l’individu. La compréhension de ces mécanismes dans des modèles précliniques in vivo est essentielle pour la découverte de molécules efficaces, présentant peu d’effets secondaires, pouvant traiter la thrombose.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d'exercer un contrôle sur la population animale, offrant ainsi la possibilité de restreindre leur nombre au strict minimum pour résoudre nos hypothèses sur la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la thrombose et la thrombose associée au cancer. Notre production locale d’animaux est adaptée à nos besoins. Nos trois souches de souris genetiquement modifiées nous permettent d’évaluer différentes voies de propagation et initiation de la thrombose.
Procédures
Les animaux sont soumis à une seule biopsie d'oreille ou de queue (maximum 2 mm dans les deux cas) par animal. ce geste est effectué sur des animaux vigiles. La procedure dure moins de 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les perturbations anticipées pour les animaux se résument à la possibilité de ressentir de la douleur, associée au prélèvement d'une biopsie de 2 mm maximum. Une seule biopsie est réalisée par animal, le geste est effectué par du personnel compétent et dure 2 à 5 minutes maximum, contention incluse. Le saignement pouvant découler du prélèvement est contrôlé grâce à l'utilisation de sites de prélèvement faiblement vascularisés.
Devenir
Les animaux ne présentant pas le génotype d’intérêt sont utilisés pour de la formation interne à l’équipe ou rétrocéder à d’autre équipes. Les animaux de génotype d’intérêt nous permettent d’évaluer différentes voies de propagation et initiation de la thrombose. L’étude de ces voies a fait l’objet d’une autre demande de projet.
Remplacement
L’utilisation de ces animaux est justifiée par l’impossibilité de les remplacer par un modèle in vitro. À ce jour, il est : 1) impossible de reproduire un vaisseau sanguin contractile et activable ; 2) impossible de mettre en contact le vaisseau avec la totalité des cellules figurées du sang dans des conditions natives 3) impossible de produire des lignées cellulaires sanguines stables in vitro avec les modifications génétiques qui nous intéressent.
Réduction
Nous veillons à produire un nombre suffisant d’animaux pour maintenir nos lignées dans un statut sanitaire sans pathogènes, en les amplifiant selon nos besoins expérimentaux futurs. Les différents lots d'animaux ont eté estimé en fonction des projets en cours et déjà validés par le ministère en incluant la composante maintient des lignées murines. Les animaux ne présentant pas le génotype d’intérêt sont utilisés pour de la formation interne à l’équipe ou rétrocéder à d’autre équipes avant euthanasie.
Raffinement
Les animaux sont hébergés par 5 maximum dans des cages de portoir ventilé avec de l’eau et de la nourriture ad libitum. Un cycle circadien est appliqué dans les locaux d'hébergement. Un enrichissement de type « Nestlets » qui correspond à des nids végétaux à base de fibres de coton est ajouté dans toutes les cages. Les animaux reproducteurs sont 3 par Cages (Un male pour deux femelles d’un âge supérieur à 7 semaines) pour les trois lignées. une lignée ne présente pas de phénotype dommageable et elle est utilisée en temps qu’hétérozygotes pour visualiser certain globules blancs. Deux autres lignées ont un phénotype dommageable car nous adaptons le site de prélèvements des biopsies pour réaliser le génotypage. Ces deux lignées présentent des temps de saignement modérément allongés par rapport à des animaux wild type mais ne mettent pas leur vie en danger. Nous prélevons donc au niveau des oreilles qui sont bien moins vascularisées que la queue de sorte à ce que le saignement soit le plus faible possible. Les points limites sont la présence de dermatites associées avec une perte de pilosité et une perte de fertilité. De manière générale les couples reproducteurs sont reformés tous les 6 à 8 mois pour deux souches. Concernant la derniere lignée: les males peuvent êtres stériles à partir de la 25 -ème semaine de vie, les couples sont donc renouvelés entre deux à trois fois par an.
Choix des espèces
Le modèle murin est le plus adapté pour notre thématique de recherche qui, est un modèle de choix pour l’étude préclinique de la thrombose. En effet, la formation d’un thrombus dans le modèle murin est excessivement proche de celle de l’Homme aussi bien au niveau moléculaire que cellulaire. Le genotypage est realisé en même temps que le sevrage et l'indentification des animaux pour 2 de nos souchesà la troisieme semaine de vie de l'animal. Pour lla troisieme seul les couples reproducteurs sont genotypés. Un accouplement pouvant etre mis en place entre la 7 eme et la 15 eme semaine de vie de l'animal, le genotypage sera realisé à ce moment.
Mise au point d’un modèle murin pour l’analyse de la survenue et/ou la progression des cancers germino-testiculaires.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Les souris mâles de ce projet sont génétiquement modifiées pour développer un cancer du testicule dans 75 % des cas. 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le seul acte que le porteur décrit est le prélèvement de deux phalanges au maximum à sept jours, pour l'identification et le génotypage, et il annonce comme nuisances la tumeur elle-même, une gêne au déplacement quand elle se développe au niveau du scrotum, une baisse d'activité. Les animaux surnuméraires et ceux dont le génotype ne sert pas au projet sont tués, les autres le sont en fin de procédure pour le prélèvement d'organes.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’analyser la survenue et/ou la progression des cancers germino-testiculaires et la sensibilité aux traitements par chimiothérapie.
Bénéfices attendus
Le cancer du testicule (CT) est le plus fréquemment diagnostiqué chez l'homme jeune (15-35 ans). Son incidence n'a cessé d'augmenter dans les pays industrialisés depuis plusieurs décennies. L'étiologie des CT est peu connue. L'identification d'acteurs impliqués dans la prédisposition et la survenue de ces cancers permettra une meilleure compréhension des mécanismes impliqués. Ceci est d'autant plus important que 10% des malades décèdent des suites de leur cancer. L'étude de la physiologie des cellules germinales est fondamentale, puisqu'elles sont à l'origine de la majorité (95%) des CT. Des études récentes ont démontré les rôles des signalisations des xénobiotiques dans la régulation de la physiologie testiculaire et notamment celle des cellules germinales. L’objectif de ce projet est d’analyser l’implication de ces signalisations cellulaires dans la survenue et/ou la progression des cancers germino-testiculaires.
Procédures
Sur ces animaux, il y aura 1 prélèvement à 7 jours de deux phalanges maximum par souris pour la numérotation et le génotypage.
Impact sur les animaux
Seulement les animaux obtenus des croisements avec la lignée exprimant la recombinase Cre développeront des tumeurs. Les nuissances et effets indésirables attendus seront d'une part développement de la tumeur, ce qui au niveau du scrotum pourrait entrainer une gêne pour le déplacement de la souis, aussi nous abserverons les troubles au niveau de son activité (hypoactivité).
Devenir
Les animaux surnumérères et de génotypes sans intérêt pour le projet seront mis à morts. De même à la fin de la procédure, les animaux d'intérêt seront mis à morts pour les prélèvements d'organes.
Remplacement
Le remplacement par des approches alternatives n'est pas possible car aucune approche ne permettrait d'analyser les mécanismes de l'étiologie la tumorigenèse testiculaire avec une origine potentiellement au cours de la vie empbryonnaire et un développement de la patholgie et période postnatale.
Réduction
Nous réduirons au maximum le nombre de souris utilisées et présentant des attente délétère grâce à l'utilisation du système de ciblage tissulaire de l'altération génétique dans le tissus d'intérêt. Le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence l'effet des altérations génétiques dans la survenue des tumeurs germinales du testicule. Avec une incidence attendue selon la litérrature de 75%; nous utiliserons 20 animaux par groupe et par âge afin d’obtenir des résultats valides pour définir les différences entre les différents génotypes.
Raffinement
Le raffinement reposera sur la surveillance quotidienne des animaux effectuée par du personnel qualifié (expérimentateurs et personnel animalier). De plus, les animaux seront maintenus en groupes sociaux (5 au maximum) dans des cages de tailles conformes à la législation en fonction du nombre de souris, avec un enrichissement (tunnel en carton et maisons à souris) des cages. De plus, nous avons défini un arbre décisionnel (annexe) avec des critères adaptés d'arrêt de l'expérimentation en cas de souffrance de l'animal. Si un animal devait présenter des signes de douleur, l’animal sera isolé et un analgésique sera administré à des intervalles qui seront définis avec le vétérinaire référent.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris mâles modifiés génétiquement et qui développent dans 75% des cas un cancer germino- testiculaire. il s'agit d'un des rares modèles permettant de développer ce type de pathologie avec un incidence suffisante pour réaliser des études moléculaires et physiologiques donnant des résultats fiables.
Rôle du récepteur minéralocorticoïde dans un modèle d’inflammation intestinale aigue chez la Souris.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Aucun analgésique ne sera administré, le porteur estimant qu'ils interféreraient tous avec le modèle, et les souris qui atteignent les points limites sont tuées par surdosage d'anesthésiques. 144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs intestins. Elles reçoivent pendant sept jours du dextran sulfate de sodium dans leur eau de boisson, ce qui déclenche une inflammation intestinale, une douleur viscérale et une perte de poids, puis passent une minute trente dans un tube de mesure de composition corporelle la veille de leur mise à mort. L'enjeu déclaré est de vérifier si des antagonistes du récepteur minéralocorticoïde, déjà commercialisés pour d'autres indications, pourraient être repositionnés contre les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin.
Objectifs
5.5.1 décrire les objectifs du projet (repris automatiquement du champs 3.3.2.1) Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin affectent près de 300 000 personnes en France. Il existe des thérapies, mais de nombreux patients ne répondent pas à ces thérapies ou y deviennent résistants. Le projet a pour objectif d’évaluer l’inhibition du récepteur minéralocorticoïde sur la réponse inflammatoire dans un modèle de colite aiguë induite par un agent chimique. L’inhibition du récepteur minéralocorticoïde exerce des effets anti-inflammatoires dans des contextes extra-intestinaux. Ces effets anti-inflammatoires sont médiés par une de ces cibles : la neutrophil gelatinase-associated lipocalin, et impliquent les cellules myéloïdes.
Bénéfices attendus
Même si des progrès thérapeutiques notables ont été réalisés dans le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, de nombreux patients ne répondent pas ou plus aux traitements proposés. De plus, les antagonistes du récepteur minéralocorticoïde ne sont pas contre-indiqués chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. En cas de validation de notre hypothèse de travail, nous pourrions repositionner les antagonistes du récepteur minéralocorticoïde déjà disponibles sur le marché dans un nouveau champ thérapeutique. De plus, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents sur l’implication du récepteur minéralocorticoïde dans le développement de l’inflammation intestinale.
Procédures
Les animaux seront soumis à du dextran sulfate sodium (1%) dans leur eau de boisson durant 7 jours afin d'induire une inflammation intestinale relative aux maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. La composition corporelle des animaux sera mesurée le jour précédant la mise à mort des animaux. Cette mesure peut occasionner un inconfort chez les animaux lors de l’introduction de la souris vigile dans un tube de mesure, mais n’entraine pas de douleur, la souris reste 1min30 dans l'appareil.
Impact sur les animaux
Le modèle de colite aiguë induite par le dextran sulfate sodium peut entrainer une douleur viscérale chez la Souris, ainsi qu’une perte de poids. La composition corporelle des animaux sera mesurée, le jour précédent la mise à mort des animaux. Cette mesure peut occasionner un inconfort chez les animaux lors de l’introduction de la souris vigile dans le tube de mesure, mais n’entraine pas de douleur.
Devenir
À l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir récupérer leurs intestins pour analyser différents paramètres et marqueurs biologiques.
Remplacement
Avant d’être testés in vivo, nous utilisons des modèles in vitro d’inflammation intestinale comme des lignées de cellules épithéliales intestinales ou de macrophages en réponse à des molécules pro-inflammatoires. Cependant, ces modèles in vitro ne permettent pas de rendre compte de la complexité physiologique de la réponse inflammatoire in vivo. Les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales.
Réduction
Ce projet s’efforce de réduire le nombre de souris au strict nécessaire pour que l’étude soit concluante et en collectant le maximum d’observations au cours d’une même expérience (données nutritionnelles, composition corporelle, poids des animaux, inflammation et fonction de barrière intestinale). Le nombre d’animaux nécessaires a été évalué selon la spécificité des procédures utilisées, en fonction de l’expérience acquise lors de nos précédentes études et des données de la littérature. Pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, plusieurs approches combinées ont été prévues : la dose de Dextran Sodium Sulfate utilisée est évaluée à chaque lot de dextran sulfate sodium comme recommandé dans le protocole initial et nous avons fait le choix d’utiliser une dose faible de dextran sulfate sodium (1%) pour limiter au maximum la mortalité, permettant ainsi d’optimiser le bien-être des animaux et de réduire le nombre d’animaux. L’utilisation d’espèces d’animaux utilisés à des fins scientifiques, caractérisés par une faible variation génétique, permet de limiter la variabilité de la réponse biologique et par conséquent le nombre d’animaux. L’effectif de chaque groupe a été déterminé par une approche statistique en prenant comme critère principal le score histologique. Nous avons fait le choix de tester l’inhibition génétique du récepteur minéralocorticoïde uniquement sur les animaux colitiques et par conséquent de limiter les groupes contrôles au strict minimum. Les données obtenues chez des animaux contrôles seront réutilisées autant que possible. Par exemple, des échantillons de côlon seront préservés dans le laboratoire et indiqués dans une base de données communes à notre Unité et pourront ainsi être réutilisées au cours d’un autre protocole.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des cages standards (4 souris/cage), avec enrichissement. Les animaux seront maintenus dans un environnement contrôlé et stabilisé. Une période d’acclimatation d’une semaine après réception des souris sera réalisée avant le début des procédures. Les conditions de soins et les méthodes utilisées viseront à réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Une grille d’évaluation des points limites pour le bien-être animal sera utilisée. Un animal présentant un état de mal être ou de souffrance sera exclu de l'étude et mis à mort en fonction de son score et de la discussion avec les membres de la cellule SBEA. Pour limiter la douleur des animaux avec colite induite par le dextran sulfate sodium, l’usage est de ne pas utiliser d’analgésique en raison en de leur interaction potentielle avec le processus inflammatoire. Il existe un panel d’analgésiques utilisés dans l’inflammation intestinale, qui présentent tous un risque d’interférence avec notre modèle. Nous ne pourrons donc pas utiliser ces analgésiques dans nos procédures. En cas d'atteinte des points limites, les souris seront mises à mort par surdosage d'anesthésiants .
Choix des espèces
La Souris est le mammifère non-primate le plus proche (phylogénétiquement) de l’Homme. La Souris est l’animal le plus couramment utilisé pour modéliser la colite expérimentale et les modèles génétiques d’invalidation du récepteur minéralocorticoïde ne sont disponibles que chez la Souris. Cette souche n’est pas résistante à l’induction par le dextran sulfate sodium et permet ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés. Nous utiliserons des souris d’environ 6 semaines. La réponse à la colite diffère en fonction de l'âge des animaux et le stade de développement choisi correspond à une phase de réponse optimale avec un risque de mortalité réduit.
Étude pilote sur l’effet de la couleur et de l’ultrastructure de la peau des ectothermes sur la thermoregulation par absorption de radiation infrarouge
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Capturés dans des populations semi-naturelles entretenues par le laboratoire, puis acclimatés deux semaines en terrarium individuel, 10 lézards vivipares adultes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun subit une seule biopsie de peau dorsale de 1,5 mm sous anesthésie locale, d'une minute environ, avant trois semaines de surveillance puis un retour dans son enclos d'origine. Le porteur anticipe un stress lié à la capture et à la manipulation, une douleur localisée et un risque d'infection. Il revendique un raffinement face à l'usage courant du domaine, qui consiste à tuer les animaux pour prélever leur peau, et affirme qu'aucune alternative non animale n'est disponible, les modèles informatiques manquant précisément des données que ce projet doit produire.
Objectifs
Ce projet a pour but de réaliser une étude pilote pour : 1. Évaluer et mettre au point une méthode pour réaliser des biopsies de la peau des lézards sans mise à mort, 2. évaluer et mettre au point les méthodes de microscopie électronique qui permettront d’analyser les échantillons prélevés et 3. évaluer la variation naturelle existante au niveau de la structure de la peau des lézards afin de développer des études futures. L’objectif de ce projet est de raffiner la procédure de prélèvement qui a pour finalité l’étude de l’adaptation des espèces au changement climatique à travers des changements de la structure et de la couleur de leur peau. Cette question fait partie d’un intense débat au sein de la communauté scientifique qui vise à prédire si et comment la coloration des espèces animales sera affectée par le changement climatique et pourrait en partie aider les espèces les populations naturelles à s’adapter à celui-ci.
Bénéfices attendus
Cette étude pilote aidera au développement des projets futurs pour comprendre l’adaptation des espèces ectothermes (c'est à dire espèces à "sang froid") au changement climatique. La coloration externe des animaux, particulièrement les mélanines - pigments qui colorent la peau des humains et de la plupart des animaux -, est supposée jouer un rôle clé dans l’efficacité d'absorption de la chaleur du soleil (radiation infra-rouge). En produisant des couleurs plus ou moins foncées, les mélanines sont supposées affecter la vitesse à laquelle les radiations solaires sont captées. Cette hypothèse est centrale pour comprendre comment la coloration peut aider les espèces à s’adapter au changement climatique et quelles seront les conséquences à moyen et long terme du changement climatique sur la biodiversité et les écosystèmes. Bien que la coloration animale soit supposée être sous sélection du réchauffement du climat, le sens de la réponse, à savoir si des températures plus chaudes favoriseraient plutôt des individus de couleur claire que foncée, est fortement débattu. Au centre de ce débat, il existe un manque de compréhension sur comment les mélanines et d’autres composantes de la peau influencent l’absorption de chaleur, ce que le projet proposé peut aider à comprendre grâce à un développement méthodologique.
Procédures
Les animaux seront soumis une seule fois à un prélèvement de la peau dorsale, par biopsie, avec anesthésie locale. La durée estimée est de 1 minute.
Impact sur les animaux
Nous estimons que la procédure pourrait entrainer un stress lié à la capture et la manipulation des animaux, une douleur légère et localisée pendant et après la biopsie de peau, et un risque d’infection à cause du prélèvement des échantillons de peau. En prévision et afin de limiter ces dommages potentiels, nous avons conçu l’étude en laissant un temps d’acclimatation pour réduire le stress (deux semaines après la capture), en minimisant la surface de peau échantillonnée (1.5 mm de diamètre), en utilisant de l’anesthésie locale durant la procédure, du matériel stérile pour la biopsie de la peau, et des soins (désinfection de la peau avant et après la biopsie et application de cicatrisant , et une période de 3 semaines pour contrôler la récupération des animaux avant de les relâcher). Ces mesures seront couplées à des stratégies de réduction du stress lors de l’hébergement des lézards dans l’animalerie avant et après la procédure (i.e., bonnes conditions d’hébergement, accès à la nourriture, l’eau, et abris).
Devenir
À la fin de l’étude et une fois leur état de santé vérifié, tous les individus seront relâchés dans leurs populations semi-naturelles d’origine.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’un modèle animal pour cette étude. Un modèle non-animal potentiel consisterait à utiliser des modèles informatiques pour prédire comment la structure de la peau peut changer avec différentes températures ambiantes. Cependant de tels modèles ne sont pas réalisables pour le moment, car les informations nécessaires à leur développement manquent et dépendent de la collecte de données, telles que celles qui seront obtenues grâce à la procédure proposée ici. Un autre modèle potentiel serait de collecter des échantillons de peau sur des animaux morts de cause naturelle. Cependant cette approche n’est pas faisable étant donné que la structure de la peau se dégrade rapidement après la mort et qu’elle est détruite par les méthodes de préservation communément appliquées (conservation dans l’éthanol, formol ou congélation). Bien qu’aucune alternative à l’utilisation d’animaux vivants ne puisse être appliquée, la procédure que nous proposons de tester dans notre étude pilote n’est pas la procédure communément suivie pour étudier la structure de la peau des ectothermes, qui implique de tuer les animaux avant de collecter leur peau. Nous proposons ici de collecter un petit échantillon de peau par biopsie, une procédure plus légère et beaucoup moins invasive déjà appliquée avec succès sur des reptiles dans une étude récente.
Réduction
Nous avons déterminé le nombre d’individus nécessaires à cette étude (N=10) pour pouvoir tester les différentes méthodes de microscopie et estimer la variabilité des traits étudiés. Trois échantillons seront initialement utilisés pour raffiner la méthode de fixation qui permettra d’obtenir des coupes de bonne qualité et exploitables avec les 3 méthodes de microscopie que nous souhaitons utiliser (microscopie par transmission électronique, microscopie électronique à balayage et microscopie RAMAN). Les 4 restants seront traités ultérieurement avec la méthode sélectionnée, et nous aurons ainsi un total de 5 échantillons d’individus différents pour estimer la variation naturelle des différents paramètres à mesurer pour réaliser des études futures à partir de la moyenne et la variance des traits.
Raffinement
Nous avons implémenté plusieurs mesures d’amélioration durant les différentes phases du projet. D’une part, les conditions dans lesquelles les animaux sont hébergés, dans les mésocosmes (prairies humides clôturées pour pouvoir faire les suivis des individus) ainsi que dans l’animalerie avant et après la procédure, sont optimales pour l’espèce et offrent des éléments indispensables à la diminution du stress. La taille des enclos correspond à la biologie de l’espèce. Des pierriers et des tas de bois, pour se cacher et thermoréguler, ainsi que des points d’eau sont présents dans chaque enclos. La majorité de la surface des enclos est constituée de zones végétales denses ressemblant à des zones humides, caractéristiques de l’habitat naturel de l’espèce. Un système d’ombrage permet de réduire la température lorsque celle-ci devient trop importante. Les enclos sont arrosés 30 minutes par jour pour éviter tout stress hydrique. Les lézards utilisés dans ce projet (10 individus) seront ramenés au laboratoire et maintenus individuellement dans des terrariums de taille supérieure à celle requise pour cette espèce et offrant les éléments indispensables à la diminution du stress des animaux (source de chaleur et d’UV, zone humide et fraiche, abris). Chaque lézard sera nourri avec 2 grillons par jour, grillons régulièrement enrichis en vitamines. La santé des animaux sera surveillée avec des observations quotidiennes (activité des animaux) et des mesures hebdomadaires (suivi du poids). Ces conditions de captivité sont optimales. Durant la procédure proposée, les mesures d’amélioration comprennent l’utilisation d’anesthésique local, de matériel de biopsie stérile (et spécialement conçu pour la biopsie de peau) et de désinfectant, ainsi que le suivi de la cicatrisation de la peau pendant au moins trois semaines suivant la biopsie. Les lézards seront exclus de la procédure s’ils présentent des points incluant une apathie forte, des défauts de mues importants, ou une perte de masse de 25 à 30 % associée à une diminution d’appétit.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée ici est le lézard vivipare Zootoca vivipara (Jacquin 1787). Il s’agit d’un lézard de la faune française étudié depuis trente ans dans les populations naturelles. Cette espèce est intéressante pour comprendre l’écologie de vertébrés ectothermes comme les reptiles ou les amphibiens terrestres, une majeure partie de la biodiversité. Dans le monde, 20% des reptiles sont menacés d’extinction, pourtant leur écologie reste peu étudiée et comprise. Il devient donc urgent de mieux comprendre le comportement de ces espèces à l’aide de modèles solides. L’espèce Zootoca vivipara est optimale car son écologie est bien connue et son génome est séquencé, ce qui en fait un modèle unique pour l’écologie fondamentale et appliquée des vertébrés ectothermes. L’espèce n’est pas menacée en Europe (classée comme espèce à préoccupation mineure par l’Union Internationale de la Conservation de la Nature) même si elle est sensible aux dégradations de son milieu, et plusieurs études montrent que les populations naturelles de cette espèce sont en péril à cause de changement climatique. Les individus utilisés seront des adultes uniquement (2 ans et plus) afin de réduire les sources connues de variation de couleur associée à l’âge.
Production de sérum et collecte de tissus pour développer des outils immuno-sérologiques
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Immunisés une ou deux fois par injection dans l'abdomen sous anesthésie, puis saignés par ponction dans le cœur sous anesthésie profonde, 80 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le projet vise à fabriquer du matériel de référence, sérums et organes, pour mettre au point des tests de détection des virus qui circulent chez les chauves-souris européennes. Le porteur écrit qu'aucune nuisance n'est attendue en dehors de la vaccination et de la ponction cardiaque, et affirme qu'il n'y a "pas d'alternative non animale disponible à ce jour dans ce domaine". La ponction est terminale, les organes sont prélevés dans la foulée.
Objectifs
De plus en plus d’études montrent que des virus circulent ou apparaissent chez les chauves-souris européennes dont certains sont particulièrement préoccupants en raison de leur capacité connue à se transmettre d'une espèce à l'autre et à provoquer des maladies graves chez l'Homme. Les méthodes de détection disponibles, développées pour des virus humains (ex. les virus de la rage et Ebola), sont rarement validées pour les virus trouvés chez les espèces de la faune sauvage tel que les chauves-souris ou ne sont pas adaptées aux échantillons collectés sur le terrain. Pour cela, il apparait nécessaire de développer de nouveaux outils de détection des virus circulant dans la faune sauvage permettant ainsi d’appréhender plus rapidement le risque pour l’Homme. De plus, l'absence de matériaux de référence ou de valeurs seuils communes complique l'interprétation des résultats et leur comparaison entre les groupes de recherche. Le modèle hamster est un modèle sensible à certains virus et peut facilement être utilisé pour produire des matériaux de référence comme du sérum. Ces matériaux de référence issus de sérums/organes d’animaux immunisés ou non-immunisés permettront de développer un panel d’outils de détection de ces virus. La collecte des organes, permettra de développer de nouvelles méthodes de recherche d’anticorps intratissulaires pour chaque virus quand l’obtention de sérum ne sera pas possible. Ils permettront également de mettre au point des cultures de cellules en 3 dimensions mimant les caractéristiques et fonctionnalités des organes en vue de constituer une banque biologique limitant ainsi l’utilisation d’animaux par la suite.
Bénéfices attendus
L’approche expérimentale réalisée au cours de ce projet permettra de développer et valider des outils de détection sérologiques adaptés à chaque virus et aux investigations chez les chauves-souris, réservoir de ces virus (microprélèvements, organes/tissus d’intérêt…). La collecte des différents tissus permettra de rechercher les marqueurs d’une infection passée (anticorps) pour chaque virus et dans différents organes lorsque l’obtention de sérum ne sera pas possible dans les conditions du terrain. Le travail innovant sur les cultures de cellules en 3 dimensions permettra l’étude des mécanismes d’infection d’un agent pathogène sur une espèce sensible, limitant ainsi l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques. Dans un second temps, ce travail pourra être étendu aux chauves-souris afin de tester la réceptivité/sensibilité de ces espèces vis-à-vis de nouveaux virus et de caractériser les relations hôtes-pathogènes. Dans cette optique, et sur le long terme, cela permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés. Ces modèles pourront ensuite être utilisés dans d’autres études ou pour tester d’autres agents pathogènes.
Procédures
Les hamsters seront immunisés une ou deux fois par voie intra-péritonéale (volume de 0.5mL- animaux anesthésiés- durée =10 secondes environ). Une prise de sang intracardiaque sous anesthésie profonde (+ analgésie) est effectuée sur tous les hamsters (durée 3 minutes)
Impact sur les animaux
Hormis la phase de vaccination, et la ponction cardiaque sous anesthésie générale, aucun nuisance ou effets indésirables ne sont attendus.
Devenir
Mise à mort pour collecte de sang et tissus
Remplacement
Suite à l’émergence de nouvelles espèces virales chez les chauves-souris européennes, il est nécessaire de se préparer pour mieux appréhender les prochaines émergences qui pourraient toucher les animaux sauvages et/ou domestiques et qui pourraient potentiellement être transmises à l’Homme, d’autant plus que le franchissement de la barrière d’espèces existe, comme cela a déjà été montré avec le chat ou la fouine pour les lyssavirus. Le modèle hamster nous permettra de collecter des échantillons pour développer des outils sérologiques et cellulaires adaptés à leur détection ou à leur étude dans d’autres espèces animales. De plus, l’étude in vitro des mécanismes de franchissement de la barrière d’espèce de ces virus dans la faune sauvage nécessite la mise en place de cultures de cellules primaires et d’organoïdes. Seuls des organes rapidement prélevés sur l’animal permettront la mise au point de ce type de modèle in vitro (poumons, cerveau, rate…). Il n’y a donc pas d’alternative non animale disponible à ce jour dans ce domaine.
Réduction
Le nombre de hamsters a été déterminé de façon à obtenir les volumes nécessaires de sérum pour pouvoir mener à bien le développement et la validation des différentes techniques qui permettront une meilleure compréhension de la réponse immunitaire induite suite à l’immunisation avec chaque espèce virale. Aucune analyse statistique n’est réalisée. La collecte des organes sera effectuée sur l’ensemble de ces hamsters afin de disposer de matériel qui pourra être utilisé pour la mise au point de méthodes de détection sérologiques sur des matrices alternatives au sérum mais également pour le développement des organoïdes qui à moyen terme permettra des études in vitro, réduisant ainsi l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques.
Raffinement
Les hamsters seront hébergés en cage de 2 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette), cellulose, et de bâtonnets de bois à ronger. Un contrôle de leur état de santé sera assuré tous les jours. Aucun signe clinique n'est attendu dans la mesure où les animaux seront uniquement immunisés par des suspensions non pathogènes (virus inactivés ou protéine virale vectorisée)
Choix des espèces
Plusieurs études scientifiques menées sur les lyssavirus et sur des protéines virales vectorisées d’intérêt ont démontré que le hamster doré était un modèle expérimental qui présentait une bonne réponse immunitaire humorale et permettait l’obtention de sérums spécifiques. Le hamster est donc un très bon modèle pour réaliser ces tests d’immunisation. D’après la littérature des hamsters âgés entre 7 et 10 semaines le jour de l’immunisation sont connus pour avoir une bonne réponse immunitaire humorale. Nous utiliserons donc des hamsters adultes de 7 semaines à réception.
Etude du comportement alimentaire chez des souris atteintes de glycogénose de type Ia: EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Cinq injections sous-cutanées en cinq jours déclenchent chez ces souris une maladie hépatique rare, la glycogénose de type Ia, avant leur transport vers un second établissement où elles passent quatre jours isolées dans des cages qui enregistrent chaque accès à la mangeoire. 23 souris sont concernées, 12 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 11 un niveau léger. Le porteur qualifie cet isolement de "léger stress" et écrit qu'aucune souris ne sera mise à jeun, tout en indiquant que ces animaux peuvent tomber en hypoglycémie, se prostrer, voir leur température chuter et en mourir, ce qu'il a observé chez moins de 2 % de l'élevage. Aucune n'est tuée à l'issue : toutes sont gardées en vie et pourront servir à un autre projet si le vétérinaire juge la gravité réellement subie inférieure ou égale au niveau modéré.
Objectifs
La glycogénose de type Ia (GSDIa) est une maladie métabolique rare due à l’absence de production de sucre (glucose) par l’organisme. Cette fonction est essentielle pour maintenir les taux de sucre dans le sang (glycémie) constante en dehors des repas. Contrairement aux diabétiques, les patients atteints de GSDIa développent des hypoglycémies sévères. Une baisse du taux de sucres dans le sang conduit à un mal-être important, qui peut conduire au coma, et à la mort en quelques minutes. Ainsi, les patients doivent manger régulièrement (toutes les 3h environ), y compris la nuit. Ces perturbations du rythme biologique ont un fort impact sur l’ensemble de fonctions physiologiques. Ainsi, la prise de nourriture à un temps inapproprié par rapport au cycle biologique, par exemple durant la période de sommeil, entraine un dérèglement de certaines réactions biologiques, en particulier dans le foie. Des résultats préliminaires obtenus dans un modèle de souris atteintes de GSDIa montrent des dérégulations dans le foie des souris, qui pourraient être entrainées par une modification du rythme biologique. L’objectif de ce projet est d’étudier la prise alimentaire et la structuration des repas de souris atteintes de GSDIa sur une période de 3 jours, avec un accès continu à la nourriture. Le projet se déroulera dans deux établissements différents, l’un produira les souris et l’autre sera chargé de l’étude du comportement alimentaire.
Bénéfices attendus
L’étude des paramètres des repas (fréquence-quantité) devrait permettre de confirmer que les souris atteintes de GSDIa mangent régulièrement, tout au long de la journée et de la nuit, afin de limiter le développement d’hypoglycémie. Ces données seront utiles pour expliquer les origines des perturbations de l’horloge biologique observées au niveau du foie.
Procédures
Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, une biopsie de tissu sera prélevée pour caractériser leurs gènes. Pour obtenir les souris atteintes de glycogénose de type 1a, les souris transgéniques sélectionnées et leur souris contrôles (souris saines) subiront une injection d’un produit chimique par voie sous-cutanée pendant 5 jours de suite à l’âge de 8 semaines dans le premier établissement utilisateur. Après transfert par un transporteur agréé dans le deuxième établissement, ces souris seront ensuite isolées pendant 4 jours afin d’étudier leur comportement grâce à des cages détectant quand la souris accède à la mangeoire ou au biberon. L’appareillage permet aussi de déterminer la quantité de nourriture et le volume d’eau ingérés sur 24h. Afin de limiter le stress induit par l’isolement des souris, une période d’acclimatation progressive (isolement d’une demi-journée, puis 2 demi-journées, avec remise avec leurs congénères entre chaque période, et enfin 24h) à leur nouvel environnement sera programmée sur les 3 jours précédents les enregistrements de prises alimentaires. Les animaux seront ensuite regroupés dans leur cage d’origine en fin de procédure. Les souris pourront être utilisés dans un autre projet, après validation du niveau de sévérité de l’ensemble de la procédure subi par chaque animal par le vétérinaire désigné du deuxième établissement.
Impact sur les animaux
Les souris subiront une série d’injections de 5 injections par voie sous-cutanée qui peuvent entrainer une légère douleur liée à la piqure. Ce projet concerne une pathologie caractérisée par le développement d’hypoglycémies lors de jeûnes courts (entre les repas), et par des atteintes hépatiques menant à long terme au développement de tumeurs du foie. En ciblant la pathologie dans le foie par transgenèse, le modèle de souris atteintes de GSDIa utilisé dans cette étude reproduit toute la pathologie hépatique observée chez l’homme et est viable. Cependant, ces souris peuvent développer des hypoglycémies si elles ne s’alimentent pas régulièrement, car elles ne peuvent pas utiliser leur stock de sucres accumulé dans le foie. Les hypoglycémies entrainent un mal-être, observé par la prostration des animaux, une baisse de la température corporelle, et possiblement le décès de l’animal (qui a été observé dans moins de 2% des souris de l’élevage grâce à une observation renforcée des animaux). Les souris développent aussi des tumeurs hépatiques autour de 12-15 mois ce qui ne constituera pas un point limite dans ce projet puisque les procédures seront limitées à 6 mois. Enfin, les souris seront isolées physiquement afin de mesurer leur prise alimentaire et leur rythme de prise de nourriture. Cet isolement sera limité à 4 jours. Il peut entrainer un léger stress chez l’animal.
Devenir
A l’issu du projet, l’avis du responsable du suivi du bien-être animal sera demandé pour chaque animal afin d’évaluer la gravité réelle subie au cours du projet. Les souris transgéniques et leurs contrôles (souris saines) seront gardées en vie et pourront être utilisées pour un autre projet si leur état de santé le permet, et si la gravité réelle subie par l’animal est classée au maximum en niveau modérée. Les souris supplémentaires de l’élevage (mâles ou femelles) pourront être utilisées dans un autre projet ou pour la reproduction.
Remplacement
L’étude du comportement alimentaire des souris atteintes de glycogénose de type Ia nécessite de travailler sur les animaux vivants. Ce modèle animal reproduit toute la pathologie hépatique de cette maladie rare, y compris les modifications de l’horloge biologique liées probablement aux adaptations des prises alimentaires des souris régulièrement nuit et jour afin d’éviter le développement d’hypoglycémie.
Réduction
Afin de pouvoir réaliser une analyse statistique, le nombre d’animaux a été limité à 11 souris par groupe (avec une souris supplémentaire pour les souris atteintes de glycogénose en cas de décès d’un congénère), soit au total 23 animaux, sur une période de 2 ans. Ce nombre a été calculé pour obtenir une puissance d’étude élevée et tenir compte de la variabilité inter-individus. Les résultats des 2 groupes de souris étudiés seront comparés par un test statistique. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés en expérimentation animale, ces souris ne seront pas mises à mort et seront utilisés pour un autre projet.
Raffinement
Afin d’éviter la mort précoce des animaux atteints de GSDIa, la pathologie a été induite uniquement dans le foie et à l’âge adulte ; ceci permet d’éviter les hypoglycémies chez les souris nourries et de passer la période néonatale sans phénotype dommageable (pas de retard de croissance). Pour éviter les réactions inflammatoires liées à l’injection du produit chimique utilisé pour générer les souris transgéniques, les traitements seront réalisés par injections sous-cutanées. La connaissance de ce modèle animal a permis de définir des points limites, en contrôlant les risques d’hypoglycémie et en limitant les efforts des souris pour accéder à la mangeoire (croquettes accessibles directement dans la cage) et au biberon. L’état de bien-être sera évalué quotidiennement par l’observation des signes physiologiques (état du pelage, mouvements/posture de la souris, morsures...) et du comportement des animaux pour détecter tout mal -être occasionné par une hypoglycémie (fiche de suivi des animaux fournie aux zootechniciens). En cas d’hypoglycémie, la souris sera systématiquement injectée avec une solution de sucre et une partie de sa cage sera placée sur une plaque chauffante afin de maintenir sa température corporelle. Dans ce projet, aucune souris ne sera mise à jeun. A leur arrivée dans le deuxième établissement, les souris seront hébergées pendant une période de 15j au minimum afin de s’acclimater à leur nouvel environnement. L’enrichissement sera conservé tout au long de l’étude. Les souris seront ensuite hébergées progressivement dans les cages d’enregistrement de la prise alimentaire pour les habituer à l’isolement. Un suivi du poids sera effectué quotidiennement lors de l’isolement de l’animal. Pour réduire le stress de l’isolement, les cages sont transparentes et sans couvercle permettant aux souris un contact visuel et par l’odorat. L’enrichissement et la litière de la cage d’origine seront conservés lors de l’isolement. Des céréales (type Kellogg’s) seront proposées aux souris à la fin de chaque période d’isolement comme récompense. En cas de petites plaies, une crème à base de teintures mères et d’huiles essentielles qui apaise et cicatrise sera systématiquement appliquée par les zootechniciens en charge du suivi du bien-être animal.
Choix des espèces
Souris (Mus musculus) En ce qui concerne la production de sucre par l’organisme, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs, tels que le poisson, montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Les expériences seront donc réalisées avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’homme et qui reproduisent toute la pathologie hépatique observée chez les patients. Pour cela, un modèle de souris reproduisant la pathologie hépatique de la glycogénose de type Ia a été obtenu par transgenèse en ciblant uniquement la perte de production de sucre par le foie. Ce modèle murin est unique et viable. En effet, l’élevage des deux autres modèles d’animaux atteints de glycogénose de type Ia (souris et chien qui présentent une perte totale de la production de sucre par l’organisme est très complexes car la plupart des animaux meurt avant le sevrage. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 6 semaines et 6 mois.
Etude d’un modèle murin d’une mutation de PAK1 : myélinisation, physiologie et comportement.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Après une chirurgie crânienne de quarante-cinq minutes, une partie des souris est hébergée seule, un isolement dont le porteur reconnaît qu'il génère du stress chez une espèce grégaire. 2 294 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 480 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 1 814 un niveau modéré. Toutes subissent un prélèvement de queue à sept jours, certaines une prise de sang à l'âge adulte, d'autres des tests comportementaux que le RNT ne nomme pas, seulement décrits comme allant "du moins au plus stressant". Une des lignées a une espérance de vie raccourcie et la mutation étudiée pourrait faire apparaître des tumeurs, atteintes que le porteur met en regard de la forte homologie du gène avec celui de l'humain et de traits autistiques déjà caractérisés chez la souris.
Objectifs
Dans le système nerveux central (cerveau et moelle épinière), les neurones communiquent sous forme d’influx électrique, appelé influx nerveux, transporté le long de leurs axones. Afin d’assurer le bon transport de l’information électrique, la formation de gaines isolantes autour de l’axone est essentielle. Ces gaines sont nommées ‘gaines de myéline’. Elles sont formées par des cellules appelées les ‘oligodendrocytes’ et permettent donc de moduler la vitesse de conduction de l’influx nerveux afin que les messages transmis dans le cerveau se déplacent de façon coordonnée. Il a été démontré que les défauts de substance blanche du système nerveux central (substance riche en gaines de myéline) sont observés de façon systématique chez des patients atteint du spectre de l’autisme. Ces défauts pourraient être directement liés au défaut de myélinisation (processus de formation de gaine de myéline) engendré par la présence d’une mutation de la protéine kinase que nous appellerons ‘protéine A’ qui a été observée chez certains patients. L’objectif de ce projet est l’étude des effets d’une mutation de la protéine A retrouvée chez des patients atteints du spectre de l’autisme. En effet, une telle mutation rendrait son activité kinase constitutivement active. Une souris porteuse de cette mutation telle qu’elle est retrouvée chez les patients, et porteuse d’un marqueur fluorescent pour visualiser les cellules myélinisantes permettra l’étude (1) des défauts structurels de myélinisation, (2) des autres défauts du cerveau liés à cette mutation (études des neurones et de leur fonction), (3) de la présence ou non de traits autistiques chez la souris (étude du comportement moteur, social et cognitif). L’étude de ce modèle murin nous permettra donc de contribuer à la compréhension de la physiopathologie de l’autisme et de mettre en avant de potentielles futures voies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
A terme, l’étude approfondie de la souris porteuse d’une mutation de la protéine A, telle qu’elle est retrouvée chez les patients, permettra d’apporter de nouveaux éléments à la compréhension de comment le développement des gaines de myéline mène à un comportement autistique. Les résultats de ce projet permettront peut-être d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de stimuler la myélinisation.
Procédures
L’ensemble des animaux de cette étude auront un prélèvement unique à 7 jours post-natals afin d’identifier les animaux porteurs de la mutation génétique d’intérêt pour notre projet. Une fois adulte, à 60 jours, 20 de ces souris auront une prise de sang (prélèvement unique conforme aux recommandations, effectué sur animal vigile) afin d’analyser différents paramètres biochimiques d’intérêt chez les sujets autistes. Dans le but de caractériser ce modèle de souris et analyser si elle présente des caractères autistiques, un groupe de souris sera étudié dans des tests comportementaux non-invasifs, effectués du moins au plus stressant, et séparés à minima d’une semaine entre chaque. Les tests seront effectués le matin, avec une habituation de l’animal à la salle d’expérimentation pendant à minima une heure. La durée maximale par test n’excédera pas 1h30 (temps d’habituation à la salle et test compris). Enfin, afin d’analyser les effets de la mutation sur la fonctionnalité du cerveau des souris, une partie d’entre elles seront opérées sous anesthésie locale et générale, et analgésie avant et après l’opération (une seule chirurgie par animal, durée maximal 45 minutes). Les animaux seront observés quotidiennement en post-opératoire afin d’intervenir au plus vite s’ils présentent des signes de douleur. Les animaux devront être hébergés de façon isolée (si sevrées) après la chirurgie afin de ne pas abîmer le matériel implanté et permettre le bon enregistrement des données. L’hébergement individuel des souris sera réduit au temps minimal nécessaire (10 jours) et leur cage sera enrichie en maison en carton et en kraft afin de limiter le stress.
Impact sur les animaux
L’une des lignées murines présente une espérance de vie raccourcie ainsi qu’un développement accru du cerveau. De plus, la mutation que nous étudions pourrait induire le développement de tumeur au sein de l’organisme. Les prélèvements de sang et d’un fragment de queue pourraient générer un stress et une légère et brève douleur, mais aussi un risque de saignement. Des nuisances liées à l’acte chirurgical pourraient survenir : risques liés à l’anesthésie (hypothermie, risque cardio-respiratoire), saignements et infections, qui seront maitrisés par les bonnes pratiques. Un stress pourra être induit suite à la manipulation des animaux et aux tests comportementaux auxquels ils seront sujets. S’agissant d’animaux grégaires, l’hébergement individuel des animaux générera un stress.
Devenir
A l’issue de ce projet, l’ensemble des animaux sera euthanasié : - soit pour prélever leur cerveau en post-mortem, afin de réaliser les analyses nécessaires pour répondre à notre question scientifique. - soit à l’issue des tests comportementaux ou après la chirurgie puisque nous aurons d’ores et déjà obtenu le maximum de renseignements possibles sur ces animaux - soit à la fin de la période de reproduction prévue.
Remplacement
Le neurone, cellule nerveuse, comporte une partie très allongées appelée axone. Autour d’elle s’organise une structure particulière nommée myéline. Cette myéline est une structure en trois dimensions : une extension des membranes dites oligodendrocytaires qui s’enroule autour d’un axone électriquement actif. Suivant le principe de remplacement, nous étudierons en détail cette structure sur les cellules à l’origine de ces membranes, appelées oligodendrocytes mis en culture (donc hors de l’animal). il est essentiel ensuite dans le cadre de cette étude, de passer par une étude chez l’animal de la mutation afin de pouvoir : (1) observer la formation de la myéline impactée par toutes les interactions cellulaires présentes dans le cerveau et surtout l'activité électrique des neurones, (2) d'étudier l'impact de la mutation sur le comportement de la souris.
Réduction
Afin d’appliquer le principe de réduction, nous fondons une grande partie de notre étude sur des expériences de cellules en culture. De plus, nous optimiserons l’utilisation de nos animaux. Le nombre d’animaux utilisés (2294) sera limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement exploitables (taille des effectifs nécessaire établi grâce à un calcul de puissance permettant une interprétation fiable des résultats, étude faite en collaboration avec les statisticiens). Toutes les expériences mentionnées seront réalisées sur des mâles et des femelles afin d'évaluer la présence éventuelle d'un sex-ratio. Toutes les quantifications se feront en aveugle, c’est-à-dire sans connaitre au préalable le génotype de la souris analysée pour limiter le biais lié à l’observateur, donc la variabilité et ainsi le nombre de souris nécessaire
Raffinement
L’animalerie est agréée, les conditions d’hébergement (température, hygrométrie, éclairage et espace) et les conditions d’enrichissement de l’environnement (maison et neslet, papier craft), d’alimentation et soins quand nécessaires seront contrôlés. Une période d’acclimatation d’une semaine sera effectuée avant toute procédure expérimentale pour les animaux arrivant de l’extérieur. Les animaux seront suivis régulièrement par notre équipe (deux fois par semaines) et quotidiennement par la zootechnie. Un vétérinaire est présent sur place afin de conseiller les expérimentateurs sur les soins appropriés à mettre en place, si besoin. Ils seront hébergés en portoirs ventilés et dans des conditions de température et d’hygrométrie maintenus dans les références recommandées. De plus, ils seront hébergés dans un environnement enrichi (animaux hébergés en groupe de cinq souris maximum, avec du coton pour se former un nid et un bâtonnet à ronger). Afin d’évaluer les impacts des mutations étudiées, nous tiendrons un registre de suivi du bien-être des animaux. Ainsi, les animaux génétiquement modifiés seront observés tous les deux à trois jours (deux fois par semaine) à l’aide d’une grille d’évaluation qui permet de suivre de près toute modification du comportement physique ou alimentaire présupposant une détresse de l’animal. Si une telle détresse est observée, l’avis du vétérinaire sera automatiquement demandé et les soins appropriés seront donnés à l’animal. Toute mise en place de traitement nécessitera l’isolement de l’animal. Ainsi tout animal isolé sera dans une cage enrichie avec du kraft, des bâtonnets de bois et une maison en carton. Si le vétérinaire le conseille, l’animal en détresse pourra être euthanasié afin de réduire ses souffrances.
Choix des espèces
La formation de myéline est propre au développement des animaux vertébrés. Ainsi son étude nécessite l’utilisation de modèles animaux vertébrés. De plus, puisque nous étudions une voie moléculaire en particulier, celle de la ‘protéine A’, l’établissement de la myélinisation avec une visée thérapeutique future, il est indispensable que le modèle que le modèle que nous choisissions ait une forte homologie de séquence génétique de cette protéine A avec l’Homme. Le modèle souris présente plusieurs avantages pour notre étude : c’est un vertébré dont les gènes codant la protéine A présentent une forte homologie de séquence avec ceux de l’Homme. De plus, de nombreux traits autistiques ont été bien caractérisés chez la souris, avec les tests comportementaux adaptés pour les étudier. Nous étudierons les animaux à différents âges depuis la naissance. Une étude à différents âges au cours du développement post-natal permettra de suivre l’évolution de la myélinisation En parallèle, nous étudierons aux mêmes âges comment est affecté le fonctionnement du cerveau en enregistrant les ondes produites (étude dite électrophysiologique). Enfin, nous étudierons le comportement des souris à différents âges post-nataux correspondant à la maturation de la myéline dans les zones testées. Ainsi par exemple, le comportement social sera évalué à un stade où la myélinisation des cortex gérant les interactions sociales est fortement active.
Evaluation du rôle précoce de CaMK1D in vivo au cours de la neuroinflammation induite par l’obésité
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Toutes tuées pour le prélèvement de leurs tissus, 768 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 240 d'entre elles reçoivent de trois jours à quatre semaines un régime enrichi en graisses destiné à les faire grossir, 160 subissent deux prélèvements sanguins à la mâchoire, d'autres passent vingt-quatre heures à jeun avant un test de réalimentation. La mesure des paramètres métaboliques impose d'isoler des souris pendant quatre semaines, un enfermement que le porteur range parmi les sources d'inconfort. Sur le remplacement, il affirme avoir déjà obtenu la preuve de concept in vitro et écrit avoir "maintenant besoin de la souris", la régulation de l'énergie mobilisant selon lui plusieurs organes à la fois.
Objectifs
L'homéostasie énergétique se définit comme l'équilibre entre les entrées et les dépenses énergétiques. Les dépenses résultent principalement du métabolisme basal et de l’activité physique, tandis que les apports trouvent leur origine dans l’alimentation. Quand cet équilibre est rompu, le terrain est favorable à l’installation de maladies métaboliques telles que l’anorexie ou l’obésité. Récemment, nous avons mis en évidence le rôle neuronal d'une protéine dans la régulation de la balance énergétique. Nous avons récemment observé, chez la souris, qu'en invalidant cette protéine dans les cellules microgliales (cellules immunitaires du cerveau impliquées dans la neuroinflammation) les animaux soumis à un régime riche en graisse présentent une prise alimentaire et une prise de poids réduites. Or, ce régime alimentaire est bien connu pour induire une inflammation de bas grade qui contribue à l'obésité, établissant ainsi un lien entre notre protéine d'intérêt dans les cellules microgliales et l'obésité induite par un régime gras. Cependant ces observations ont été réalisées aprés plusieurs semaines de régime gras. Dans ce projet, nous voulons déterminer les mécanismes moléculaires précoces de la neuroinflammation induite par un régime gras conduisant à l'obésité.
Bénéfices attendus
Au cours de la dernière décennie, l'humanité a été confrontée à une épidémie d'obésité et de diabète de type 2 (DT2) en rapide augmentation. Le nombre de sujets touchés continue d'augmenter dans les économies de marché établies. Plus important encore, la propagation de l'épidémie est encore plus spectaculaire dans les économies émergentes et en développement très peuplées. Le mode de vie sédentaire et la suralimentation, caractéristiques de notre société moderne, expliquent cette propagation épidémique de la maladie. Une approche simple consisterait donc à adapter les habitudes personnelles en conséquence. Malheureusement, cette approche ne fonctionne que pour un petit sous-ensemble de la population, car elle exige une maîtrise de soi très forte et n'est pas suffisante lorsque le diabète à part entière est déjà apparent. Si d'énormes efforts de recherche ont été déployés pour élucider et cibler les mécanismes responsables de l'obésité et du DT2, le tableau est encore loin d'être complet. Par conséquent, de nouvelles perspectives de recherche menant à des approches thérapeutiques sont fortement demandées pour prévenir les énormes coûts de santé et les conséquences négatives du mode de vie moderne. Cette étude servira à identifier les mécanismes moléculaires qui font le lien entre la suralimentation et la mise en place de l'obésité et, par conséquent, le développement du DT2. L'identification de ces mécanismes permettra de savoir si notre protéine d'intérêt constitue une cible thérapeutique pour prévenir le développement de l'obésité. En effet, les médicaments réduisant l'obésité sont particulièrement intéressants pour l'industrie pharmaceutique, notamment en combinaison avec des médicaments qui agissent pour restaurer la fonction des cellules sécretrices d'insuline. Ainsi, notre approche jettera les bases de nouvelles perspectives thérapeutiques pour les patients atteints de DT2.
Procédures
Des prélèvement sanguins seront réalisés sur 160 animaux vigiles. Ces animaux subiront un prélèvement temporo-mandibulaire (1min) à l'age de 9 semaines et un autre à l'âge de 15 semaines avant euthanasie. Au cours du test de tolérance au glucose, des gouttes de sang seront prélevées (6x10 secondes). 240 souris seront soumises à un régime enrichi en gras pendant 3 jours, 1 semaine ou 4 semaines, qui entrainera une prise de poids.
Impact sur les animaux
Le test de réalimentation après un jeûne prolongé nécéssite une mise à jeun des souris pendant 24H. Une diète riche en gras pour créer une environement obésogène sera mise en place chez les souris, ce qui peut créer un inconfort chez les souris. Pour les expériences nécessitant la mesure de la prise alimentaire, les souris seront individualisées dans les cages. La tolérance au glucose nécessite l'injection d'un bolus de glucose qui peut entrainer un inconfort chez la souris. La détermination des paramètres métaboliques par calorimétrie indirecte nécessitent d'isoler les souris pendant 4 semaines.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés et leurs tissus seront prélevés pour des études histologiques ou moléculaires
Remplacement
Toutes nos données in vitro convergent vers une fonction de notre gène d'intétêt dans la neuroinflammation induite par l'obésité. Nous avons apporté la preuve de concept in vitro que notre approche expérimentale fonctionne. Pour tester nos hypothèses, nous avons maintenant besoin de la souris. En effet, la régulation de l'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, îlots de Langerhans dans le pancréas, muscles, tissus adipeux, cerveau). Ces mécanismes de régulation ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris.
Réduction
Nous utiliserons un total de 768 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs procédures expérimentales (avec un temps de récupération adaptée pour les animaux) seront réalisées chez les mêmes cohortes de souris. L'invalidation du gène n'est pas fiable à 100%, pour cette raison, le nombre d'animaux a été déterminé en prennant en compte cette difficulté. Afin d’analyser les paramètres évalués (poids des souris, nourriture consommée) nous déterminerons les tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages avec un enrichissement essentiel pour leur bien-être (Coton + Carton). La litière des animaux est remplacée une fois par semaine. Le stress lié aux procédures nécessitant L'isolement des animaux sera diminué par l'usage de cages transparentes rendant leurs congénères visibles. L'habituation des souris à l'opérateur aura systématiquement lieu quelques jours avant l'expérience par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Un tube sera disposé dans la cage pour déplacer les animaux en limitant le stress dû à la préhension. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié pour prendre les mesures appropriées en cas d'apparition de signes d'inconfort ou de douleur après avis vétérinaire. Des points limites seront déterminés pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Pour étudier le métabolisme, la souris est le modèle animal de référence. L’utilisation des souris se justifie également par l’existence de lignées génétiquement modifées dans lesquelles le gène pour notre protéine d'intérêt est invalidé. Les animaux seront injectés avec du tamoxifène à l'age de 5 semaines, stade auquel toutes les structures cérébrales sont pleinement développées. Les animaux seront nourris avec de la nourriture riche en gras dès l'âge de 9 semaines afin de favoriser une prise de poids optimale
Etude d’une molécule pro-coagulante pour la prise en charge des hémorragies intracérébrales
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour tester une molécule pro-coagulante destinée à limiter les hémorragies cérébrales humaines, 36 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Une chirurgie d'une heure sous anesthésie générale leur provoque une hémorragie dans le cerveau, suivie d'IRM et de scanners à quatre, six et vingt-quatre heures, chaque examen exigeant une nouvelle anesthésie. Le porteur indique que les animaux se retrouveront désorientés, avec des déficits neurologiques moteurs et cognitifs. Il envisage de ne pas les réveiller après l'examen de six heures et conclut que, dans ce cas, "il n'y aurait pas de nuisance associée au réveil".
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une atteinte neurologique soudaine, secondaire à une lésion vasculaire. On peut distinguer 2 types d’AVC : l’AVC ischémique ou infarctus cérébral (85% des cas), et l’AVC hémorragique (15% des cas). Les hémorragies cérébrales (HC) représentent 10 à 30 % des AVC, soit environ 25 000 nouveaux cas par an. Les HC sont à l’origine d’une très lourde morbi-mortalité, avec une mortalité précoce de plus de 40% à 30 jours dont la moitié des décès surviennent dans les 48 premières heures. Seuls 20% des patients seront autonomes à 6 mois. Le mauvais pronostic des hémorragies cérébrales est directement lié à la croissance de l’hématome ainsi qu’aux complications survenant à la phase aiguë (hypertension intracrânienne, hydrocéphalie aiguë et crises convulsives). L’objectif thérapeutique principal est de contrôler la croissance de l’hématome et ses complications neurologiques. Une grande proportion de patients atteint d’HC sont bien souvent sous traitement anticoagulant ce qui à pour conséquence d’augmenter considérablement la probabilité et la gravité de l'HC. L'une des principales raisons de ces mauvais résultats est que les patients sont tout simplement traités trop tard avec des agents d'inversion. Les thérapies actuelles nécessitent une prise d’information multifactorielle (identification de l'anticoagulant, calcul de la dose, poids du patient…), processus chronophage qui réduit les chances du patient. Ainsi, le projet propose d’évaluer une nouvelle molécule de première ligne ayant un mode d’action universel ne nécessitant pas d’identifier l’anticoagulant et dont la mise en œuvre est simple et rapide ce qui permettrait une prise en charge plus rapide du patient. Il est donc prévu d’utiliser cette molécule dans un modèle d’AVC hémorragique chez le porc en vue de passer ce nouveau traitement au plus vite en phase clinique.
Bénéfices attendus
Ce projet à pour but de participer au développent d’une nouvelle molécule à visée clinique dans la prise en charge de l’hémorragie intracérébrale. Les travaux réalisés devraient permettre à l’industriel de valider le composé dans un modèle animal dont l'anatomie cérébro-vasculaire est proche de l’homme et ainsi augmenter le taux de succès des futures études cliniques.
Procédures
Les animaux auront une intervention chirurgicale induisant une hémorragie cérérale sous anesthésie générale d'une durée de 1 heure . Puis l'évolution de cette hémorragie sera suivi à l'aide d'outils d'imagerie médicale IRM (durée de 30 minurtes) et scanner (durée 15 minutes) à différents temps (+4h, +6h et +24h). Pour chaque examen d'imagerie l'animal est maintenu sous anesthésie générale . Ainsi il est prévu de réapliser les imagerie à +4h et +6h dans la continuité de la chirurige. L'animal ne sera donc pas révillé avant la fin des examens à +6h. Une seconde anesthésie sera alors nécessaire à +24h pour effectuer les examens d'imagerie sur une durée de 1 heure.
Impact sur les animaux
Suite à la chirurgie d’induction de l’hémorragie intracérébrale ainsi que le suivi en imagerie post-AVC, les animaux se trouveront désorientés, avec des déficits neurologiques moteurs et cognitifs vecteur de stress. Pour cela une surveillance accrue des animaux sera réalisée sur les 24h post AVC. Il est également probable que le choix du temps d’évaluation soit inférieur à 24h, soit à +6h post AVC. Dans ces conditions, les animaux ne seraient pas réveillés de l’anesthésie générale et seraient mis à mort suite à l’examen d’imagerie médicale. Ainsi, il n’y aurait pas de nuisance associée au réveil.
Devenir
L'induction d'une hélorragie cérébrale provoquant des troubles neurologiques, il n'est pas prévu de maintenir en vie des animaux dont la qualité de vie soit trop impactée. Ainsi, il est prévu une mise à mort en fin de procédure.
Remplacement
Les études de développement de stratégies thérapeutiques nécessitent leur validation sur un modèle animal proche de l’homme avant un potentiel essai clinique. Cette étude se positionne dans la validation in vivo d’un nouveau traitement thérapeutique faisant suite à de nombreuses études in vitro. Il est impossible de remplacer l’utilisation d’animaux dans ce contexte
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé a été réduit au maximum afin de pouvoir conclure à un effet de la molécule testée et ce à l'aide d'une analyse de puissance statistique. Il est prévu d’utiliser des approches d’imagerie non invasives afin de faire un suivi de l’évolution de la pathologie à différentes phases post-opératoires et ainsi cibler la meilleure approche stratégique. Le nombre d’animaux nécessaire est néanmoins réduit et l’étude prévoit maximum 36 animaux, 6 pour la phase pilote et 30 pour l’étude principale. En fonction des résultats de la phase pilote, il sera également possible d’inclure les 6 animaux dans l’étude principale permettant de réduire d’autant les animaux de l’étude principale.
Raffinement
Au cours de cette étude, toutes les dispositions seront prises afin de réduire au maximum la souffrance et le stress et l’angoisse des animaux en accord avec les points limites identifiés pour ce projet. L’étude est menée par du personnel formé et expérimenté, sensible au bien-être et soins spécifiques des animaux. Une acclimatation à l’arrivée après transport du fournisseur est prévue (minimum 7 jours). Les animaux seront hébergés 2 par 2 pour favoriser les interactions sociales dans des boxes contrôlés en hygrométrie et température. Enrichissement et alimentation seront adaptés pour limiter les comportements anormaux (stéréotypies, prostration…) avec un suivi journalier des comportements individuels et alimentaires ainsi que des interactions sociales. Pour la chirurgie et le suivi en imagerie, les animaux seront anesthésiés et sous couverture analgésique. Les paramètres physiologiques (température, hydratation) seront contrôlés.
Choix des espèces
Les modèles d’hémorragies cérébrales ont été développés chez les rongeurs mais l’anatomie et la physiologie vasculaire du porc est plus proche de celle de l’Homme. En effet, les résultats d’une étude chez le porc apportent des informations plus probantes pour une utilisation ultérieure en clinique chez l’Homme, notamment pour les pathologies cérébrovasculaires. Pour ces raisons, nous avons choisi le porc comme modèle d’étude. De plus, le laboratoire a de l’expérience dans les manipulations chez le porc, les séquences d’imagerie sont connues et les installations sont ad hoc pour le bon déroulé des expériences. Les animaux seront utilisés à un stade jeune (autour de 4 mois, 35 à 40 kg). A ce stade, le cerveau a terminé son développement. Ce poids permet de concilier ses animaux à la manipulation et aux études d’imagerie.