Recherche fondamentale

Trois à cinq injections d'antigène, des séries de cinq jours d'instillations nasales, des gavages répétés puis jusqu'à quatre prélèvements sanguins à la mâchoire : 750 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par ponction cardiaque terminale. L'objet est la production d'anticorps polyclonaux destinés à des activités de recherche ou de diagnostic, un consommable de laboratoire fabriqué dans le corps de ces souris. Le porteur indique que l'inoculation peut provoquer une hyperthermie, une forte inflammation locale, une ulcération ou une nécrose au point d'injection. Il qualifie pourtant ces mêmes gestes de douleur "légère de courte durée".

Objectifs

Produire sur des souris de très bons anticorps polyclonaux spécifiques avec une haute affinité dirigée contre des protéines d'intérêt, pour des activités de recherche ou de diagnostic pour lesquels ils n’existent pas des alternatives accessibles. Éventuellement : Utiliser les cellules B pour préparer des hybridomes et/ou extraire les séquences des portions variables des chaines légères et lourdes des anticorps.

Bénéfices attendus

De nombreuses analyses de diagnostic ou de recherche nécessitent de détecter, de visualiser ou de quantifier une protéine dans un échantillon biologique. La plupart d'entre elles reposent sur l'utilisation d'anticorps qui reconnaissent spécifiquement la protéine d'intérêt. Ces anticorps sont produits en immunisant un animal contre la protéine.

Procédures

- 3 à 5 iInjections sous-cutanées, intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale ou espacées de 14 à 21 jours sur animaux vigiles : quelques secondes - 3 à 5 series de 5 jours d’iInstillations intranasales (20ul) sur animaux anesthésiés espacées de 14 à 21 jours : 6 à 10 min - Gavage avec sonde gastrique sur vigiles : jusqu’à 3 séries de 5 jours consécutives espacées de 21 jours: quelques secondes - Prélèvement sanguin (retro mandibulaire) sur souris vigiles (100ul, J-7, J24, J45 ou 48 et éventuellement J66 et J87: quelques secondes - Prélèvement sanguin (cœur) sur souris anesthésiés (acte terminal) animaux : quelques minutes

Impact sur les animaux

Il se peut que l'inoculation d'une protéine (ou l'adjuvant utilisé) induise une réaction inhabituelle plus générale (hyperthermie) ou intense (forte inflammation locale, ulcération, nécrose). Pour cette raison, l'état général des animaux et les points d'injection seront surveillés pendant les 48h premières heures, puis régulièrement. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention. Pour ce geste les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur légère de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour un prélèvement sanguin terminal afin de répondre à l’objectif scientifique.

Remplacement

La production d'anticorps polyclonaux de forte affinité dirigés contre un antigène résulte de la stimulation de différentes populations leucocytaires qui ne peut être reproduite de façon satisfaisante et efficace in vitro. L’initiation de la réponse immunitaire dans les souris naïves est unique pour chaque antigène et possible grâce à l’expression d’une grande diversité d’anticorps par les cellules B in vivo. Cette diversité est assurée par la recombinaison de différents segments de gènes qui ensemble composent les anticorps (germline répertoire). Au début d’une immunisation, certaines de ces anticorps (cellules B) vont se lier à l’antigène avec une affinité souvent très faible, mais suffisante pour initier une réaction immunitaire. Lors de cette réactions les cellules B reconnaissant de l’antigène vont se multiplier et commencer à secréter des anticorps. Au fur et à mesure de l’immunisation et des boosts, les cellules B accumulent des mutations aléatoires dans les gènes codant pour les anticorps, permettant ainsi d’augmenter (ou diminuer) de manière significative l’affinité des anticorps produits. Ce processus nécessite des interactions des plusieurs types cellulaires dans des tissues immunitaires et ne peuvent pas être reproduits in vitro ni prédit de manières satisfaisant par des méthodes in silico.

Réduction

Dans la très grande majorité des cas, un lot de 5 animaux sera suffisant pour obtenir la quantité d'anticorps nécessaire pour les travaux scientifiques. Dans certains cas (échec de l'immunisation ou besoin de très grandes quantités d'anticorps), il peut être nécessaire de répéter l’immunisation 2 ou 3 fois. Nous estimons que le nombre de demandes de production d'anticorps polyclonaux portera sur un total d'environ 30 antigènes et donc 150 animaux par an.

Raffinement

Il se peut que l'inoculation d'une protéine (ou l'adjuvant utilisé) induise une réaction inhabituelle plus générale (hyperthermie) ou intense (forte inflammation locale, ulcération, nécrose). Pour cette raison, l'état général des animaux et les points d'injection seront surveillés pendant les 48h premières heures, puis régulièrement. Le protocole d'immunisation sera interrompu si des signes généraux sont observés. Les soins adéquats seront apportés à l'animal (anti-inflammatoires, antibiotiques, soins locaux…). L’animal sera mis à mort si aggravation des signes cliniques malgré le traitement. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention, une préparation aseptique et une anesthésie locale et une réhydratation sous-cutanée. Le prélèvement terminal (grand volume) sera réalisé sous anesthésie générale.

Choix des espèces

L’espèce utilisée est la souris de laboratoire. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental. Les souris de laboratoire restent des modèles dont la pertinence biologique et biomédicale est établie. De plus, l’utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées permettra d’évaluer plus précisément les mécanismes moléculaires et cellulaires de la pathologie humaine. L’ensemble des animaux expérimentaux seront utilisés au stade « jeune adulte » : entre 6 et 12 semaines au début de l’expérience, âge à partir duquel le système immunitaire est mature et ne subit plus de changements majeurs.

Injectées de cellules leucémiques puis maintenues en boîte de contention pour recevoir jusqu'à trois injections de lymphocytes modifiés, 120 souris immunodéficientes subissent aussi trois prises de sang dans la joue et une ponction de moelle osseuse dans le fémur. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à l'issue. Les souris témoins, laissées sans traitement, développent la leucémie jusqu'à la restriction des mouvements des pattes arrière, la perte d'appétit et la perte de poids. Le porteur écrit avoir déjà démontré en culture que ces cellules tuent les cellules tumorales, et juge pourtant l'étape chez la souris "indispensable et incontournable" avant tout usage clinique.

Objectifs

L’objectif de cette étude est d’étudier différents modes d’administration de cellules qui ont été génétiquement modifiée dans le but de reconnaître puis d'éliminer des cellules cancéreuses (lymphocyte T modifié, CAR-T) afin d’étudier la réponse immunitaire dirigée contre la leucémie dans un modèle murin. La thérapie par cellules CAR-T consiste en la greffe autologue de lymphocytes T préalablement modifiés par thérapie génique pour leur faire exprimer un récepteur dirigé contre une protéine tumorale et permettre son élimination. Cependant, la réponse dirigée contre la tumeur provoque le relarguage massif de certaines molécules pouvant donner lieu à des complications plus grave jusqu’à la mort du patient. De plus, suite à leur activation, les cellules administrées meurent, ce qui nous emmene à une autre problématique : la persistance de ces cellules CAR-T in vivo. Enfin à cause de la pression thérapeutique, les cellules tumorales peuvent perdre l'expression de la cible du CAR-T conduisant aux rechutes des patients traités. Ainsi, le développement de nouveaux modèles d’administration est donc un enjeu majeur pour inhiber ces réponses et permettre le succès thérapeutique sur le long terme. Dans ce projet, nous allons utiliser de 2 types de cellules CAR-T en comparant la méthode d’administration standard telle qu'elle est utilisée à ce jour en clinique à une injection de manière séquentielle (fractionnée). Ainsi, la même dose sera administrée soit en une seule injection soit en deux injections. L’objectif principal sera d’évaluer la tolérance de la dose fractionnée ainsi que l'effet antileucémique comparativement à la dose unique. Secondairement, nous évaluerons la persistance des cellules CAR-T in vivo.

Bénéfices attendus

Cette approche devrait nous permettre d’évaluer dans un modèle murin l’intérêt d’une telle stratégie d’injection chez l’homme afin d’améliorer la sécurité du traitement et d’optimiser l’injection des cellules CAR-T afin d’en améliorer l’efficacité thérapeutique.

Procédures

Injection en intra-veineuse sur souris vigile maintenue en boite de contention, 1 injection de cellules à J0 puis 1 ou 2 autres (J10 et J17 selon les groupes de souris), moins de 10 secondes par injection. Des prélevements sanguins seront réalisés en submandibulaire sur souris anesthésiée avec un volume n’excédant pas 75 µl tous les 10 jours et un maximum de 3 prélèvements au total par souris, durée de prélèvement moins de 5 secondes. 1 prélèvement de moelle osseuse sur souris anesthésiée, moins de 10 secondes par prélèvement. Suivi par utilistion d'un bioimageur du développement des tumeurs sur souris anesthésiée. Prélèvements de sang et de moelle sur souris après le mise à mort.

Impact sur les animaux

Les souris contrôles vont développer la leucémie et l'avancée de la maladie va conduire à une restriction des mouvements des souris notamment des pattes arrières, une perte d'appétit et de poids. Une réaction de greffon contre l'hote plusieurs semaines après l'injection des CAR-T peut également se produire chez les souris, faisant partie des points limites de la procédure expérimentale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de la procédure expérimentale.

Remplacement

Nous avons déjà étudier le phénotype et la fonctionnalité des CAR-T cells in vitro en démontrant leur capacité à tuer les cellules tumorales. Cette validation in vitro nous a permis de démontrer la qualité et l'efficacité des cellules CAR-T à court terme. Pour nous rapprocher des conditions physiologiques chez le patient, une étude de l'efficacité des CAR-T à long terme dans un modèle in vivo reste cependant indispensable et incontournable avant leur utilisation en thérapeutique clinique.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum grâce à l’expérience acquise d’autres protocoles expérimentaux dans lesquels la réponse antitumorale des CAR-T cells chez des souris greffées de cellules leucémiques a été évaluée. Le nombre minimum de souris utilisées prend en compte les variabilités des mesures par bioluminescence du signal tumoral chez les souris (pouvant varier selon l’âge, le sexe, le délai de prise de greffe tumorale) et des réponses immunologiques observées durant ces protocoles. Les résultats obtenus seront analysés statistiquement.

Raffinement

L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, statut SPF, où les conditions d’hébergement sont contrôlées quotidiennement : température (23°C), hygrométrie (50%), cycle jour/nuit (12/12), change et nourriture. Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec un abri de cellulose et des fibres de coton. Des points limites ont été mis en place et dans l'éventualité où un ou plusieurs animaux atteindraient le point limite, ils seront mis à mort. Pour les animaux présentant des difficultés de locomotion, la nourriture et l’eau seront apportés directement dans la cage sous forme de gel. L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Toutes les interventions sur les souris seront réalisées sous hotte à flux laminaire pour éviter tout risque d'infection. Afin de répondre au principe de raffinement les prélèvements de sang seront effectués en sub-mandibulaire sous anesthésie générale. Les volumes de sang prélevés aux différentes étapes seront limités à 2 gouttes. Une analgésie par injection en sous-cutané (au niveau du genou) d'un analgésique sera mis en place 5 minutes avant le prélèvement de la moelle osseuse pour renforcer l’analgésie locale. Un maximum de 2 prélèvements par souris sera autorisé (1 prélèvement par fémur). En cas de douleur des souris (évaluation physique et comportementale) un anti douleur adapté sera injecté en sous-cutané, toutes les 6 à 12 heures durant 24 à 48 heures.

Choix des espèces

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des populations lymphocytaires et le suivi des réponses immunitaires. L’utilisation d’animaux immunodéprimés nous permet de n’observer que les effets des cellules CAR-T sur la leucémie. Les mécanismes immunologiques observé dépendront donc des cellules injectées et non des cellules murines. Les animaux seront âgés entre 8 et 12 semaines (adultes) au début des protocoles, car il faut que le système immunitaire soit totalement mature. Le poids des souris varient entre 20 et 30g.

1 200 truites, chabots et ombres communs capturés en rivière vont être marqués dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis remis à l'eau vivants. Chaque poisson est anesthésié, mesuré, pesé, puis ouvert par une incision ventrale pour l'implantation manuelle d'un transpondeur, l'ensemble se déroulant hors de l'eau pendant trente secondes à une minute. Le porteur annonce moins de 1 % de mortalité après l'opération, mais table aussi sur une perte du marqueur chez 5 à 10 % des salmonidés et jusqu'à 20 % des femelles au moment de la fraie, ce qui gonfle l'effectif capturé. Il affirme qu'aucune méthode de remplacement n'existe pour évaluer si les poissons franchissent une passe aménagée, et la version modifiée du projet porte l'effectif à 1 500 individus.

Objectifs

L’objectif principal est d’évaluer, grâce à la technologie RFID (Radio Frequency Identification) la franchissabilité des ouvrages et des aménagements réalisés pour rétablir la continuité écologique dans un cours d'eau salmonicole. Dans cette rivière, de nombreuses actions de restauration de la continuité écologique ont été réalisées sur un secteur long de 6.7 km, sur lequel 8 seuils ont être arrasés ou modifiés pour faciliter la mobilité piscicole mais aussi sédimentaire. En 2022, le dernier des seuils de ce secteur a été aménagé pour permettre aux poissons de franchir un obstacle considéré jusqu’ici comme infranchissable (création d’une rivière de contournement). Dans la suite des efforts réalisés par le syndicat gestionnaire pour améliorer la continuité écologique sur ce secteur dit « renaturé », une étude écologique pluriannuelle, par la technologie RIFD devra confirmer que la mobilité piscicole et sédimentaire y est à nouveau assurée. Cette étude devrait aussi permettre d’identifier les zones de déplacements des poissons en tenant compte des contraintes physiques et morphologiques du milieu (thermie, disponibilité en habitat).

Bénéfices attendus

Les projets permettront de mettre en lumière la « transparence » des ouvrages à la migration des espèces cibles, c’est à dire l’absence de sélectivité et de retard à la migration. Dans le cas de blocage avéré des individus, des aménagements seront envisagés pour restaurer la continuité écologique et permettre à ces espèces de rejoindre des habitats piscicoles de qualité, notamment pour la reproduction.

Procédures

Après anesthésie générale, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale sera réalisée et un transpondeur PIT tag sera implanté manuellement sur 1'200 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau. MODIFICATION du 30/04/2024 : 1'500 poissons.

Impact sur les animaux

La capture, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Des précautions seront prises à chaque étape pour limiter le stress et la douleur des animaux. La cicatrisation après implantation des PIT tags est généralement très bonne, tant sur des lots conservés en pisciculture qu'en milieu naturel.

Devenir

Tous les individus capturés puis marqués seront remis à l’eau vivants pour l'étude de leur comportement in situ.

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement des passes à poissons doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire des espèces considérées, dans le cas présent la truite de rivière et le chabot. Il est nécessaire de capturer des animaux sauvages en rivière, de les marquer individuellement et de les relâcher vivants à l’aval des ouvrages étudiés. Ensuite, les déplacements sont évalués en utilisant des dispositifs de détection fixes et mobiles.

Réduction

Le projet est prévu sur une durée de 3 ans, avec captures et marquages les deux premières années (maximum 5 ans si reports des marquages en cas de conditions environnementales défavorables). Les effectifs prévus par espèce sont un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des « patterns » comportementaux, et évaluer in fine la franchissabilité et la sélectivité de l'ouvrage. Ils ont été adaptés au gabarit du cours d’eau et à la densité de population en place. Chez la truite, il peut être attendu un taux de montaison de 10 à 30%, taux moyen constaté dans les différentes études réalisées. Cet effectif théorique attendu doit être nuancé par plusieurs facteurs : - L’implantation des PIT tags ne génère en principe pas (ou très peu,

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac de 50L oxygéné et refroidi. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. Le bac d'anesthésie sera renouvelé toutes les 20 minutes en moyennes ou plus souvent si le temps d’anesthésie augmente, ceci pour éviter que la température ne varie de plus de 2°C et soit toujours 80mm ; 23 mm au-dessus. Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés en bon état sanitaire (absence de blessure, de parasites, d’infections visibles) seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision (pommade recommandée et fournie par E. Meunier, vétérinaire référent).

Choix des espèces

L’espèce cible principale est la truite commune (Salmo trutta). Cette espèce caractéristique de la rivière étudiée et à fort enjeu halieutique est la plus susceptible de migrer sur des longues distances notamment en période de pré-reproduction, et donc d'être le plus fortement impactée par les obstacles à la migration. En complément, une petite espèce d’accompagnement de la truite, le chabot (Cottus gobio), sera également intégrée dans le suivi en raison de son abondance sur certains secteurs et de sa faible capacité de nage. Pour les truites, seuls les individus d’un an et plus dont la longueur totale excédera 120 mm seront marqués à l’aide de PIT tags 23 mm. Pour les chabots, les stades sub-adultes et adultes seront visés, avec une longueur minimale de 80 mm. Ces individus seront marqués par PIT tag de 13 mm. Ces tailles minimales assurent un ratio « poids du l’émetteur / poids du poisson » inférieur à 2%, ce qui est en adéquation avec les préconisations tirées de la littérature scientifique. Les individus plus petits que les tailles minimales indiquées seront relâchés sans être marqués, après une phase de réveil dans un vivier placé dans la rivière. MODIFICATION du 30/04/2024 : l’ombre commun a été ajouté en tant qu’espèce protégée présente sur le secteur d'étude et fortement impactée par la fragmentation des cours d’eau. Les ombres de plus de 180 mm seront marqués.

1 515 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à vingt échographies abdominales sous anesthésie de quinze minutes et dix prélèvements de sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des vecteurs viraux sont injectés avant la naissance ou sur des souriceaux de deux, cinq et quinze jours, pour déclencher un cancer du foie de l'enfant, d'autres animaux recevant une greffe de fragment tumoral au cours d'une chirurgie abdominale. Le porteur signale que l'usage d'animaux à des âges aussi précoces peut conduire la mère à les abandonner, voire à les manger. Toutes sont tuées à l'issue, pour une maladie qui touche vingt enfants par an en France et dont quatre sur cinq guérissent avec les traitements actuels.

Objectifs

L’hépatoblastome (HB) est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. La survie globale à 5 ans actuellement est de 80 pour cent. Le traitement associe de la chimiothérapie à base de Cisplatine à une résection chirurgicale de la tumeur. Mais 20 pour cent des enfants traités vont développer une résistance au Cisplatine au cours de la chimiothérapie néoadjuvante ou au cours de la récidive de la maladie. Il existe actuellement peu d’alternatives thérapeutiques, avec des données insuffisantes sur les alternatives proposées. Il est donc crucial de pouvoir tester de nouvelles associations de traitement ou de nouveaux traitements. Les modèles pré-cliniques d’hépatoblastome qui existent aujourd’hui sont réalisés sur des souris nude, souris immunodéprimées, chez qui un fragment d’HB humain, ou des suspensions cellulaires issues de culture cellulaires d’HB sont implantés en sous cutané ou en situation orthotopique, c’est-à-dire directement dans le foie. Cependant le système immunitaire a un rôle primordial dans la réponse anti-tumorale. Il est donc très important de développer des modèles syngéniques d’hépatoblastomes chez la souris immunocompétente afin de pouvoir, une fois le modèle établi, étudier l’effet de nouveaux traitements et également étudier la réponse immunitaire impliquée dans la réponse anti-tumorale. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Notre équipe s’intéresse à deux grands types de tumeurs malignes du foie : les carcinomes hépatocellulaires (CHC) principalement développés chez l’adulte et les hépatoblastomes (HB) qui se développent chez l’enfant de moins de 5 ans. L’HB est une maladie rare mais c’est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. L'incidence est de 1 à 1,5 /1000000 d'enfant de moins de 15 ans, et cette incidence est en cours d'augmentation. Il touche 20 enfants par an en France. Dans le cas des HB, bien que la majorité des patients répondent aux traitements conventionnels, environ 20 pour cent sont réfractaires et décèdent. Les modèles de xénogreffes de lignées tumorales ou de greffes orthotopiques de tumeurs dérivées de pièces opératoires de patients représentent les modèles précliniques les plus pertinents actuellement pour étudier la réponse thérapeutique. Mais ces modèles sont développés chez des souris immunodéficientes et ne permettent pas d’étudier le rôle du système immunitaire. Cette étude nous permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu, et notamment les mécanismes immunitaires, et de tester de nouvelles approches thérapeutiques pouvant être bénéfiques aux patients réfractaires aux traitements habituels.

Procédures

Les animaux pourront être soumis, selon les cas, à l’un des gestes suivants : 1) une chirurgie abdominale ou lombaire pour injection dans le foie ou la rate (une seule fois, animal anesthésié et analgésié, 15min maximum) (réalisé dans l'établissement utilisateur 1 (EU1), 2) injection percutanée (animal vigile, 1 fois maximum, 15sec) (EU1), ou 3) une chirurgie abdominale pour greffe d’un fragment tumoral dans le foie (une seule fois, animal anesthésié et analgésié, 15min maximum) (EU1). L’ensemble des animaux seront amenés à avoir : des prélèvements de sang de faible volume (animal anesthésié, 10 fois maximum avec une intervalle d’une semaine minimum entre chaque, 1min) ; un suivi par échographie abdominale (animal anesthésié, 20 fois maximum, 15 min) (EU1) ; pour certains un transport dans un autre établissement afin d’effectuer une imagerie non invasive par IRM (animal anesthésié, 2 fois, 30 min) (réalisé dans l'établissement utilisateur 2 (EU2)). En fin de période de maintien les animaux seront anesthésiés, un dernier prélèvement sanguin (1 min) sera réalisé et ils seront immédiatement euthanasié par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les nuisances prévues sont principalement celles engendrées par les procédures chirurgicales réalisées, qui peuvent engendrer une douleur au niveau de l’incision au réveil de l’animal et avoir une incidence sur l‘état général de santé de l‘animal (perte d‘appétit, baisse de l‘activité, infection de la cicatrice, détresse de l’animal dans les cas les plus grave), ainsi qu’entrainer une légère gêne dans la locomotion. Un risque anesthésique est également à prendre compte (détresse respiratoire, réveil intempestif). L’utilisation d’animaux à des âges précoces peut engendrer un abandon de la part de la mère, voir du cannibalisme dans le cas des nouveau-nés. Un stress de l’animal peut aussi être constaté lors des contentions, ainsi qu’un inconfort lors des injections. Le développement des tumeurs hépatiques est généralement asymptomatique et n’entraîne donc pas de nuisances en soit, car les animaux seront euthanasiés avant que les tumeurs entrainent une dégradation de l’état général des animaux. Une imagerie non invasive (IRM) sera réalisée dans un autre établissement utilisateur, ce qui nécessite un transport des animaux qui peut entraîner une nuisance. Une imagerie non invasive (IRM) sera réalisée dans un autre établissement utilisateur, ce qui nécessite un transport des animaux qui peut entraîner une nuisance du fait du stress lié à la néophobie des rongeurs. Un risque anesthésique est également à prendre compte car l'IRM est effectuée sous anesthésie générale (détresse respiratoire, risque d'hypothermie, réveil intempestif).

Devenir

Le prélèvement des tissus d’intérêt étant nécessaire pour la réalisation de nos analyses, l’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin des procédures grâce à une méthode réglementaire, et dans le respect des bonnes pratiques.

Remplacement

Les modèles in vitro ne miment que partiellement la pathologie humaine car ils ne permettent pas de modéliser certains paramètres biologiques pouvant influencer le développement tumoral ou la réponse thérapeutique, tels que les interactions des cellules tumorales avec leur environnement ou encore l'hétérogénéité intra-tumorale. Il est donc essentiel de disposer de modèles in vivo reproduisant le plus fidèlement possible les caractéristiques de la pathologie humaine. Le recours à des modèles animaux est donc indispensable pour mieux comprendre l'histoire naturelle de la maladie et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Les effectifs ont été réduits au maximum et les groupes seront composés de 8 à 12 animaux. Cet effectif a été déterminé grâce à un calcul de puissance, afin d’utiliser le moins d’animaux possibles tout en permettant d’obtenir des résultats suffisamment robustes, et les expériences pourront être réitérées jusqu’à 3 fois si nécessaire. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Afin de limiter au maximum les éventuelles variations entre les expériences, les paramètres d’hébergement et de soin des animaux seront contrôlés. Le suivi tumoral hépatique sera réalisé grâce à une méthode non invasive, l’imagerie par échographie et par IRM, ce qui diminue également le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total d'animaux utilisés sur la totalité du projet s'élève à 1515.

Raffinement

Les paramètres d'hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur. Les cages seront enrichies avec du coton de nidification, des maisonettes en plastique ainsi que des batônnets à ronger. Les femelles gestantes seront regroupées à 2 par cages afin d’éviter leur isolement, et ne seront séparées qu’après avoir mis bas afin d’éviter la surpopulation au sein d’une même cage. Les animaux issus d’établissement fournisseur observeront une durée d’acclimatation de 7 jours minimum avant toute utilisation. Un change sera réalisé par le personnel de l’animalerie une fois par semaine (sauf indication contraire) et une surveillance quotidienne rigoureuse des animaux sera réalisée tout au long de leur vie. Des pesées seront également réalisées à intervalles réguliers et une grille de suivi est utilisée. Les procédures seront raffinées afin de limiter au maximum la douleur et l’inconfort des animaux (personnel formé et compétent, anesthésie et analgésie adéquate suite aux procédures chirurgicales puis surveillance rapprochée des animaux avec étiquetage spécifique des cages concernées), et des points limites précis seront établis. Si un animal présente des signes de douleur ou de détresse, il sera immédiatement euthanasié par une méthode réglementaire afin d’éviter toute souffrance animale. La Structure chargée du Bien-Etre Animal et/ou le vétérinaire pourront être sollicités pour conseil si besoin. Les transposrts des animaux entre l'EU1 et l'EU2 est assuré par un transporteur agréé, dans des boîtes de transport appropriées, ventilées, sécurisées et suffisament spacieuses. Un apport en nourriture et en eau gélifiée sera fourni durant le transport. Le temps de transport est de moins de 20 minutes entre les 2 EU.

Choix des espèces

La souris est un modèle expérimental de choix pour l'étude des pathologies humaines car c'est un petit mammifère qui se reproduit rapidement, est facile à manipuler, et dont nous avons une bonne connaissance du comportement et de la génétique. De plus, le génome de la souris est identique à plus de 95 pour cent à celui du génome humain, ce qui suggère une bonne homologie des mécanismes observés. On peut également facilement apprécier les modifications physiques et/ou comportementales traduisant une souffrance et/ou douleur, ce qui conduirait à l’euthanasie de l’animal. De nombreux outils moléculaires sont également disponibles chez ce modèle animal. La première procédure sera réalisée sur des femelles gestantes âgées de 2 à 3 mois, ce qui correspond à l’âge adulte et également à l’âge optimal permettant le bon déroulement de la gestation d’une part, et une bonne récupération de l’acte chirurgical d’autre part. Les vecteurs viraux seront injectés à différents âges (prénatal, 2, 5 et 15 jours de vie post natal), présentant un foie encore immature et en prolifération, afin de développer un hépatoblastome.

225 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux cents d'entre elles reçoivent sous la peau un implant de tissu biologique, opération de dix minutes sous anesthésie, puis subissent une micro-incision de la queue pour un prélèvement de sang au moment où l'implant leur est retiré, avant d'être tuées. Les 25 restantes, écartées parce qu'elles n'ont pas le génotype recherché, sont laissées en vie et réutilisées dans d'autres protocoles en cours. Le projet cherche à savoir si le blocage d'une enzyme freine la calcification des bioprothèses valvulaires, et le porteur affirme devoir le vérifier "in vivo, dans un système biologique entier", après des résultats non publiés obtenus en culture cellulaire.

Objectifs

Le rétrécissement aortique calcifié (RAC) est la valvulopathie la plus fréquente dans les pays occidentaux et sa prévalence augmente avec l’âge. Il n’y a aujourd’hui pas de traitements pour traiter le développement du RAC. En plus du remplacement valvulaire aortique (RVA), les recommandations de prise en charge des patients ayant un RAC incluent aussi l’implantation d’une prothèse biologique dans la valve aortique par voie percutanée (TAVI). Concernant ces prothèses, il a été observé des cas de recalcification et peu d’étude existent sur la durabilité des prothèses au-delà de 5 ans. Nous avons précédemment identifié, en travaillant sur des modèles cellulaires, une cible thérapeutique appelée Ezh2 (Enhancer Zeste Homologue 2), qui agit sur les phénomènes inflammatoires et de calcification dans le RAC. Nous souhaitons au travers de cette étude démontrer son rôle dans les processus inflammatoires associés à la dégénérescence de bioprothèse valvulaire aortique.

Bénéfices attendus

Démontrer l'intérêt thérapeutique du ciblage de l'enzyme épigénétique EZH2 (Enhancer zest homolog 2) par une meilleure compréhension de son rôle dans les processus inflammatoire associés à la dégénerescence des bioprothèses valvulaire aortique.

Procédures

1. implantation de tissus biologiques en sous cutanée chez un modèle de souris sous une anesthésie gazeuse et sous couverture analgésique adaptée suivant le poids de la souris 40 minutes avant opération chirurgicale. Le temps nécessaire à l'implantation des tissus biologique en sous cutanée est de 10 minutes par souris 2. Chaque souris (n=200) subira un prélèvement sanguin par micro-incision de la queue au moment de l'extraction des implants. La couverture analgésique obtenue dure 6 heures et la durée d'injection de l’analgésique est de 2 à 3 secondes.

Impact sur les animaux

Les prélèvements sanguins (classe légère), les administrations d’analgésique (classe légère) et le traitement avec l'inhibiteur pharmacologique de Ezh2 (classe légère), pourront occasionner des effets secondaires. L’implantation de tissus biologiques en sous cutanée est une procédure de classe modérée pouvant occasionner une douleur modérée post-opératoire et une gêne au niveau des zones implantées.

Devenir

Tous les animaux inclus dans la procédure (n=200) seront mis à mort. Les implants seront prélevés pour les explorations ex vivo. Les 25 animaux n’ayant pas le génotype d’intérêt et n'ayant donc pas été inclus dans la procédure seront laissés en vie et réutilisés pour d’autres protocoles en cours.

Remplacement

Des résultats non publiés de notre laboratoire ont montré que le ciblage, in vitro, de l’enzyme épigénétique Ezh2 dans les cellules inflammatoires permettait une réduction des phénomènes inflammatoires participant au développement des calcifications de la valve aortique. Dans cette étude nous voulons évaluer, in vivo, dans un système biologique entier, l'effet du ciblage spécifique d'Ezh2 sur les processus inflammatoires associés à la dégénérescence de bioprothèse valvulaire aortique.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude nous avons mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex vivo durant la procédure et au moment de la mise à mort. Le choix des inhibiteurs pharmacologiques de Ezh2 est issu d'expériences préalablement réalisées dans des modèles de RAC in vitro. A l'aide du logiciel G*power version 3.1.9.7 qui s'appuie sur la variabilité statistique des résultats obtenus le nombre d'animaux nécessaire est ajusté. Des animaux des deux sexes seront utilisés dans nos procédures afin de s'affranchir d'un effet du genre et d'utiliser l'intégralité des animaux OGM produits dans notre animalerie. Une stratégie de reproduction adaptée et associée à une analyse du génotype de chaque animal nous permettra de nous limiter à l'unique production d'animaux pour les procédures expérimentales. Afin d'éviter la production d'animaux servant au maintien de la lignée OGM dans notre animalerie, une stratégie de cryopréservation de sperme sera mise en place.

Raffinement

Pour raffiner, les animaux seront hébergés sur portoirs ventilés et dans des cages en plaques de cellulose vierge et maisons en carton. Nous avons déterminé des points limites adaptés grâce à notre grille de score qui s’appuie sur le comportement de l'animal, son apparence et des signes cliniques spécifiques. De plus, nous adopterons une stratégie de réhydratation par injection en sous-cutanée de sérum physiologique à 37°C, et en cas de besoin, une injection de glucose par voie intrapéritonéale. Un traitement analgésique en pré et postopératoire, sera administré, soit immédiatement après l'implantation ou une fois par jour sur les 48h qui suivent l’implantation. Si un des points limites est atteint ou si la somme des paramètres de suivi atteint un score entre 10 et 14, la méthode de mise à mort prévue est la dislocation cervicale. Un suivi quotidien du bien-être animal sera mis en place.

Choix des espèces

La souris a l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des outils biologiques, l’utilisation d’animaux pour lesquels un gène est invalidé de manière spécifique dans différents types cellulaires comme cela est le cas dans cette demande concernant la délétion de Ezh2 dans les cellules myéloïdes, qui ne sont parfois pas accessibles pour le rat (modèle développé au sein de notre laboratoire). Ces modèles sont particulièrement intéressants pour mieux comprendre les mécanismes de la pathologie. Dans notre laboratoire nous avons, depuis de nombreuses années, une excellente expérience des évaluations fonctionnelles et structurelles cardiaques in vivo ainsi que ex vivo chez la souris. La souche de souris (C57Bl/6j) sera utilisée dans cette étude Nous allons inclure des animaux adultes de 12 semaines. La taille des souris à cet âge permet une implantation facilitée des prothèses .

Après un transfert de cellules T qui déclenche chez elles une maladie auto-immune de la peau, 714 souris sont saignées sous anesthésie à J0, J7, J14, J21 puis J28, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La maladie provoque des érosions sur le museau, autour des yeux et des oreilles, sur le dos, la poitrine, l'abdomen, les quatre pattes et la queue, une perte de poils et un allongement des dents. Le porteur écrit que cette inflammation ne peut pas être atténuée, puisque la réduire modifierait le phénotype recherché. Toutes sont tuées à l'issue, pour mesurer dans leurs tissus le niveau d'inflammation et la réponse immunitaire.

Objectifs

Les maladies bulleuses auto-immunes sont un groupe de maladies inflammatoires chroniques de la peau rares avec des bulles et des érosions de la peau. Parmi ces maladies, le pemphigus vulgaire (PV) est caractérisé par la production d’auto-anticorps (auto-Ac) dirigés contre deux protéines desmosomales. Les traitements des formes modérées à sévères de PV sont efficaces, cependant, il y a environ 40 % de patients en rechute. Par conséquent, il existe un besoin médical non satisfait afin de prédire et de guérir les rechutes de PV. Les réponses Ac sont contrôlées par des globules particuliers appelés lymphocytes T. Nous avons observé chez les patients PV une diminution de ces cellules T après traitement corrélée à une baisse prolongée des auto-Ac.

Bénéfices attendus

Notre objectif est de tester le rôle causal et mécanistique des lymphocytes T dans la physiopathologie du PV à l’aide de modèles murins pré-cliniques de PV déficients pour la population de lymphocyte T afin de développer de nouvelles thérapies.

Procédures

Prélèvement sanguin à J0, J7, J14, J21 et J28 après transfert des cellules T afin d'évaluer la mise en place de la pathologie autoimmune de PV par mesure de la quantité d'auto-anticorps sérique. Les prélèvements de sang auront lieu sous anesthésie gazeuse (durée de l'anesthésie = 2 min). Nombre total d'interventions chez les animaux = 5.

Impact sur les animaux

Développement d'une pathologie équivalente au PV : erosion (Museau, Région périorbitaire, Région périoriculaire, Dos, Poitrine, Abdomen, Patte avant droite, Patte avant gauche, Patte arrière droite, Patte arrière gauche, Queue), alopécie (face, dos, cou et abdomen), allongement des dents avants

Devenir

Les souris seront euthanasiées afin que nous prélevions et analysions dans les tissus le niveau d'inflammation et la réponse immunitaire dans le contexte du pemphigus

Remplacement

Les maladies inflammatoires chroniques cutanées sont des maladies multifactorielles complexes dans lesquelles plusieurs organes du corps jouent un rôle important (p.ex., les structures épithéliales, les organes lymphoïdes secondaires ou encore le système vasculaires etc). Ce projet est multidisciplinaire et vise à mieux comprendre le rôle des cellules du système immunitaire dans le contrôle d'un modèle murin mimant le PV. De ce fait nous devrons travailler avec des animaux vivants afin de pouvoir analyser le rôle des différents organes et différents types cellulaires suspectés d'être impliqués dans le développement de cette pathologie étudiée.

Réduction

Nous avons calculé que le nombre minimum pour obtenir des résultats reproductibles et statistiquement interprétables est de 7 souris/groupe et que les expériences seront reproduites 3 fois. Au total 10 lots experimentaux réalisés, ce qui correspond à 102 groupes experimentaux. Nous essayons d'effectuer le maximum d'analyse sur le même animal : analyse des tissus inflammés par histologie, analyse multiparamétrique en cytométrie en flux pour analyser la nature, le phenotype et la fonctionnalité des cellules immunitaires

Raffinement

Les animaux seront attentivement observés après induction du PV. Le poids des animaux sera suivi et si les souris devaient perdre 20% de leur poids initial ou si nous observons des signes de douleurs apparentes, l'animal sera mis à mort. Les animaux seront placés dans des cages (5 souris par cage) avec enrichissement : igloo/maison, papier kraft pour nidification. L'objectif de ce projet est de tester de nouvelles approches thérapeutiques, donc l'inflammation induite ne pourra être réduite car elle impacterait le phénotype.

Choix des espèces

La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif (avec une variation possible en fonction des fonds génétiques étudiés) et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponible chez la souris. Enfin, la physiologie des différents organes chez la souris présentent de nombreuses similarités avec celle des organes humains, ce qui permet l’induction de modèles pathologiques mimant les maladies humaines observées chez les patients. Pour la majorité des expériences, les animaux seront utilisés entre 8 et 12 semaines ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature.

Toutes tuées en fin de procédure pour des analyses post-mortem, 205 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, puis pour certaines des injections deux fois par semaine pendant quatre semaines, toujours sur animal vigile. Un second groupe est irradié trois minutes sous contention avant de recevoir des cellules par voie intraveineuse, puis des cellules tumorales six semaines plus tard et deux prises de sang. Le porteur reconnaît que l'irradiation peut dégrader l'état général des animaux et que des nécroses peuvent apparaître sur les tumeurs, et conclut que le recours aux souris reste "indispensable" malgré les méthodes alternatives auxquelles son laboratoire a eu recours.

Objectifs

Notre système immunitaire est capable de détecter la présence d’un élément étranger dans notre organisme et de déclencher une réponse immunitaire efficace afin d’éliminer ce pathogène. La réponse immunitaire résulte de l’action combinée des cellules de l’immunité innée comme les cellules dendritiques dont la mission est de patrouiller dans l’organisme à la recherche de cellules infectées ou tumorales, et des cellules de l’immunité adaptative comme les lymphocytes B et T qui reconnaissent de manière spécifique les pathogènes. Le contrôle de la réponse immunitaire est un mécanisme très important pour empêcher par exemple une suractivation des lymphocytes pouvant aboutir à la destruction des cellules saines de l’organisme. Pour cela, les lymphocytes sont équipés de récepteurs dits de contrôle (checkpoint). L’engagement de ces récepteurs avec leurs ligands (molécule qui se lie de manière réversible à son récepteur) régule la durée et l’intensité de l’activation lymphocytaire. Mais ce mécanisme peut être détourné par les cellules tumorales qui en exprimant les ligands des récepteurs checkpoint freinent le système immunitaire au lieu de l’activer. Les médicaments anti-checkpoints sont déjà utilisés en clinique contre plusieurs types de cancers. Cependant ces traitements dit « d’immunothérapie » ne sont pas efficaces chez tous les patients et uniquement pour certains cas de cancers. Comprendre la raison d’une telle variation est un défi important pour la communauté scientifique. Tout comme l’identification de molécules avec lesquelles les inhibiteurs de checkpoint pourraient être combinés pour augmenter leur efficacité. Parmi celles-ci, les kinases sont une cible particulièrement intéressante. Ce sont des protéines dont le rôle principal est d'ajouter un petit groupe chimique appelé phosphate à d'autres protéines, ce qui peut les activer ou les désactiver. Dans le contexte du cancer, certaines kinases peuvent être hyperactives, contribuant ainsi à la croissance incontrôlée des cellules cancéreuses. En ciblant spécifiquement ces kinases avec des médicaments inhibiteurs, les chercheurs espèrent ralentir ou arrêter la croissance des cellules cancéreuses. Plus de 30 de ces médicaments sont déjà utilisés, et d'autres sont en cours d’essai clinique. Le but de ce projet est d’explorer si notre protéine kinase d’intérêt peut améliorer les mécanismes de défense anti-tumeurs des lymphocytes en combinaison avec des traitements anti-checkpoints.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de définir si notre protéine kinase d’intérêt joue un rôle dans la réponse des lymphocytes T contre les tumeurs solides et pourrait améliorer la réponse aux traitements d’immunothérapie. Si tel était le cas, elle pourrait être considérée comme une nouvelle cible thérapeutique dans le traitement du cancer.

Procédures

Dans un premier lot de souris, des cellules tumorales seront injectées une fois par expérience aux animaux vigiles (durée du geste inf à 10 sec). Certains animaux seront ensuite traités deux fois par semaine pendant maximum 4 semaines par injection sur animaux vigiles (durée du geste inf à 10 sec). Dans une deuxième expérience, des souris vigiles seront irradiées (3 minutes) puis 4H après, elles seront injectées avec des cellules par voie intraveineuse et sous anesthésie gazeuse rapide (durée de l’anesthésie inf à 5 minutes). Six semaines après cette manipulation les animaux seront injectés une fois par expérience avec des cellules tumorales. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur les animaux vigiles 7 jours et 14 jours après cette dernière injection (durée du geste inférieur à 20 secondes)

Impact sur les animaux

Les animaux greffés avec des cellules tumorales développeront des tumeurs. Une nécrose peut apparaitre sur la tumeur en fin d’expérience. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection de produits non douloureux et non toxiques (douleur légère de courte durée liée à la piqûre elle-même). Une légère douleur de très courte durée est attendue lors des prélèvements sanguins ou des injections par voie intraveineuse. La procédure d’irradiation n’est pas douloureuse pour les animaux néanmoins un stress de courte durée, lié à la contention est attendu. Dans de rares cas, l’irradiation peut entrainer une altération de l’état général des animaux (déshydratation, prostation……) dans les jours suivants l’irradiation.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin des procédures pour analyses post-mortem.

Remplacement

Après des premières étapes d’analyse et de validation dans des lignées cellulaires in vitro, le projet a pour but maintenant d’étudier le rôle de notre molécule d’intérêt dans la réponse des lymphocytes T contre les tumeurs et nécessite donc le système immunitaire d’un organisme vivant et intégré comme la souris. En effet, le développement des tumeurs met en jeu de multiples types cellulaires et de nombreux mécanismes qui ne peuvent pas être reproduits dans des modèles in vitro. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation des souris reste indispensable pour le présent projet.

Réduction

Les croisements des lignées de souris ont été optimisés afin d’obtenir le maximum d’animaux avec un phénotype utilisable dans nos expériences. Plusieurs analyses (imagerie et cytométrie) seront réalisées sur la même tumeur pour permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le nombre de souris par groupe est de 10 avec 3 manips afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Dans l’ensemble des procédures, une grille de score est mise en place pour évaluer de manière objective l’état des animaux. En cas d’atteinte d’un point-limite tel que décrit dans la grille de score, l’animal en souffrance est mis à mort. Dans le cadre des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés quotidiennement pour l’état général, et deux fois par semaine pour mesurer la taille de la tumeur ayant été greffée par voie sous-cutanée, afin d’appliquer les points limites de la grille de score. Après l’irradiation, du gel nutritif et hydratant sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire, et limiter la perte de poids et la déshydratation qui peuvent apparaitre.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche thérapeutique du cancer, car la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les réponses immunitaires anti tumorales. La connaissance complète du génome murin permet d’utiliser de nombreux outils bien caractérisés, ce qui sera particulièrement pertinent dans le cadre de ce projet.

Isolées cinq jours en cage individuelle puis privées de nourriture pendant vingt heures, 144 souris sont ensuite placées devant deux aliments au choix pendant vingt-quatre heures. Toutes seront tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le but est de mesurer le rôle d'une hormone du foie, FGF21, dans la préférence alimentaire après un jeûne, chez des souris dont ce gène a été invalidé au niveau hépatique. Le porteur reconnaît que le jeûne peut provoquer une chute du glucose sanguin, une baisse de la température corporelle et une perte de poids importante, et que l'hébergement individuel stresse l'animal, tout en annonçant retirer de l'étude toute souris présentant un signe de souffrance.

Objectifs

Le foie est un régulateur central du métabolisme et du dialogue avec les autres organes, notamment avec le cerveau pour assurer le contrôle du comportement alimentaire. Dans ce dialogue entre le foie et le cerveau, la protéine FGF21 (pour Fibroblast Growth Factor 21), une hormone produite de manière prédominante par le foie, exerce divers effets métaboliques parmi lesquels le contrôle de l’appétence pour le sucre et les protéines. FGF21 est aussi une hormone dont l’expression est fortement induite lors du jeûne. Dans ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’implication de FGF21 spécifiquement du foie dans le comportement alimentaire après une période de jeûne. Pour cela, nous utiliserons des souris mâles et femelles dont le gène FGF21 est invalidé au niveau hépatique spécifiquement. Ces souris, en comparaison d’animaux contrôles de type sauvage, seront soumises à un jeûne prolongé (20h) afin d’induire la production de FGF21 puis auront le choix entre 2 aliments différents afin d’évaluer le rôle de FGF21 hépatique dans la préférence alimentaire en réponse au jeûne.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront de définir le rôle de FGF21 d’origine hépatique dans la préférence alimentaire après une période de jeûne. En effet, si le rôle de FGF21 dans le comportement alimentaire est bien connu, il n’est pas décrit dans la littérature la préférence alimentaire dépendante de FGF21 hépatique induite par une période de jeûne.

Procédures

Les animaux seront hébergés individuellement pendant 5 jours, dans des cages de permettant la mesure automatique de la prise alimentaire durant 3 jours pour l’habituation et mis à jeun pendant 20h puis seront renourris ad libitum avec 2 régimes au choix pendant 24 heures.

Impact sur les animaux

Le jeûne peut induire une baisse du taux de glucose circulant et une baisse de la température corporelle, ainsi qu’une perte de poids importante. L’hébergement individuel entraîne un stress de l’animal.

Devenir

Il n'y aura pas d'autres projets portant sur l'étude de la protéine d'intérêt, c'est pourquoi, tous les animaux seront mis à mort a la fin de la procédure.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire car les phénomènes biologiques étudiés (jeûne et comportement alimentaire) sont complexes et font intervenir différents tissus agissant en synergie (notamment foie et cerveau). Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives. L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car il est possible d’étudier la protéine d’intérêt (FGF21) grâce à l’utilisation de souris génétiquement modifiées.

Réduction

LLe nombre d’animaux pour ce projet est défini pour permettre d’une part de répondre aux questions scientifiques et d’autre part de respecter la réduction du nombre d’animaux au maximum. Ainsi, nous utiliserons le plus petit nombre d’animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux a été déterminé par un calcul de puissance et est basé sur des données provenant d’expériences antérieures du laboratoire. Ce nombre d’animaux est le nombre minimum nécessaire mais suffisant afin d’obtenir des résultats exploitables.

Raffinement

A leur arrivée à l’animalerie, une période de deux semaines minimum dans la salle d'hébergement collectif sera laissée aux animaux afin qu’ils s’acclimatent à leur nouvel environnement. Le change est hebdomadaire, et l’état des animaux est contrôlé au quotidien par le personnel dédié aux soins des animaux. Tous les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé (température, hygrométrie), calme dans les pièces et le cycle lumineux (12h/12h) sera inversé, ce qui permet de laisser aux animaux leur temps de repos. Des enrichissements du milieu d’hébergement (dômes de nidification et carrés de coton) seront disposés dans la cage afin de pouvoir se distraire, se cacher et fabriquer des nids. Au moment des expérimentations (mise en cage individuelle), une phase d’acclimatation sera appliquée durant trois jours en conditions de régime standard afin de vérifier que les animaux se nourrissent et s’abreuvent correctement. Les mangeoires et les biberons du système de mesure sont similaires aux cages domestiques typiques des laboratoires, ce qui permet une transition moins stressante vers le système, ils sont de plus, disposés à l'extérieur de la cage et facilement accessibles à la fois à l'animal et à l’expérimentateur Nous surveillerons l’apparence physique externe (Echelle d’évaluation des expressions faciales, affichée dans la pièce), le poids (pesée quotidienne) et le comportement des animaux. Des points limites seront mis en place pour l’évaluation de différents paramètres. Si un animal présente un signe de souffrance (inactivité, somnolence, respiration lente) après évaluation de ces paramètres, le critère d’arrêt sera atteint. L’animal sera aussitôt retiré de l’étude et replacé dans des conditions d’hébergement standard (hébergement collectif, régime standard et aucune procédure réalisée) après examen par le vétérinaire référent.

Choix des espèces

Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car le développement du foie est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte. La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans le projet. Nous utiliserons des souris mâles et femelles car le métabolisme énergétique est différent selon le sexe. Il serait incorrect d’extrapoler les données obtenues chez les mâles aux femelles.