Recherche fondamentale

Pour savoir si un transporteur du fructose intervient dans la sécrétion d'insuline, 192 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever le pancréas, l'intestin et le contenu du cæcum. Chaque animal subit trois gavages de glucose, trois coupures à l'extrémité de la queue et jusqu'à six prélèvements submandibulaires, entre six et dix-neuf semaines d'âge. Un jeûne de six heures précède chaque test de tolérance au glucose, dont le porteur écrit qu'il n'entraîne qu'une baisse modérée de la glycémie. Une perte de poids dépassant 20 %, un poil hérissé, une prostration ou une léthargie de plus de deux jours déclenchent l'arrêt du protocole et la mise à mort de l'animal.

Objectifs

La sécrétion d’insuline est fortement stimulée par le glucose et pas du tout par le fructose lequel représente pourtant 50% des sucres consommés par notre alimentation. Le fructose est structurellement proche du glucose mais est transporté, notamment au niveau de l’intestin, par un transporteur spécifique qui ne transporte que le fructose. Ce transporteur est essentiellement présent dans l'intestin et n'a pas été décrit dans le pancréas. Pourtant chez les souris génétiquement modifiées chez qui ce transporteur n'est pas présent il y a une diminution des taux circulant d'insuline. La découverte d’une nouvelle d’une voie de régulation de la sécrétion d’insuline via ce transporteur semble très importante à caractériser et c'est le but du projet proposé. Ce travail vise à déterminer chez des souris mâles et femelles adultes à quel âge cette diminution des taux circulants d'insuline apparait et quels sont les mécanismes impliqués. Parmi ces derniers, le rôle du transport de fructose sera étudié ainsi que le rôle éventuellement du métabolisme du fructose à la fois dans le pancréas et dans l'intestin, grâce à des modèles de souris spécifiques.

Bénéfices attendus

Le phénotype observé chez les souris chez qui le transporteur du fructose n'est pas présent, à savoir une baisse drastique des taux circulants d’insuline, ressemble à ce qui est observé dans le diabète de type 1 chez l’humain. Le diabète de type 1 représente environ 10% des cas de diabètes en France et dans le monde. Depuis une vingtaine d’années, le nombre de personnes atteintes de diabète de type 1 ne cesse d’augmenter (+ 3 à 4% /an). Les raisons de ces évolutions sont inexpliquées à ce jour, mais certaines modifications de l’environnement et de leurs interactions avec le génome sont suspectées telles que les facteurs nutritionnels ou la modification de la flore intestinale. Bien que le fructose soit suspecté de conduire à la mise en place d’un diabète de type 2 (mise en place progressive de l’insulino-résistance) le rôle de son transporteur dans la sécrétion de l’insuline n’a jamais été étudié. Notre projet permettra possiblement d’identifier une nouvelle voie impliquée dans la régulation de la synthèse et ou la sécrétion de l’insuline.

Procédures

Les 192 animaux vigiles recevront au cours de la totalité de la procédure 3 gavages oraux de glucose (intervention d’une durée inférieure à 5 secondes), 3 petites coupures à l’extrémité de la queue (intervention d’une durée inférieure à 1 seconde) et ils auront au maximum 6 prélèvements submandibualires (intervention d’une durée inférieure à 20 secondes).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un stress sur des temps très courts au cours de la contention nécessaire lors des gavages pour le test de tolérance au glucose (moins de 5 secondes), la contention permettant de limiter les fausses routes éventuelles, et lors de la contention pour le prélèvement de sang (moins de 20 secondes). Les animaux seront soumis à stress lors du passage de leur salle d’élevage à la salle d’expérimentation pour les OGTT. Les animaux seront soumis à une légère douleur de l’ordre de la piqure lors du prélèvement de sang. Les souris seront soumises à un jeun de 6h avant les tests de tolérance au glucose ce qui n’entraine qu’une diminution modérée de la glycémie et aucune hypoglycémie.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié afin de prélever certains tissus (pancréas, intestin et contenu de caecum)

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de modèle ou de technique in vitro ou ex vivo permettant de simuler les interactions inter-organes impliquées dans le contrôle de l’homéostasie glucidique d’un individu. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des paramètres spécifiques à chaque souris (génétique, microbiote, alimentation) et biologiques obtenues à partir du sang (glycémie, insulinémie), des tissus producteurs d’hormones (pancréas) et intestinaux (tissus permettant de stimuler la sécrétion d’insuline via la production de molécules de type hormonales).

Réduction

Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental, car d’après les études déjà menées au laboratoire, ce nombre apparait nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives. De plus, nous avons fait le choix d’utiliser les mêmes groupes de souris ente 6 et 19 semaines et de n’effectuer les prélèvements finaux de tissus qu’à 19 semaines afin de réduire le nombre d’animaux. Des mâles et des femelles seront utilisés.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier pour leur nid, d’un bâton à ronger, d'un abri en propylène rouge et de deux hamacs (limitation des bagarres). Les animaux seront habitués à la contention avant le démarrage des gavages pour limier le stress lors de la procédure expérimentale. Les expérimentions étant effectuées dans une salle différente de la salle d’élevage les animaux seront habitués à la salle d’expérimentation 1h avant le début des procédures et maintenus dans leur cage d’élevage avec les mêmes congénères afin de réduire le stress. Les animaux seront surveillés visuellement 1 fois par semaine et leur poids mesuré 1 fois par semaine. Une perte de poids dépassant 20 % du poids initial de l’animal sera considérée comme un point limite. De même des comportements atypiques de type poil hérissé, prostration, absence de toilettage ou léthargie pendant plus de deux jours ou stéréotypie seront également considérés comme des points limites entrainant l’arrêt précoce du protocole sur les animaux concernés et leur euthanasie. Les souris seront à plusieurs par cage pour éviter l'isolement et réduire le stress.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal et surtout pour décrypter le mécanisme posé ici (rôle du transporteur et du métabolisme du fructose dans la sécrétion d’insuline) nous disposons de modèles génétiques originaux disponibles uniquement chez les souris. A 6 semaines les souris n'exprimant pas le transporteur de fructose étudié ont une insulinémie normale alors qu’elle est diminuée à 16 semaines. Afin de déterminer à quel âge l’la diminution de la synthése d’insuline se produit nous proposons de suivre les animaux ente 6 et 19 semaines d’âge.

460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune portant deux greffes de tumeur sous la peau, une de chaque côté du corps. Elles passent jusqu'à trois séances d'imagerie sous anesthésie, dont une acquisition dynamique de quatre-vingt-dix minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur retient 230 souris immunodéficientes et 230 souris à système immunitaire normal, et écrit que l'imagerie non invasive a permis de réduire les effectifs. Le projet vise un produit d'imagerie mesurant une protéine du système immunitaire dans les cancers du poumon, avec l'hypothèse plus lointaine d'un marquage au lutétium 177 pour traiter, alors que les greffes tumorales et les anesthésies, elles, sont immédiates.

Objectifs

L’immunothérapie à base d’anticorps spécifiques est un traitement qui vise à stimuler les défenses immunitaires de l’organisme contre les cellules cancéreuses. Les décisions de traitement clinique sont souvent guidées par le statut d'expression d'un récepteur applé PD-L1 dont la présence sur la tumeur est évaluée par des tests d'immunohistochimie (IHC) standardisés à partir d'un seul échantillon de biopsie tumorale avant traitement. Cependant, l'IHC présente de nombreuses limites techniques et biologiques : une biopsie unique, ou plusieurs petites biopsies, représentent mal l'hétérogénéité de l'expression de PD-L1 au sein des patients (hétérogénéité au sein même de la tumeur, ou entre la tumeur primaire et ses métastases). De plus, la biopsie de la tumeur n'est pas toujours pratique lorsque le site de la lésion est inaccessible. Ces limites soulignent qu'il est nécessaire de disposer d'outils permettant de détecter les niveaux de PD-L1 dans l'organisme entier afin d'améliorer notre compréhension de la réponse des patients aux thérapies ciblant l'axe PD-1 :PD-L1 et sélectionner au mieux les patients susceptibles de répondre à cette famille de traitements. La Tomographie par Emission de Positons (TEP) permet une évaluation quantitative, en temps réel et non invasive des niveaux d'expression de la cible et de sa dynamique dans le corps entier. Nous avons pour objectif dans ce projet de développer des sondes radioactives conçues pour ce type d'imagerie.

Bénéfices attendus

Nous espérons obtenir un produit d'imagerie basé sur un petit peptide pour mesurer la quantité de PD-L1, une protéine importante du système immunitaire dans les cancers du poumon non à petites cellules (CPNPC), en tomographie par émission de positon (TEP). Selon les résultats obtenus, nous envisagerons des expériences de radiomarquage du même peptide avec un élément radioactif nommé lutetium 177 pour tenter de traiter le cancer par radiothérapie interne.

Procédures

Les animaux subiront une fois une greffe sous cutanées des cellules cancéreuses de chaque côté, sous anesthésie et ce pendant 10 à 20 minutes par animal. Ils réaliseront également sous anesthésie, de l'imagerie non invasive. Un même animal pourra subir au total 3 imageries successives (une dynamique d'une durée de 90 min et au maximum 2 statiques d'une durée de 24 minutes), avec au moins 2 jours d'intervalle entre les imageries). En fin de protocole et suite à la dernière session d'imagerie, les animaux seront maintenus sous anesthésie, afin de réaliser un prélèvement sanguin (durée de 1 min) puis l’euthanasie sous anesthésie sera réalisée.

Impact sur les animaux

Les animaux pourraient ressentir un stress lors de leur manipulation. Ils peuvent subir du stress lié à l’anesthésie lors de l'injection des cellules tumorales, lors de l'injection du radiotraceur ou lors de leur réveil. Ils peuvent également souffrir de la croissance des tumeurs greffées en sous cutané. Il existe une possibilité de perte de poids et d’altération de l’état général de santé. Les animaux vont subir une anesthésie, les nuisances possibles sont une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Les animaux vont subir une injection intraveineuse, il y a un risque de plaie ou d'infection, de cyanose ou de détresse respiratoire lors de l’administration d'un des radiotraceurs.

Devenir

La totalité des animaux sera euthanasiée selon une méthode règlementaire, afin de récupérer les tumeurs et effectuer ensuite les analyses adéquates

Remplacement

Pour étudier la cinétique de biodistribution de nouveaux radiotraceurs, il n'existe aujourd'hui aucun modèle non vivant qui pourrait mimer le modèle animal vivant. Nous n'avons donc pas la possibilité de remplacer le modèle vivant utilisé.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l'interet d'un radiotraceur. Les analyses statistiques seront effectuées via le test Mann Whitney qui est adapté au nombre d'échantillons faibles. Le nombre d'animaux (460 au total, 230 souris immunodéficientes et 230 souris normales, répartis dans 2 études successives, permettant de comparer nos nouveaux ligands aux données de la littérature) a été réduit, notamment par l’utilisation de l’imagerie non invasive sous anesthésie qui permet des analyses corps entier en 3D et un recueil de données longitudinales.

Raffinement

Tous les animaux bénéficieront d'une période d'acclimatation à l'animalerie d'au moins 7 jours. Pour minimiser les dommages aux animaux, ils bénéficieront d’un environnement enrichi (outil de nidification, maisonnettes plastiques) et du maintien de l’interaction sociale en étant groupés, et resteront sous surveillance tout au long du projet. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Nous avons plusieurs indicateurs physiologiques et comportementaux permettant de suivre le bien-être de l’animal dès le 1er jour de xénogreffe tumorale : pesée 2 fois par semaine (perte de poids rapide par rapport au dernier jour de mesure du poids), apparition de comportement anormal (hypertoilettage, prostration), posture en cas de douleurs, absence d’interactions avec les congénères, consommation d’aliments et d’eau, sommeil. Si plusieurs symptômes sont présents de façon légère, nous sortirons l’animal de la procédure en cours qui sera alors sous surveillance journalière, un 3ème enrichissement (baton à ronger) sera alors proposé à l'animal isolé. Si un des symptômes est important, nous euthanasierons l’animal. Cependant d’après les connaissances sur ces modèles de xénogreffe tumorale et l'utilisation de l'imagerie non invasive, il ne devrait pas y avoir de telles souffrances. Si un animal montre des signes de cyanose ou de détresse respiratoire lors de l’administration d'un des radiotraceurs, celle-ci sera immédiatement stoppée et l’animal sera placé dans sa cage sous surveillance. Pour éviter tout risque de non réveil, la quantité d'anesthésique sera maitrisée et diminuée lors des temps d'imagerie longs.

Choix des espèces

Nous travaillons avec des souris immunodéprimées car ces animaux acceptent la xénogreffe de cellules tumorales humaines et constituent des modèles validés pour l’étude de la progression tumorale et la validation de la biodistribution de nouveaux radiopharmaceutiques. Nous envisageons également l'utilisation de souris immunocompétentes pour les xénogreffes de cellules tumorales murines. Stade adulte, l’étude est portée sur l’imagerie d’un organisme déjà totalement développé.

Le miniporc Yucatan est retenu pour sa proximité digestive avec l'humain, ce qui vaut à 52 cochons d'être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Douze truies reçoivent un régime carencé ou témoin avant la reproduction, pendant la gestation et l'allaitement, et 40 porcelets naissent puis grandissent six semaines sous ces régimes. Le porteur indique que la carence peut ralentir la croissance et provoquer des troubles de l'apprentissage, des desquamations et des problèmes de fertilité, et prévoit une injection d'ocytocine aux truies pour prélever leur lait après les avoir séparées de leurs porcelets. Neuf truies sont tuées, dont les huit carencées qui ne peuvent plus servir de reproductrices, trois rejoignent le troupeau, et tous les porcelets sont tués pour prélever leurs tissus.

Objectifs

La consommation de produits laitiers réduit le risque de survenue de maladies métaboliques, comme par exemple le diabète de type 2 (DT2), sans que les mécanismes ne soient encore clairement élucidés. Les acides gras saturés impairs (dont l’acide pentadécanoïque C15:0 est le représentant majoritaire dans le lait, 1% des acides gras totaux) sont des marqueurs de la consommation des produits laitiers, ce qui en fait des acteurs potentiels de cet effet protecteur. Ils peuvent également moduler le microbiote intestinal et l’homéostasie glucidique de l’hôte. Des études récentes suggèrent de plus que l’acide pentadécanoïque pourrait être un acide gras indispensable (AGI) et pourrait potentiellement se substituer dans l’alimentation à des AGI connus comme l’acide linoléique (LA). Un nutriment indispensable est une molécule, non synthétisée chez l'homme (ou l’animal modèle), qui assure des fonctions physiologiques ou structurales essentielles. Historiquement, 3 AGI ont été décrits dans la littérature. En 1929, le caractère indispensable du LA (omega 6), a été découvert par Burr : des rats soumis à des carences alimentaires en LA ont développé un retard de croissance. Plusieurs études ont ensuite montré qu’un apport énergétique de 2% en LA était suffisant pour éviter la carence. Les 2 autres AGI actuellement connus sont l’acide alpha-linolénique (ALA) et l’acide docosahexaénoïque (DHA). Une carence en ALA entraîne notamment une diminution d’aptitude à des tests d’apprentissage. Ces études ont été réalisées sur le modèle rongeur, qui possède de nombreuses limites pour la transposition des résultats à l’homme, tandis que le modèle porcin est reconnu comme un bon modèle préclinique notamment pour les études nutritionnelles, du fait de la proximité de sa physiologie intestinale avec celle de l’homme. Le premier objectif de cette étude est d’étudier la capacité potentielle de l’acide pentadécanoïque à se substituer au LA (en situation de carence) et d’assurer certaines fonctions structurales et physiologiques similaires (croissance, fluidité membranaire…) dans le modèle miniporc Yucatan.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’évaluer le rôle de l’acide gras C15:0 en nutrition, plus particulièrement ses effets sur la croissance et le maintien de fonctions physiologiques en situation de carence en AGI. Ces effets qui seront analysés chez le miniporc nous permettront d’observer des impacts nutritionnels dans un modèle proche de l’homme, ce qui complétera et validera certains effets du C15:0 observés chez le modèle rongeur. Le métabolisme des acides gras impairs a très peu été étudié chez l’homme et jamais chez le modèle porcin. Ainsi, cette étude permettra de caractériser le métabolisme des acides gras impairs, à la fois en situation saine (avec le régime CTRL contenant du C15:0) et en situation de carence d’AGI pour étudier le potentiel caractère indispensable de cet acide gras impair. Cette étude permettra ainsi d’améliorer les connaissances concernant les AGI et l’impact de leur carence chez le modèle mini-porc. L’ensemble de ces données permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur le rôle du C15 :0 qui pourraient concourir à réévaluer les recommandations nutritionnelles en acides gras chez l’homme, et également les apports en produits laitiers, principales sources de C15 :0 chez l’homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à différents régimes, contrôle ou carencés en AGI, et supplémentés ou non en C15:0 et LA. Un prélèvement de lait sera réalisé à 15 jours de lactation chez les truies, nécessitant l'injection IM d'ocytocine. Ces prélèvements seront réalisés une fois sur chaque truie et le temps de prélèvement n'excédera pas 20 min. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur les truies au moment du sevrage des porcelets (

Impact sur les animaux

Concernant les régimes, une légère diminution de la croissance et l'apparition de troubles cognitifs (de l’apprentissage) sont possible chez les animaux carencés. Des sécheresses cutanées (desquamations) ont également été décrites. Enfin, des problèmes de fertilité ont également été rapportés en lien avec une carence en AGI. Concernant les différents prélèvements prévus au protocole, la collecte du lait chez les truies à 15j de lactation nécessite une injection d’ocytocine, ce qui peut entraîner une douleur au point d’injection, et nécessite également la séparation préalable des porcelets de la truie, ce qui peut entraîner un stress à la fois pour la truie et les porcelets. Cependant, cette séparation est limitée à quelques minutes (

Devenir

9 truies seront euthanasiées à la fin de la procédure 1: les 8 truies ayant reçu le régime Carence ne peuvent pas être réutilisées comme reproductrices dans l'élevage expérimental. 3 truies du groupe Contrôle seront intégrées dans le troupeau comme truies reproductrices et 1 sera euthanasiée conformément au plan de renouvellement du troupeau. Tous les porcelets de la procédure 2 seront euthanasiés à la fin de la procédure pour récupérer les tissus d'intérêt.

Remplacement

L’effet recherché dans cette étude est d’ordre nutritionnel et nécessite donc l’analyse d’un organisme dans son ensemble. En effet, les nutriments diffusent dans le « corps entier » après digestion-absorption des aliments et leurs impacts physiologiques ou physiopathologiques concernent de multiples organes qui interagissent entre eux pour former un système biologique complexe. L’utilisation d’un modèle animal vivant reste indispensable pour une évaluation globale et intégrée du métabolisme du C15 :0 et pour prendre en compte le rôle du microbiote intestinal, qui sont impossible à reproduire dans leur complexité dans des modèles in vitro. Le miniporc a été choisi pour sa proximité physiologique avec l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque condition (10 porcelets par condition) a été calculé par analyse de la puissance statistique nécessaire pour pouvoir comparer les paramètres étudiés. Ce nombre d’animaux représente la limite basse pour laquelle les effets induits au terme du projet permettront d’observer un effet statistiquement significatif. Les truies Yucatan ayant des portées de 2 à 6 porcelets, le nombre de cochettes nécessaires pour avoir 10 animaux dans chaque groupe a été évalué à 4 pour le groupe Contrôle, pour assurer 10 porcelets, et 8 dans le groupe Carence, pour assurer 30 porcelets, qui seront répartis dans les 3 groupes Carence, enrichi en acide gras pentadécanoïque et enrichi en acide gras linoléique à raison de 10 animaux par groupe. Concernant les truies nourries par le régime Contrôle, 3 sur 4 pourront être maintenues dans l’élevage à l’issue de l’expérimentation pour le renouvellement du troupeau. L’expérimentation sera réalisée en 2 répétitions successives de 6 truies (2 sous régime Contrôle, 4 sous régime Carence), permettant statistiquement d’obtenir les 40 porcelets nécessaires. Si, par chance, le 1er lot permettait d’obtenir un nombre supérieur à 20 porcelets, le 2nd lot de truies serait réduit en conséquence.

Raffinement

Les compétences et l’expérience des expérimentateurs garantissent le respect du bien-être animal. Des points limites ont été établis, entraînant la sortie de protocole ou l’euthanasie anticipée de l’animal en cas de nécessité. Les animaux seront élevés en groupes, que ce soit pour les truies en gestation ou les porcelets en post-sevrage, favorisant le bien-être et les interactions sociales. Les truies gestantes seront transférées en salle de maternité 3 semaines avant la date de mise-bas prévue, dans des loges individuelles (2,30 m2) permettant les contacts olfactifs et visuels avec leurs congénères, selon la pratique en vigueur dans l’élevage expérimental. Les porcelets resteront classiquement en portée avec leur mère pendant toute la durée de la lactation et une habituation à l’aliment solide sera réalisée quelques jours avant le sevrage pour faciliter la transition alimentaire. Les porcelets ont accès libre à un nid chauffé par une lampe et à l’écart de la truie (0,25x1,37m). Au sevrage, les 2 portées issues des mères Contrôle seront regroupées et le groupe observé pour voir si la mise en place de la hiérarchie se passe bien, comme ce qui est pratiqué en routine à l’élevage. Les portées issues des mères du groupe Carence seront réparties en 3 groupes avec idéalement, un à deux porcelets de chaque portée par groupe pour limiter l’effet portée, ce qui brassera les portées et facilitera la constitution du nouveau groupe et ses interactions sociales. Une attention particulière sera là encore apportée par le personnel de l’unité expérimentale pour s’assurer que la mise en place de la hiérarchie se passe bien. Des enrichissements de type ballon seront apportés dans les cases des animaux.

Choix des espèces

Le modèle miniporc Yucatan est un modèle avec une plus grande proximité physiologique avec l’homme que ne l’est le modèle rongeur, notamment au niveau de sa taille, de son système digestif et de son microbiote. De plus, il s’agit d’un animal omnivore monogastrique, ce qui en fait un modèle très recherché pour les recherches en nutrition humaine. Les cochettes prévues pour cette expérimentation auront approximativement 1 an d’âge (naissances en mai-juin 2023). Elles seront soumises au régime Contrôle ou Carence 15 jours avant la mise en reproduction, puis pendant la gestation et la période d’allaitement. Au sevrage, soit 4 semaines après leur naissance, les porcelets seront nourris avec les différents régimes expérimentaux. Ils seront nourris avec ces régimes pendant 6 semaines puis euthanasiés. L’induction de la carence doit débuter chez les truies gestantes afin d’induire une carence chez les porcelets issus de ces mères. L’âge final des porcelets correspond au temps nécessaire pour observer l’effet de la carence ou de la resupplémentation.

Prélevées dans d'autres projets pour ne pas en utiliser de nouvelles, 42 souris vont être soumises à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le groupe stressé subit quinze contentions de trente minutes dans un tube de 50 ml réparties sur vingt et un jours, un rasage, un test d'anhédonie sur une semaine et un test de la boîte noire et blanche de cinq minutes en isolement. Le projet vise à valider un dosage de la corticostérone dans l'urine, les fèces et les poils, afin de mesurer ensuite le stress des souris de l'animalerie. Un stress chronique est donc infligé pour mettre au point un outil de mesure du bien-être des animaux non-humains, et les souris rejoignent ensuite le "stock" de formation interne si l'avis vétérinaire le permet, sinon elles sont tuées.

Objectifs

Le projet vise à valider une méthode de mesure de la corticostérone dans différents échantillons pouvant être prélevés de manière non invasive chez la souris. Cette méthode de mesure servira ensuite à évaluer l’effet de modifications de paramètres environnementaux ou de procédures spécifiques sur le bien-être et le stress des souris.

Bénéfices attendus

La souris est l'espèce la plus couramment utilisée dans la recherche biomédicale et sa sensibilité est désormais largement reconnue. La directive européenne demande de réduire autant que possible la douleur et la détresse ressenties par les animaux utilisés, et d'augmenter le bien-être des souris (Directive européenne 2010). La corticostérone est le principal glucocorticoïde chez les souris et sa concentration reflète le niveau de stress d'un individu. Cette hormone de stress est classiquement mesurée dans le sérum ce qui nécessite une méthode de prélèvement invasive et reflète la concentration de corticostérone à court terme. D'autres matrices peuvent être utilisées, comme les selles, l'urine et les poils. En plus des mesures environnementales et comportementales, les niveaux de corticostérone fournissent des informations sur le stress des souris de laboratoire. Mesurer le stress chez nos souris nous permet de nous conformer à l'accréditation de l'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) International qui demande de revoir le programme d'enrichissement pour garantir l’amélioration du bien-être animal.

Procédures

Chaque souris du groupe « stressé » subit 15 contentions de 30 min chacune réparties sur 21 jours. Le rasage sera d’une durée inférieure à une minute. Les prélèvements d’urines (1µL) et de fèces (0.2mg) seront réalisé une seule fois à la fin du protocole et dureront moins de 2 minutes. Les souris du groupe contrôle seront simplement manipulées pendant moins d’une minute dans les mains de l’expérimentateur. Le test d’anhédonie se déroule sur une semaine. Lors du test de la boite noire et blanche, les souris sont placées individuellement dans le dispositif durant 5 min et leurs déplacements sont automatiquement enregistrés.

Impact sur les animaux

La contention de 30min / jour dans un tube de 50ml induit un stress chronique chez les animaux du groupe stressé. Les prélèvements nécessitent une contention qui peut induire un stress ponctuel aux souris bien qu’elles soient habituées à la manipulation dans un autre projet.

Devenir

Les souris retourneront dans le stock de formation interne après la procédure si l’avis vétérinaire le permet, dans le cas contraire elles seront euthanasiées.

Remplacement

Il s’agit ici de tests comportementaux permettant d’améliorer les conditions de vie des souris de notre animalerie. Ce protocole permet d’obtenir des résultats significatifs en utilisant les individus présents dans notre établissement. Il n’est donc pas possible de remplacer l’utilisation des souris par un autre modèle pour ce projet, mais les souris seront réutilisées à partir d’autres projets, afin de pas utiliser de nouveaux animaux.

Réduction

Le nombre de souris utilisées pour ce projet a été réduit et permet d’obtenir des résultats significatifs sur le sexe et les souches de souris qui seront utilisées ensuite pour mesurer la corticostérone. Un total de maximum 42 souris sera utilisé pour ce projet sur 1 an. Les souris seront divisées en groupes de 5 à 10 souris en fonction des tests réalisés. Plusieurs types de prélèvement seront réalisés sur chaque individu, ces effectifs permettront donc de réaliser une analyse statistique robuste. Les souris retourneront dans le stock des souris utilisées en formation après la procédure si l’avis vétérinaire le permet.

Raffinement

Les souris seront hébergées en cage ventilée, par groupe social stable de 2 à 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : un morceau de bois par souris, permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, un tunnel en carton et un dôme en polycarbonate rouge seront également disposés. En cas de changement de salle d’hébergement ou de congénères, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine et seront habituées à la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. Une échelle de scores prenant en compte l’aspect du pelage, les mouvements, l’activité, la couleur des muqueuses et le score corporel permettra d’objectiver la présence de souffrances et pourra amener au traitement ou à l’euthanasie des souris pour raison éthique. En cas de modification des groupes sociaux pour la réalisation de l’étude, une semaine d’acclimatation sera respectée avant de démarrer le protocole expérimental.

Choix des espèces

Notre établissement utilise uniquement des souris et majoritairement des femelles, c’est pourquoi il est nécessaire de valider la mesure de la corticostérone chez cette espèce.