Recherche fondamentale

Pour trier des souris entre résilientes et vulnérables à la dépression, 528 d'entre elles sont soumises huit semaines à des conditions d'hébergement rendues stressantes et imprévisibles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur état est mesuré par un test de désespoir, un test de motivation, un test d'anxiété et une mesure hebdomadaire de deux heures de leur consommation de sucre, censée révéler la perte de plaisir. Celles qui sont classées vulnérables reçoivent ensuite un antidépresseur en injection quotidienne pendant cinq semaines, avant que toutes soient tuées pour analyse métabolique et génomique. Le porteur chiffre le coût mondial de la dépression à 350 milliards de dollars par an et renvoie les retombées à des biomarqueurs qui restent à identifier.

Objectifs

La prévalence au cours de la vie (environ 20 %) et le fardeau économique (350 milliards de dollars par an) associés aux troubles de dépression majeure (TDM) en font l'une des maladies neuropsychiatriques les plus courantes et les plus débilitantes. Le diagnostic du TDM et des comportements suicidaires est subjectif et il manque des biomarqueurs quantitatifs pour une détection précoce et une évaluation à long terme. Sans ces biomarqueurs objectifs, le diagnostic, la surveillance et les ajustements thérapeutiques reposent exclusivement sur un examen clinique sous-optimal. L’accent mis sur l’utilisation du carburant cérébral comme différenciateur de la vulnérabilité et de la résilience au stress est un concept nouveau et original qui n’a pas été exploré de manière approfondie.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus peuvent conduire à une compréhension étendue et plus détaillée du métabolisme du cerveau et du corps normal et dysfonctionnel. L'étude a le potentiel d'identifier de nouvelles cibles innovantes pour promouvoir la résilience et améliorer le diagnostic, la surveillance et le traitement du TDM. L’étude des liens mécanistiques à travers les niveaux d’analyse (épigénome, métabolome, comportement) aidera à expliquer comment et quand des facteurs de stress spécifiques et divers conduisent à des changements durables dans le cerveau et produisent des déficits fonctionnels durables en matière de santé mentale liés au comportement. Nous allons rechercher ces changements qui contribuent au maintien de la santé ou des états pathologiques.

Procédures

Nous modifions les conditions d'hébergement stressantes sans que celles-ci puissent être anticipées. Les animaux peuvent alors engager 2 styles d'adaptation: la résilience ou la vulnérabilité au développement de troubles du comportement de type dépressif et anxieux que nous mesurerons par des tests de désespoir, de motivation et d'anxiété appliqué une seul fois sur une durée de 10 minutes au cours des 8 semaines de protocole. Le 1er objectif vise à sélectionner les sujets résilients ou vulnérables à la dépression. Le 2e objective vise à évaluer la stabilité du trait phénotypique avec ou sans traitement antidepresseur (injection quotidienne pendant 5 semaines). Le protocole débutera à l'age de 3 mois et durera 8 semaines. Dès la 3e semaines d'exposition les animaux seront triés en groupes de résilients et de vulnérables selon leurs scores de consommation de sucrose lors d'un test de mesure d'anhédonie (diminution de la capacité à ressentir le plaisir), pratiqué 1 fois sur 2 heures par semaine pendant 8 semaines. Des prélèvements sanguins (20 microlitres) sur deux minutes sont prévus à l'issu du 1er objectif (1 fois à la 3e semaine) et du 2e objectif (1 fois à la 8e semaine).

Impact sur les animaux

Stress léger chronique chez la souris Douleurs d’injection Douleurs de prélèvements de sang

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de vérifier la validité des interventions génétiques et phamarcologiques. Des échantillons seront prélevés pour permettre les analyses métaboliques et d'expression du génome qui differencieraient les individus résilients des vulnérables malgré leur exposition identique au stress chronique léger.

Remplacement

Les facteurs de stress sont hétérogènes et ne peuvent être réduits à une seule expérience. Un paradigme peut conduire à des réponses uniques chez différentes espèces. Par conséquent, il sera testé plusieurs modèles complémentaires avec des collaborateurs. Cette application concerne un modèle murin exclusivement. Une manipulation expérimentale rigoureuse est obligatoire étant donné que la réponse au stress peut varier en fonction du moment, de l'intensité, de la durée, de la chronicité, du contexte et des sexes biologiques. Les réponses des sujets sont à la fois dynamiques et multiformes, nécessitant des études longitudinales sur les mêmes sujets. La précision de la conception expérimentale nous a amenés à choisir le stress chronique léger (CMS) comme paradigme expérimental adapté aux rongeurs pour développer de nombreux styles d'adaptation (résistance et vulnérabilité) comme chez les êtres humains. Nous utiliserons la souris comme modèle, qui selon l’état de l’art peut résister ou être susceptibles aux conséquences néfastes liées au stress. Les autres collaborateurs impliqués dans ce projet étudient le rat, ou bien des souches murines sélectionnées pour leurs critères de résistance ou de vulnérabilité innés, ou bien des patients atteints de dépression majeure. Chaque centre utilise un modèle complémentaire pour interroger les mécanismes conservés entre espèces. Il n’est pas raisonnable d’utiliser des modèles alternatifs réducteurs in vitro pour étudier la relation physiologique entre le cerveau et le comportement des résilients et des vulnérables. Il n’existe pas de solution in vitro alternative conservant les systèmes de communication multicellulaires nécessaires pour ce projet. Nous étudierons des modèles génétiques murins caractérisés pour leurs similitudes génétiques et physiologiques aux corrélats de pathologies humaines.

Réduction

Une seule souche de souris sera utilisée ce qui limitera le nombre d'animaux à utiliser. Le nombre d'animaux utilisés sera réduit grâce à une approche longitudinale rationnelle et qui augmentera la puissance statistique des données collectées. Nous ne pouvons pas étudier un seul sexe puisque les différences entre les sexes sont associées à la physiopathologie de la depression et à la réponse au traitement.

Raffinement

Une grille de score des points limites adaptés est mise en place pour identifier quand raffiner. Un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance est établi pour déterminer quels individus sont concernés. L'administration d'analgésique permettra de corriger des douleurs éventuelles. La mise à mort en dernier recours serait effectué si le score des points limites venait à dépasser les critères de raffinement prérequis.

Choix des espèces

Nous avons besoin d’un modèle animal présentant une grande similitude avec le cerveau humain en terme de structure, d’organisation et de connectivité. Un modèle mammifère semble donc être le plus adapté pour répondre à nos besoins. Les rongeurs ont été choisi à cause de leurs manipulations génétiques bien étudiées. De plus, les rongeurs ont déjà été utilisés comme modèle fiable et solide pour l'étude de conditions de vulnérabilité et de résilience au stress. Les processus que nous étudierons ne sont pas reproductibles à ce jour par des modèles in vitro ni par la modélisation in silico. La souris demeure le modèle de choix. Les souris seront âgées de 3 mois au début du protocole de stress qui durera pendant 8 semaines. Nous ciblons en particulier des jeunes adultes afin de comparer les résultats avec l'étude clinique chez l'homme conduites chez les patients dépressifs par notre collaborateur. Le même protocole de stress léger sera aussi appliqué par nos collaborateurs sur des espèces complémentaires.

Une souris qui perd 15 % de son poids, titube ou cesse de se toiletter deux jours d'affilée est retirée de l'étude et tuée par dislocation cervicale. 144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie du crâne de quatre-vingt-dix minutes pour l'injection de vecteurs viraux dans deux populations de neurones, puis vit seule en cage pendant dix semaines et demie, avec six injections dans l'abdomen et deux semaines de mesure continue de sa prise alimentaire et de sa course. Le porteur compense cet isolement par sept carrés de cellulose et un morceau de bois, et renvoie les retombées à la compréhension de l'obésité et de l'anorexie chez l'être humain.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de comprendre comment les réseaux neuronaux participent à la balance énergétique et la motivation pour l'exercice. Pour cela, des souris transgéniques permettant de manipuler de façon concomitantes les deux sous-populations neuronales principales impliquées dans la motivation recevront des injections de vecteurs viraux permettant de manipuler spécifiquement l'activité de ces deux populations. Différents tests comportementaux permettront d'étudier la prise alimentaire exacte, la dépense énergétique et la motivation pour courir de chaque souris afin de mieux disséquer les mécanismes biologiques impliqués dans cette balance énergétique.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d'identifier les mécanismes sous-jacents aux régulation métaboliques et de l'activité physique, dimensions altérées en particulier dans les troubles du comportement alimentaire tels que l'obésité ou l'anorexie.

Procédures

- Procédure chirurgicale (environ 90 minutes x 1 fois/ animal) - Isolement (environ 10.5 semaines) - Injections intrapéritonéales (1 injection/ jour x 6 fois, environ 3 secondes par injection)-Tests comportementaux: étude de la prise alimentaire et de l'activité locomotrice (2 semaines au total, 24h/24) et étude de la motivation pour l'activité physique (2 semaines au total, 1h/jour)

Impact sur les animaux

Les différents tests utilisés dans ce projet nécessitent de pouvoir étudier la prise alimentaire individuelle des souris. Celles-ci seront donc hébergées de manière individuelle dès l'âge de 8 semaines et ce jusqu'à la fin des procédures. Cette absence d'interaction sociale peut être une source de stress pour les animaux. La chirurgie stéréotaxique pour l'injection bilatérale de virus peut entrainer des risques de douleurs post opératoires ou d'infections. Ces douleurs devraient s'estomper dans les jours suivant la chirurgie grâce au traitement analgésique mis en place. Enfin, les injections intrapéritonéales durant la période dans les cages métaboliques ou durant les tests de ratio progressifs peuvent également entrainer une douleur. Afin de diminuer la gêne engendrée par ces injections, le côté de l'animal qui sera injecté sera interverti chaque jour. Les traitements médicamenteux, les injections intrapéritonéales, et produits utilisés (et les doses) sont bien contrôlés en laboratoire et tolérés par les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour procéder à des analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico. De plus l'utilisation d'invertébrés, serait incompatible avec l'étude de la motivation pour une récompense telle que l'activité physique.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux à inclure sera de 12/groupe. Ce n d’animaux/groupe a été fixé (i) en utilisant des calculs de puissance nous permettant d’obtenir une différence significative pour les différentes variables d’intérêt qui seront évaluées dans l’étude et de rejeter une hypothèse nulle, et (ii) en se référant à des publications du domaine (iii) en prenant en compte la variabilité que nous retrouvons habituellement dans le comportement d'intérêt. Nous utiliserons 2 cohortes d'animaux (n=12/groupe/cohorte) afin de valider la reproductibilité des résultats et en prenant en compte que certains animaux pourraient ne pas apprendre la tache comportementale opérante (pourcentage de succès de 50-60%). Nous avons regroupé dans la mesure du possible différents tests comportementaux sur les mêmes lots de souris, et avons conçus nos expériences de manière à obtenir un maximum d'informations à partir des mêmes animaux.

Raffinement

Comme prévue par la Directive 2010/63/CE, un enrichissement du milieu (7 carrés de cellulose) ainsi qu’un morceau de bois à ronger seront utilisés pour réduire les stress des animaux lié à l'isolement que ce soit dans les cages métaboliques ou dans les cages d'hébergement des souris. Les souris seront manipulées grâce à un tunnel en carton (présent dans leur cage d'hébergement) afin de les déplacer dans les cages métabolique ou dans les chambres opérantes. En ce qui concerne la période pré et post-opératoire, les animaux recevront un traitement analgésique et suite à la chirurgie stéréotaxique, chaque animal est suivi quotidiennement (poids, prise alimentaire, aspect général) et une étiquette est accrochée au dos de sa carte de cage individuelle pour le personnel animalier, avec l’ensemble des informations concernant son suivi post-opératoire sur une semaine (médication, poids corporel, aspect général). La récupération des animaux est normalement totale après 1 semaine. Pour le point limite, nous le définissons par un état anormal constaté sur deux jours consécutifs (perte de poids de 15%/jour, ataxie, hypolocomotion, pelage non soigné). Si ce point est atteint, nous préviendrons immédiatement la vétérinaire de l’établissement afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude (comme la poursuite du traitement analgésique). En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort par dislocation cervicale afin de lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.

Choix des espèces

Ce projet nécessite l'utilisation de modèles transgéniques disponibles uniquement dans des modèles souris et permet la reproductibilité et la comparaison avec les résultats obtenus dans le laboratoire auparavant et avec la communauté scientifique plus large. Des modèles animaux moins évolués (par exemple: ver C. elegans ou poisson zèbre) ne peuvent convenir pour l'étude d'une récompense naturelle comme l'activité physique. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 8 semaines) qui se justifie par l'immaturité du système nerveux au cours de l'adolescence.

Six porcs de cinq semaines reçoivent un virus grippal directement dans la trachée, pour que soit mesuré ce qu'ils exhalent, dans l'intérêt déclaré de la filière porcine et de la santé humaine. Ils subissent ensuite six écouvillonnages nasaux et cent prélèvements d'air, deux par jour et par animal, tous sur animaux vigiles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'infection provoque une fièvre de quatre jours, une baisse d'appétit, de la toux et des difficultés respiratoires. Tous sont tués pour prélèvement de tissus, et le porteur reconnaît qu'un générateur d'aérosols pourrait produire des particules virales, mais écrit qu'il "ne reproduit pas totalement" l'excrétion naturelle.

Objectifs

Le projet vise à produire des connaissances sur les émissions respiratoires de porcs infectés par un virus Influenza A. Les épidémies provoquées par ces virus transmissibles par voie aéroportée ont des impacts économiques et sanitaires importants pour la filière porcine et sont aussi des enjeux de santé humaine. Le protocole expérimental proposé dans ce projet a pour objectif de caractériser l’excrétion du virus dans les émissions respiratoires des porcs infectés. La charge virale présente dans ces émissions sera évaluée. La distribution de la taille des particules ainsi que la composition biologique et biochimique des aérosols qui transportent cette charge virale seront décrites. Des collectes d’air exhalé, grâce à un banc de prélèvement, seront effectuées sur un lot de 6 porcs. Des analyses physico-chimiques, bactériologiques et virologiques seront effectuées sur ces prélèvements. Conjointement, des écouvillons nasaux et leur analyse virologique permettront de suivre l’infection virale chez les animaux. La phase de collecte se déroulera sur la première semaine post-inoculation, période où l'excrétion virale est maximale.

Bénéfices attendus

Le projet vise à documenter les modalités de diffusion d’un virus influenza porcin, en caractérisant la charge virale dans l’air exhalé ainsi que la taille et la composition des microgouttelettes respiratoires porteuses de virus. Les résultats du projet contribueront à plusieurs aspects. D'une part, il s'agira de mieux évaluer et modéliser les risques d’exposition animale/humaine en cas de foyer détecté dans un élevage. D'autre part, les résultats permettront de proposer des contre-mesures environnementales efficientes pour limiter la propagation du pathogène (ex : adaptation des stratégies de traitement de l’air, préconisations organisationnelles dans les activités, etc.).

Procédures

Les animaux seront soumis à un challenge viral par voie trachéale : acte réalisé en moins d’une minute. Les animaux seront également soumis à 6 prélèvements nasaux par écouvillonnage : acte réalisé en moins d'une minute. Enfin, les émissions respiratoires des porcs seront prélevées à l'aide d'un banc de collecte : 10 minutes de prélèvement en continu pour la collecte de l’ensemble des exhalaisons des porcs auxquelles s'ajoutent 10 autres minutes pour la collecte en continu des aérosols. Au total, 100 prélèvements d'émissions respiratoires seront effectués au cours de cette procédure expérimentale, à savoir 2 prélèvements d'émissions respiratoires par porc par jour de collecte. Ces procédures seront réalisées sur animal vigile.

Impact sur les animaux

L’infection par un virus Influenza A porcin provoque une hyperthermie ne persistant guère plus de 4 jours ainsi qu’une baisse de l'appétit et des troubles respiratoires très modérés (dyspnée, toux, et éternuements) au cours de la première semaine post-inoculation. Aucune symptomatologie sévère n’est attendue lors de cette procédure.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Des prélèvements de tissus (pour recherche virologique) sont prévus à la fin de la procédure, la mise à mort des animaux est donc indispensable.

Remplacement

Une alternative non animale disponible tiendrait à l’aérosolisation du virus influenza avec un générateur d’aérosols. Toutefois, cette technique physique ne reproduit pas totalement le processus naturel d’excrétion et d’aérosolisation qui se produit au niveau de l’organisme de l’animal. Le projet ayant pour objectifs d’étudier la composition physique et biologique des aérosols exhalés par des animaux infectés et de la mettre en relation avec la charge microbiologique, l’utilisation d’une technique produisant des aérosols de manière artificielle et pouvant modifier les caractéristiques des émissions respiratoires n’est pas envisageable. L’expérimentation consistant en la génération naturelle d’aérosols par les animaux, il n'y a aucune possibilité de remplacement du modèle animal.

Réduction

Le dispositif expérimental, qui repose sur un total de 6 porcs inoculés, a été pensé de manière à minimiser le nombre de porcs utilisés tout en garantissant la fiabilité des résultats. De plus, des études antérieures ont montré la nécessité de regrouper a minima 3 prélèvements individuels pour optimiser la sensibilité analytique et maintenir des conditions de manipulation animale efficace. En limitant la manipulation à 10 min par animal, nous optimisons la qualité de l’échantillonnage des émissions respiratoires tout en minimisant le temps de contention des animaux. Cela nécessite en revanche de cumuler les échantillonnages pour détecter les particules virales dans les exhalaisons pour améliorer la sensibilité analytique. Ainsi, l’expérimentation sur un premier groupe de 3 animaux permettra de constituer un jeu de données initial, et une répétition sur un second groupe de 3 porcs permettra d’étudier la répétabilité de la mesure. L'objectif du projet étant de produire des connaissances sur les émissions respiratoires de porcs infectés par un virus Influenza A porcin, le dispositif expérimental ne comporte pas de lots d'animaux Témoin et les données ne feront l'objet d'aucune analyse statistique du type Cas/Témoin.

Raffinement

Les animaux seront élevés en groupes stables au cours de toute la durée du projet. Ils seront alimentés à volonté et auront accès à discrétion à de l’eau. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes et des plaques de couchage dans les jours qui suivent le sevrage. Ils auront accès à des jouets. Après chaque prélèvement, une récompense type grenadine sera distribuée aux animaux. Une attention particulière sera apportée au suivi clinique de chaque animal au quotidien pendant toute la durée de la procédure expérimentale. En cas d’atteinte d’un des points limites, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible du virus Influenza A porcin. Il est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de cette procédure. Les porcs seront inoculés par un virus Influenza A porcin à 5 semaines d'âge conformément au modèle d'infection appliqué par notre Laboratoire dans le cadre d'expérimentation impliquant ce contaminant.

Nourries six mois d'un régime enrichi en sucres et en graisses, isolées quarante-huit heures en cage de calorimétrie puis vingt et une heures en cage d'actimétrie, 72 souris enchaînent rotarod, grip test, marche en équilibre sur planche à trous et open field de trente minutes. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et courent jusqu'à l'âge de dix-huit mois. Le porteur qualifie ces tests de non invasifs, tout en reconnaissant que le régime enrichi peut mener à une obésité et que l'isolement répété stresse les animaux. Toutes sont tuées à la fin, pour analyse histologique et moléculaire de leurs tissus.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier la locomotion et le métabolisme chez des souris qui semblent résistantes à la prise de poids. En effet, nous avons développé un modèle de souris avec une perte d’expression d’un gène spécifique, et à notre surprise ces animaux sont résistants à la prise de poids. Des analyses complémentaires montrent une masse musculaire normale mais une non-accumulation de la masse graisseuse dans ces animaux à l’âge d’un an. Nous souhaitons donc explorer plus en avant ce phénotype, notamment via des analyses longitudinales de la composition corporelle, du métabolisme, de l’activité locomotrice et de la calorimétrie de ces animaux, complété par des analyses sanguines, et ceci à la fois en diète normale ou enrichie en lipides. Nous espérons que cette approche nous permettra de mieux comprendre la résistance à la prise de poids dans ce modèle.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour but d’étudier l’activité locomotrice et le métabolisme dans un modèle de souris. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal car il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier la locomotion et la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour l’étude de l’activité locomotrice et du métabolisme.

Procédures

1 – Les prélèvements sanguins requièrent moins d'une minute. 2 – L’analyse de la masse corporelle se fera par qNMR, qui est une analyse non-invasive d’une durée de 1 minute. 3 - L’analyse du métabolisme se fera par des tests de Calorimétrie indirecte, qui se déroulent dans des cages d’hébergement individuelles pendant 48 heures. 4 – De même, un test d'actimétrie réalisé aux âges de 6 et 12 mois nécessite de placer les souris dans des cages individuelles pour une durée de 21h. 5 – L’analyse de la locomotion des animaux se fera par une batterie de tests non invasifs réalisés sur une durée de 3 à 4 semaines selon un protocole classique : pour le rotarod, 3 tests de 5 min sont réalisés par souris ; le grip test et la marche en équilibre sur planche à trou sont aussi réalisés trois fois (environ 5 min) par souris et l’open field est un test de 30 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Nous souhaitons étudier le métabolisme et l’activité locomotrice chez des souris résistantes à la prise de poids, et ceci via des tests classiques et non invasifs. Nous souhaitons aussi analyser les paramètres biochimiques de ces souris et ceci via un prélèvement d’une faible quantité de sang. Ces analyses peuvent induire des contraintes décrites ci-dessous : -Une partie de l’étude du métabolisme se fait chez des animaux avec une diète enrichie en sucres et en lipides, ce type de régime peut conduire à la longue à une obésité avec ces problèmes associés (difficulté à se déplacer, etc.). Nous allons donc restreindre ce régime enrichi en sucres et en lipides à une période de 6 mois. - L’étude de l’actimétrie et l’étude du métabolisme nécessitent des tests se déroulant dans des cages d’hébergement individuelles, conduisant donc à un isolement des animaux pendant 21 heures (actimétrie) ou 48 heures (métabolisme). Toutefois ce test est de courte durée et une fois terminé, les animaux sont remis dans leurs cages d’origine avec les mêmes dispositions d’avant le test (les mêmes souris dans la même cage, et les cages sont gardées dans le même état qu’avant le début du test, et ceci afin que les animaux retrouvent leur environnement). - Concernant les prélèvements sanguins, ceux-ci peuvent entrainer un stress et/ou éventuellement à une légère douleur. Les animaux seront donc anesthésiés quelques minutes avant le prélèvement sanguin.

Devenir

Les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure afin d’étudier leurs tissus pour des analyses histopathologiques et moléculaires.

Remplacement

Cette étude a pour but d’étudier l’activité locomotrice et le métabolisme dans un modèle de souris d’une maladie humaine génétique. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal car il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier la locomotion et la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour l’étude de la locomotion et du métabolisme. Enfin, nous espérons que l’analyse de ce modèle murin permettra de mieux comprendre la faiblesse musculaire et la perte de poids de noter maladie d’intérêt.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Des travaux précédents et l’étude de la littérature nous ont permis d’établir que l’étude de groupes de 12 animaux permet d’obtenir des résultats statistiquement significatifs, et compte tenu de notre projet d’analyser deux conditions (souris contrôle ou souris sans notre gène d’intérêt) sous deux types de nourriture (normale ou enrichie en lipide), nous estimons que l’étude de 72 animaux sur 3 ans est nécessaire.

Raffinement

Afin de limiter la prise de poids des animaux, le régime enrichi sera limité à 6 mois. De plus, les prélèvements sanguins à la veine temporale superficielle se feront sous anesthésie. Les point limites seront alors déterminés en fonction des observations faites d'une part pendant l'anesthésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l'animal) et d'autre part pendant et après le prélèvement sanguin (changement du comportement : akinésie, prostration, paralysie, non réponses à des stimuli externes). L'anesthésie et la procédure de prélèvement seront arrêtés si ces points limites sont atteints. Enfin, les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. Néanmoins, si des signes de douleur apparaissaient (réduction de l’appétit, diminution de la mobilité et du comportement exploratoire, tendance à l’isolement, poil terne et hérissé, dos voûté), nous ferons alors un traitement analgésique et anti-inflammatoire. De plus, de la nourriture gélifiée sera de plus mise à disposition de l'animal dans la cage dès les premiers signes de problème moteur pour palier tout risque de réduction de prise de nourriture. Toutefois, en cas de douleur forte (isolement, immobilité, automutilation, ca66chexie, etc.) et/ou d’échec des traitements précèdent ; les animaux seront euthanasiés rapidement pour éviter toute souffrance et l’expérience sera stoppée.

Choix des espèces

Cette étude a pour but d’étudier l’activité locomotrice et le métabolisme dans un modèle de souris. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal car il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour l’étude du métabolisme. Nous allons étudier le métabolisme et l’activité locomotrice par des tests non invasifs sur 72 souris adultes, et ceci sur une période de 6 mois pour l'étude du métabolisme, à 18 mois pour l'étude de la locomotion, Ce protocole a été choisi d’après nos expériences précédentes et par l’étude de la littérature et ceci afin de reproduire l’aspect progressif de la perte de force et de la prise de poids des animaux.

Un quart seulement des souriceaux de chaque portée porte la mutation recherchée, et ceux dont le second gène est invalidé meurent le premier jour de vie. 4 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune peut subir jusqu'à six échocardiographies sous anesthésie gazeuse, six injections dans l'abdomen, six tests de force et six passages sur tapis roulant, plus une biopsie de génotypage et des transports vers un centre extérieur. Celles qui portent la première mutation développent une cardiomyopathie et peuvent, dès neuf semaines, perdre du poids et adopter une posture anormale, pendant que le porteur décrit la création de ces modèles comme une étape "nécessaire" à un traitement qui n'existe pas.

Objectifs

Les maladies dues à un défaut de production d’énergie, sont de maladies génétiques très rares et incurables. Ces maladies peuvent se manifester à tout âge et peuvent affecter plusieurs types d'organes en même temps. Les mutations du notre gènes d’intérêt n 1 et 2, codant des protéines essentielles pour la production d'énergie dans nos cellules, provoquent des maladies affectant le cerveau et le cœur. Comme ces maladies affectent les cellules qui ne se divisent pas, la culture cellulaire ne peut pas aider à comprendre comment le dysfonctionnement mitochondrial affecte le fonctionnement des organes affectés et le développement de la maladie. Ainsi, un modèle animal doit être utilisé pour comprendre les mécanismes physiopathologiques de ces maladies. Nous avons décidé d'utiliser les souris comme modèle parce que les souris sont plus proches de l’humain et la physiologie mitochondriale chez l’homme et la souris sont très similaires. Nos objectifs sont les suivants : - Création et étude d'un modèle de souris pour l'étude du développement des maladies associées au gène d’intérêt 1 et 2. La création de ces deux modèles animaux et la compréhension du développement de la maladie mitochondriale sont des étapes nécessaires à la mise au point d'un traitement efficace.

Bénéfices attendus

Ce projet fournira des modèles murins pour les maladies mitochondriales et permettra de découvrir leurs mécanismes pathologiques. Ces deux points sont des étapes essentielles pour le développement d'un traitement pour ces maladies encore incurables.

Procédures

-échocardiographie (20 min par souris; 6 fois maximum par souris) -anesthésie gazeuse (20 min par souris; 6 fois maximum par souris) -injection intra-péritonéale (1 min par souris ; 6 fois maximum par souris) -grip-test (5 min par souris ; 6 fois maximum par souris) -treadmill (5 min par souris ; 6 fois maximum par souris); biopsie pour génotypage: (1 min par souris; 1 fois par souris )

Impact sur les animaux

Les souris où l’expression du notre gène d’intérêt 1 est abolie (seuls 25% des souris de chaque portée), développeront une cardiomyopathie.. À partir de 9 semaines, ces souris peuvent commencer à perdre du poids et avoir une mobilité réduite avec une posture anormale. Les souris où l’expression du notre gène d’intérêt 2 est abolie (seuls 25% des souris de chaque portée), développeront maladie neurologique et meurent le premier jour de vie. Les autres nuisances que les souris subiront sont le stress pendant le test comportementaux, pendant l’échocardiographie, pendant l’injection intra péritonéal et le stress pendant le transport vers le centre expert de l’échocardiographie.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort, pour analyser les tissus.

Remplacement

L’objectif de notre projet est d’étudier la pathophysiologie des maladies mitochondriales. Pour cette raison l’utilisation d’un modèle animal est nécessaire. La préparation des cultures cellulaires primaires, pour l'étude du rôle moléculaire des protéines codées par notre gènes d’intérêt, aide à réduire le nombre d'animaux utilisés mais ils ne peuvent malheureusement pas remplacer l'utilisation du modèle animal.

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris utilisées pour les expériences, nous nous sommes basés sur nos précédents travaux sur l’étude d’autres modèles murins de maladies mitochondriales et sur de méthodes et analyses statistiques. De plus, lorsque cela est possible, les prélèvements d’une même souris seront utilisés pour plusieurs analyses. L’échocardiographie est elle-même une méthode de réduction car elle permet un suivi longitudinal des souris, par opposition à une mise à mort séquentielle.Nous utiliserons des méthodes statistiques comme des tests t de Student et Anova en fonction des groupes d’animaux comparés.

Raffinement

Dans un contexte de raffinement adapté, les animaux seront surveillés quotidiennement par les techniciens de l'animalerie (dans les weekends par les personnes d’astreinte), et une fois par semaine par les chercheurs travaillant sur ce projet, pour détecter un éventuel état de souffrance et/ou d’angoisse. Pour minimiser la détresse causée par les symptômes de la maladie, nous avons établi des critères de décision pour la mise à mort des souris lorsque cela est nécessaire. Concernant l'échocardiographie, les souris seront anesthésiées, pour être capable de mesurer correctement les différents paramètres du système cardiaque et éviter le stress. Concernant les injections le volume injecté sera réduit au minimum possible et la solution sera chauffée à la température ambiante. Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupée dans un milieu enrichi avec des carrés de coton, des maisonnettes et des bâtonnets à ronger. L’enrichissement social des souris sera garanti en évitant tout isolement prolongé. Le transfert des souris vers le centre expert de l’échocardiographie se fera dans des cages de transport sécurisées dans des véhicules dédiées tout en réduisant les vibrations et le bruit.

Choix des espèces

Les souris sont génétiquement, physiologiquement et anatomiquement proches des humains. La physiologie mitochondriale et la tissu-spécificité des fonctions mitochondriales chez l’homme et la souris sont très similaires. Pour nos études, nous utiliserons des souris de différentes tranches d'âge (nouveau-nés, souris juvéniles et juvéniles adultes). Les tests comportementaux et les échocardiographies seront réalisés sur des souris âgées de 3 semaines et plus.

180 souris subissent une craniotomie de trente minutes, avec incision de la peau, injection stéréotaxique dans le cerveau et sutures, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce comme effets possibles des saignements, des douleurs postopératoires, une infection de la suture et une perte de poids passagère. Il présente les cellules souches de pulpe dentaire comme une alternative dénuée de "conflits éthiques", par opposition aux cellules embryonnaires, et se félicite de transformer un "déchet biologique" en source thérapeutique. Toutes les souris sont tuées à la fin de la procédure, pour électrophysiologie sur tranches de cerveau ou étude histologique.

Objectifs

L'un des défis les plus importants auxquels est confronté la société d'aujourd'hui est la recherche de thérapies neurorégénératives efficaces qui aident à résoudre les blessures du système nerveux causées par des événements traumatiques, des maladies neurodégénératives ou même celles plus récemment connues dérivées de l'inflammation provoquée par le SARS-COV-2. Ces blessures sont dans la plupart des cas irréversibles, entraînant des coûts économiques et sociaux élevés tant pour les patients que pour leurs familles. De plus, le système nerveux a une faible capacité d’auto-réparation, puisque le processus de neurogenèse diminue avec l’âge et que les neurones endommagés ne sont pas facilement remplacés. Ces dernières années, diverses études se sont concentrées sur la recherche de candidats cellulaires efficaces pour ce type de thérapie. Au vue des problèmes éthiques et juridiques liés à l'utilisation de cellules souches dérivées d'embryons, les cellules souches de pulpe dentaire ont été identifiées comme une alternative prometteuse dans ce domaine.Elles se distinguent par leurs nombreux avantages par rapport aux autres cellules, tels que : leur facilité d'obtention et l'absence de conflits éthiques, leur capacité à sécréter des facteurs neuronaux, sa capacité à exprimer des marqueurs et des récepteurs neuronaux, sa capacité à se différencier en neurones sans avoir besoin d'être génétiquement modifiés. Dans le cadre de la thérapie cellulaire, le projet actuel a pour but de valider l’utilisation des cellules souches de pulpe dentaire sur les circuits cérébraux, sur le remodelage des synapses et sur leur action neuroprotectrice. Nous validerons les effets des vésicules extracellulaires qui ont pour avantage de limiter les besoins direct d'un implant cellulaire, et de réduire le risque de rejet du greffon de thérapie cellulaire.

Bénéfices attendus

Le projet validera le potentiel des cellules souches de pulpe dentaire à être utilisées dans des modèles in vivo dans le système nerveux central. Cela démontrera pour la première fois qu'elles peuvent être différenciés en neurones fonctionnels et intégrés dans le système nerveux, ce qui ouvrira de futures perspectives d'utilisation en thérapie substitutive. D’autre part, l’utilisation de vésicules extracellulaires démontrera leur fonctionnalité dans un environnement sain, leur permettant d’être le point de départ de leur utilisation dans de futurs modèles de lésions et/ou d’inflammation du système nerveux. Tout cela présente un énorme intérêt pour pouvoir réutiliser du matériel considéré comme un « déchet biologique » et le transformer en une source cellulaire capable d’être réutilisé pour la thérapie cellulaire.

Procédures

Les 180 animaux de cette demande d’autorisation subiront une chirurgie pour l’injection de cellules souches ou de vésicules extracellulaires (30min)

Impact sur les animaux

Les différentes étapes de la chirurgie tels que l’incision de la peau, la craniotomie, l’injection stéréotaxique, et la réalisation des points de sutures peuvent entrainer des effets indésirables comme des saignements, des douleurs post chirurgicales, une infection au niveau de la suture et une légère perte de poids de courte durée. .

Devenir

L'ensemble des animaux est euthanasié à la fin de la procédure afin de réaliser des expériences d'électrophysiologie in vitro ou des études histologiques.

Remplacement

A ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives, pour évaluer la fonctionnalité et l’intégration des cellules greffées dans un système neuronal complexe.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les conditions de l'élevage seront standardisées et en adéquation avec le bien-être des animaux de façon à obtenir des groupes d'animaux les plus homogènes possibles et ainsi diminuer le nombre d'individus pour les analyses statistiques. L’utilisation de tests statistiques pour ces expériences nous permet d’estimer un nombre minimal de souris nécessaires pour satisfaire les conditions statistiques de significativité.

Raffinement

Les souris seront acclimatées pendant 4 jours après leur arrivée dans l’animalerie . Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel, nid) sur un portoir filtrant. Les animaux sont surveillés chaque jour par les zootechniciens. Cette surveillance est renforcée (2/jours) dans les jours qui suivent la chirurgie jusqu’à récupération complète des animaux. Des critères de bien être seront évalués : allure du poil, dos vouté, blessures dues à des bagarres entre congénères, lésions cutanées, agressivité ou repli, respiration accélérée/saccadée. Le constat de signes de souffrance sans lien avec les procédures expérimentales entraine la création d’une « fiche individuelle de soin » (FIS), qui renseigne les soins prodigués (réchauffement, soins médicamenteux, etc…) et l’évolution des signes. La cage est alors signalée par une étiquette « animal à surveiller ». Cette fiche est fermée quand l’animal a récupéré ou qu’une décision de mise à mort a dû être prise. Un suivi spécifique établi pour les procédures de chirurgie sera décrit dans les procédures. La chirurgie est réalisée sous anesthésie. Un contrôle de la respiration et de l’absence de reflex sera effectué tout le long de la chirurgie. La douleur induite par l’incision sera couverte par l’injection préalable en sous cutané d’un anesthésique local. L’injection d’un morphinique, en sous cutané en début de chirurgie va permettre une couverture analgésique jusqu’au réveil de l’animal. Une seconde injection est réalisée en fin de chirurgie pour assurer une couverture analgésique pendant les 4-6 heures post-opératoire. Les jours suivants si l’animal montre des signes de souffrance, il recevra en sous cutanée une injection quotidienne d’un anti inflammatoire non stéroïdien, jusqu’à disparition des signes de mal être.La mise à mort est précédé d’une injection d’une double dose d’analgésique et d’un euthanasiant. L’absence de reflexe est vérifié avant toute incitions afin de contrôler la profondeur de l’anesthésie de l’animal.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des mammifères. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine afin de mieux comprendre l’importance des mécanismes synaptiques sur l’adaptation comportementale. Le projet sera réalisé sur des animaux de 6 à 8 semaines d'âge, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.