Recherche fondamentale

Le poids, le comportement et l'apparence des souris porteuses de tumeurs sont contrôlés chaque jour pour décider du moment de leur mise à mort. 4 011 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Un groupe de 2 100 subit une injection puis un unique prélèvement sanguin sous anesthésie terminale, un autre de 1 001 reçoit une incision du flanc, une greffe de cellules cancéreuses dans la glande mammaire, huit injections du produit testé puis, deux fois par semaine pendant quatre mois au plus, une injection de luciférine suivie d'un examen d'imagerie sous anesthésie. L'objet du projet est de comparer des nanoparticules ciblant HER2 selon leur taille et leur composition, et les souris chez qui la tumeur n'a pas pris sont tuées elles aussi, parce qu'elles ont reçu des cellules tumorales.

Objectifs

Le cancer du sein est le premier cancer chez la femme en France, dont 10 à 20% sont HER2 positifs (protéine exprimée à la surface des cellules positives). Cependant, des résistances aux traitements proposés actuellement se développent, et la toxicité systémique (toxicité qui affecte l’ensemble de l’organisme) des traitements existants reste problématique. Il reste donc indispensable de chercher de nouveaux traitements contre le cancer du sein. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de valider l’efficacité thérapeutique de nouvelles molécules associées à des nanoparticules ciblant HER2, réduisant les effets secondaires dans le traitement du cancer du sein. Nous espérons ainsi ouvrir de nouvelles pistes pour résoudre cette problématique de santé publique. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Menée à bien, cette étude devrait permettre de connaître la place des différentes nanoparticules dans l’arsenal thérapeutique actuel du cancer du sein. La comparaison des différentes nanoparticules ciblées devrait permettre de mieux comprendre l’influence de la taille et de la composition des nanoparticules sur le ciblage de la tumeur, et de montrer leur intérêt d’un point de vue pharmacocinétique. Cela montrera l’intérêt des nanoparticules pour réduire les toxicités associées aux traitements du cancer du sein humain grâce à l’amélioration de la pharmacocinétique par rapport aux chimiothérapies classiques.

Procédures

- Un groupe de 700 souris subira 1 injection du médicament sur animal vigile d’une durée de 10 secondes, puis 2 prélèvements sanguin à deux jours d’intervalle, sous anesthésie (durée : environ 30 secondes). Les souris subiront cette séquence d’une semaine sur 4 semaines (4 injections et 8 prélèvements au total). - Un groupe de 2100 souris subira 1 injection du médicament sur animal vigile d’une durée de 10 secondes, puis un prélèvement sanguin sous anesthésie terminale (sans réveil) (durée : 30 secondes). - Un groupe de 210 souris subira 2 injections de cellules cancéreuses (10 secondes chacunes) sur animal anesthésié, puis une injection du médicament (7 à 15 jours après) sur animal vigile d’une durée de 10 secondes ; puis sera observée à 7 temps différents par imagerie sous anesthésie (durée : 30 secondes) réparties sur 3 jours. - Un groupe de 1001 souris subira 1 incision sous anesthésie et analgésique (durée 10 secondes) suivie d’une injection de cellules cancéreuses dans la glande mamaire sous anesthésie et analgésique (durée 10 secondes), puis 10 à 20 jours plus tard, huit injections du médicament (10 secondes) sur animal vigile, et deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’étude (4 mois maximum), une injection de la luciférine (nécessaire à l’imagerie) sur animal vigile (durée 10 secondes) suivie de l’examen en imagerie (durée 1 min) sous anesthésie. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs. Les animaux concernés par l’étude de la dose maximale tolérée et de toxicité et de pharmacocinétiques seront réceptionnés, hébergés, injectés et sacrifiés dans l'EU1. Dans le cadre de l’étude de biodistribution ; la réception, hébergement, la greffe et la pousse tumorale se fera dans l'EU1, puis les animaux seront transférés dans l'EU2 pour l’injection des formulations et le suivis jusqu’à euthanasie. L’ensemble des animaux de l'étude d’efficacité thérapeutique sera réalisée dans l'EU2 (réception, hebergement, greffe/pousse tumorale, injection des formulations).

Impact sur les animaux

Il n’y a pas de nuisances attendues sur les souris saines autre que la toxicité éventuelle de la molécule à haute dose (perte de poids, perte de poils). Le poids, le comportement et l’apparence physique de la souris sera alors contrôlée quotidiennement pour l’euthanasier selon des points limites prédéfinis. Les nuisances attendues pour l’incision du flanc sont des douleurs au niveau de la zone incisée. Les nuisances attendues pour les souris porteuses de tumeurs sont la nuisance due à la tumeur : perte de poids, nécrose, etc. Le poids, le comportement et l’apparence physique de la souris sera alors contrôlée quotidiennement pour l’euthanasier selon des points limites prédéfinis. Après injection intraveineuse, des irritations au point d’injections peuvent apparaître et seront surveillés.

Devenir

Les souris sont prélevées post-mortem pour des analyses ultérieures, elles seront donc toutes mises à mort. Les souris dont la pousse tumorale n'a pas prise seront mises à mort car elles ont étés injectées avec des cellules tumorales.

Remplacement

Nous avons préalablement réalisé des études in vitro afin de remplacer en partie l’expérimentation in vivo autant que possible, mais à ce stade du projet, l’utilisation de modèles animaux reste inévitable pour examiner l’aspect translationnel de nos travaux. En effet, cette étude préclinique, visant à évaluer la pertinence clinique de l’utilisation des nanoparticules pour le traitement du cancer du sein nécessite obligatoirement l’utilisation d’animaux entiers pour déterminer la biodistribution des nanoparticules, leur pharmacocinétique et leur efficacité.

Réduction

Les effectifs sont justifiés par l’importante variabilité des résultats obtenus pour l’efficacité du traitement pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre de paramètres mesurés par animal a été optimisé et nous avons privilégié les études longitudinales lorsque cela était possible grâce au suivi par imagerie non invasive et non irradiante (croissance tumorale et biodistribution des formulations dans les modèles de souris porteuses du cancer du sein). Une étude préliminaire, avec un nombre restreint de groupes conditionnera la suite du projet, le nombre d’animaux annoncé est donc un nombre maximum.

Raffinement

Toutes les manipulations susceptibles de générer de l’inconfort ou de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale. Un analgésique sera localement appliqué sur les sites d’ouverture de la souris. Les souris seront observées quotidiennement et la croissance des tumeurs sera mesurée tous les 3 jours. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en portoir ventilés en groupe sociaux selon les normes en vigueur avec des conditions d’hébergement et d’enrichissement de leur environnement conformes à la validation de la structure du bien-être animale. Pour le transport des animaux, ces derniers seront installés dans des boites spécifiques assurant leur confort et leur sécurité (isolation thermique, filtre sanitaire, chaufferette) pour un temps de transport estimé entre 5 à 10 minutes. Une période d’acclimatation de 12 à 24h minimum sera observée suite à leur transferts.

Choix des espèces

La raison la plus importante du choix des souris pour nos études est leur similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. La plupart des antécédents génomiques de la souris sont similaire à ceux de l’homme (env. 95%), ce qui rend les souris particulièrement utiles pour la recherche sur les maladies humaines. Les souris seront utilisées à partir de l’âge de 6-8 semaines, âge adulte de manière à avoir un poids corporel plutôt stable d’environ 20g.

Une constriction du nerf sciatique sous anesthésie, une injection d'adjuvant de Freund dans le coussinet plantaire, des plaques à 4 et à 55 degrés, huit séries de filaments de von Frey : les procédures de ce projet consistent à provoquer de la douleur puis à la mesurer. 342 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyses cellulaires et moléculaires. Le porteur indique que l'injection dans la patte peut entraîner des douleurs modérées et persistantes, des difficultés à se mouvoir et des automutilations, et que la chirurgie s'accompagne de risques de destruction des sutures, de cannibalisme et de décès au réveil. Le niveau de souffrance déclaré reste modéré pour l'ensemble, alors que le protocole retient la constriction du nerf sciatique comme le modèle admis des douleurs neuropathiques chroniques chez l'être humain.

Objectifs

Le projet vise à établir le rôle des lymphocytes T régulateurs (Treg) dans la perception de la douleur chez la souris. Les Treg sont des cellules supprimant la réponse immunitaire. Ils sont donc bénéifiques dans les maladies auto immunes mais nuisibles dans le cancer. Notre hypothèse est que les lymphocytes T régulateurs masquent la douleur directement de par leur capacité à sécréter des analgésiques naturels. Nous utiliserons des lignées de souris mutantes et des tests de sensibilité à la douleur dans différentes conditions inflammatoires et non inflammatoires. Nous évaluerons particulièrement la douleur ressentie dans un modèle de cancer, dans un modèle de chimiothérapie et dans un modèle inflammatoire induit. Nous évaluerons aussi le rôle des Treg dans la douleur dans un modèle de chirurgie du nerf sciatique, le modèle communément admis de douleurs neuropathiques chroniques chez l'homme. Nous mesurerons l'intensité de la douleur percue par stimulation mécanique ou par des observations comportementales. L'ensemble des résultats de ce projet permettra de proposer un nouveau mécanisme de régulation de la douleur chez la souris avec de possibles implications cliniques chez l'homme.

Bénéfices attendus

Les patients atteints de cancer et traités par chimiothérapie souffrent souvent d'une sensibilité thermique altérée. Notre projet va permettre de préciser les mécanismes associés afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales sur animal vigile, nécessaire à l’induction des modèles génétiquement modifiés à raison de cinq injections à un jour d'intervalle (moins d’une minute/injection). Une première partie des animaux seront impliqués dans une injection unique dans le coussinet plantaire effectuée sous anesthésie générale gazeuse (environ 5 minutes). Une deuxième partie des animaux seront soumis à une injection sous-cutanée de cellules tumorales effectuée sous anesthésie gé nérale gazeuse (environ 5 minutes). Une troisième partie des animaux seront impliqués dans une unique chirurgie de constriction du nerf sciatique ischio-jambier (environ 30 minutes) effectuée sous anesthésie et analgésie pré et post-opératoire. La sensibilité à la douleur sera mesurée à l’aide d'un test de référence (filaments Von Frey) à raison de 8 mesures de 3 à 9 jours d'intervalles (environ 60 minutes). Enfin, une quatrième partie des animaux seront impliqués dans une injection unique voie intrapéritonéale d’une molécule d’intérêt (environ 1 minute) et la sensibilité́ thermique sera mesurée à l’aide de test de référence en exposant les animaux sur une courte durée sur un plaque au froid (4 degrés) et au chaud (55 degrés) et en mesure le temps de retrait (maximum 1 minute/animal). Ce test sera effectué 4 fois avant et après l’induction du modèle génétiquement modifié. A l’issue de ces actes, l’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en vue des prélèvements et des analyses nécessaires pour répondre à la question scientifique.

Impact sur les animaux

Les injections intra péritonéales entrainent une douleur légère et brève, L'injection d'adjuvant complet de Freund dans la patte est susceptible d'entrainer douleurs modérées mais persistantes, difficultés à se mouvoir et auto-mutilations. Les animaux sont opérés avec une chirurgie invasive, entrainant une douleur modérée. Il existe des risques infectieux suite à la chirugie. Le comportement des souris peut être altéré suite à l'anesthésie et à la chirurgie. Des comportements aggressifs peuvent apparaitre avec destructions de sutures et cannibalisme. L'anesthésie en tant que telle présente des risques tels que hypothermie, difficultés respiratoires pouvant aller jusqu'à l'arrêt cardiaque. Le réveil de l'anesthésie est une étape critique avec un risque certain de décès. La croissance des tumeurs en sous cutanée pourrait entrainer douleurs et perte de poids liées soit à la croissance de la tumeur localement, soit à la dissémination métastatique de la tumeur. Les tests thermiques peuvent entrainer une douleur légère à modérée, objet de l'étude.

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour analyses cellulaires et moléculaires complémentaires.

Remplacement

Selon la définition de la Douleur par l'Association Internationale de l'Etude de la douleur (1979), " La douleur est une expérience sensorielle et émotionnelle désagréable, associée à un dommage tissulaire présent ou potentiel, ou décrite en terme d'un tel dommage. ", on perçoit le caractère pluridimensionnel et plurifactoriel de la notion de douleur. Au regard de notre thématique faisant appel à des mesures de variation de la nociception, il nous est par conséquent impossible de palier à l’utilisation d’animaux vivants (anesthésiés ou vigiles). Notre projet est basé sur la perception de la douleur chez l'animal sans possibilité de remplacement par des expérimentations in vitro, la douleur n'étant pas quantifiable par des paramètres biochimiques connus.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum (342) sans compromettre la validité statistique des analyses des résultats. Après calculs, nous avons établi que 6 animaux par groupe dans 3 expériences indépendantes assurait la fiabiité statistique des résultats. Une approche de réduction du nombre d’animaux utilisés est aussi de réaliser les expériences sur les deux lignées de souris génétiquement modifiées en même temps afin de les comparer au même groupe témoin.

Raffinement

L’état général des animaux sera suivi de manière journalière par le personnel qualifié de l'animalerie ou par les membres habilités de l'équipe. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en oeuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Le milieu sera enrichi avec du carton pour permettre aux souris de faire un nid. Les animaux sont regroupés de façon à éviter les combats et permettre l'installation d'une hiérarchie stable et non conflictuelle. Les animaux reçoivent nourriture et eau en quantité non limité. Les animaux provenant de l'extérieur seront acclimatés une semaine avant leur inclusion dans les protocoles. Les animaux sont anesthésiés durant les procédures pouvant engendrer de la souffrance. Les animaux entrant dans le cadre d’une chirurgie seront traités avec des analgésiques/anti-inflammatoires avant et après la chirurgie.

Choix des espèces

La souris et le rat sont les espèces animales utilisées depuis de nombreuses années pour ce type d’étude. La souris représente un très bon modèle pour réaliser des expériences de comportement, des études de neuroanatomie, de physiologie et de biologie cellulaire et moléculaire. En outre le choix des rongeurs dans les études portant sur la douleur est admis depuis de nombreuses années et les modèles expérimentaux de douleurs chroniques sont bien caractérisés tant du point de vue des études comportementales que des analyses cellulaires ou moléculaires. La disponiblité de souris génétiquement manipulées pour les gènes d'intérêt rend aussi l'utilisation de cette espèce indispensable à la réalisation de ce projet. Dans ce projet 3 lignées différentes de souris génétiquement modifiées seront utilisées. Ces animaux sont issus d'élevage réalisés dans notre animalerie. Des souris de 8 à 12 semaines d'âge seront utilisées pour travailler avec un système immunitaire mature. De plus, des souris adultes résistent mieux à l'anesthésie, ce qui garantit un réveil rapide et sans séquelles.

96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à J2 ou J14 pour prélever leurs muscles. Elles reçoivent une à sept injections dans l'abdomen, dont une drogue qui détruit chimiquement leurs nerfs sympathiques, des gavages, puis une injection dans l'orbite sous anesthésie juste avant la mise à mort. Le projet cherche à savoir si le système nerveux sympathique règle le comportement des cellules souches du muscle sain, avec des retombées annoncées, à terme, pour des maladies neuromusculaires comme la dystrophie de Duchenne. Parmi les raisons du choix de la souris, le porteur cite sa petite taille, sa gestation rapide et sa "durée de vie courte compatible avec notre étude".

Objectifs

Le processus de régénération musculaire est très important pour la restauration de la fonctionnalité du tissu après une lésion. La niche des cellules souches du muscle est un environnement complexe impliquant des interactions entre les cellules interstitielles, les cellules des vaisseaux et les cellules souches. Le muscle est également un tissu innervé par le système nerveux somatique responsable de la contraction volontaire ainsi que par le système nerveux sympathique dont les neurones sensoriels sont capables de capter les contraintes mécaniques et sensitives appliquées au tissu musculaire. Tout changement dans la niche comme le vieillissement peut altérer le potentiel de régénération du muscle. Pour cette raison, il est capital d’élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires nécessaires au maintien fonctionnel de la niche. Par ailleurs, plusieurs myopathies sont causées par l'épuisement et la perte du potentiel de réparation musculaire et à une altération de l'organisation du réseau vasculaire. Le présent projet a pour objectif d’étudier l’interaction entre les nerfs sympathiques, les cellules vasculaires et les cellules souches en conditions physiologiques. Le rôle du système nerveux sympathique a récemment été décrit dans la niche des cellules souches hématopoïétiques et des cellules souches intestinales mais n'a été parfaitement étudié dans le muscle. Des observations sur des coupes de tissu musculaire ont permis d’émettre l’hypothèse que le système nerveux sympathique pourrait intervenir dans la régulation des fonctions des cellules souches musculaires via une modulation des signaux moléculaires émis par les cellules composant les microvaisseaux.

Bénéfices attendus

Nombre de pathologies du muscle sont liées à des perturbations du fonctionnement intrinsèque de la cellule souche musculaire mais également de sa niche. L'implication du système nerveux central mais surtout périphérique en tant que modulateur de la niche reste encore peu exploré. Cette étude vise à identifier un nouveau mécanisme contrôlant la quiescence des cellules souches musculaires par le système nerveux autonome sympathique via le relais des cellules des vaiseaux. En effet, la modulation de ce circuit neuro-vasculaire aura des implications significatives pour mieux comprendre le comportement des cellules souches musculaires dans les maladies neuromusculaires, comme la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Effectivement, l'innervation sympathique et les signaux de la niche vasculaire, sont déréglés et peuvent altérer directement la fonction des cellules souches dans la DMD. Ainsi, comprendre les mécanismes de la modulation des voies signalisation impliquées dans le dialogue nerf-muscle, ouvre potentiellement sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les maladies neuromusculaires.

Procédures

Les drogues utilisées pour la dénervation, pour stimuler la voie de signalisation cible seront injectées par voie intrapéritonéale. La drogue inhibitrice de la voie de signalisation ciblée sera administrée par voie orale. Les anticorps inhibiteurs de la voie de signalisation ciblée et les anticorps contrôles seront injectés par voie intrapéritonéale. La molécule permettant de visualiser les vaisseaux sanguins sera administrée par voie retro-orbitale une seule fois avant la mise à mort. Toutes les autres administrations seront faites 1 jour sur deux pendant 1 à 14 jours soit 1 à 7 injections selon le jour de mise à mort (J2 ou J14). Les injections intrapéritonéales et par gavage sont rapides et durent de quelques secondes à 30 secondes pour le gavage, en respectant les volumes autorisés à injecter. L'injection par voie retro-orbitale est également assez rapide et sera effectué sous anesthésie pour éviter le stress et la douleur.

Impact sur les animaux

Les animaux sont régulièrement surveillés et manipulés par du personnel qualifié afin de les habituer à l’homme et éviter tout stress lors des procédures expérimentales. Après chaque injection, les souris seront surveillées (signes de détresse, comportement, poids corporel, prise de nourriture) et en cas de signes de douleur, un anti-douleur sera administré pendant 24h. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleurs chez les animaux.

Devenir

Les animaux sont tous mis à mort pour prélèvement de leurs muscles à des fins d'analyses histologiques et moléculaires ou de mise en cultures cellulaires.

Remplacement

La niche des cellules souches du muscle squelettique est un environnement tissulaire complexe impliquant de nombreuses interactions cellulaires notamment avec les cellules vasculaires, les cellules inflammatoires et le systèmes nerveux moteur et sympathique. Expérimentalement, il n’est pas possible de reproduire la complexité de cet environnement dans un système cellulaire in vitro ou par modélisation mathématique. C’est pourquoi, l’utilisation des modèles animaux reste nécessaire à la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires intégrés à la base du fonctionnement de la niche et qui peuvent influencer la régénération musculaire. Cependant en préambule à l'étude proposée, la présence de récepteurs du système nerveux autonome a été mis en évidence in vitro sur les cellules musculaires et vasculaires, ces récepteurs permettant l'activation et/ou l'inhibition de ces cellules. Les études in vivo permettront de valider l'hypothèse de travail ainsi que les résultats obtenus in vitro.

Réduction

Pour avoir des résultats statistiquement significatifs, il faut un minimum de 6 animaux par groupe dans les différentes procédures en raison de la variabilité dans un même groupe d’animaux et afin d'avoir assez de matériel pour réaliser toutes les analyses prévues. Cela devrait également éviter d'avoir à répéter l’expérience. Par ailleurs, l'expérience du laboratoire sur les modèles animaux a permis de déterminer que l'utilisation d'une solution saline comme contrôle en injection intrapéritonéale ou en injection intramusclaire ne provoquait aucun effet secondaire ou altération sur le processus de régénération musclaire, aussi ces contrôles ne seront pas systématiquement inclus afin de limiter le nombe d'animaux utilisés. Ne seront injectées que les solutions qui n'ont jamais été utilisées et pouvant potentiellement avoir des effets sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Les animaux sont dans des cages ventilées dans des zones dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les souris ont en permanence accès à l’eau et à la nourriture et ne sont jamais isolées, elles restent avec leurs congénères et sont uniquement séparées par sexe afin d’éviter les accouplements non contrôlés. Les animaliers sont formés à procéder à l’amélioration des conditions d’hébergement par ajout de papier et d’abris en carton dans les cages. Les animaux sont régulièrement surveillés et manipulés par du personnel qualifié afin de les habituer à l’homme et limiter tout stress lors des procédures expérimentales. Après chaque injection, les souris seront surveillées (signes de détresse, comportement, poids corporel, prise de nourriture) et en cas de signes de douleur, un anti-douleur sera administré pendant 24h et si cela n'est pas suffisant, une mise à mort compassionnelle sera réalisée avec approbation du vétérinaire référent. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour étudier les mécanismes de l’innervation sympathique sur le tissu musculaire car la dénervation chimique chez la souris est un procédé assez rapide et bien caractérisé. La souris est par ailleurs un modèle de petite taille, avec une gestation rapide et une durée de vie courte compatible avec notre étude. Les souris utilisées seront des adultes âgés de 16 semaines parce qu'à cet âge le système nerveux sympathique est mature.

Des parasites sont injectés dans l'abdomen de souris pour déclencher une toxoplasmose, suivis d'un gavage quotidien pendant sept jours et de quatre séances d'imagerie sous anesthésie. 2 127 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit pourtant que les souches de type I conduisent systématiquement à la mort des animaux infectés en l'absence de traitement, et que les kystes formés par les souches de type II persistent toute la vie de l'hôte. Toutes les souris seront tuées, notamment pour disséquer leur cerveau et y compter les kystes.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet de recherche est double, visant à approfondir notre compréhension d'une maladie due à une infection par des parasites, et à développer des approches thérapeutiques innovantes. Dans un premier volet, l'équipe se concentre sur l'identification et la caractérisation des des protéines sécrétées par les parasites lors de l'infection de la cellule hôte. L'objectif ultime est de déterminer le rôle de ces protéines dans le processus de virulence du parasite chez son hôte intermédiaire naturel, la souris. Ce volet comprend une analyse in vivo, en se penchant particulièrement sur la phase initiale de la maladie et la formation de kystes pendant la phase persistante de la maladie. Dans un second volet, le projet a pour objectif d'évaluer l'efficacité in vivo de composés antiparasitaires, préalablement sélectionnés parmi des molécules approuvées par la "U.S. Food and Drug Administration" (FDA, fda.gov). La FDA veille à ce que des médicaments sûrs et efficaces soient disponibles pour améliorer la santé de la population des États-Unis. Ces composés sont donc déjà utilisés dans le traitement de différentes maladies, garantissant leur non-toxicité chez l'humain. L'objectif est de comparer leur efficacité à la sulfadiazine, un médicament antiparasitaire utilisé actuellement en clinique, tout en confirmant in vivo leur cible moléculaire. Notez que ce projet se déroulera dans deux Etablissements Utilisateurs (nommés EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche présente des avantages significatifs sur plusieurs aspects. Tout d'abord, il vise à répondre à des questions fondamentales sur les infections causées par les parasites, en éclairant le rôle des protéines sécrétées dans la virulence et le processus infectieux. À moyen terme, ces réponses permettront de mieux comprendre le dialogue établi entre le parasite et son hôte ainsi que les mécanismes permettant le contrôle de l'infection, guidant ainsi le développement de nouvelles approches thérapeutiques. En ce qui concerne le deuxième volet, l'évaluation in vivo des composés antiparasitaires présente un intérêt majeur. À long terme, si ces composés s'avèrent efficaces, cela pourrait ouvrir de nouvelles perspectives dans le traitement contre les infections parasitaires, offrant des alternatives potentielles aux traitements actuels, tout en minimisant les effets secondaires. Il est important de souligner ici qu'il n'existe jusqu'à présent aucun traitement contre les formes persistantes d’infections parasitaires. Une fois établis, les kystes persistent théoriquement pendant toute la durée de vie de l'hôte. Pour information, il est estimé que 30% de la population mondiale est infectée par un parasite. En somme, ce projet offre une approche globale, alliant une compréhension approfondie des mécanismes d'infection à des solutions thérapeutiques novatrices. Les connaissances générées et les avancées thérapeutiques potentielles contribueront à la lutte contre les maladies parasitaires, avec des implications positives pour la santé publique à moyen et long terme.

Procédures

Lors de ce projet, les interventions sur les animaux vivants seront de trois types : (i) Les injections au niveau abdominal (1 par expérience et par souris, durée du geste : quelques secondes) des parasites dans le but de déclencher l'infection parasitaire avec une charge parasitaire contrôlée. Cette étape sera réalisée dans l’Etablissement Utilisateur EU1. (ii) Traitement des animaux par administration par voie orale des composés à l'aide de sondes de gavage adaptées à la souris (1 gavage par jour pendant 7 jours consécutifs et par souris, durée du geste : quelques secondes à chaque gavage). Cette étape sera réalisée dans les Etablissements Utilisateurs EU1 et EU2. (iii) Pour les expériences d'imagerie in vivo, les animaux sont anesthésiés et le produit luminescent est injectée dans l’abdomen des animaux (4 fois par souris à J0, J2, J5, et J7, durée du geste : quelques minutes chaque jour). Cette étape sera réalisée dans l’Etablissement Utilisateur EU2.

Impact sur les animaux

Les infections parasitaires peuvent est caractérisées par deux phases distinctes : la première phase de l’infection, qui correspond à la phase de dissémination des parasites dans les différents organes de l'hôte (la souris ou l’homme). Celle-ci peut être mortelle chez la souris comme chez l'homme si elle n'est pas contenue et contrôlée par le système immunitaire. Les souches de type I sont particulièrement virulentes chez les souris de laboratoire et conduisent systématiquement à la mort des animaux infectés en l'absence de traitement. Les souches de type II, non-virulentes, induisent une première infection légère, conduisant systématiquement à une infection parasitaire persistante sans symptômes. Cette phase correspond à l'étape où la multiplication des parasites est contenue par le système immunitaire de l'hôte, et seuls les parasites capables de s'enkyster dans les muscles et le cerveau vont survivre. Cette étape se met en place plus tardivement, et les kystes vont persister pendant toute la durée de vie de l'hôte.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure afin de réaliser des prélèvements sur les animaux morts tels que le prélèvement du sang dans le but de détecter la présence d’une réaction immunitaire contre le parasite et la dissection du cerveau pour la détection et la quantification des parasites sous forme de kystes dans le cerveau des animaux.

Remplacement

Volet "étude des protéines sécrétées par les parasites" : Des études préliminaires réalisées in vitro en culture cellulaire nous ont permis d’identifier spécifiquement des gènes (24 gènes candidats) du parasite codant pour des protéines du parasite sécrétées dans la cellule infectée et ayant donc un rôle potentiel dans le contrôle de la virulence chez l’animal. De même, que des études de biochimie ont permis de montrer que ces protéines s’associent avec des protéines de la cellule hôte confirmant leur rôle potentiel dans la régulation des interactions hôte-parasite. Il est donc essentiel de pouvoir réaliser des expériences chez la souris afin de déterminer l’importance de ces gènes dans le contrôle de la virulence, ainsi que dans la capacité des parasites à persister chez l’animal sous forme de kystes (infection persistante). En effet, aucune autre approche alternative in vitro ou de culture cellulaire ne permet de répondre à ces questions. Le modèle murin d’étude des maladies parasitaires est communément utilisé par la communauté scientifique. En effet, la souris constitue un hôte intermédiaire naturel et privilégié étant donné que le cycle sexué du parasite s’effectue exclusivement chez les félidés en tant qu’hôte définitif, après ingestion de proies infectées. Contrairement aux études in vitro de culture cellulaire, la souris permet l’étude de l’infection parasitaire avec la formation de kystes dans les tissus. Volet "évaluation de l'efficacité de composés parasiticides" : L'activité antiparasitaire des composés (27) a été déterminée à travers des tests effectués sur des cellules in vitro. Il est maintenant essentiel de tester ces composés in vivo chez la souris afin de confirmer leur activité parasiticide chez un mammifère. En effet, des essais cliniques chez l'homme ne seront envisageables que si des études précliniques chez l'animal ont été réalisées.

Réduction

Volet "étude des protéines sécrétées par les parasites" : Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, 3 souches mutantes différentes seront testées en parallèle d’une souche sauvage parentale de référence. Par exemple, les souches mutantes de type I seront comparées entre elles et à la souche sauvage de référence de type I. Idem pour les souches parasitaires de type II. Concernant les souches de type I (virulentes), une première lignée des souris seront d’abord testées. Si une atténuation de virulence est observée, l’analyse sera poursuivie sur lignée différente de souris. Ces dernières étant plus sensibles, cette expérience permettra d'évaluer la robustesse de l’atténuation de virulence. Si aucun effet du mutant n’est observé sur la virulence avec la première lignée de souris, l’expérience ne sera pas poursuivie sur la deuxième lignée de souris, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux. Volet "évaluation de l'efficacité de composés parasiticides dans les phases initiale et persistante de l’infection parasitaire" : La première expérience sera conduite avec 2 à 3 animaux par condition à tester (totalisant 13 souris pour cette première expérience). L'objectif est d'assurer une efficacité totale des composés, et les expériences subséquentes ne seront menées que si la survie atteint 100% parmi les souris traitées avec les composés testés lors de cette première expérience. Si les composés se révèlent seulement partiellement efficaces, le protocole ne sera pas poursuivi. De plus, les contrôles sont mutualisés puisque les trois composés sont testés simultanément. En cas de réussite, les expériences ultérieures seront menées avec 2 à 5 animaux par condition à tester.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un établissement utilisateur agréé par du personnel formé. Les souris seront maintenues en groupes autant que possible, dans des cages offrant un enrichissement du milieu de vie, et leur bien-être sera régulièrement contrôlé. Les animaux seront logés dans un environnement contrôlé, exempt de germes dangereux pour les animaux, afin d'éviter toute infection supplémentaire pouvant biaiser l'interprétation des résultats obtenus. Dès le début de chaque expérience, les souris sont observées 3 fois par semaine jusqu'à l'apparition des symptômes, puis quotidiennement (jusqu'à deux fois par jour) jusqu’à la fin de la procédure expérimentale et elles seront euthanasiées dès l'apparition des premiers signes cliniques dû à l’infection parasitaire, avec le point limite défini dans ce document. Les composés testés, non toxiques, seront mis en solution selon une formulation préalablement déterminée. Pour l'expérience d'imagerie in vivo réalisée dans une autre animalerie, les animaux seront transportés dans des conditions optimisées afin de limiter le stress lié au transport.

Choix des espèces

Le modèle murin utilisé pour étudier les infections parasitaires est largement adopté par la communauté scientifique. La souris, en tant qu'hôte intermédiaire naturel du parasite, offre un cadre privilégié, car le cycle sexué du parasite se produit exclusivement chez les félidés, en tant qu'hôtes définitifs, après l'ingestion de proies infectées. Les souris développent ainsi une infection parasitaire avec une réponse immunitaire comparable à celle observée chez l'homme. Les souches de souris utilisées présentent des niveaux de sensibilité variables aux parasites. Il est donc pertinent d'explorer le potentiel rôle des effecteurs parasitaires dans la virulence des différents types de parasites (Type I virulent et Type II non-virulent), ainsi que chez des souris présentant divers niveaux de sensibilité à cette infection. De plus, les modèles murins sont particulièrement adaptés pour étudier l'efficacité de composés antiparasitaires, car les souris peuvent reproduire les différentes phases de l’infection, tant infection initiale que persistante. Seules des expériences in vivo, réalisées sur des modèles murins, permettront de confirmer l'efficacité de ces composés au cours des différentes phase de l’infection parasitaire, et de répondre à la question cruciale : représentent-ils de véritables candidats médicaments ? Par conséquent, les expériences seront réalisées sur de jeunes adultes, car le système immunitaire doit être mature afin de pouvoir répondre à l’infection parasitaire.