Recherche fondamentale

864 souris subissent une chirurgie d'environ vingt minutes pour se voir implanter une tumeur dans le cerveau, puis deux séances d'IRM sous anesthésie. Avec les 960 autres, injectées sous la peau, 1 824 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Un groupe de 32 porte pendant six semaines un dispositif appliqué en continu sur l'abdomen, et l'ulcération ou la nécrose de la tumeur figure parmi les effets attendus. Le porteur qualifie la majorité des procédures de peu traumatisantes et annonce un vaccin thérapeutique contre le glioblastome, tumeur cérébrale pour laquelle il indique lui-même qu'aucun traitement connu ne fonctionne.

Objectifs

Le cancer reste une maladie souvent mortelle, pour laquelle la recherche de traitements innovants est requise. Le succès récent de l’immunothérapie dans divers cancers a renouvelé l'intérêt pour les vaccins anti-tumoraux. Actuellement aucun vaccin a montré une efficacité dans les cancers, probablement à cause de la faible activation de lymphocytes cytotoxiques capables d’attaquer les cellules du cancer par les formulations vaccinales classiques utilisant aluminium ou émulsions comme adjuvants. Nous avons développé une formulation vaccinale innovante qui permet de stimuler de façon exceptionnelle la réponse immunitaire lymphocytaire contre un antigène tumoral. Notre but est de poursuivre le développement de notre formulation afin d’obtenir à terme un vaccin thérapeutique pour le traitement des cancers humains, en nous concentrant plus particulièrement sur le glioblastome, la plus fréquente des tumeurs cérébrales, pour lequel il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement satisfaisant. Devant la résistance du glioblastome à tout traitement connu à l’heure actuelle, la stratégie la plus prometteuse semble être l’association de plusieurs thérapies. Dans ce projet différentes combinaisons thérapeutiques de notre vaccin avec des traitements anti-cancéreux seront évaluées : chimiothérapie, traitements immunomodulants, thérapies qui permettent d’augmenter le passage de molécules thérapeutiques et lymphocytes dans le cerveau.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra la validation de l’efficacité de notre vaccin innovant dans un modèle intracrânien de glioblastome et de sélectionner les meilleures stratégies thérapeutiques de combinaison du vaccin avec des traitements couramment utilisés pour le glioblastome (chimiothérapie) et d’autres traitements immunomodulateurs ou potentiellement synergiques avec l’immunothérapie.

Procédures

960 Souris subiront des injections sous anesthésie générale (durée totale de la procédure de 5 minutes) et 864 Souris une intervention chirurgicale (durée de la procédure d’environ 20 minutes). Pour l’administration des traitements, toutes les Souris auront des injections à fréquence variable selon la molécule entre une fois par jour et une seule injection dans toute la durée de l'experience (durée d’environ une minute). Un groupe de 32 Souris sera traité avec un dispositif appliqué au niveau abdominal 24/24h pendant maximum 6 semaines. Afin d’évaluer l’effet des différents traitements sur la croissance tumorale, nous réaliserons 2 IRM aux Souris avec le modèle intracérébral (864 souris). Durée totale de la procédure : environ 30 minutes. 216 Souris seront mises à mort par chirurgie terminale sans réveil sous anesthésie générale profonde et analgésie. Aucun prélèvement sera réalisé chez l’animal vivant mais toujours après mise à mort.

Impact sur les animaux

Aucune de ces lignées de Souris ne présente de phénotype dommageable à l’état basal. Concernant les injections réalisées sous anesthésie générale (injection de cellules tumorales), les animaux subiront un léger stress pour l’induction de l’anesthésie. Un effet indésirable attendu, susceptible d'entrainer une douleur modérée, est l'apparition d'une ulcération ou d'une nécrose de la tumeur. En ce qui concerne les injections des médicaments, les animaux subiront un léger stress pour la contention et les effets indésirables sont une rougeur, un gonflement, une démangeaison ou une douleur au point d'injection. Les effets indésirables attendus pour le dispositif appliquant un courant sont une rougeur au niveau de la zone d’application du dispositif. Les examens d'imagerie réalisés sont non invasifs et atraumatiques et impliquent l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique. Néanmoins, le souris subiront un léger stress pour l’induction de l’anesthésie.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin de limiter la souffrance (selon points limite) et aussi afin de prélever les différents organes et les analyser pour pouvoir comprendre les mécanismes d’efficacité ou échappement du cancer aux traitements.

Remplacement

Il s’agit d’une étude qui nécessite d’être réalisée in vivo pour évaluer la réponse immunitaire et antitumorale après immunisation par voie sous-cutanée. Aucun modèle in vitro n’est en effet prédictif d’une réponse immune chez l’animal ou chez l’Homme, en raison de la complexité des mécanismes biologiques impliqués. Cependant, les corrélations entre les résultats obtenus chez l’animal et les résultats des études in vitro menées en parallèle seront évaluées en permanence dans l’objectif de remplacer le modèle in vivo par la prédiction in vitro lorsque cela sera possible.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au nombre minimum nécessaire et suffisant pour permettre l’analyse statistique des données. Afin de limiter le nombre de souris avec un modèle de tumeur intracrânien, uniquement les stratégies de combinaison thérapeutique les plus prometteuses selon les résultats des modèles sous-cutanées seront évaluées dans ce modèle. Les protocoles de ce projet utiliseront des modèles validés par la littérature, permettant d’obtenir des résultats reproductibles. De plus, les expériences sont conçues de façon à utiliser les mêmes groupes contrôles pour plusieurs traitements ce qui permettra de limiter encore davantage le nombre d’animaux. Au total, 1824 souris seront utilisées dans ce projet.

Raffinement

La majorité des expériences nécessiteront des procédures peu traumatisantes (injections sous-cutanées ou intra-péritonéales, traitements par voie orale). La bonne tolérance des formulations vaccinales a été préalablement démontrée dans notre laboratoire. Chez les animaux porteurs de tumeurs sous-cutanées, la croissance tumorale est mesurée 3 fois par semaine à l’aide d’un pied à coulisse, ce qui constitue une procédure non invasive, non douloureuse et peu perturbante pour l’animal. En ce qui concerne les animaux porteurs de tumeur intracrânienne, l’implantation sera réalisée sous anesthésie locale et générale et après analgésie locale. Afin de prévenir la douleur post-chirurgicale, un traitement analgésique pendant 3 jours après l’implantation sera également administré. Tous les animaux de toutes les procédures font l’objet d’une surveillance quotidienne afin de déceler précocement des signes de souffrance et d’y mettre un terme par une mise à mort anticipée si nécessaire, selon les points limite.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l'étude du développement tumoral et de la réponse immunitaire. Le système immunitaire des souris est bien caractérisé et de nombreux outils pour l’analyse de la réponse immunitaire aux immunothérapies sont disponibles. Les animaux seront âgés de 5 à 7 semaines en début d’expérimentation, ce qui permet d’utiliser des animaux jeunes adultes dotés d’un système immunitaire mature.

80 souris femelles au système immunitaire en partie défaillant reçoivent chacune deux greffes de tumeurs humaines, une par flanc, précisément pour qu'il en faille moins. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et seront toutes tuées, pour prélever les deux tumeurs et le maximum de sang. Le protocole prévoit la greffe sous anesthésie, dix jours consécutifs d'injections dans l'abdomen, des pesées et des mesures de tumeur au pied à coulisse. Le porteur annonce que ces travaux valideront le potentiel de certains gènes comme cibles thérapeutiques, la perspective de nouvelles thérapies contre le cancer colorectal restant renvoyée à une étape ultérieure.

Objectifs

Dans ce projet nous souhaitons étudier les mécanismes responsables de l'apparition du Cancer, et notamment du cancer colorectal. Le but est d’observer dans un modèle de greffe tumorale si la perte d’expression des gènes étudiés induit une diminution de la croissance tumorale. Cela mettrait en évidence ces molécules comme de futures cibles pour traiter le cancer.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à montrer l’impact de la perte d’expression de gènes sur la croissance tumorale. Cela permettra de valider alors le potentiel comme cible thérapeutique de ces gènes, le but étant de proposer ensuite de nouvelles thérapies curatives contre le cancer colorectal.

Procédures

Greffes de cellules tumorales d'origine humaine, durée de l'anesthésie au réveil environ 5 minutes. Une seule fois durant le protocole. Traitement par voie intra-péritonéale, tous les jours pendant 10 jours consécutifs. 30 secondes par traitement chaque jour. Les souris seront pesées régulièrement, nécessitant le transfert de la souris sur la balance et le retour dans la cage (15 secondes par souris). Les tumeurs seront mesurées régulièrement à l'aide d'un pied à coulisse électronique. Cela va nécessiter le maintien de la souris afin d'effectuer les mesures (environ 30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir un stress modéré lors de la manipulation (pesée hebdomadaire, observation) et lors de l’initiation de l’anesthésie gazeuse. Les animaux pourront ressentir de la douleur lors de la greffe de cellules tumorales humaines ainsi que lors des injections en intra-péritonéale. Risque de plaie ou d’infection au point d’injection.

Devenir

A l'issu de la procédure tous les animaux seront mis à mort car nous souhaitons (1) prélever les deux tumeurs et (2) prélever un maximum de sang afin de pouvoir obtenir un maximum de sérum (pour pouvoir réaliser des dosages si besoin sur de nombreux marqueurs sériques).

Remplacement

Notre équipe développe un axe de recherche afin de mettre en évidence des cibles potentielles pour lutter contre le Cancer. Nous possédons une forte expertise dans les méthodes de criblages cellulaires et l’analyse des bases de données afin d’identifier les gènes impliqués. Nous possédons également une forte connaissance des outils de modification cellulaire et de validation in vitro. Toutefois, une fois la validation réalisée sur des méthodes in vitro nous devons alors vérifier nos hypothèses. Dans ce projet nous voulons étudier l'impact de la perte d'expression de protéines impliquées dans la régulation de gènes sur la croissance tumorale en lien avec l'induction de la sénescence cellulaire. Nous ne pouvons donc pas nous passer pour cette phase de notre recherche de modèles complexes comme les modèles murins.

Réduction

Pour ce protocole nous souhaitons réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés. Pour cela nous grefferons deux tumeurs par souris. Des résultats préliminaires nous ont permis de connaitre le pourcentage de prises tumorales dans les conditions que nous souhaitons utiliser. Le volume des tumeurs étant petits nous ne pouvons utiliser qu'une tumeur par technique. C'est cela qui a donc conditionné le nombre de souris que nous devons utliser, soit vingt souris par groupe. Nous utiliserons également uniquement des souris femelles.

Raffinement

Dès leur arrivée dans l’animalerie, à l’âge de 6 semaines, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation aux expérimentateurs de 7 jours. Les animaux seront pesés une fois par semaine, et observés à la fois par le personnel animalier (une fois par semaine lors du change) et les expérimentateurs (une à deux fois par semaine, hors geste expérimental) dans le cadre du suivi de l’état général des souris. Une liste précise permettant de scorer les signes éventuels de souffrance sera alors utilisée afin d’évaluer si les animaux présentent des signes de souffrance ou d’atteinte d’un point limite qui entrainerait leur mise à mort. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements comme du coton de nidation, des batonnets de bois et éventuellement des tunnels.

Choix des espèces

Nous utiliserons le modèle murin car c'est un modèle classiquement utilisé dans les études de cancérologie, de par son homologie avec le génôme humain. De façon plus spécifique ici les souris possèdent un système immunitaire en partie défaillant. Cela facilite alors la prise de greffes de cellules tumorales d'origine humaine. Les animaux seront utilisés à un stade jeune adulte avec une arrivée à l'animalerie à 6 semaines et une greffe de cellules à 7 semaines. A ce stade de développment la prise tumorale est optimale. Avec des souris plus âgées le pourcentage de prise tumorale serait moindre.

Mesurer la puissance paralysante de formulations de toxine botulique, destinées au traitement de la spasticité comme à des usages cosmétiques, occupe ici 4 650 souris et 1 550 rats. Tous vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tous seront tués, par prélèvement intracardiaque, le dernier jour. La toxine est injectée dans le muscle du mollet sous anesthésie, ce qui provoque une paralysie plus ou moins marquée des membres postérieurs, une perte de poids et des difficultés à atteindre la mangeoire, puis chaque animal passe dix à trente tests d'écartement des orteils sur cinq à vingt-cinq jours. Le porteur indique que des cultures de neurones humains ont été proposées comme alternative sans être validées par la communauté scientifique ni par les autorités, et conclut que l'étude ne peut se faire que sur animaux vivants.

Objectifs

Les neurotoxines botuliques (BoNTs) sont utilisées depuis près d’un demi-siècle dans le traitement des troubles liés à une contractilité musculaire excessive. Elles sont classiquement utilisées dans le soulagement des troubles du mouvement tels que la dystonie et la spasticité, ainsi que pour des fins cosmétiques. En plus les formulations dérivées de BoNTs bénéficient à un éventail beaucoup plus large de patients souffrant de vessie hyperactive, de dysfonction érectile, d’arthropathie, de douleurs neuropathiques et de cancer. La recherche de nouvelle formulation de BoNTs est très active en ce moment et il est nécessaire de mettre au point de test in vivo rapides mais précis, pour évaluer l’efficacité de différents types de BoNTs, autant naturels que recombinants. L’objectif de cette étude est de réaliser une évaluation in vivo de l’efficacité de molécules thérapeutiques à base de neurotoxine botulique nouvellement développées ; le protocole expérimental consiste à exécuter le test du score d’abduction des orteils (DAS) chez le rongeur. La puissance d’une préparation de neurotoxine botulique (BoNT) donnée peut être évaluée régulièrement en utilisant le test DAS, qui mesure la réduction de la force musculaire des doigts de la patte après injection de BoNT dans le muscle squelettique de la patte arrière chez les rongeurs. Il est bien connu en littérature que les rats ont des sensibilités différentes aux différentes types de toxines botuliques par rapport à la souris. Selon le type de toxine étudié, il sera donc nécessaire d’utiliser l’espèce animale la plus sensible entre le rat et la souris.

Bénéfices attendus

Les neurotoxines botuliques (BoNTs) sont utilisées dans le traitement des troubles liés à une contractilité musculaire excessive. Ils sont classiquement utilisés dans le soulagement des troubles du mouvement tels que la dystonie et la spasticité, ainsi que pour des fins cosmétiques. En plus les formulations dérivées de BoNTs bénéficient à un éventail beaucoup plus large de patients souffrant de vessie hyperactive, de dysfonction érectile, d’arthropathie, de douleurs neuropathiques et de cancer. La recherche de nouvelle formulation de BoNTs est très active en ce moment et il est nécessaire de mettre au point de test in vivo rapides mais précis, pour évaluer l’efficacité de différents types de BoNTs. Nos études vont participer à la recherche et la mise en place de ces nouvelles formulations de toxine botulique et aider dans le futur les patients atteint de ces troubles.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs test DAS (test du score d’abduction des orteils) entre 10 à 30 tests, sur une durée de 5 à 25 jours. La durée d'un test DAS est de 3 minutes. Les animaux seront soumis également à une seule injection en intra-musculaire de toxine botulique sous anesthésie. La durée de cette intervention est de 10 minutes. Et pour finir les animaux seront soumis à un seul prélèvement en intra-cardiaque, le dernier jour d'expérimentation. La durée de cette intervention est de 15 minutes.

Impact sur les animaux

À la suite de l'injection dans le muscle gastrocnémien, avec la toxine botulique, les animaux vont développer une paralysie des membres inférieures plus ou moins élevées ; les animaux risquent également de présenter une perte de poids, des poils piqués, la présence d'un excédent de porphyrine. Une difficulté à atteindre la mangeoire risque d'être présent, mais pour permettre à l'animal de se nourrir et de boire, une alimentation spécifique sera mise en place.

Devenir

Etant donné la réalisation d'un prélèvement de sang et des muscles, les animaux seront tous mis à mort à la fin de l'intracardiaque.

Remplacement

A ce jour, à cause de la complexité de la structure protéique de la toxine botulique, il n’y a pas de test in silico validés pour effectuer un criblage des effets paralysant des différentes toxines botuliques et de ses dérivés. Afin de tester un grand nombre de dérivés de la toxine botulique, des modèles in vitro alternatif à l’expérimentation animale ont été proposé par le passé, en utilisant des cultures cellulaires de neurones humains. Toutefois ces modèles in vitro ne sont pas encore validés par la communauté scientifique ni par les autorités régulatoires, car ne sont pas capables de prédire exactement les effets des toxines botulique chez l’homme ou l’animal, donc l’étude ne peux se faire que sur animaux vivants.

Réduction

Le nombre d'animaux pour chaque groupe expérimental sera de 6 à 10 animaux, étant donné la variabilité interindividuelle que nous pourrions rencontrer. Le nombre de groupes est déterminé en fonction du nombre des doses à tester pour chaque molécule. Le nombre d'animaux est réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisamment robustes et permettant une analyse statistique appropriée. Du point de vue statistique, les groupes expérimentaux (entre 5 à 31 groupes expérimentaux, nombre d'animaux par groupes égal à 6 à 10) seront comparés entre eux en utilisant des tests statistiques appropriés. Pour déterminer le chiffre exact d’animaux par groupe, cela dépendra des premiers résultats des premiers animaux, le chiffre 10 ne sera pas dépassé. Nous utiliserons les tests statistiques les plus appropriés afin d'analyser nos données.

Raffinement

Tous les efforts seront mis en place afin de minimiser la douleur, l'angoisse et la souffrance animale. Les cages sont de type IVC (cage individuelles ventilée pouvant contenir plusieurs animaux par cage) en surpression et sont rangées sur portoirs ventilés. Les animaux seront hébergés 5 ou 6 par cage pour les souris et 2 ou 3 par cage pour les rats, en fonction de leur poids corporel et ainsi permettre aux animaux de pouvoir interagir et entretenir des liens sociaux avec leurs congénères, tout en gardant un espace suffisant. Des morceaux de coton, des igloos, des tunnels et des bâtonnets en bois seront intégrés dans les cages d'hébergement. Après les intra-musculaires, quelques croquettes d'aliment seront placées dans le fond de la cage et de la pâté humide sera également donnée, au cas où les animaux n'arrivent plus à s'alimenter et la taille des tétines des biberons seront ajustées en conséquence. Des tapis chauffants seront utilisés pendant la durée des anesthésies et les réveils des animaux. Les responsables de l'application des procédures, de la manipulation et du bien-être des animaux, sont une technicienne en recherche et développement et un ingénieur, tous deux expérimentés et formés pour reconnaitre tout signes éventuels de stress, douleurs et inconfort. Ils observeront les animaux tous les jours (du lundi au dimanche), pour déceler les mauvais signes cliniques et remplirons quotidiennement une fiche de suivi par animal. La zootechnicienne, en charge de la surveillance et du change des animaux, observeras également les animaux une fois par jour (du lundi au vendredi) et s'assurera que tous les animaux disposent assez d'aliment et d'eau de boisson.

Choix des espèces

Les rongeurs sont utilisés très fréquemment en recherche préclinique pour les études utilisant de la toxine BONT/A, dans le cadre d’amélioration de la contractibilité musculaire. Les paramètres physiologiques et pathologiques liés aux problèmes de contractilité musculaire sont très bien caractérisés chez les rongeurs, ce qui facilite la comparaison des résultats entre différents laboratoires. Les rats et les souris seront utilisés, car ces espèces sont largement utilisées pour ce type d’étude (nombreuses références bibliographiques). D’autres modèles expérimentaux, notamment, le chien, le chat et les primates, posent de nombreux problèmes éthiques et d’infrastructures d’hébergement. Adultes, entre 6 et 12 semaines ; car les adultes possèdent des membres inférieurs plus gros et cela permet une meilleure visualisation de la patte et donc le résultat du DAS est plus optimal. Les animaux adultes sont aussi plus résistants face à la perte de poids et aux différents signes cliniques.

Un rat qui cumule hypothermie, prostration et plus de 20 % de perte de poids sur plusieurs jours est tué. 600 rats Sprague-Dawley vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour récupérer tissus et sang. Rendus obèses et diabétiques par un régime hypercalorique servi de la sixième à la trente-deuxième semaine de vie, ils reçoivent des composés une à deux fois par jour, subissent cinq prises de sang précédées chacune de six heures de jeûne, l'implantation d'un cathéter dans la veine fémorale, puis une perfusion continue de 210 minutes appelée clamp. La société qui porte le projet dispose déjà d'une plateforme in vitro pour ce type d'étude, mais affirme que ces modèles ne sont pas un miroir assez fiable de la complexité de l'organisme.

Objectifs

Le diabète a touché 8,5% de personnes de plus de 18 ans dans le monde. 90% des personnes diabétiques sont atteintes de diabète de type 2, forme de diabète associé à l’obésité. Le nombre de personnes diabétiques ne cesse d’augmenter. Le diabète a des conséquences dramatiques sur le fonctionnement de certains organes comme le foie, le système nerveux, les reins ou le cœur et certaines de ces conséquences sont mortelles. Le diabète de type 2 se caractérise par deux phases, la phase de résistance à l’insuline où les niveaux plasmatiques d’insuline sont très élevés pour essayer de contrer l’hyperglycémie puis au fur et à mesure les cellules sécrétant l’insuline se fatiguent, ne sont plus capables de répondre et meurent. On parle alors de phase de dépendance à l’insuline. Plus le diabète de type 2 est traité précocement, moins les conséquences sont dramatiques. Ainsi, il est important de développer des thérapies qui ciblent la phase de résistance à l’insuline. Pour se faire, les animaux rendus obèses par l’ingestion d’un régime gras sur plusieurs semaines constituent le meilleur modèle préclinique pour valider ces thérapies. En effet, l’ingestion d’un régime gras chez la souris ou le rat se traduit par la mise en place d’une résistance à l’insuline. La résistance à l’insuline peut être évaluée de différentes manières : en réalisant des tests de tolérance à l’insuline et au glucose mais la technique la plus précise reste la technique dite "clamp" car elle permet la mesure de la sensibilité à l’insuline au niveau des différents organes et de façon bien précise, en utilisant de la radioactivité. Ainsi, au cours de ce projet, des rats seront rendus obèses puis traités ou non par des molécules et leur résistance à l’insuline sera évaluée par des tests de tolérance puis un "clamp".

Bénéfices attendus

Par cette étude, de nouveaux traitements ciblant la résistance à l’insuline et donc les phases précoces du diabète peuvent être trouvés. Ceci permettra d’éviter les complications induites lors des phases avancées du diabète et d’augmenter les taux de survie des patients.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques chez le rat, un régime hypercalorique sera mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 6 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 32 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles : orale, sous-cutanée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Cinq prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (avant traitement et 2, 4, 6 et 8 semaines après traitement) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang se fait sur animal vigile et libre de ses mouvements, il est préalablement habitué à ce geste. La prise de sang dure environ 2 minutes par animal, et nécessite que l'animal ait un jeun de 6h. Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline pourront être effectués après 6 semaines de traitement, ces tests durent 120 minutes. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. L’implantation d’un cathéter à demeure dans la veine fémorale : la chirurgie est faite sous anesthésie et analgésie, par du personnel formé et l’état des animaux est surveillé de près. Une manipulation de 210 minutes appelée « clamp » est réalisée après 8 semaines de traitement. Pendant toute la durée du clamp, l’animal est à jeun, il est connecté à une perfusion et reçoit de l’insuline et du glucose par voie veineuse de façon continue.

Impact sur les animaux

1 – Un régime hypercalorique sera mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 6 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 32 semaines), cela va induire une obésité et un diabète de type 2. Les animaux se déplacent un peu moins mais ils gardent un bon état général. 2 – Les traitements : le geste de traitement réalisé à répétition génère un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé. 3 - Pour mesurer les consommations alimentaire et hydrique, les animaux seront hébergés en cage individuelle pendant la durée du traitement, cela est impactant pour les rats qui ont un caractère grégaire. 4 – Les mises à jeun (6h) lors des prélèvements de sang peuvent être une source de stress, notamment pour des animaux diabétiques. 5 –La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. 6 – La chirurgie (implantation du cathéter fémoral) est faite sous anesthésie et analgésie, par du personnel formé et l’état des animaux est surveillé de près. L’anesthésie et la cicatrisation sont plus difficiles chez un animal diabétique. 7 – Clamp : Pendant toute la durée du clamp, l’animal est à jeun, il est connecté à une perfusion et reçoit de l’insuline et du glucose par voie veineuse de façon continue. Cette manipulation terminale peut être source de stress. 8- Nous mesurerons de nombreuses fois la glycémie par microprélèvement en bout de queue, l'extrémité de la queue sera désinfecté à la vétédine en fin de manipulation. Cependant, du fait du diabète, certains animaux peuvent avoir des complications (queue hypersensible, infection).

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (comptage des radioéléments, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...).

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screening, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. D’ailleurs, la société possède aujourd’hui une plateforme in vitro pour y répondre. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Toutes les étapes de la procédure seront réalisées sur le même animal. Des étapes de screening sont réalisées afin d’obtenir des groupes homogènes et les animaux ayant les meilleurs critères permettant d’avoir des données fiables et exploitables en fin d’étude et d’éviter de répéter plusieurs fois la dite étude. Nous effectuerons des tests statistiques, le nombre de données par groupe nécessaire pour être statistiquement robuste et donc pouvoir conclure sur l’effet d’un traitement est de 10 en fin de clamp.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rats de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Le bout de la queue des rats sera observé de près car le diabète peut induire des complications au niveau de la cicatrisation. De la vétédine sera appliquée après chaque fin de manipulation. Après la chirurgie, des changements significatifs dans le comportement des rats peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une absence de comportement de toilettage ou à l’inverse un léchage excessif de la zone opérée ou une sécrétion de porphyrine au niveau du nez et des yeux, entraineront un examen clinique poussé par le personnel qui a réalisé la procédure chirurgicale et la SBEA. Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre plusieurs des points limites suivants sur plusieurs jours : hypothermie, prostration, perte de poids >20%, ce dernier serait euthanasié. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de soluté de réhydratation est envisagée (5 ou 10mL/kg). En cas d’hypothermie, l’animal peut être placé en armoire chauffante. Les prélèvements de sang effectués en cours d’étude se feront en respectant les volumes préconisés par les règles éthiques. Des mises au point de chirurgie "double cathétérisation" permettant d'éviter les multiples mesures de glycémie à la queue sont en cours de discussions.

Choix des espèces

L’espèce choisie est le rat Sprague-Dawley : Sans régime gras, cette souche de rat possède un poids corporel important et est plus à même à développer une obésité marquée lorsqu’elle est placée sous régime gras. Le rat est une espèce adaptée pour l’étude de la résistance à l’insuline par clamp puisque les données obtenues sont assez homogènes. La chirurgie pour la mise en place du cathéter impacte très peu l'obésité et la résistance à l'insuline. Les animaux sont mis sous régime à partir de 6 ou 8 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.

Trente minutes de nage forcée dans une piscine réparties sur deux jours, puis treize jours d'un test d'apprentissage : 45 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. Elles subissent quatre tests de mémoire étalés sur six semaines, mémoire spatiale, reconnaissance d'objets, olfaction et apprentissage d'une tâche, le porteur indiquant que la nage peut provoquer une légère hypothermie. L'objet déclaré est de savoir si la perte d'un gène dans les cellules immunitaires du cerveau modifie la mémoire, dans le cadre d'une forme de sclérose latérale amyotrophique associée à une démence. Le choix de la souris tient à l'existence de tests comportementaux déjà établis chez elle, et l'effectif de 45 est présenté comme le minimum fixé par des consignes internationales de la discipline.

Objectifs

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative qui touche 7000 adultes en France, caractérisée par une atteinte des motoneurones (cellule nerveuse spécialisée dans la commande des mouvements) et résultant par la paralysie et le décès des patients 2 à 5 ans après le diagnostic. Tandis que la plupart des cas de SLA ont une cause non-identifiée, certaines formes sont familiales. Certains cas de SLA peuvent aussi être associés à une Démence Fronto-Temporale (DFT), on appelle ce syndrome SLA-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale). Les formes génétiques de SLA (et SLA-DFT) sont cruciales pour la recherche car elles permettent de modéliser la maladie. Récemment, des mutations dans un nouveau gène ont été identifiées comme étant impliquées dans la SLA-DFT. Nous étudions le rôle de ce gène dans différents types de cellules du cerveau. Le but est de savoir si la déficience de ce gène peut changer le comportement des souris, en termes de défaut de mémoire, ce qui est lié aux symptômes de la DFT dans le syndrome SLA-DFT.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait nous permettre de mieux comprendre le rôle de notre gène d'intérêt, dans différents types de cellules du cerveau. Ceci est cliniquement important car des mutations dans ce gène peuvent causer la sclérose latérale amyotrophique (SLA) avec en plus des symptômes de Démence Fronto-Temporale (DFT) - donc, SLA-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale). Si nous montrons que la perte de ce gène dans différents types de cellules du cerveau peut induire des anomalies du comportement, cela aiderait à expliquer pourquoi et comment des mutations dans ce gène peuvent causer la SLA-DFT et donc à identifier de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront transportés de l’établissement d’élevage à l’établissement utilisateur à l’âge de 2 mois. Dans l’EU les souris réaliseront 4 tests de comportement répartis sur 6 semaines, à partir de l’âge de 4 mois. Ces tests permettent de tester la mémoire des souris Le premier test permet d’évaluer la mémoire spatiale des souris et nécessite 30 minutes par souris répartis sur 2 jours. Le second test permet d’évaluer la capacité à reconnaitre et mémoriser des objets et dure 10 minutes par jour pendant 4 jours. Il est suivi par un test d’olfaction qui dure 20 minutes sur une journée. Le dernier test permet d’évaluer l’apprentissage d’une tâche, puis la mémoire spatiale, et dure 30 minutes réparties sur 13 jours (soit 1 habituation d’1min + 4 répétitions de 1 minute par jour pendant 7 jours + 2x 1 minute dernier jour). Les tests seront espacés d’au moins 4 jours pour éviter de stresser les animaux. Ces 4 tests de comportement ne produisent pas de douleurs et sont réalisés sur des animaux vigiles, libres de leurs mouvements. Ces tests permettent d’évaluer différentes formes de mémoire des souris. A la fin de la procédure, toutes les souris sont euthanasiées par une méthode règlementaire, et les tissus d’intérêts sont prélevés après vérification de la mort des animaux.

Impact sur les animaux

Les tests de comportement peuvent induire un stress et angoisse chez l'animal. L’un des tests consistera à faire nager les animaux dans une piscine ce qui pourrait induire une légère hypothermie.

Devenir

A la fin de la procédure, toutes les souris sont euthanasiées pour prélever des tissus d’intérêts.

Remplacement

Avant de réaliser les expériences in vivo que nous proposons dans ce projet, nous avons mené des études in vitro, pour tester si notre hypothèse est solide. Nous avons utilisé des cultures primaires de cellules immunitaires du cerveau (microgliales) avec une délétion du gène d’intérêt, pour tester si les fonctions normales des cellules microgliales sont défectueuses (réaction en réponse à une molécule stimulante). Nos résultats étant prometteurs, nous nous sommes demandé si cela pourrait entrainer un phénotype comportemental subtile in vivo. Même si on peut modéliser certaines interactions pathologiques entre cellules microgliales et cellules neuronales in vitro, déterminer un effet sur le comportement est seulement possible chez l’animal.

Réduction

Pour les tests de comportement, nous avons besoin de 15 souris par génotype avec 3 génotypes étudiés soit 45 souris au total. Il s’agit du nombre minimal de souris nécessaire pour évaluer un modificateur génétique sur le comportement - défini par des consignes internationales de la communauté de la recherche contre la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) et la SLA avec en plus des symptômes de Démence Fronto-Temporale (DFT), donc, ALS-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale). Comme les quatre différents tests de comportement ne produisent qu'un stress mineur sur les souris, nous utiliserons les mêmes souris pour ces 4 tests, avec au moins 4 jours de repos entre chaque test, pour en utiliser le moins d'animaux possible

Raffinement

Les souris seront transférées de l’EU d’élevage à l’EU d’expérimentation. Elles seront mises dans une boite de transport adaptée, entre congénères (1boite par cage). Le transfert sera rapide (moins de 1h), car les deux EU sont géographiquement très proches. Les conditions d’hébergement sont agréées. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et un enrichissement correspondant à leurs besoins. Pour la stimulation environnementale, nous utilisons du coton, permettant de faire des nids dans chaque cage, et des bâtonnets à ronger. Les animaux seront hébergés entre fratrie autant que possible, mais pourraient être séparés en cas de bagarre. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Avant la réalisation des tests comportementaux, une habituation à l’expérimentateur sera réalisée par manipulation des animaux pendant une semaine tous les jours. De plus, avant chaque session de test il y aura une habituation à la pièce pour les animaux en déposant les cages dans la salle d’expérimentation 30min à 1heure avant le début de l’expérimentation. Une surveillance particulière des animaux testés sera faite durant les tests comportementaux. Nous respecterons une période de repos au moins 4 jours entre chaque type de test comportemental et nous réaliserons les tests du moins au plus stressant. Pour le test nécessitant de faire nager les animaux, à la sortie de l’eau ils seront séchés à l’aide d’un torchon avant d’être replacés dans leur cage d’hébergement.

Choix des espèces

Il existe différents modèles animaux utiles pour étudier la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), et la SLA avec en plus des symptômes de Démence Fronto-Temporale (DFT), donc SLA-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale): souris, rats, poissons, mouches, vers. Cependant, nos questions concernent les interactions entre neurones et cellules immunitaires dans un système nerveux central de mammifère. Par conséquent, nous avons besoin d’un système complexe pour répondre à nos questions. Les tests comportementaux que nous voulons utiliser sont bien établis chez la souris. Il existe également de solides données dans la littérature qui ont montré que la microglie (cellules immunitaires du cerveau) peut influencer le comportement chez la souris. Les souris sont utilisées à l'âge jeune (à 4 mois).

Des souriceaux de vingt et un jours sont gavés d'antibiotiques trois jours de suite, mis à jeun six heures, gavés de glucose, incisés à la queue puis saignés huit fois. 100 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 40 nourries cinq semaines d'un régime pauvre en protéines. Chacune est aussi anesthésiée chaque semaine, cinq semaines durant, pour que sa taille soit mesurée. Le porteur répète que le régime "n'induit pas de sensation de faim ni de phénotype délétère" et que les antibiotiques "ne devraient pas avoir d'effet sur le bien-être", pour un protocole qu'il classe lui-même en souffrance modérée.

Objectifs

La malnutrition infantile est un problème majeur à travers le monde. Des études ont montré que le microbiote (ensemble des micro organismes vivant dans un environnement spécifique chez un hôte) des individus mal nourris était sévèrement impacté. Il est également observé une différence de réponse au régime pauvre en protéines en fonction du sexe, avec des bactéries n’apparaissant que chez les femelles. De plus, ces variations étaient reliées à des variations du métabolisme e chez les souris, ainsi qu’une variation de l’apparition de la puberté. Cela incite donc à explorer de façon détaillée l’effet du microbiote sur le métabolisme et la maturation sexuelle afin de déterminer si celui-ci peut expliquer les différences observées entre les sexes. En utilisant un modèle murin de malnutrition protéique, permettant d’étudier la communication inter-organes, l'objectif de ce projet est de caractériser finement le métabolisme et la maturation sexuelle de souris subissant une ablation partielle du microbiote intestinal par un traitement antibiotique

Bénéfices attendus

Les altérations métaboliques induites pas la malnutrition dans un contexte juvénile sont encore mal connues, de même que le rôle précis du microbiote intestinal dans les altérations physiologiques associées. Ce projet permettra d’identifier les modifications précises qui s’opèrent lors d’un régime métaboliquement délétère et d’évaluer le rôle potentiel du microbiote intestinal, qui sera déplété par un traitement antibiotique. Nous pourrons ainsi identifier au cours du projet de futures cibles thérapeutiques permettant d’optimiser à long terme la prise en charge des enfants souffrant de malnutrition au travers d’un traitement adapté basé sur la nutrition et le microbiote.

Procédures

40 souris seront soumises à un régime nutritionnel pauvre en protéines pendant 5 semaines au maximum. Ce régime n’induit pas de sensation de faim (isocalorique d’un régime contrôle) ni de phénotype délétère. 100 souris auront leur taille mesurée toutes les semaines, pendant 5 semaines, sous anesthésie générale. 100 souris seront pesées chaque semaine, pendant 5 semaines, ce qui prend moins d’une minute. 50 souris seront gavées avec de l’eau (souris contrôles) à P21, P22 et P23, suite à une contention. Ce geste dure environ 10 secondes. 50 souris seront gavées avec un cocktail antibiotique à P21, P22 et P23, suite à une contention. Ce geste dure environ 10 secondes. Les antibiotiques ne devraient pas avoir d’effet sur le bien-être des souris. 50 souris auront des antibiotiques de façon continue dans l’eau de boisson, de P24 à P56. Les antibiotiques ne devraient pas avoir d’effet sur le bien-être des souris. 80 souris seront mises à jeun pendant 6 heures. 80 souris seront gavées avec du glucose après les 6 heures de jeûne, suite à une contention. Ce geste dure environ 10 secondes. 80 souris auront une incision sous anesthésie locale à la queue. Ce geste dure environ 1 seconde. 80 souris subiront 7 prélèvements à la queue d’environ 3 µL de sang. Ce geste dure environ 5 secondes. 80 souris subiront un prélèvement additionnel à la queue d’environ 20 µL par prélèvement pour mesurer l’insulinémie. Ce geste dure environ une minute.

Impact sur les animaux

Ce projet ne devrait entraîner que des nuisances modérées sur les animaux. Le gavage des animaux ne devrait entraîner qu’un léger stress lié à la contention et un inconfort mineur lors du gavage. Le marquage des animaux à la patte et la mesure de la taille des animaux de (du jour 21 post natal au jour 56) n’induiront qu’un léger stress lors de l’induction de l’anesthésie. Les pesées et la caractérisation de la maturation sexuelle induiront un léger stress associé à la contention de l’animal. Le traitement antibiotique dans l’eau de boisson a été utilisé dans la littérature et n’engendre ni perte de poids ou d’appétit, ni diarrhées. Le jeûne de 6 heures induit un stress léger sur la souris. Le test de tolérance au glucose induira un stress modéré lié à la contention et au gavage des souris, puis à l’incision d’un bout de queue d’environ 1 mm et au prélèvement de gouttes de sang au niveau de la queue

Devenir

L'ensemble des animaux mis en procédure seront mis à mort en vue du prélèvement des organes d'intérêt.

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires et d’une bactérie probiotique, ce qui nécessite une étude chez l’animal. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d'un organisme dans son entier dans un contexte de malnutrition et pour l'étude des fonctions métaboliques liées à la communication entre plusieurs organes. C'est pourquoi cette étude nécessite l'expérimentation animale. La souris sera utilisée car il s'agit d'un bon modèle pour étudier les modifications induites par une malnutrition protéique sur le métabolisme dans un contexte physiologique, ainsi que les conséquences locales et systémiques de ces modifications.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus, tout en contournant le problème de la variabilité inter-individuelle des paramètres étudiés. Chaque groupe expérimental contient 10 animaux. Des tests statistiques appropriés seront utilisés. Dans une optique de réduction, nous allons prélever en fin de procédure l’ensemble des organes qui pourraient nous intéresser (muscle, tissu adipeux par exemple) mais sur lesquels nous n’avons pas prévu de travailler pour le moment et les conserver au congélateur pour d’éventuelles analyses ultérieures. Notre protocole expérimental utilisera des souris issues d’une reproduction chez un fournisseur agréé. Le choix d’utiliser des souris issues d’un fournisseur nous permettra de mieux contrôler certains paramètres liés à l’âge et à la croissance juvénile afin d’assurer une analyse pertinente et un résultat statistiquement significatif. Les mères pourront être réutilisées pour d’autres procédures.

Raffinement

La croissance en taille et en poids sera mesurée individuellement chaque semaine grâce à une anesthésie légère. La prise alimentaire sera également mesurée pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement, et la nourriture sera mise directement dans la litière au début de la procédure expérimentale afin de faciliter l’accès aux souriceaux qui viendront d’être sevrés. Des points limites suffisamment prédictifs seront établis pour anticiper tout stress et toute souffrance animale. L’atteinte des points limites entraînerait alors la mise à mort des individus concernés. Le protocole du régime expérimental, ainsi que le prélèvement en veine porte avant mise à mort ont déjà été employés au laboratoire et ne devraient pas apporter de souffrance animale. Le prélèvement terminal est réalisé sous anesthésie générale, avec une analgésie appropriée. Le traitement antibiotique a été décrit dans la littérature et n’entraîne pas de modification du bien-être animal.

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin de comparer l'effet d'un antibiotique dans une étude nutritionnelle. L'objectif du projet est d'étudier les effets d’une déplétion du microbiote sur le métabolisme et la puberté pendant la période juvénile. Pour cela, les animaux doivent être inclus dans la procédure dès le sevrage, qui est une période clé pour la croissance, la maturation sexuelle et la maturation métabolique.

Toutes tuées à l'issue de chaque procédure pour prélèvement d'organes, 3 900 souris vont être utilisées dans des travaux menés en prestation pour des laboratoires privés et publics, avec un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent du tamoxifène par gavage ou injection cinq à dix jours de suite, ou dans leur nourriture pendant un mois, puis un second composé dans l'eau de boisson qui leur provoque une inflammation aiguë de l'intestin, avec perte de poids et diarrhées. Le nombre, la durée et la voie d'administration des composés immunothérapeutiques sont fixés par le partenaire commercial. Ni analgésique ni anti-inflammatoire ne leur seront administrés, le porteur écrivant que cela biaiserait la réponse observée, et il justifie le recours aux souris par une évaluation à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

Les différents laboratoires privés et publics pour lesquels nous réalisons des prestations cherchent à connaitre la fonction de gènes d’intérêts sur le système immunitaire en condition normale ou lors d’une inflammation intestinale et dans certain cas tester des traitements pour voir l’impact de ceux-ci sur le système immunitaire en condition normale ou lors d’une inflammation intestinale lorsque la fonction d’un gène est modifiée. En utilisant un système moléculaire inductible à un traitement appelé tamoxifène, nous pouvons réguler l’expression de gènes d’intérêt en les supprimant, ou en les augmentant (surexpression). En effet, ce système permet de contrôler l’expression de gènes dans le temps et l’espace ouvrant ainsi de nouvelles possibilités pour l’étude de la fonction des gènes. Ainsi, nous traiterons avec du tamoxifène des souris génétiquement modifiées pour lesquelles le gène d’intérêt est modulable et nous évaluerons l’effet de sa suppression ou surexpression sur le système immunitaire à l’état basal. Nous évaluerons aussi l’effet de la modulation de ce gène en condition pathologique où nous induirons une inflammation intestinale. Enfin nous évaluerons également l’impact d’un traitement sur le système immunitaire lorsqu’un gène est supprimé ou surexprimé en condition normale ou lors d’une inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Ce projet est mis en œuvre dans le cadre général de la validation de modèles animaux génétiquement modifiés pour des études précliniques in vivo. Il vise donc à évaluer de façon qualitative et quantitative l’impact de la régulation de gène d’intérêt par induction au tamoxifène et/ou l’impact d’un traitement immunothérapeutique en présence ou non d’une inflammation aigüe de l’intestin.

Procédures

La procédure expérimentale consiste en l’induction d’un gène cible, par administration d’un premier composé chimique, afin d’évaluer sa fonction sur le système immunitaire de la souris, dans les conditions ou non d’une inflammation aigüe de l’intestin qui sera elle induite par l’administration d’un second composé chimique 1) L’administration du 1er composé peut se faire de différentes manières en fonction du type de gène à moduler, du type cellulaire et/ou tissulaire ciblé et de la demande du partenaire et sur 5 jours minimum (sans jamais excéder 10 jours) par injection et gavage ou sur 1 mois maximum dans l’alimentation : -Par injection : sur souris vigile, la souris sera pesée puis une contention sera réalisée afin de réaliser l’injection (30 secondes par souris). Ou -Par gavage : sur souris vigile, la souris sera pesée puis une contention sera réalisée afin de pouvoir réaliser le gavage à l’aide d’une aiguille de gavage (30 secondes par souris) . Ou -Par alimentation : Les souris seront soumises à un régime alimentaire avec des croquettes au tamoxifène. 2) Des pesées hebdomadaires : sur souris vigiles (10 secondes par souris). Deux collectes de sang : sur souris vigile, une contention sera réalisée afin de pouvoir réaliser le prélèvement (30 secondes par souris). Dans le cas où nous devrons être dans les conditions d’une inflammation aigüe de l’intestin : 3) Suite à l’induction par le 1er composé, les souris seront traitées avec le second composé (sur une durée de 7 jours consécutifs). Le second composé est préparé dans de l’eau de boisson + des pesées quotidiennes sur souris vigiles (10 secondes par souris). Dans le cas où nous devrons traiter les individus avec un composé immunothérapeutique : 4) Les administrations des composés immunothérapeutiques (le nombre, la durée et la voie d’administration sera défini par le partenaire). Suivant la voie d’administration sélectionnée par le partenaire, celles-ci seront réalisés sur souris vigiles (30 secondes/souris) ou sur souris anesthésiées (anesthésie gazeuse courte : 1minute/souris).

Impact sur les animaux

Prérequis : Les tests de toxicité des composés immunothérapeutiques seront effectués en amont par les partenaires. Les doses injectées n'induiront donc aucun effet indésirable sur les animaux dans le cadre de ce projet. Les animaux seront soumis à plusieurs actes techniques nécessitant une contention pouvant engendrer du stress tel que : 1) Les administrations du composé n°1 soit par gavages oraux ou injections intrapéritonéales sur 5 jours consécutifs minimum (sans jamais excéder 10 jours) ; 2) Des pesées hebdomadaires ; 3) Deux prélèvements de sang (60 à 100μL), Une semaine d’écart entre les prélèvements sera impérativement respectée ; 4) En fonction du projet, un traitement par un second composé dans l’eau de boisson suite à l’administration du 1er composé afin de créer une inflammation aiguë de l’intestin pouvant amener à une perte de poids et des selles molles/diarrhées. 5) Injections de composés immunothérapeutiques par voie sous cutanée, intra péritonéale, intramusculaire, intraveineuse ou gavage.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de procéder au prélèvement des organes et à leur analyse.

Remplacement

Dans ce type de projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous placer dans des conditions physiologiques similaires. En effet, l’étude du système immunitaire et le modèle inflammatoire testé dans le cadre de cette demande doit être évalué à l’échelle de l’organisme entier, permettant ainsi la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de réponse.

Réduction

Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique selon la nature continue ou discontinue de la variable concernée. Le nombre utilisé pour ces expériences est de 6 animaux par génotype et par lot expérimental afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expérience.

Raffinement

Les animaux en expérimentation seront hébergés en zone d’expérimentation, en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu sera enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un nid compact de lanières de papier Kraft. Les lots expérimentaux seront établis avant le début de l’expérimentation et un temps d’acclimatation d’une semaine sera respecté entre la réception des animaux et le début du protocole expérimental. Les souris seront observées quotidiennement par le personnel de zootechnie formé et qualifié et des points limites seront préalablement établis. En ce sens, une grille de score sera utilisée prenant en compte le comportement naturel et provoqué de l’animal, la variation pondérale et la caractérisation. Des points limites seront établis pour chaque observation (valeur maximale de la grille de score) qui entraineront la mise à mort de l’animal s’ils sont atteints. Dans ce projet nous étudions le système immunitaire, toute administration d’analgésique entrainerait un biais de la réponse cellulaire observée. Ainsi, nous ne pouvons pas utiliser d’analgésique. De plus, dans le cas de l’inflammation aigüe de l’intestin, nous étudierons l’impact de la surexpression ou délétion d’un gène dans la modulation d’une inflammation, aucun anti-inflammatoire ne pourra être administré aux souris.

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, la souris est un animal de petite taille, à reproduction rapide et facile d’élevage. De plus, la communauté scientifique dispose de bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Nous utiliserons des souris adultes uniquement, à partir de 8 semaines pour une analyse du système immunitaire mature. L’étude d’un système immunitaire en développement ou vieillissant ne fait pas l’objet de ce projet.