Recherche fondamentale

22 babouins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit quatre anesthésies profondes de deux heures et 21 prélèvements sanguins sous anesthésie légère, avant une mise à mort sous anesthésie profonde pour prélèvement de plusieurs organes. Hébergés en volière avant le protocole, ils passent la durée de l'étude dans des cages séparées, seulement jointives. L'étude sert à caler la dose d'anticorps polyclonaux développés par une société privée avant l'essai de toxicité réglementaire, et le porteur écrit qu'il est "nécessaire" de valider l'innocuité de cette dose, deux animaux par dose suffisant selon lui à trancher.

Objectifs

Notre société développe des anticorps polyclonaux glyco-humanisés dans le domaine de la cancérologie notamment. Trois anticorps polyclonaux glyco-humanisés nouvellement développés dans le domaine de la cancérologie ont démontré leur efficacité dans des modèles murins précliniques. Des études de toxicité réglementaire sont requises chez le primate non humain par les recommandations réglementaires. En préalable à ces études et dans un souci de réduction du nombre d’animaux à inclure, il est nécessaire de valider l’innocuité d’une dose équivalente à la dose thérapeutique visée. Des prélèvements sanguins réguliers seront effectués afin d’effectuer un bilan cardiaque/musculaire, hépatique/pancréatique, inflammatoire. Les animaux seront observés quotidiennement et soumis à une grille d’observation comportementale, afin d’obtenir un bilan cognitif primaire. Les prélèvements sanguins seront aussi utilisés pour déterminer la pharmacocinétique du produit, conformément aux recommandations réglementaires. Cette étude préliminaire permettra de valider la bonne tolérance de la dose présumée, de mettre au jour d’éventuels points d’alerte qui permettront de prévoir une surveillance accrue et plus exhaustive de ces paramètres, et de limiter l’étude de toxicité réglementaire à un simple groupe à cette dose.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider la tolérabilité d’une dose thérapeutique

Procédures

4 anesthésies profondes par animal (2h) avec prélèvements, et 21 prélèvements sanguins sous anesthésie légère (15 min), euthanasie en fin de projet sous anesthésie profonde

Impact sur les animaux

Les anesthésies profondes de 2h ainsi que les prélèvements de sang multiples sous anesthésie légère peuvent occasioner de l'inconfort, de la confusion et du stress pour les animaux au moment du réveil, pour autant elles permettent de diminuer ces effets d'inconfort, de confusion et de stress pendant les procédures, les rendant ainsi le moins traumatisantes possible pour les animaux par rapport à ces mêmes procédures qui seraient effectuées sur animaux vigiles.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort, sous procédure complète d'anesthésie, en fin de protocole de gravité modérée pour prélèvement multi-organes post-mortem.

Remplacement

Cette autorisation de projet a pour objectif de valider la dose thérapeutique ciblée pour les anticorps polyclonaux 1, 2 et 3, de manière à optimiser l’étude de toxicité réglementaire nécessaire à la constitution du dossier de demande d’autorisation d’essai clinique. Les études pré-cliniques réalisées montrent que les primates non humains et le babouin notamment est l’espèce la plus représentative de l’homme pour l’évaluation de la toxicologie des anticorps car la cross-réactivité cellulaire est comparable.

Réduction

Pour chaque dose, le nombre d’animaux est réduit à son minimum soit 2 par dose, en raison de la variabilité interindividuelle. Le groupe contrôle est partagé pour tous les anticorps testés, toujours dans un objectif de réduction. De plus, le projet est divisé en 2 parties. Dans la partie 1 seul l’équivalent de la dose thérapeutique ciblée chez l’homme sera administrée. La dose forte ne sera pas administrée si une des précédentes doses a provoqué des effets indésirables graves

Raffinement

-De façon à diminuer le stress, la souffrance et la douleur, toutes les procédures seront réalisées chez ces animaux sous anesthésie générale. Un traitement analgésique leur sera donné si nécessaire en fonction de la procédure. -Les anesthésies et traitements analgésiques donnés aux animaux sont décrits dans les procédures. La fréquence d'observation des animaux est doublée lors des expérimentations et consiste en un examen clinique de l’animal selon une grille de signes notables, signes sévères et un arbre décisionnel -Si des effets indésirables apparaissent dès la première injection, la seconde injection ne sera pas réalisée. -Les animaux sont hébergés avant protocole expérimental en volière, de façon à préserver leur mode de vie en communauté, puis, au cours du protocole expérimental les individus sont hébergés dans des cages séparées, mais jointives permettant la vision et la communication entre congénères. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est donné quotidiennement, un enrichissement du milieu par jeux (différentes activités) est donné en rotation dans les cages selon un programme hebdomadaire. Enfin, un aménagement (perchoirs, cordes…) des cages permet un enrichissement de mouvements.

Choix des espèces

Les primates non humains, ici les babouins, représentent des espèces animales de choix comme modèles animaux pré-cliniques, car proches de l’homme de par leur anatomie, leur physiologie, leur métabolisme, leur proximité phylogénétique et leur similitude avec le système immunitaire de l’homme. Les investigations in vivo sur une espèce représentative est un prérequis obligatoire par les autorités réglementaires avant d’envisager un essai clinique chez l’homme. Les animaux seront inclus à un stade jeune adulte, afin de présenter un système immuntaire mature.

Une nécrose humide, creuse ou douloureuse à la palpation sur la tumeur d'une souris déclenche sa mise à mort, comme une tumeur qui atteint la taille limite. 2 112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous anesthésie une injection de cellules tumorales, puis jusqu'à trois semaines d'injections combinant chimiothérapie, immunothérapie et molécules ciblant les récepteurs TLR, avec un épisode fébrile possible. Le porteur cherche à retirer la chimiothérapie de ces combinaisons et écrit que l'avantage pour le bien-être des patients "serait alors énorme", à un stade où les résultats restent à établir chez la souris.

Objectifs

L’objectif de ce projet consiste à démontrer l’intérêt d’utiliser des agents qui ciblent des récepteurs de l’immunité (TLR) afin d’induire l’infiltration de cellules immunitaires dans les tumeurs, et ainsi favoriser les réponses aux thérapies anti-cancéreuses. Il est déjà connu que les agents ciblant les TLRs peuvent induire le recrutement de cellules immunitaires dans les tumeurs et ainsi favoriser une réponse immunitaire anti-tumorale. Certains agents ciblant ces TLR sont actuellement utilisés en clinique dans le traitement des cancers. Ces agents sont utilisés individuellement et associés à d’autres thérapies conventionnelles comme les chimiothérapies (drogues anti-cancéreuses) ou les immunothérapies (agents stimulant la réponse immunitaire). Dans ce projet, nous nous proposons d’utiliser ces agents ciblant les TLRs en association et de tester leur capacité à augmenter l’efficacité anti-tumorale des immunothérapies sans l’ajout de chimiothérapies qui sont connues pour induire des effets secondaires.

Bénéfices attendus

Grâce à cette étude nous pensons pouvoir proposer de nouvelles combinaisons thérapeutiques pour les patients atteints de cancer. L’association des agents ciblant les TLRs devrait permettre le recrutement d’un fort infiltrat immunitaire qui après stimulation pourra éliminer efficacement les tumeurs. L’étude de la composition de l’infiltrat immunitaire permettra une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeux dans l’élimination des tumeurs, ce qui est cruciale pour le développement et l’optimisation des thérapies anti-cancéreuses chez les patients. De plus, nous nous attendons à ce que l’association des deux ligands de TLR avec l’immunothérapie induise une efficacité anti-tumorale bien supérieure à celle pouvant être obtenue avec l’association des chimiothérapies à l’immunothérapie. L’avantage en terme de bien être des patients serait alors énorme.

Procédures

Les souris recevront une injection de cellules tumorales sous anesthésie générale. Les traitements reçus par les souris seront : - injection (30 secondes) de chimiothérapies au maximum 1 fois par semaine pendant 3 semaines. - injection (30 secondes) d’immunothérapies au maximum 2 fois par semaine pendant 3 semaines. - injection (30 secondes à 1 minute) de molécules ciblant les TLRs, 2 fois par semaine à raison de 5 injections maximum

Impact sur les animaux

- Les souris seront anesthésiées à l’isoflurane lors de l’injection des cellules tumorales en sous-cutanée - La contention des souris lors de la mesure de la taille des tumeurs et des traitements pourrait provoquer un léger stress. - Le développement de la tumeur peut générer une gêne au mouvement et donc impacter son état général. - Des nécroses peuvent apparaitre sur les tumeurs. - Les injections intra-péritonéales et intraveineuses répétées pourraient provoquer un léger inconfort et des lésions locales. - Les chimiothérapies et immunothérapies administrées sont largement utilisées en préclinique à ces doses et fréquences, et ne devraient pas beaucoup impacter l’état de santé des animaux, au maximum elles peuvent provoquer une perte de poids transitoire. - Les agents ciblant les TLRs sont également utilisés à des doses déjà bien établies dans les modèles murins. L’injection des agents ciblant les TLRs membranaires pourrait induire un léger épisode fébrile.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences et leur tumeur sera prélevée.

Remplacement

Une grande partie de nos démonstrations a été réalisée in vitro mais la capacité de nos associations d’agents ciblant les TLRs à pouvoir induire le recrutement des cellules immunitaires dans la tumeur et ainsi à promouvoir l’efficacité anti-tumorale des thérapies conventionnelles ne peut être démontrée que dans un organisme vivant entier.

Réduction

Les prises tumorales et la réponse aux traitements peuvent varier d’un individu à l’autre, les croissances tumorales seront réalisées sur des groupes de 8 souris. Nous répèterons l’expérience 1 fois de manière indépendante afin d’avoir suffisamment de puissance pour des analyses statistiques, comme nous avons déjà pu le déterminer dans des expériences antérieures. Pour l’analyse de l’infiltrat immunitaire intra-tumoral, les groupes seront alors réduits à 5 souris par groupe, l’expérience sera renouvelée 1 fois afin d’atteindre une puissance satisfaisante pour l’analyse statistique. L’analyse de l’infiltrat immunitaire sera réalisée sur 8 groupes uniquement, ceux associés aux immunothérapies ne seront pas ajoutés, leurs rôles étant déjà connus. La mise en évidence de l’importance du système immunitaire dans l’efficacité des associations thérapeutiques ne sera étudié que dans les 3 modèles où nous aurons déterminé les meilleures efficacités thérapeutiques et avec les 6 groupes les plus représentatifs.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. L’hébergement se fera en groupe pour éviter le stress. Du matériel d’enrichissement permettant la construction de nids sera fourni et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement. Pour tous les animaux, une semaine d’acclimatation sera respectée avant le début de l’expérimentation. Ces animaux seront habitués aux gestes techniques (contention, injections…) avant toute expérimentation. Les injections se feront au même moment de la journée, pour perturber au minimum le cycle des souris, l’injection des cellules tumorales se faisant sous anesthésie générale. Les souris immunodéficientes seront hébergées sous couvercle filtrant pour éviter les risques d’infection. Les animaux seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude, la fréquence de surveillance étant augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux tels qu’une perte de poids, des modifications du comportement, l’apparition de nécroses sur les tumeurs ou d’une période de fébrilité. En cas de changement de comportement ou d’apparence physique, une nourriture gélifiée pourra être rajoutées dans la cage et les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas d’apparition de nécrose non sèche, ou lorsque les nécroses sont sèches mais douloureuses à la palpation ou creuses, les souris seront euthanasiées. Si les nécroses sont sèches, non douloureuses et sans déformation ni signe d’inflammation, les souris seront surveillées quotidiennement et pourront être prise en charge avec l’utilisation d’un produit cicatrisant. En cas d’épisode fébrile de plus 24h post-injection du composé ciblant les récepteurs, les souris recevront 1 injection d’un analgésique toutes les 12h jusqu’à disparition des symptômes (le maximum retrouvé étant de 48h dans de très rares cas). Lorsque la tumeur atteint une taille limite, en cas de perte de poids ou d’autres signes mettant en évidence une souffrance, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles de choix utilisés pour une analyse de l’efficacité de nouveaux traitements anticancéreux. De plus, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. Dans un premier temps, nous utiliserons des souris immunocompétentes permettant l’implantation de cellules cancéreuses murines syngéniques. Afin de déterminer l’implication du système immunitaire dans l’effet anti-tumoral de nos combinaisons thérapeutiques, nous utiliserons alors des souris immunodéficientes. Les animaux devront avoir au moins 8 semaines pour que leur système immunitaire soit mature.

Soumis à une chirurgie du cerveau de 45 à 90 minutes, puis à des injections quotidiennes dans l'abdomen pendant deux semaines et à des tests comportementaux d'une heure par jour pendant neuf semaines, 612 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une neurotoxine leur est injectée pour reproduire une maladie neurodégénérative, et certains auront besoin d'une alimentation enrichie pour continuer à se nourrir. Tous sont tués à l'issue pour que leur cerveau soit observé au microscope et que l'activité de leurs neurones soit enregistrée sur des tranches, dans un projet portant sur les troubles de l'humeur associés à la maladie de Parkinson. Le porteur qualifie les nuisances des tests comportementaux de "très modérées" et ses gestes chirurgicaux de "très bien maîtrisés", sans nommer aucun des tests qu'il fait subir aux rats pendant ces neuf semaines.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser l’implication d’une communication neuronale entre deux structures cérébrales chez le rat dans les effets délétères sur l’humeur d’une maladie neurodégénérative et de l’un de ses traitements. Ce projet met en œuvre des approches de biologie moléculaire, des approches électrophysiologique et des approches comportementales chez des animaux sains et des animaux malades

Bénéfices attendus

Le projet vise à fournir une compréhension de certains troubles de l’humeur dans une maladie neurodégénérative. Ce projet conduira à une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à ces troubles suite, ou non, a un traitement. L’identification des circuits impliqués dans ces troubles permettra ensuite d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Intervention numéro 1: Une chirurgie cérébrale d'une durée de 45 minutes. Un enregistrement électrophysiologique in vivo sous anesthésie. Intervention numéro 2: chirurgie cérébrale d'une durée de 45 minutes. Des injections quotidiennes (1 par jour, quelques secondes) dans l'abdomen pendant 2 semaines. Des tests comportementaux d'1h par jour environ pendant 9 semaines au total. Intervention numéro 3: chirurgie cérébrale d'une durée de 60 minutes. Intervention numéro 4: chirurgie cérébrale d'une durée de 90 minutes). Des injections quotidiennes intrapéritonéales pendant 2 semaines (1 par jour, quelques secondes). Des tests comportementaux d'1h par jour environ pendant 9 semaines au total.

Impact sur les animaux

Suite à la mise en place de la pathologie neurodégénérative, certains animaux nécessiteront une assistance particulière avec supplémentation en nourriture riche. Les injections dans l'abdomen, individuellement très bien tolérées et peu douloureuses, pourraient par leur répétition entraîner une souffrance légère et des hématomes bénins. Les approches comportementales induiront des nuisances très modérés (stress) en cas de contention temporaire. Les procédures chirurgicales et suites opératoires peuvent induire des nuisances modérés comme une perte de poid légère et passagère, mais ces approches sont très bien maitrisées au sein de l'équipe. Enfin, l'isolement de certains groupes d'animaux peut être lié à un stress modéré de l'animal.

Devenir

L'ensemble des animaux sont destinés seront tous mis à mort afin de prélever les cerveaux pour les analyser au microscope et enregistrer l’activité des neurones sur des tranches de cerveau.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, qui permettront à,la fois l’évaluation comportementale et électrophysiologique. De plus, de telles expérimentations chez l'homme sont impossibles

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe pour obtenir des résultats statistiquement fiables, en se basant sur des procédures similaires réalisées auparavant. L’utilisation des outils statistiques appropriés nous permettra également de gagner en puissance statistique et donc de réduire le nombre d'animaux nécessaire. Pour une question d’organisation et de gestion des expérimentations, l’ensemble des expérimentations se feront sur des cohortes distinctes plus petites. Ainsi, à l’issue de la première session, si les résultats sont suffisants pour mettre en évidence des différences significatives des différents paramètres étudiés, il ne sera pas nécessaire de faire appel à une seconde session.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement. Ils seront hébergés pendant une semaine à leur arrivée et ils seront manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations afin d’atténuer le stress lié à l'isolement relatif et aux manipulations. En cas de signe d’alerte, l’alimentation sera supplémentée par une nourriture hypercalorique et hydratée fournie par l’animalerie. Le suivi et les pesées quotidiennes des animaux permettront de veiller à ce qu’ils ne souffrent pas et de mettre en place des stratégies de soins et de points limites adaptés. Un analgésique pourra également être injecté si nécessaire. Les animaux nécessitant une assistance particulière suite à l’injection de la neurotoxine seront supplémentés en nourriture riche.

Choix des espèces

Le rat est une espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des réseaux neuronaux sur lesquels portent notre étude, tant du point de vue anatomique que physiologique. Les comportements explorés et les tests associés sont facilement appréhendables dans cette espèce. Les animaux utilisés sont des animaux adultes de 8 à 10 semaines, ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des procédures expérimentales.

Immunodéficientes pour que des cellules tumorales humaines s'y développent sans rejet, 52 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses dans le sang, développent des métastases pulmonaires avec perte de poids et difficultés respiratoires possibles, puis passent jusqu'à seize cycles d'imagerie hebdomadaires sous anesthésie gazeuse. Une partie subit en plus quatre anesthésies de quarante-cinq minutes en quatre jours consécutifs, une autre reçoit un anticorps couplé à un métal radioactif. Toutes sont tuées pour analyser les tissus, dans un projet qui vise un sous-type de cancer du rein représentant 5 % des cas.

Objectifs

Le rein est un élément central dans la régulation de l'homéostasie. Ils filtrent le sang et produisent un certain nombre d’hormones capitales dans la régulation de la tension artérielle. Le cancer du rein est un problème majeur de santé publique avec ~400 000 nouveaux cas par an dans le monde. Ce projet vise à cibler une protéine, initialement décrite comme participant au développement du cerveau, dans un sous-type de cancer du rein, dit chromophobe. En effet, cette protéine est spécifiquement exprimée par les cellules de la tumeur primaire et des métastases de cancer du rein chromophobe. Nous prendrons l’avantage du développement au laboratoire d’un anticorps dirigé contre la protéine d’intérêt couplé à un métal radioactif, technique appelée radiothérapie interne vectorisée. Cette technique permet soit de détecter des métastases par imagerie nucléaire ou de cibler thérapeutiquement les cellules tumorales sous l’effet des rayonnements ionisants. Ces candidats médicaments seront testés sur un modèle tumoral murin.

Bénéfices attendus

Les cancers du rein chromophobe sont une maladie rare. Elle ne touche que 5 % des cancers du rein. Actuellement, ce sous-type de cancer du rein fait l’objet de très peu de recherche et par conséquent les perspectives thérapeutiques de ces patients sont pauvres. Par ailleurs, les patients métastatiques n’ont quant à eux aucune perspective thérapeutique, puisqu’ils reçoivent le traitement de référence des autres sous types de cancer du rein. Ce dernier n’a jamais montré d’efficacité thérapeutique dans leur pathologie. Ainsi, notre projet pourrait permettre de développer la première stratégie thérapeutique spécialement dédiée au cancer du rein chromophobe et apporter un espoir à ces patients métastatiques pour qui l’issue est aujourd’hui fatale.

Procédures

Dans ce projet, les animaux recevront tous une injection intraveineuse des cellules tumorales (2 minutes), puis au cours du suivi longitudinal hebdomadaire, ils seront au maximum soumis à 16 cycles d’imagerie (Injection d’un traceur et une anesthésie gazeuse à l’isoflurane durant l’acquisition 10 minutes). Ensuite, certains animaux recevront une injection intraveineuse du composé pour l’imagerie sous anesthésie gazeuse (détection des métastases). Ces derniers seront ensuite soumis à 4 anesthésies gazeuse de 45 minutes pour l’imagerie nucléaire (4 jours consécutifs). Une autre partie des animaux recevront une injection intraveineuse du composé thérapeutique sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (5 minutes).

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux développeront des métastases pulmonaires. L’apparition de ces métastases peut être associé à une perte de poids et à des problèmes respiratoires.

Devenir

Tous les animaux seront tous mis à mort pour analyser les tissus.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, nous cherchons à voir si notre molécule pourrait être utilisable pour la détection et le ciblage thérapeutique de métastases de cancer du rein chromophobe. Afin de tester l’effet de notre molécule sur des métastases, nous utilisons des modèles animaux, car il n’existe pas d’autre solution pour générer des modèles de métastases autrement que par des expériences in vivo. Seul un organisme complexe permet de récapituler les caractéristiques physiques et biologiques que l’on retrouve chez le patient (accessibilité du traitement au cellules tumorales, notamment).

Réduction

Afin de réduire considérablement nos effectifs, nous avons choisi d’utiliser une approche de suivi longitudinal par imagerie. De plus, le nombre d’animaux a été déterminé par des approches statistiques nous permettant de répondre à notre question biologique.

Raffinement

Méthodes utilisées pour réduire la douleur : La plupart des interventions sur les animaux seront réalisés sous anesthésie gazeuse (anesthésie générale et analgésie). De plus, nous utiliserons le suivi longitudinal par imagerie pour suivre l’apparition des foyers métastatiques. De la sorte, nous serons dans la capacité d’arrêter la procédure avant l’apparition de signes cliniques. Par ailleurs, nous avons mis en place un scoring pour les points limites afin de prendre en charge les animaux présentant un signe de douleur (analgésie ou mise à mort si scoring trop élevé).

Choix des espèces

La souris est un organisme modèle qui partage 98% son patrimoine génétique avec l’homme. Ce modèle permet donc d’étudier les mécanismes biologiques que l’on retrouve chez l’homme. Procédure 1 à 3 : 3: La souris immunodéficiente est le modèle le plus approprié pour greffer des cellules cancéreuses humaines afin qu’il n’y ait pas de rejet des cellules. Au début du projet, Les animaux sont âgés de 6 à 8 semaines car la prise tumorale est meilleure à cet âge.

Pour suivre par imagerie l'installation d'un rétrécissement de la valve aortique, 92 souris, dont une lignée dépourvue du gène de l'apolipoprotéine E, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une opération du cœur de trente minutes à une heure sous anesthésie, puis deux à quatre échographies cardiaques et trois examens d'imagerie radiologique de dix à soixante minutes, jusqu'à seize semaines de suivi. Le porteur signale un risque de déchirure de la valve, d'hémorragie ou d'arrêt cardiaque pendant l'opération, puis des douleurs et une baisse d'appétit possibles. Toutes sont tuées pour prélever le cœur, les valves et les artères, et le calcul d'effectif intègre d'emblée un taux de mortalité attendu de 20 % après la chirurgie, soit près d'une vingtaine de souris dont la mort est anticipée dès la conception du projet.

Objectifs

Notre projet vise à approfondir la compréhension des mécanismes conduisant à une altération de la valve aortique du cœur, communément appelée sténose (ou rétrécissement) valvulaire aortique. Cette pathologie grave peut entraîner des complications sévères telles que l'insuffisance cardiaque et une forte mortalité, atteignant jusqu'à 60% dans l'année suivant le diagnostic. Actuellement, la seule option de traitement est une intervention chirurgicale lourde et risquée visant à remplacer la valve défaillante. De plus, le risque de développer une sténose aortique est significativement accru chez les individus souffrant d'autres maladies, notamment l'athérosclérose, caractérisée par l'accumulation de dépôts de graisse sur les artères et les valves en raison d'un excès de cholestérol dans le sang. Il est à noter que l'athérosclérose est en constante augmentation au sein de la population générale. Notre approche consiste à étudier le développement de la sténose aortique chez des souris saines, ainsi que chez des souris exposées à un régime riche en cholestérol favorisant l'athérosclérose. Pour ce faire, nous utiliserons une technique d'imagerie sensible et précise qui n'est pas encore utilisée dans le diagnostic de cette maladie. Notre objectif est de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à cette pathologie et d'explorer de nouvelles avenues pour la prévention et le traitement de cette maladie potentiellement mortelle.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux caractériser l'évolution de la sténose aortique en utilisant des techniques d'imagerie sensibles et précises. L'objectif est de diagnostiquer la maladie chez les patients plus tôt et de déterminer le stade de la maladie afin d'améliorer la prise en charge médicale. De plus, ce projet cherche à comprendre comment l'athérosclérose peut aggraver la sténose aortique. En examinant cette relation à travers diverses méthodes d'imagerie, nous espérons découvrir de nouvelles voies thérapeutiques pour traiter efficacement cette condition et améliorer les stratégies de prévention chez les individus présentant un taux sanguin de cholestérol élevé. En comprenant les interactions entre ces deux facteurs, nous pourrons développer des interventions plus ciblées pour protéger le cœur contre les maladies cardiovasculaires sévères. Cela contribuera à améliorer la qualité de vie des patients et à réduire les risques de complications graves associées à ces affections.

Procédures

Les souris auront une chirurgie d'une durée de 30 minutes à 1 heure, sous anesthésie (1 seule fois chacune). Certaines seront suivies jusqu'à 8 semaines, tandis que d'autres seront suivies jusqu'à 16 semaines. Les souris suivies jusqu'à 8 semaines auront 2 échographies cardiaques à 4 et 8 semaines (20 à 30min pour chaque examen), tandis que celles suivies jusqu'à 16 semaines en auront 4 échographies à 4, 8, 12 et 16 semaines (20 à 30min pour chaque examen). Toutes les souris auront trois examens d'imagerie médicale radiologique à des jours différents sous anesthésie générale : un pour détecter l'accumulation du sucre dans les artères et les valves (30 min), un pour repérer les dépôts de calcium (10 min), et un dernier pour détecter l'inflammation dans le cœur et les vaisseaux (60 min). Avant l'examen pour détecter le sucre dans les tissus, une petite goutte de sang sera prélevée une fois par souris, ce qui prendra au maximum 30 secondes.

Impact sur les animaux

La chirurgie est délicate et peut durer longtemps, nécessitant une anesthésie à l'isoflurane pendant environ une heure maximum. Cela peut entraîner des changements dans le corps de la souris, comme la température, la pression artérielle et la respiration. Pendant la chirurgie, il y a un risque de déchirure de la valve aortique, d'hémorragie ou un arrêt cardiaque. Après la chirurgie, la souris pourrait souffrir de complications telles que des crises cardiaques, des douleurs ou une réduction de l'appétit. De plus, pour les examens d'imagerie qui mesurent le taux de sucre , le jeûne des animaux peut entraîner une diminution du taux de sucre dans le sang. Des effets secondaires liés à l'anesthésie et à la manipulation chirurgicale peuvent survenir, notamment des douleurs post-opératoires, une diminution temporaire de l'appétit, une réduction de l'activité physique et des réactions inflammatoire ou infectieuse au site opératoire.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure. Des organes seront prélevés pour faire des analyses post mortem sur les valves cardiaques, le cœur et les artères.

Remplacement

Pour comprendre l'impact d'une lésion sur une valve cardiaque sur la capacité du cœur à pomper le sang, ainsi que la manière dont cette lésion peut être aggravée par l'athérosclérose, il est essentiel d'étudier ces phénomènes chez des animaux vivants. Certaines mesures cruciales, telles que la contraction et le vidage du cœur, ne peuvent être pleinement appréhendées que lorsqu'elles sont observées dans un organisme en vie.

Réduction

Avant de débuter notre étude, nous avons effectué une analyse statistique approfondie pour déterminer le nombre optimal d'animaux à inclure. Cette analyse s'est basée sur des données bibliographiques ainsi que sur les résultats de recherches antérieures menées au sein de notre laboratoire. Grâce à cette démarche rigoureuse, nous avons pu ajuster de manière précise le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables et significatifs, tout en tenant compte d'un taux de mortalité attendu de 20 % après les procédures chirurgicales. De plus, les techniques d'imagerie que nous avons sélectionnées permettent un suivi longitudinal des animaux, ce qui élimine le besoin de les sacrifier à chaque étape de l'étude. Cette approche non seulement réduit le nombre d'animaux utilisés, mais elle offre également la possibilité d'évaluer en continu les paramètres de calcification et d'inflammation au niveau de l'aorte, des valves et du cœur. Ainsi, nous obtenons une compréhension complète de l'évolution de la pathologie au fil du temps.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupes de 3 dans des cages bien aérées, avec une litière propre et des jouets pour s'amuser, comme du papier kraft, des tunnels et des bâtonnets en bois. Ils auront toujours de l'eau et de la nourriture à disposition dans une animalerie équipée pour garantir leur confort en termes de température, d'humidité et de qualité de l'air. Avant le début de l'étude, ils auront une semaine d'adaptation pour s'habituer à leur nouvel environnement. Nous surveillerons leur santé deux fois par jour en semaine et une fois par jour le week-end et les jours fériés. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie gazeuse, et les animaux seront maintenus à bonne température sur une plaque chauffante. Leur respiration et leur rythme cardiaque seront constamment surveillés. Après la chirurgie, nous serons attentifs à tout signe de détresse, comme des changements dans leur aspect physique, leur mobilité, leur comportement, ou leur poids. Nous nous assurerons qu'ils mangent et boivent suffisamment, et nous utiliserons un tableau de notation pour évaluer leur bien-être. Si un problème de santé survient, nous prendrons immédiatement des mesures pour garantir leur confort. Nous adapterons également les doses de médicaments pour chaque animal afin de contrôler la douleur et d'autres symptômes après la chirurgie. En cas de complication grave, nous mettrons à mort les animaux pour éviter toute souffrance. Avant chaque examen d'imagerie, les animaux seront endormis pour les calmer, et nous surveillerons attentivement leur santé pendant toute la durée de l'anesthésie.

Choix des espèces

Les souris C57Bl/6 et ApoE-/- ont été choisies pour notre étude car elles présentent des similitudes remarquables avec les humains en termes de structure corporelle et de fonctionnement physiologique. Elles sont capables de développer des maladies cardiovasculaires telles que l'athérosclérose et la sténose valvulaire aortique, ce qui les rend pertinentes pour notre recherche sur ces pathologies. Les souris incluses dans notre étude ont entre 10 et 12 semaines et pèsent au moins 20 grammes. À cet âge, leur cœur et leurs vaisseaux sanguins sont complètement développés, ce qui correspond à un stade de jeune adulte. Avant de débuter les expériences, les souris seront habituées à leur nouvel environnement pendant au moins une semaine afin de minimiser le stress et d'assurer des conditions de vie optimales pour leur bien-être.

Gavés une fois d'une dose de pyréthrines ou de pipéronyl butoxide diluée dans de l'huile végétale, après quatre heures de jeûne suivies de six autres, 50 rats Wistar mâles passent 72 heures en cage métabolique individuelle pour que leurs urines et leurs fèces soient recueillis à huit reprises. La procédure implique un niveau de souffrance modéré, et c'est le séjour en cage métabolique et le jeûne de dix heures qui la classent ainsi, non la substance testée. Le projet vise à décrire pour la première fois le devenir des pyréthrines chez un mammifère, préalable annoncé à une biosurveillance humaine. Tous les rats restent vivants et sont ensuite réutilisés en travaux pratiques d'enseignement, sans que le RNT dise ce qui leur arrive à ce stade, ni pourquoi seuls des mâles sont utilisés au-delà de la mention de "recommandations en vigueur".

Objectifs

L'étude des expositions alimentaires aux résidus de pesticides est un réel enjeu de santé publique. En étudiant comment les substances circulent dans notre organisme, sont transformées et sont éliminées (toxicocinétique) et en développant des méthodes pour mesurer ces produits de transformation (métabolites), on peut mieux estimer les risques liés à l'exposition. Les Pyréthrines sont des produits utilisés en agriculture biologique, fabriqués à partir de fleurs de pyrèthre de Dalmatie ou de certains chrysanthèmes. Leur mécanisme d’action cible le système nerveux des insectes, mais peut aussi être toxique pour les poissons. Aucune étude sur le devenir des pyréthrines chez les mammifères n'est disponible. Seule une étude réalisée chez l’Homme rapporte la présence de deux métabolites pouvant être ceux des pyréthrines. Ainsi cette étude a pour objectif de confirmer que ces deux métabolites identifiés sont bien spécifiques à l'exposition aux pyréthrines et d’en étudier la toxicocinétique, ce qui n’a jamais été réalisé. Cette étude représente une étape préliminaire au développement de méthodes de biosurveillance aux pyréthrines chez l’Homme, que ce soit pour les professionnels de l’agriculture ou la population générale. D’autre part, le Pipéronyl Butoxide (PBO) est une substance qui, lorsqu'elle est combinée avec des insecticides, les rend plus puissants en empêchant les insectes de s'en débarrasser facilement. Le PBO est le plus souvent utilisé avec les pyréthrines et les pyréthrinoïdes (dérivés synthétiques des pyréthrines). Ce projet vise également à évaluer la toxicocinétique du PBO chez le rat car à ce jour peu de données sont retrouvées dans la littérature scientifique (1 seule étude disponible ne permettant pas de caractériser les métabolites). Une meilleure connaissance de la toxicocinétique du PBO permettra d’identifier les métabolites formés et de mettre au point leur dosage. Les deux substances étudiées ici présentent des dangers potentiels pour la santé humaine telle des affections des systèmes endocriniens, nerveux et reproducteur. Il est donc primordial pour la prévention de la santé de l’ensemble de la population de mieux connaître leurs toxicocinétiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser la toxicocinétique et de caractériser les métabolites des Pyréthrines et du PBO. A notre connaissance, la toxicocinétique des pyréthrines n'a jamais été décrite dans la littérature. Celle du PBO n'a été réalisée que dans une seule étude mais elle n'a pas permis de caractériser les métabolites. Une meilleure connaissance de ces paramètres permettra d'adapter les mesures de prévention pour la santé des populations.

Procédures

Après 7 jours d’acclimatation à l’animalerie, les rats seront placés en cages métaboliques pendant 24h afin de les acclimater à la cage métabolique. Au 8ème jour, les rats seront mis à jeun pendant 4 heures puis une dose de pyréthrines ou de PBO leur sera administrée en une seule fois par gavage (durée du geste : 15 à 20 s). La substance d'intérêt sera diluée dans un volume d’huile végétale adapté selon le poids du rat. Le jeûne sera maintenu pendant 6 heures supplémentaires après le gavage. La durée de mise à jeun de 10 heures au total permet d’éviter la variabilité interindividuelle de l'absorption de substances en raison d'une consommation alimentaire variable d’un individu à l’autre. L’eau sera disponible à volonté durant cette période de jeûne. Après le gavage, les rats seront replacés en cages métaboliques pendant 48 heures, afin de pouvoir recueillir les fèces et urines à 30 minutes, 1 heure, 3 heures, 6 heures, 9 heures, 12 heures, 24 heures et 48 heures, ceci dans le but d’étudier la vitesse d’élimination des substances et des métabolites identifiés.

Impact sur les animaux

Ce protocole nécessite un séjour des rats de 72 heures en cage métabolique (24h d'acclimatation à la cage métabolique et 48h pour l'étude et le recueil des fèces et urines). L'acclimatation de 24h en cage métabolique est nécessaire dans le cadre de notre étude pour ne pas influencer les excrétions d'urines et de fèces qui seraient liés au stress lié à la mise en cage métabolique juste après le gavage des animaux. De plus, une mise à jeun pour une durée totale 10 heures (4 heures avant et 6 heures après le gavage) est nécessaire afin de diminuer la variabilité inter-individuelle d'absorption. Ces éléments classent la procédure en classe de gravité modérée selon les recommandations réglementaires.

Devenir

50 rats Wistar seront utilisés lors de cette étude et soumis à une procédure de gravité modérée. Tous les rats seront maintenus en vie à la fin de la procédure et seront réutilisés pour d'autres projets (enseignement/travaux pratiques).

Remplacement

L'étude de la toxicocinétique des Pyréthrines et du PBO ne peuvent pas être évaluées sur des cellules ou tissus isolés car il est nécessaire d’étudier la réponse d’un organisme entier à ces substances. De plus, le recours à l’expérimentation animale permet de maîtriser les apports en pyréthrines et PBO en phase d'exposition ainsi que tous les facteurs qui pourraient influencer ces paramètres.

Réduction

Le nombre d’animaux s’appuie sur les lignes directrices de l'OCDE n°417 pour les essais de produits chimiques relatives aux études de toxicocinétique chez les rongeurs. Ce protocole utilise trois doses de Pyréthrines afin d'assurer des résultats scientifiques fiables et robustes tout en utilisant un nombre total d'animaux minimal. Selon une évaluation statistique et ce qui a été décrit dans la littérature scientifique concernant la toxicocinétique du PBO seul et des pyréthrines seules, un nombre minimal de sujets nécessaires a été estimé à dix rats par groupe afin de pouvoir visualiser une différence statistique entre les groupes. Ce protocole n’utilisera que des rats mâles, des animaux de sexe féminin ne seront pas utilisés. Le choix du sexe est fait en fonction des recommandations en vigueurs.

Raffinement

Ce protocole ne fait appel qu'à des procédures légères ou modérées. Les rats seront observés quotidiennement et pesés 1 fois par semaine. Les rats seront nourris avec un régime standard qui permet de couvrir l’ensemble des besoins nutritionnels et caloriques des rats. Ils seront hébergés dans des cages à 25°C et 30-50% d’hygrométrie, dans un environnement contrôlé dépourvu de pathogènes, avec une alternance jour/nuit de 12h. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum, sauf pendant la période de jeûne. Les rats seront traités selon les règles éthiques de l’expérimentation animale. L’ensemble du projet est mené par un personnel compétent en expérimentation animale qui maîtrise parfaitement les gestes techniques nécessaires. Les animaux bénéficieront d'une surveillance quotidienne avec des critères d'observation stricts définis. Au-delà du non-respect d’un certain nombre de ces critères, ils seront considérés en souffrance et sortiront de l'étude.

Choix des espèces

Le modèle rat a été choisi comme préconisé par les lignes directrices de l'OCDE n°417 pour les essais de produits chimiques. De plus, le modèle de rat Wistar correspond à l'espèce la plus pertinente et la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse de façon durable et sans qu'il soit possible de la soulager. Aucun modèle in vitro ne permet d'atteindre les objectifs fixés, le rat est un modèle approprié et bien validé pour ce genre d’étude. De plus, l'étude sur le Pipéronyl Butoxyde a été réalisée sur un modèle de rat. Réaliser cette étude dans des conditions similaires permettra de comparer et d’enrichir les données décrites dans la littérature scientifique avec l’analyse des résultats de cette étude. Les rats seront âgés de 6 semaines pesant environ 250g au démarrage de l'étude. Les rats seront âgés de 7 semaines à la fin de l'étude. L'âge des animaux s'appuie sur les lignes directrices de l'OCDE n°417 pour les essais de produits chimiques relatives à l'étude de la toxicocinétique chez les rongeurs. Suite à une décision de l'équipe, les rats utilisés dans cette étude sont le plus jeune possible afin de pouvoir être réutilisés sur un autre projet (enseignements/travaux pratiques).