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Etude de la régénération musculaire dans des dystrophies musculaires par xénogreffe de biopsies humaines dans une souris immunodéficiente 1/2
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Les souris employées sont immunodéficientes, condition qui les rend vulnérables à la moindre infection et sans laquelle elles rejetteraient le muscle humain qu'on leur greffe. 390 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une greffe chirurgicale de trente minutes sous anesthésie, une semaine de récupération, un transport routier d'une heure vers un second établissement, puis jusqu'à seize séances de résonance magnétique sous anesthésie générale en un an, chacune pouvant durer deux heures. Toutes sont tuées en fin de projet pour que le muscle greffé et les autres organes soient analysés.
Objectifs
Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs. Nous nous intéressons aux dystrophies musculaires, un groupe hétérogène de maladies génétiques touchant le muscle squelettique. Dans ce projet nous allons greffer des fragments de muscle humain ou des muscles 3D générés in vitro à partir de cellules humaines pour étudier la régénération musculaire chez l’homme. Notre objectif est de comprendre comment elle se déroule et comment elle peut être perturbée dans le cas des maladies touchant le muscle squelettique. Un autre objectif de notre projet est de tester la régénération musculaire in vivo d’un muscle 3D d’origine humaine.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de comprendre comment la régénération musculaire se déroule dans le muscle squelettique humain, sain et malade (caractérisé par une dégénérescence et une faiblesse musculaire). Le bénéfice attendu est une meilleure compréhension de la régénération musculaire chez l’homme et le développement de nouvelles thérapies visant améliorer la régénération musculaire chez l’homme
Procédures
Les animaux sont immunodéficients et sont donc plus sensibles aux infections. Les animaux seront soumis à une greffe musculaire, une procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie générale et analgésie d’une durée de 30 minutes. Après une période de récupération d’une semaine, les animaux seront transférés en voite double emballage avec enrichissement, croquette et hydrogel dans un second établissement par un transport de 1h par un transporteur agréé en véhicule climatisé . Après un temps d'acclimatation de 7 jours, les animaux seront soumis à des analyses par résonance magnétique nucléaire (RMN) réalisées sous anesthésie générale d'une durée maximale de 120 minutes (16 répétitions sur 1 an). A l’issue de la période de maintien, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en vue des différents prélèvements et analyses.
Impact sur les animaux
Dans notre projet, nous greffons des biopsies musculaires humaines ou des muscles 3D générés avec des cellules humaines chez la souris. L'effet indésirable qui peut se produire sur les animaux est une inflammation/infection de la peau au site d’injection, l'animal pourrait alors ressentir une douleur locale au niveau du site d'injection. Lors des anesthésies effectuées pour l'ensemble des gestes techniques, les risques/contraintes peuvent être les suivants : effets sur le fonctionnement normal du corps pendant l'anesthésie (hypothermie, hypotension, hypoxie). Les analyses tissulaires réalisées par résonance magnétique nucléaire peuvent induire un stress de courte durée. Le phénotype dommageable de la lignée se traduit par une immunodéficience qui implique un risque accru aux infections. Le transport entre les différents établissement peuvent générer du stress.
Devenir
Ce projet implique 390 souris en total. Ces animaux seront euthanasiés en fin de projet pour l’analyse indispensable des muscles greffés et des autres organes (foie, etc) est indispensable.
Remplacement
Nous travaillons sur la régénération musculaire chez l’homme. Les études réalisées in vitro et en culture ne donnent qu’une vision partielle du comportement des cellules musculaires humaines lors de la régénération musculaire et elles ne peuvent pas recréer in vitro la complexité observée in vivo avec l’ensemble des acteurs cellulaires qui y participent.
Réduction
390 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière kraft, bâtonnet en bois, rouleau en carton ou maisonnette. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.).
Choix des espèces
La xénogreffe des muscles humain dans des animaux immunodéficients est indispensable pour pouvoir tester le comportement in vivo du tissu musculaire humain. Nous utiliserons des souris entre 2 et 3 mois d'âge. A ce stade, les souris sont déjà adultes (l’effet de la croissance pourrais affecter les résultats) et elles ont une taille facilitant la chirurgie)
Rôle du récepteur des glucocorticoïdes et de son co-régulateur Lsd1 dans l’atrophie musculaire
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Une souris qui perd plus de 20 % de son poids en une semaine est tuée par dislocation cervicale. 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Toutes reçoivent du tamoxifène cinq jours de suite, puis selon le groupe une injection de dexaméthasone, un gavage quotidien de prednisone pendant un mois, ou un jeûne de vingt-quatre à quarante-huit heures dont le porteur reconnaît qu'il peut "fortement affaiblir les animaux" et faire fondre jusqu'à 30 % de leur muscle. L'enjeu déclaré est de comprendre pourquoi les corticoïdes prescrits aux patients provoquent une atrophie musculaire, effet secondaire connu de longue date.
Objectifs
Les glucocorticoïdes (cortisol chez l'homme et corticostérone chez la souris) ont différents effets chez les mammifères, contribuant au métabolisme, à la réaction immunitaire et à la réponse au stress. En raison de leurs propriétés anti-inflammatoires, les glucocorticoïdes sont des traitements largement prescrits qui ont révolutionné le domaine de la médecine. En effet, les agonistes synthétiques, par ex. la prednisone et la dexaméthasone (Dex) sont couramment utilisés pour traiter les maladies inflammatoires chroniques telles que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques, l'asthme, et certaines myopathies. Néanmoins, l'utilisation chronique de ces composés peut entraîner d'importants effets secondaires, comme le diabète de type 2, l'ostéoporose, ou une atrophie musculaire. Les effets des glucocorticoïdes sont médiés par le récepteur des glucocorticoïdes (GR), un membre de la superfamille des récepteurs nucléaires. Dans le modèle classique, GR lié à une hormone est convoyé dans le noyau, où il se lie à ses éléments de réponse sur l'ADN de manière coopérative avec d'autres protéines appelées des corégulateurs. De plus en plus de preuves indiquent une spécificité tissulaire de ces corégulateurs. Lsd1 est un corégulateur qui interagit avec un autre membre des récepteurs nucléaires, le récepteur aux androgènes, dans les cellules cancéreuses de la prostate humaine. Nos données préliminaires montrent que Lsd1 interagit avec GR dans le muscle squelettique et que les niveaux de Lsd1 augmentent lors de la fonte musculaire induite par les glucocorticoïdes. De plus, les souris dépourvues de Lsd1 dans les myofibres ne parviennent pas à induire l’expression des gènes impliqués dans la protéolyse en réponse à la mise à jeun, ce qui indique que Lsd1 pourrait agir comme un coactivateur de GR pour favoriser le catabolisme musculaire. L'objectif de ce projet est d'identifier le rôle de Lsd1 dans les fibres musculaires adultes dans des conditions physiologiques et dans l'atrophie musculaire induite par les glucocorticoïdes soit par des traitements avec des composés analogues, soit par la mise à jeun.
Bénéfices attendus
Contrôler l'activité des GR en modulant celle des co-régulateurs tels que Lsd1 ouvrirait de nouvelles perspectives pour réduire les effets indésirables induits par les glucocorticoïdes.
Procédures
L'ensemble des animaux sera injecté au Tamoxifène par voie intra-péritonéale pendant 5 jours (30 sec/ souris). Le groupe 1 qui nous servira à étudier le rôle de Lsd1 dans le muscle sain subira ensuite une mesure de poids (30 sec/ souris), de glycémie (1 min/ souris), ainsi qu'un test de tolérance au glucose (IPGTT) et un test de tolérance à l’insuline (IPIST) (180 min au total / souris) par prélèvements sanguins au niveau de la veine caudale. Le groupe 2 qui nous permettra de comprendre le rôle de Lsd1 dans l'atrophie musculaire induite par un traitement aigü aux glucocorticoïdes sera injecté une seule fois à la dexaméthasone ou avec un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 3 qui nous permettra de comprendre le rôle de Lsd1 dans l'atrophie musculaire induite par un traitement prolongé aux glucocorticoïdes sera traité à la prednisone ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Le groupe 4 ne subira pas di'ntervention en dehors de l'injection au Tamoxifène mais sera mis à jeun de 24 à 48h. Amendement: Le groupe 5 sera traité avec un inhibiteur de Lsd1 ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 3 jours, puis la moitié des animaux sera mise à jeun 48h.
Impact sur les animaux
L’injection de tamoxifène, de glucose, d'insuline et de dexaméthasone peut causer des infections. Le site d'injection sera surveillé chaque jour, et désinfecté si besoin. La mise à jeun sur 24 - 48h pourra fortement affaiblir les animaux. L'injection d'insuline pourra éventuellement provoquer une hypoglycémie. Le gavage peut conduire à des fausses routes. L'incision au niveau de la queue pour les mesures de glycémie n'est pas douloureuse mais peut entrainer un inconfort chez l'animal. La présence de sang dans la cage peut générer un comportement agressif et ses congénères. Les traitements aux glucocorticoïdes peuvent entrainer une fonte musculaire allant jusqu'à une perte de 20% du poids du muscle. Il en va de même avec la mise à jeun pour laquelle la fonte musculaire peut atteindre 30%, pouvant de ce fait impacter la mobilité des animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque PE pour des études moléculaires et histologiques.
Remplacement
Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes endogènes (mise à jeun) et synthétiques (Dex et Prednisone) sur l'atrophie musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. Par ailleurs, de nombreux facteurs et hormones interviennent dans l’homéostasie tissulaire. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte. A ce titre, la souris est un modèle de référence. En effet, l'histologie des muscles de la souris est similaire à celle de l'homme. Par ailleurs, le temps de gestation de la souris est relativement court (21 jours en moyenne) et permet la production de larges cohortes, contribuant à la production de résultats significatifs.
Réduction
De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance du modèle de mutation et de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. Pour réaliser le type d’analyses envisagées, un faible nombre d’animaux est requis par groupe, à savoir 10 animaux par condition. En effet, les études montrent qu’il faut 10 animaux par condition pour détecter la différence escomptée à l’aide d’un test statistique. De plus, pour une même souris une patte sera utilisée pour l'analyse d'expression des gènes et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux.
Raffinement
Le personnel qui effectuera les gestes techniques est formé et compétent. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur l’animal vigile. Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection du tamoxifène et des glucocorticoïdes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés quotidiennement. L’état de chaque souris sera référencé dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité. Par exemple, si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, ces observations seront référencées dans le tableau. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement sacrifié par dislocation cervicale. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, une euthanasie par dislocation cérébrale sera réalisée. Une seule injection de dexaméthasone n'est en général pas problématique pour l'animal. Néanmoins, si l'injection est mal effectuée et entraine des souffrances pour l'animal pouvant éventuellement causer sa mort, celui-ci sera euthanasié afin d'éviter toute douleur inutile. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur l'animal vigile. Nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques.
Choix des espèces
Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Le projet s’intéresse au rôle de GR et son co-régulateur Lsd1 dans l'atrophie musculaire de l’organisme adulte. Les animaux seront donc injectés au tamoxifène ou gavés avec l'inhibiteur entre 7 et 11 semaines d'âge et étudiés dans les semaines suivant l'injection. Pour les études métaboliques, les animaux seront mis à mort à deux temps : (i) à 15 semaines, âge auquel le muscle utilise essentiellement des acides gras pour produire de l'énergie, (ii) à 30 semaines, âge auquel le muscle squelettique utilise principalement des sucres.
SUIVILEZ : Suivi de populations naturelles de lézard vivipare
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Tous relâchés à l'endroit exact de leur capture, les femelles gestantes après un mois de captivité et les nouveau-nés dans les quatre jours suivant la mise bas, 5 700 lézards vivipares vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque individu non marqué est amputé d'une phalange et perd l'extrémité de sa queue, moins d'un centimètre chez l'adulte, deux millimètres chez le juvénile. Les expérimentateurs les font ensuite courir, à tous les stades, sur une piste de sprint et sur un tapis roulant pour mesurer leurs performances locomotrices. Le porteur écrit qu'il n'existe "pas d'alternative préférable" pour marquer les juvéniles, les marquages externes étant impossibles et les transpondeurs trop volumineux, et il cite des travaux montrant que la puce électronique stresse davantage que l'amputation.
Objectifs
Un point clé de la persistance des populations face aux impacts des activités humaines sur l'environnement est de prédire leur capacité à changer leurs caractéristiques face à ces nouvelles conditions environnementales, que ce soit par l’acclimatation (via la modification directe de ces caractéristiques), ou par l’adaptation (processus génétique et évolutif). Pour étudier ces phénomènes et leurs mécanismes, la meilleure méthode consiste à mettre en place un suivi individuel de populations particulières, sur lesquelles il est possible d’obtenir la filiation de tous les individus au cours du temps. Malheureusement, peu d’espèces se prêtent à l’exercice, et parmi celles étudiées par cette méthode, les endothermes (oiseaux et mammifères) sont de très loin surreprésentés. Cette demande concerne la poursuite d’un suivi de populations naturelles d’un reptile ectotherme, le lézard vivipare (Zootoca vivipara), étudiées depuis 30 ans. Ce suivi profite de la viviparité de cette espèce, qui permet l’accès aux juvéniles, pour mettre en place une étude approfondie des relations d’apparentement entre individus, ce qui permet d’étudier la sélection naturelle dans cette population, et d’en étudier la réponse évolutive. Un objectif secondaire est d'étudier plus directement comment le réchauffement climatique accélère le rythme de vie des individus (plus forte croissance, reproduction et mortalité, pour un résultat net généralement négatif) en mettant en lien les performances des individus, notamment locomotive avec la température de leur environnement et leur vieillissement biologique.
Bénéfices attendus
La connaissance des maternités grâce à l'hébergement des femelles gestantes jusqu’au terme, complétée par la reconstruction des paternités par l’analyse de l'ADN contenu dans les prélèvements de queue, permet (1) d'obtenir le succès reproducteur des individus mâles et femelles dans la population, ouvrant la voie à l'étude de la sélection naturelle ; (2) l'établissement de l'ensemble des liens de parentés des individus dans toute la population, ouvrant la voie aux études de génétique quantitative ; et (3) des analyses génomiques pour étudier les bases génétiques des traits étudiés et mieux prévoir leur évolution. Les mesures de performances locomotrices de tous les individus, des mesures moléculaires du vieillissement biologique et une caractérisation thermique de la population permettent de relier la dynamique de la condition physique des individus au cours de leur vie et leur environnement thermique, pour mieux comprendre les mécanismes de l'accélération du rythme de vie mentionnée plus haut. Ces données permettent d'étudier très finement les processus liés à la sélection naturelle, à l'adaptation et aux réponses génétiques (évolution) et plastiques (acclimatation) des différents traits phénotypiques face à ces pressions évolutives, notamment celles liées au changement climatique. Ces travaux permettent par ailleurs d’anticiper les pressions environnementales liées au changement climatique auxquelles sont confrontés ces populations en marge sud de répartition du lézard vivipare, et leur capacité à répondre quasi immédiatement par des mécanismes d’acclimatation ou à moyen terme par des mécanismes évolutifs. Des études de ce type et de cette ampleur sont extrêmement rares sur des populations naturelles de reptiles ectothermes, entraînant un manque profond d'appréhension de leur capacité à s'adapter aux défis auxquels ils sont confrontés. Les bénéfices informationnels pour la conservation s’étendent donc aux autres espèces de reptiles ectothermes de milieux froids plus difficiles à étudier.
Procédures
Après capture sur le terrain, les individus non-marqués seront marqués de façon permanente par amputation de phalange (pas d’alternative préférable permettant le marquage des juvéniles) et un prélèvement de tissu caudal sera effectué (maximum 150 individus par an, soit 750 individus sur 5 ans) pour les études génétiques, puis relâchés au lieu exact de capture. Les femelles gestantes capturées (qu’elles soient déjà marquées ou non) seront mises en hébergement temporaire (maximum 150 femelles par an, soit 750 femelles, pour une durée maximale inférieure à 2 mois) jusqu’à la mise bas des juvéniles. Les juvéniles sont marqués par amputation de phalange et un prélèvement de tissu caudal effectué 24h après la naissance (maximum 650 individus par an, soit 3250 individus). Les femelles et leurs juvéniles sont relâchés au lieu exact de capture dans les 4 jours suivants la naissance. Les performances locomotrices de tous les individus, à tous les stades seront évaluées les faisant courir sur une piste de sprint et une piste d'endurance (tapis roulant pour les adultes, arènes circulaires pour les juvéniles).
Impact sur les animaux
La source de nuisance la plus importante est liée au stress de contention lors des captures et diverses manipulations. Une autre source de nuisances est liée à l'amputation de phalange sont une faible douleur. Les études en populations naturelles et semi-naturelles de lézard vivipare montrent que ce marquage individuel n’a pas d’effet détectable sur la survie annuelle, la croissance corporelle annuelle, la reproduction annuelle et sur la mobilité des individus. Le nombre de phalanges amputées n’affectent pas l’activité locomotrice à la naissance, l’anxiété comportementale, la survie lors du premier été ou la condition corporelle (masse à taille égale) à la fin de celui-ci. Aucun impact comportemental n’est observé non plus, avec une reprise rapide de la mobilité (< 20 secondes) et de l’alimentation. Une étude de 2006 ne montre pas de différence significative de stress entre des individus non marqués et amputés, alors que le marquage par insertion d’une puce électronique provoque un stress important et chronique(augmentation de corticostérone dans le sang). Il n’existe pas de méthode d’identification alternative qui puisse s’appliquer aux juvéniles (marquages externes impossible à cause de la mélanisation juvénile et de la mue de croissance ; et transpondeurs de trop gros volumes pour un juvénile). En ce qui concerne le prélèvement de tissu caudal par section de l’extrémité de la queue (
Devenir
Les animaux sont tous relâchés dans leur population d'origine à l'emplacement exact de leur capture, immédiatement après les mesures phénotypiques sur le terrain pour les sub-adultes et les adultes mâles, et après une période d'hébergement temporaire d'environ 1 mois (maximum 2 mois) pour les femelles et au maximum 4 jours après la mise-bas pour les juvéniles.
Remplacement
Nous ne pouvons par essence pas remplacer ce modèle par un modèle non-vivant, car nous ne connaissons pas les paramètres, notamment sélectifs, génétiques et liés à la plasticité phénotypique, permettant de modéliser l’évolution des populations de reptiles face aux changements de leur environnement. Les suivis de long-terme comme celui-ci sur une espèce de reptiles se comptent au mieux sur le doigt d’une main et sa poursuite est donc essentielle.
Réduction
Le suivi demande la plus grande exhaustivité du marquage individuel par rapport à la taille de la population, permettant d’identifier en moyenne 80 à 90 % de la population chaque année. La non-exhaustivité sur la population rendrait le projet caduc suite notamment à de trop nombreux apparentements inconnus. En revanche, la taille de population permet de dégager la puissance suffisante pour les analyses, notamment grâce à l’accumulation d’année en année. Le nombre total maximum d’individus mobilisés est de 1200 chaque année (durée du projet de 5 ans, 4 ans à partir de l'AVENANT 2024, soit 5700 individus au maximum).
Raffinement
La période d’hébergement est réduite à la seule fin de pouvoir suivre les mises-bas. Les animaux sont hébergés dans des terrariums adaptés à leur espèce avec source de chaleur, support, cache et litière tourbée. Les animaux reçoivent également une alimentation à base d’insectes et de larves. Cet enrichissement de milieu spécifique permet de répondre à leurs besoins biologiques, physiologiques et comportementaux et de garantir les meilleures conditions de vie en captivité, avant la remise en liberté. Les critères d’arrêt pour ce projet sont l’incompatibilité éventuelle à la captivité ou des problèmes de santé non réversibles. L'évaluation des performances locomotrices sont basés sur des protocoles connus et adaptés à l'espèce. Les animaux sont soumis à un contrôle régulier de leur santé, de leur poids et de leur comportement. En cas de problème de santé (lésions ou infections), ils reçoivent des traitements adaptés sous la supervision d’un vétérinaire. Des tests de raffinement à base de gel de lidocaïne (anesthésique local) pour l'amputation de phalanges chez les adultes seront poursuivis au cours de ce projet.
Choix des espèces
Le lézard vivipare (Zootoca vivipara) est étudié depuis plus de 30 ans dans les populations naturelles et dans différents dispositifs expérimentaux. Cette espèce est intéressante pour comprendre l’écologie de vertébrés terrestres ectothermes. Son écologie est bien connue, les populations étudiées forment le plus long suivi chez une espèce de reptile et son génome a été séquencé, ce qui en fait un modèle unique pour les vertébrés terrestres ectothermes. Il a donc une forte valeur pour l’écologie fondamentale mais aussi appliquée. L’espèce n’est pas menacée en Europe (préoccupation mineure - UICN) mais elle est sensible aux dégradations anthropiques de son milieu, y compris climatiques, et de ce fait, protégée au titre de l’article 3 de l’arrêté du 8 janvier 2021 « fixant la liste des amphibiens et des reptiles représentés sur le territoire métropolitain protégés sur l'ensemble du territoire national et les modalités de leur protection ». Son groupe comprend également de nombreuses espèces menacées d’extinction en Europe et à forte valeur écologique. Il devient donc urgent de mieux comprendre la dynamique écologique et évolutive de ces espèces face aux changements globaux.
Rôle des ARN spermatiques dans l’hérédité des maladies métaboliques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Pour vérifier si l'obésité se transmet à la descendance par les ARN des spermatozoïdes, des ARN prélevés chez des hommes obèses sont microinjectés dans des œufs fécondés de souris, et la descendance est laissée grossir. 744 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À quatre mois elles subissent un test de tolérance au glucose, à quatre mois et demi un test de sensibilité à l'insuline, avec des prises de sang à la queue toutes les quinze minutes la première heure puis toutes les demi-heures. Une souris qui perd 10 % de son poids deux semaines de suite est tuée, et les autres le sont à cinq mois et demi pour prélever reins, tissus adipeux, cœur, pancréas, prostate, cerveau et foie.
Objectifs
L'obésité pose aujourd'hui un grave problème de santé publique. Bien que cette pathologie soit étroitement associée à une mauvaise hygiène de vie, de plus en plus de données épidémiologiques et expérimentales convergent vers la même idée : nos gènes se « souviennent » de l’hygiène de vie de nos parents ou en d’autres termes un phénotype nouvellement acquis ici l’obésité peut être transmis à la descendance via la lignée germinale paternelle et/ou maternelle. Ce type d’hérédité non darwinienne est un processus nouveau mettant en jeu des mécanismes dits « épigénétiques » qui font appel à des modifications qui ne sont pas codées par la séquence nucléotidique du gène. Contrairement aux modifications génétiques, les modifications épigénétiques induites par l’environnement sont instables et ne persistent que pendant 2 ou 3 générations. Les mécanismes moléculaires impliqués dans ce type d’hérédité sont encore très mal connus. On sait néanmoins que les petits ARNs présents dans le spermatozoïde de souris rendues obèses par une alimentation riche en graisse et en sucre sont les vecteurs de cette hérédité. L'objectif principal de notre projet est de valider le rôle des ARN des spermatozoïdes dans l’hérédité épigénétique de l’obésité chez l'homme. Pour cela, des ARN de spermatozoïdes d’hommes obèses et d’hommes non-obèses seront microinjectés dans des œufs fécondés de souris. Les caractères obèse et diabétique seront analysés sur les animaux obtenus. La présente demande correspond à l’analyse phénotypique des animaux obtenus après microinjection et de leurs descendants.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider le rôle des ARN de spermatozoïdes comme vecteurs de l'information épigénétique de l'obésité et du diabète chez l'homme. Sur le plan fondamental, ce projet conduira à mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans l’hérédité de l’obésité et du diabète chez l’homme. Sur le plan clinique, cette compréhension est une étape importante pour sinon stopper au moins ralentir l’épidémie mondiale de l’obésité. Cela conduira à identifier les parents, ici les pères, susceptibles de transmettre cette maladie à leurs descendants. Dans un premier temps, ce projet apportera des arguments aux cliniciens pour intégrer les parents et les descendants de parents obèses dans des programmes de prévention. Dans un deuxième temps, ce projet permettra de valider une méthode pour enlever ces marques épigénétiques délétères (marques non stables) soit via des voies interventionnelles (amaigrissement) soit par des voies moléculaires (éliminant des molécules inductrices).
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à 3 séries de prélèvements. A l'âge de 4 mois, les souris subissent un test de tolérance au glucose (Test GTT) et à l'âge de 4mois 1/2 un test pour mesurer leur sensibiltié à l'insuline (test ITT). Pour ces 2 tests, du sang sera prélevé au niveau de la queue . La glycémie est vérifiée toutes 15min la 1ère heure et toutes les 30 min la 2ème heure. A l'âge de 5 mois, les souris seront mises à mort et un prélèvement de sang sera effectué.
Impact sur les animaux
A notre connaissance, les animaux obtenues après microinjection d'ARN de spermatozoïdes ne développent pas de pathologies graves. Même si elles peuvent devenir obèses et diabétiques, la sévérité de ces pathologies reste modérée. L' Injection Intrapéritonéale de Glucose ou d'Insuline et le prélèvement à la queue, associés aux tests GTT et ITT, induisent une douleur légère de courte durée. Le prélèvement de sang en fin de procédure induit également une douleur légère de courte durée.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de la procédure expérimentale. Cela nous permettra de prélever plusieurs tissus (reins, tissus adipeux, coeur, pancreas, prostate, cerveau, foie). Certains seront directement congelés pour des analyses moléculaires et d'autres seront fixés pour analyses histologiques. Ce matériel biologique nous est indispensable pour réaliser les analyses moléculaires nécessaires à la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans l'hérédité épigénétique de l'obésité et du diabète.
Remplacement
Notre travail porte sur la transmission paternelle de caractères nouvellement acquis chez les mammifères et plus spécifiquement l'hérédité. L’hérédité épigénétique a été étudiée sur plusieurs modèles animaux vertébrés ou non-vertébrés. En utilisant des vers, il a été ainsi montré que les ARN étaient un vecteur de l’hérédité épigénétique pour des caractères sensorielles. Le rôle des ARN des spermatozoïdes comme vecteurs connus de cette hérédité a été montré chez la souris car il n’est pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou des modèles animaux non vertébrés pour étudier le rôle des ARN dans l’hérédité épigénétique de l’obésité. C'est pourquoi nous devons utiliser ce modèle expérimental animal pour valider l'hypothèse selon laquelle les ARN des spermatozoïdes sont des vecteurs de l'hérédité chez l'homme. Seul le modèle murin peut permettre de récapituler toutes les étapes de développement embryonnaire d’un organisme multicellulaire de mammifère. A l’heure actuelle, ce type de différenciation ne peut pas être réalisé in vitro. C’est pour cela que ce modèle a été utilisé jusqu’à présent et a permis démontrer que les ARN de spermatozoïdes de souris étaient un vecteur de l’hérédité épigénétique de l’obésité. Pour savoir si cela reste vrai chez l’homme, seul ce modèle expérimental est disponible. C’est pourquoi nous avons choisi de l’utiliser. Nous avons utilisé comme approches alternatives le vers pour étudier les mécanismes moléculaires de l’hérédité épigénétique. Néanmoins même si grâce à cette approche, nous avons pu identifier des mécanismes moléculaires associés, nous ne pouvons définir si ces mécanismes sont identiques dans des modèles animaux expérimentaux comme la souris et si ces mécanismes épigénétiques s’appliquent pour des maladies métaboliques comme l’obésité et le diabète de type II. Néanmoins les différences spécifiques entre les espèces et les tissus peuvent limiter la généralisation des résultats obtenus à partir de ce modèle non vertébré. Par conséquent, il est nécessaire d'utiliser ce modèle animal vertébré, la souris, pour obtenir une vision plus complète de la complexité de l'hérédité épigénétique de l'obésité et valider l'hypothèse selon laquelle les ARN des spermatozoïdes sont des vecteurs de l'hérédité chez l'homme.
Réduction
Avant ces expériences, nous avons utilisé, parallèlement à notre modèle murin et en collaboration, un modèle non-vertébré, Caenorhabditis elegans, un petit ver transparent et non parasitaire. Ce modèle nous a permis d’étudier certains aspects des mécanismes moléculaires de cette hérédité sans avoir recours au modèle animal vertébré. D’autre part afin de calculer la taille de l’échantillon nécessaire, nous avons réalisé un calcul de puissance basé sur nos précédentes expériences, test qui permet de minimiser le nombre d’échantillons et donc d'animaux nécessaires pour valider ou non notre hypothèse de départ. Enfin, grâce à nos analyses du transcriptome d'hommes obèses, nous avons sélectionné les hommes où les variations transcriptomiques étaient les plus fortes. Ce sont ces préparations qui seront utilisées dans ces expériences pour maximiser les potentiels effets des ARN sur la descendance.
Raffinement
Dans un souci de Raffinement, voici les dispositions que nous mettrons en place pour minimiser les souffrances éventuelles et le stress qui pourraient être générées par nos expériences : • Nous nous attendons à ce que nos souris deviennent obèses. Pour éviter de les séparer lorsqu’elles vieillissent (et ainsi de respecter le maximum de souris autorisées par cage) et de les stresser inutilement (en évitant de perturber la dominance déjà établie), les souris seront regroupées par 4 dans une cage dès leur arrivée à l’animalerie. Ces animaux seront observés hebdomadairement pour pouvoir détecter d’éventuels problèmes. Si un de nos animaux est gravement blessé (bagarre ou autres), et/ou perd 10% de son poids pendant 2 semaines consécutives, cet animal sera mis à mort et répertorié. • Un intervalle d’au moins une semaine sera respecté entre chaque test GTT et ITT et limite ainsi les manipulations des animaux. • Toutes les souris seront manipulées au moins une fois par semaine • Les souris seront identifiées par punch à leur arrivée. Cette identification est définitive et ne peut pas induire d’infection. D’autre part, elle permet une identification rapide des souris lors des tests GTT et ITT et limite ainsi les manipulations des animaux. • Afin de limiter le stress lors des tests GTT et ITT, chaque souris sera identifiée par 0, 1, 2 ou 3 traits au feutre au niveau de la queue pour accélérer leur identification (feutre inodore spécial et non toxique). Le premier test (GTT) sera réalisé lorsque la souris sera âgée de 4 mois, le second test (ITT) sera réalisé une à deux semaines après. Lors des tests de GTT et ITT, la glycémie sera vérifiée toutes les 15 min (1ère heure) toutes les 30 min (2ème heure) pendant une période de 2 heures. Si lors des tests ITT, la glycémie est faible (
Choix des espèces
Notre projet porte sur la transmission paternelle de caractères nouvellement acquis sur un mammifère. Nous avons choisi d’utiliser la souris car la technique de micro-injection d’ARN dans les œufs fécondés est solidement établie dans cette espèce ce qui n’est pas le cas chez le rat seul autre modèle expérimental de mammifère largement utilisé pour étudier l’obésité et le diabète. D’autre part, au cas où nous voudrions poursuivre ce projet en étudiant l’impact de gènes spécifiques dans ce mode d’hérédité, nous pourrions utiliser ou générer des souris génétiquement modifiées invalidées pour le gène d’intérêt. Les pesées seront réalisées une fois par semaine de l’âge de 1 à 5 mois 1/2. Cela nous permettra de suivre le possible développement de l’obésité. Les tests GTT et ITT seront effectués à l'âge de 4 mois et 4mois 1⁄2 respectivement. En effet, nos résultats ainsi que ceux publiés par d'autres groupes montrent que la micro-injection d'ARNs spermatiques dérivant de souris obèses induit le diabète seulement chez les animaux adultes. Les prélèvements de sang terminal et d’organes et tissus (reins, tissus adipeux, coeur, pancreas, prostate, cerveau, foie) seront réalisés à l’âge de 5 mois 1/2. La mise à mort aura lieu 2 semaines après le dernier test pour que les souris récupèrent d’un éventuel stress et que les analyses moléculaires ne soient pas altérées.
Rôle des rythmes circadiens dans le développement des maladies du foie
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Trente-deux semaines de régime hypercalorique, un bout de queue coupé sous anesthésie pour le génotypage, huit prélèvements de sang à la queue lors du test métabolique : 945 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie d'entre elles est gardée vivante pour l'élevage ou pour la seconde procédure, les autres sont tuées pour prélèvement des tissus. Le projet cherche à savoir si le dérèglement de l'horloge biologique aggrave la stéatose hépatique et le cancer du foie, en laissant les souris devenir obèses puis malades. Le porteur affirme que "la stéatose hépatique n'induit pas de nuisance" et que "le cancer du foie n'est pas douloureux", tout en décrivant l'ascite et l'encéphalopathie hépatique qui peuvent survenir, avec prostration, arrêt de l'alimentation et pelage négligé.
Objectifs
Le cancer du foie est une maladie en pleine expansion avec actuellement plus de 8500 nouveaux cas par an en France et plus de 7000 morts par an. En dehors des causes classiques provoquant une inflammation du foie comme les virus, l’inflammation sur foie surchargé en lipides (stéatose) est une maladie qui prend de plus en plus d’importance dans les pays développés. Cette maladie est due à l’association de plusieurs facteurs comme l’obésité, le diabète, ou le manque d’oxygène résultant de la maladie de l’apnée du sommeil. Lorsque l’on regarde de plus près ces facteurs, il a été montré que le dysfonctionnement de l’horloge biologique, aussi appelée horloge circadienne, est impliquée. L’horloge circadienne, permet aux organismes de régler leur activité en fonction du cycle journalier. De plus, à ce jour un seul traitement médicamenteux est approuvé pour le cancer du foie (carcinome hépatocellulaire). Cependant, ce traitement ne permet qu’une modeste amélioration de la survie et entraine souvent des effets secondaires qui altèrent la qualité de vie du patient. Il existe un besoin urgent de thérapies nouvelles, efficaces et sûres. Puisque les désordres métaboliques et l’horloge circadienne impliquent plusieurs organes, il est essentiel d'utiliser un modèle d'animal avec un carcinome hépatocellulaire qui associe tous les désordres sous-jacents observés chez le patient. Cela permet d'étudier l'efficacité des médicaments sur les tumeurs, mais aussi la tolérance du traitement. Cette étude permettra d’étudier l’influence et le rôle de l’horloge circadienne sur le développement du cancer du foie sur un foie stéatosé. Des études antérieures ont permis d’identifier des protéines qui régulent l’horloge. L’objectif de cette demande est maintenant de caractériser le rôle ces protéines dans le foie, pendant le développement de la stéatose, fibrose hépatique et les complications ultérieures, en combinant approches génétiques chez la souris, et analyses à grande échelle des gènes et protéines. Le modèle permettra aussi de déterminer les mécanismes moléculaires sous-jacents.
Bénéfices attendus
Les maladies de foie gras représentent une part importante des consultations chez le médecin et la prise en charge globale du patient représente un coût important pour le système de santé. Dans le cadre de cette étude, nous pourrons établir l’influence et le rôle de l’horloge circadienne dans l’établissement et le fonctionnement des maladies de foie gras. En conséquence, ce projet sera bénéfique à plusieurs échelles : démontrer des mécanismes de régulation importants des gènes de l'horloge, et de comprendre le mécanisme épigénétique de l’établissement de la stéatose hépatique et éventuellement le cancer du foie ; identifier un nouveau facteur de risque des maladies du foie gras, et donc les populations à risque de mauvais pronostic ; enfin de mettre en évidence la nécessité d’une prévention et surveillance plus étroite au niveau hépatique des personnes ayant un cycle journalier perturbé comme le jet-lag ou le travail de nuit
Procédures
Toutes les souris sont vigiles sauf indication contraire. Pour faire des analyses génétiques, un prélèvement unique du bout de la queue est réalisé à 17-21 jours de vie sous anesthésie (3min d’anesthésie,
Impact sur les animaux
Les prélèvements à la queue, ainsi que les injections dans le ventre lors des tests métaboliques provoquent une douleur légère et transitoire. La mise à jeun avant le test métabolique peut générer de l'incofort transitoire (période de jeun 6h). Le régime alimentaire va induire une réduction de la prise alimentaire car il est riche en graisse. Cependant des résultats antérieurs montrent que en terme d'apport calorique, des souris nourris avec ce régime là ont la même consommation calorique que des souris nourris avec un régime standard. La stéatose hépatique n’induit pas de nuisance. Nous n’attendons pas de décompensation de cirrhose. Si tel est le cas, cela se traduira par une ascite (abdomen distendu) ou des signes d’encéphalopathie hépatique qui correspond à une détérioration de la fonction du cerveau à cause de substances toxiques qui s'est accumulé dans le sang car le foie est trop atteint pour pouvoir correctement éliminer ces substances du sang (critères d’évaluation spécifiques : prostration, absence d’alimentation, pelage mal entretenue) Le cancer du foie n’est pas douloureux et des métastases ne sont pas attendues avec notre protocole d’induction des maladies métaboliques du foie. Les mâles de certaines lignées de souris peuvent montrer des signes d’agressivités.
Devenir
Une partie des animaux de la première procédure est gardé en vie pour être inclus dans la seconde procédure ou pour l’élevage. Les autres animaux sont mis à mort pour prélèvement des tissus. Tous les animaux de la deuxième procédure sont mis à mort pour prélèvements des tissus à analyser
Remplacement
Le développement du cancer du foie est un processus qui implique différents types de cellules au sein du foie et la maladie du foie stéatosé associe plusieurs facteurs, dont des perturbations métaboliques systémiques. Les lignées de cellules cancéreuses humaines du foie ne permettent pas de reproduire tous ces processus, en partie multi-organes. L’utilisation du modèle animal n’est donc pas pour l’instant remplaçable dans ce type d’étude.
Réduction
Un calcul des effectifs nécessaires basé sur une variable biologique simple (augmentation de 20% des scores qui permettent le diagnostique des différentes maladies : stéatose, la maladie métabolique du foie et le carcinome hépatocellulaire) nous permettra d'atteindre une significativité des résultats avec un minimum d'animaux. Notre approche statistique est basée sur la comparaison de deux moyennes. 7 animaux mâles par condition expérimentale en fin d’expérience sont nécessaires. En effet les stades de la pathologie peuvent être variable d’un animal à l’autre. Compte tenu du risque de perte de matériel biologique pendant l'expérience (mort inexpliquée d'un animal avant la fin de l'expérience ou atteintes des points limites), nous prévoyons un maximum de 9 souris mâles par groupe d’analyse. Les animaux produits mais qui n'entrent pas dans le projet pour des raisons génétiques, pourront être utilisés pour la mise au point d'autres études grâce à des prélèvements d'organes post-mortem
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’étude. Les animaux seront pesés une fois par semaine pour suivre l’évolution de la maladie et détectés tous signes précoces de souffrance. L'établissement des scores pour les points limites aura lieu à ce moment là, une fois par semaine. En cas d'apparition de signe de souffrance, la fréquence des observations pourra être augmentée jusqu'à trois fois par jour. La nourriture sera renouvelée deux fois par semaines. Un anesthésiant sera utilisé au moment du prélèvement à la queue afin de prévenir et/ou réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse dans le cas où elles surviendraient. En cas d’agressivité les mâles sont séparés. En cas de blessure la plaie est désinfectée. Si elle devient trop invalidante, la souris est mise à mort.
Choix des espèces
Du fait de sa grande similitude avec l’homme en terme de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris présente un modèle expérimental privilégié pour les investigations des maladies circadiennes et métaboliques survenant chez l’homme. De plus les mécanismes impliqués sont pour la plupart identiques chez l'homme et la souris. Il est possible aujourd'hui d'étudier les conséquences directes de la perturbation fonctionnelle d'un gène ou d'une protéine chez la souris dans un contexte de fibrose ou stéatose hépatique qui reproduit très précisément les caractéristiques des lésions hépatiques humaines. Les souris seront incluses dans le protocole dès l’âge de 17-21 jours pour l’étape d’analyse génétique. L’apparition des pathologies que l’on étudie chez le patient se développent à l’âge adulte. C’est pourquoi les souris mâles seront mises au régime alimentaire dès 7 semaines, et mises à mort entre 7 et 39 semaines.
Effets des hormones thyroïdiennes chez Proteus
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
48 protées, amphibiens cavernicoles qui vivent plus de quatre-vingts ans sans jamais se métamorphoser, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, puis remis en élevage avec leurs congénères après cicatrisation. Chaque animal est baigné six heures dans des hormones thyroïdiennes, puis un fragment de peau lui est coupé au bistouri, sous anesthésie, à l'extrémité de la queue. D'autres sont enfermés dans un récipient hermétique le temps que leur consommation d'oxygène soit mesurée. La plaie met plusieurs semaines à cicatriser et plusieurs mois à se régénérer, et le porteur conclut qu'aucune culture de cellules ne remplacerait cette espèce, trop singulière biologiquement et phylogénétiquement.
Objectifs
L'objectif est d'apporter des connaissances nouvelles concernant la biologie de l'amphibien Protée (Proteus anguinus) cavernicole obligatoire. C'est un animal remarquable sur plusieurs points : contrairement à l'immense majorité des amphibiens, il n’entreprend jamais de métamorphose qui permet de passer de la forme larvaire au stade adulte (c’est comme si il restait bloqué au stade têtard), et atteint par contre une longévité hors du commun (plus de 80 ans). Les hormones produites par les glandes thyroïdiennes sont cruciales dans le déclenchement de la métamorphose et le contrôle de l'activité métabolique (ensemble des transformations chimiques et biologiques qui s'accomplissent dans l'organisme) qui peut jouer par ailleurs sur la longévité (en théorie plus le métabolisme est lent, plus la longévité est importante). Le projet consiste donc ici à mesurer la réponse aux hormones thyroïdiennes par deux types de mesures complémentaires : d'une part quels gènes sont exprimés (dite réponse transcriptionnelle), et d'autre part les variations d'activité métabolique. Les variations d'expression des gènes seront mesurées sur un tissu connu pour répondre très fortement aux hormones thyroïdiennes chez les autres espèces d'amphibiens : la nageoire présente au niveau de la queue. L'activité métabolique sera mesurée dans une enceinte équipée d'un capteur à oxygène permettant de mesurer la consommation de l'oxygène par l'individu lors de sa respiration.
Bénéfices attendus
Le projet vise à établir clairement si le Protée est sensible ou non aux hormones thyroïdiennes. Si on ne s’attend pas à une réponse en termes de déclenchement de la métamorphose chez cette espèce d’amphibien chez qui ce processus ne se déroule jamais, on pourrait mesurer cependant des changements au niveau de l’expression de ses gènes et au niveau métabolique, qui pourrait expliquer en partie le ralentissement de son développement, de son activité basale et son extrême longévité, en réponse adaptative à la vie en milieu souterrain.
Procédures
Une première procédure consiste à traiter les animaux sont par un bain d’hormones thyroïdiennes pendant 6 heures. Un prélèvement de peau à l’extrémité de la queue est pratiqué sous anesthésie générale par coupe au bistouri. Après le prélèvement, on coagule la plaie, et on applique localement un anti-douleur et un désinfectant. Les animaux sont remis dans de l'eau désinfectée jusqu'au réveil. Au réveil, ils sont baignés dans une solution antiseptique, puis remis en élevage jusqu’à complète cicatrisation. Une autre procédure consiste à placer les animaux dans un récipient fermé hermétiquement rempli d’eau très oxygénée à température optimale. Leur consommation en oxygène sera suivie pendant quelques heures à l’obscurité et au calme. La durée de la mesure pourra variée en fonction de la vitesse de consommation de l’oxygène qui dépend de la masse de l’individu, mais pour se donner une marge de sécurité, l’expérience sera arrêtée si la concentration en oxygène descend à un seuil fixé très supérieur à la condition susceptible de provoquer des difficultés respiratoires. Ces mêmes individus seront ultérieurement (plusieurs semaines après) traités aux hormones thyroïdiennes, puis la mesure sera répétée et comparer à la première. Ce même protocole sera réalisé avec des individus différentes de ceux qui auront subi un prélèvement de peau.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de peau au niveau de la nageoire de la queue qui est très fine à son extrémité occasionnera une légère blessure amenée à se cicatriser lentement sur plusieurs semaines dans des conditions optimales (température de 12°C, eau à saturation en oxygène et dépourvue de pathogènes, alimentation régulière, obscurité constante, sans nuisance sonore). Puis, le tissu devrait se régénérer également très lentement sur plusieurs mois. En cas de problème de cicatrisation et/ou d’infection, l’animal recevra un traitement local d’analgésique et d’antiseptique. En cas de persistance d’une infection jusqu’à une nécrose associée à une souffrance (refus de s’alimenter, absence de réaction, posture anormale) qui ne laisse pas de doute sur l’évolution défavorable de la santé de l’animal, celui-ci sera euthanasié par surdose d’anesthésique. Après cicatrisation, l’animal sera remis en élevage avec ses congénères. Il ne sera pas utilisé dans une autre procédure.
Devenir
Tous les animaux seront remis en élevage avec leurs congénères après cicatrisation.
Remplacement
Il s’agit de recherche fondamentale visant à étudier les effets des hormones thyroïdiennes sur un organisme tout à fait particulier qui semble rester tout sa vie avec des caractères larvaires, et qui plus est cavernicole obligatoire (le seul d’Europe) et à longévité remarquable (plus de 80 ans). Les effets sont attendus chez l'individu dans sa globalité (réactions de nombreux tissus) aux niveaux métaboliques et de l’expression de gènes, ce qui ne peut être abordé par des alternatives faisant appel à des cultures d’organes ou de cellules isolées ou un chez un autre modèle du fait de la spécificité de l’espèce considérée aux niveaux biologique, écologique, phylogénétique (relation de parenté entre les espèces en fonction de leur similitude génétique).
Réduction
Nous avons choisi de limiter les interventions à une seule biopsie par individu. Le nombre d’animaux prévu pour subir le prélèvement est réduit à 3 individus par lot (3 juvéniles non traités, 3 autres juvéniles traités aux hormones thyroïdiennes, 3 femelles non traitées, 3 autres femelles traitées aux hormones thyroïdiennes, 3 mâles non traités, 3 autres mâles traités aux hormones thyroïdiennes), ce chiffre de 3 étant le standard pour les études portant sur l’expression et la régulation des gènes. En outre, ce qui est recherché ici, ce sont uniquement des réponses contrastées, entre les stades juvénile et adulte d’une part, et entre les sexes femelle et mâle d’autre part.
Raffinement
Les étapes de la procédure seront pratiquées en laboratoire en conditions optimales pour l’espèce c’est-à-dire dans une eau osmosée stérilisée, à température contrôlée (12°C), à saturation d’oxygène et au calme à l’obscurité constante, jusqu'à complète cicatrisation qui devrait durer plusieurs semaines. Un abri en verre facilement nettoyable et stérilisable sera proposé à ces animaux qui apprécient de se réfugier dans les anfractuosités.
Choix des espèces
Le Protée est un amphibien qui ne se métamorphose jamais c’est-à-dire qu’il semble bloqué dans son développement au stade larvaire, caractéristique longtemps interprétée comme un défaut d'activité de la glande thyroïde (ou du moins atténuée). Il dispose pourtant d'une glande thyroïde qui mature graduellement. Les traitements aux hormones thyroïdiennes sont restés sans effets apparents sur les tissus habituellement cibles, fortement modifiés lors de la métamorphose chez les autres amphibiens (disparition des branchies et développement d’un poumon, modification de la peau, du squelette, du système digestif etc.). Les approches moléculaires promettent d'être beaucoup plus sensibles et résolutives pour mettre en évidence des effets sur la régulation des gènes et le métabolisme. En outre, c’est un animal européen disponible en captivité, en environnement contrôlé, sans besoin de prélèvement in natura. L'élevage a permis de décrire le cycle de développement inconnu en nature, et de démontrer l'absence de métamorphose à maturité sexuelle (15 ans, âge maximal pour l'instant en captivité 52 ans, longévité estimée à plus de 80 ans). L’obtention de transcriptomes c’est-à-dire de l’ensemble des gènes exprimés chez des juvéniles et adultes des deux sexes vise à déterminer un transcriptome de référence pré et post maturité sexuelle chez cette espèce qui semble pourtant bloquée tout au long de sa vie dans son développement au stade larvaire.
Chirurgie guidée par la fluorescence de tumeurs orthotopiques de cancers du côlon, du pancréas et de modèles de métastases d’origine colique dans des souris immunocompétentes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Ouverture de la cavité abdominale, implantation de cellules tumorales dans le pancréas ou le cæcum, ablation de la rate pour le modèle de métastases hépatiques, fermeture : trente minutes par souris. 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont ensuite transférées dans un second établissement, reçoivent une injection tous les sept jours sous anesthésie, passent une imagerie hebdomadaire, puis subissent une seconde ouverture de l'abdomen pour l'exérèse de la tumeur guidée par fluorescence, soit deux laparotomies par animal. Toutes sont tuées et autopsiées pour vérifier l'absence de reprise tumorale, au terme d'une démonstration que le porteur juge impossible autrement que sur des animaux porteurs de ces tumeurs.
Objectifs
Malgré l'émergence des thérapies personnalisées, la chirurgie joue toujours un rôle essentiel dans le traitement de nombreux cancers comme les cancers colorectaux et pancréatiques. Un problème majeur réside dans la difficulté de détecter les tumeurs et de visualiser les marges tumorales. La chirurgie guidée par fluorescence (FGS) permet aux chirurgiens une meilleure visualisation de la tumeur en temps réel. De plus, la FGS peut être améliorée en associant de l’imagerie nucléaire (SPECT) avant l’opération pour localiser avec précision les tumeurs. Dans le projet, nous proposons de faire la preuve de concept de l’intérêt d’utiliser des anticorps ciblant les tumeurs, conjugués à une sonde (Ac bimodaux) permettant de réaliser de l'imagerie bimodale (SPECT/fluorescence) afin d'améliorer l’analysé pré-opératoire de la tumeur (SPECT), la détection pendant l’opération des tumeurs et leur élimination (FGS) mais aussi d'améliorer le suivi post-opératoire (SPECT). L’utilisation de ces Ac bimodaux dans des modèles de tumeurs sous-cutanées a déjà été démontré, ils permettent la visualisation et l’élimination de cette tumeur facile d’accès. Pour prouver le potentiel thérapeutique de l’utilisation de ces Ac bimodaux en chirurgie par fluorescence, il nous faut maintenant démontrer l’intérêt de cette technologie dans des modèles précliniques mimant la pathologie humaine, tels que des modèles de cancer du côlon et du pancréas se développant sur ces organes, mais aussi des modèles mimant la formation de métastases hépatiques ou de carcinomatoses péritonéales. Ces travaux sont en cours de réalisation dans des souris qui sont déficientes en système immunitaire et permettent de greffer des cellules cancéreuses d’origine humaine. Pour mimer encore plus ce que nous pouvons retrouver chez l’homme, nous utiliserons dans ce projet des souris présentant un système immunitaire pour vérifier que les résultats retrouvés seront similaires à ceux obtenus dans les souris immunodéficientes. Ce projet se déroule sur 2 établissements utilisateurs, le premier dans lequel sera développé les modèles tumoraux, le second dans lequel l’imagerie et la chirurgie assistée par fluorescence seront réalisées.
Bénéfices attendus
Le but de ce travail est de pouvoir mettre au point des modèles précliniques, chez la souris immunocompétentes, mimant la pathologie humaine des cancers coliques et pancréatiques avec des tumeurs se développant sur les organes et mimant ainsi des tumeurs primaires et des modèles mimant la formation de métastases hépatiques ou de carcinomatoses péritonéales d’origine colique. Les bénéfices attendus par ce projet sont de pouvoir développer des modèles précliniques de modèles de cancers afin de pouvoir démontrer l’intérêt de l’utilisation de la chirurgie assistée par fluorescence après administration d’Ac bimodaux. Ce projet devrait permettre une meilleure prise en charge chirurgicale des patients atteints de cancers primaires ou métastatiques en permettant une meilleure détection des tumeurs, facilitant leur élimination en épargnant le tissu sain et évitant ainsi une récidive tumorale.
Procédures
Trois des modèles nécessiteront l’utilisation d’une procédure chirurgicale (sous anesthésie gazeuse) afin d’implanter les cellules tumorales. Cet acte (30 min/souris) implique l’ouverture de la cavité abdominale, l’implantation des tumeurs (cellules) la fermeture de la cavité abdominale. Dans le cas du modèle de métastases hépatiques, la rate de ces souris sera enlevée suite à l’injection des cellules tumorales. Pour le modèle de carcinomatose péritonéale, les cellules tumorales seront injectées en intrapéritonéale après anesthésie gazeuse des souris (1-2 min/souris). Ce développement de modèles tumoraux aura lieu dans l’établissement utilisateur 1. Les souris seront alors transférées dans l’établissement utilisateur 2. Les souris recevront 1 injection intrapéritonéale (1-2 min/souris) tous les 7 jours (sous anesthésie gazeuse) du composé permettant l’imagerie des tumeurs. Ces souris seront ensuite anesthésiées pour être imagées. Tous les animaux porteurs de tumeurs (orthotopiques ou métastases) subiront une chirurgie d’exérèse assistée par fluorescence après injection des Ac bimodaux (30 min/souris).
Impact sur les animaux
- L’acte chirurgical nécessite d’ouvrir la cavité abdominale des souris, d’injecter des cellules tumorales dans le pancréas ou le caecum, ou d’enlever la rate. Ces interventions chirurgicales pourraient entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales. - Le développement de grosses tumeurs mais également de métastases pourrait avoir des effets indésirables, la taille de ces tumeurs sera estimée 1 fois par semaine par imagerie. - L’acte chirurgical d’exérèse nécessite d’ouvrir la cavité abdominale des souris. Ces interventions chirurgicales pourraient également entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de pouvoir vérifier par autopsie l’absence de reprise tumorale.
Remplacement
La preuve de concept de l’utilisation de ces Acs bimodaux pour de la chirurgie assistée par fluorescence nécessite de pouvoir se rapprocher le plus possible de ce qui est retrouvé chez l’Homme et donc d’avoir les tumeurs primaires sur les organes d’origine et les métastases se disséminant chez des animaux pourvus d’un système immunitaire fonctionnel. Le but est de montrer que les tumeurs sont plus facilement détectables, qu’elles peuvent être éliminées plus finement et ainsi permettre une meilleure récupération post-chirurgie et enfin qu’il y a moins de récidive. Cette preuve de concept ne peut donc être faite que sur des animaux présentant ce type de tumeurs et sur lesquels sera fait la FGS. Tous les tests in vitro préalables ont déjà été faits, tout comme la preuve de concept sur des modèles plus artificiels d’animaux porteurs de tumeurs sous-cutanée, mais également dans des modèles de souris dépourvues de système immunitaire (en cours).
Réduction
Pour chaque Ac bimodal à tester (5), deux groupes de 5 souris (contrôle vs Ac bimodal) seront constitués afin de générer des groupes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer l’efficacité de la chirurgie tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. La visualisation de la récidive par imagerie SPECT après injection du même Ac bimodal permet de réduire le nombre d’animaux qui sont leur propre contrôle. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées (formation de niveau concepteur de projet avec soit une formation chirurgie du petit animal soit être chirurgien) afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les prises tumorales peuvent être différentes d’une chirurgie à l’autre, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes.
Raffinement
Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Les interventions chirurgicales seront précédées d’une antibiothérapie préventive. Tout au long de l’opération, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Étant donné que la température ne peut pas être contrôlée et que le risque d’hypothermie est sévère lors d’une anesthésie, des tapis chauffants seront utilisés tous le long de l’expérimentation du soin pré au post-opératoire. Des antalgiques sous forme injectable et sous forme de gel seront utilisés lors de la chirurgie puis sous forme injectable les jours suivant l’opération. A la suite de l’opération, chaque animal sera examiné et pesé. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. De plus, de la nourriture gélifiée sera mise dans la cage. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Les injections intrapéritonéales seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. Le développement des tumeurs (taille et nombre) sera estimé de manière non-invasive par imagerie.
Choix des espèces
Les souris sont les modèles utilisés pour tester facilement les nouveaux outils permettant de faire de la chirurgie assistée par fluorescence. Nous utiliserons des souris immunocompétentes, nous permettant d’implanter des cellules tumorales murines. Ces souris sont largement utilisées pour l’implantation de cellules cancéreuses murines en sous-cutanée mais également dans les organes d’origine. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g).
Etablissement par imagerie par résonance magnétique des références physiologiques de l’hémo-hydrodynamique cérébrale chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
Destinés à être cédés à d'autres expériences une fois le projet terminé, et tués si personne n'en veut, 32 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal passe des séances répétées d'IRM sous anesthésie gazeuse, et reçoit lors de la dernière un cathéter veineux posé sous anesthésie puis une injection de produit de contraste au gadolinium, pour trente minutes d'acquisition. L'objectif est de constituer un abaque de valeurs de référence des écoulements de sang et de liquide cérébrospinal dans le crâne du rat, données qui manquent aujourd'hui aux laboratoires. Le porteur affirme que l'imagerie "n'induit pas de souffrance" et qu'aucun effet du gadolinium n'est à craindre, tout en rappelant les nausées, céphalées et risques rénaux rapportés chez les humains qui en reçoivent.
Objectifs
Le système cranio spinal est constitué de 3 compartiments : les tissus du cerveau (et de la moelle), le réseau vasculaire et le liquide cérébrospinal (LCS). Les volumes de ces compartiments varient chez l’homme et l’animal en fonction de l’âge du sexe et d’autres facteurs comme les pathologies cérébrales. Le sang et le LCS sont en perpétuelle circulation et en interaction dans ce système sous l’influence à la fois des pressions cardiaque et pulmonaire ainsi que de la gravité. Depuis l’arrivée de la séquence imagerie par résonance magnétique (IRM) en contraste de phase il est possible de quantifier les écoulements du sang et du LCS dans le système sans être limité par la barrière osseuse. Notre équipe est pionnière dans l’investigation des écoulements du sang et du LCS chez l’homme. Elle a quantifié les écoulements de nombreuses populations témoin et utilise aujourd’hui ces informations en clinique dans l’investigation des hydrocéphalies, des hypertensions intracrâniennes et plus généralement dans les pathologies neurovasculaires. Plusieurs hypothèses proposent que les écoulements du sang et du LCS pourraient jouer un rôle dans la physiopathologie de ces maladies cérébrales largement étudiées en préclinique. L’étude de la dynamique des neurofluides suscite une attention récente et particulièrement depuis l’émergence et l’intérêt du système glymphatique. La dynamique des écoulements veineux, artériels et du LCS bien qu’elle soit fondamentale dans l’étude de ce mécanisme est peu étudiée chez l’homme. A notre connaissance aucune étude n’a été réalisée chez l’animal. Par ailleurs, les écoulements du sang et du LCS n’ont pas étaient quantifiés simultanément dans ces 3 compartiments. Or les altérations de la macro-vascularisation cérébrale sont connues comme participant à l’étiologie de nombreuses pathologies cérébrales. De plus, des études antérieures ont démontré qu'un flux sanguin cérébral anormal peut être associé à un risque vasculaire systémique. De nouveaux biomarqueurs basés sur la dynamique des neurofluides sont réalisables et seraient utiles aux études précliniques travaillant notamment sur le cerveau. Le rat est le modèle de choix dans de nombreuses études du système neurovasculaire. L’objectif de ce projet est d’utiliser l’IRM pour constituer de manière non invasive un abaque de référence des écoulements physiologiques (débit moyens et volume oscillatoire, …) sanguins cérébraux et du LCS chez le rat sein en fonction de l’âge, du poids et du sexe.
Bénéfices attendus
De nombreuses études précliniques du système neurovasculaire se font sur le rat, ce qui fait de lui un modèle de choix. Toutefois, il n’existe pas actuellement de données fonctionnelles de référence ("master data") sur l’écoulement du sang et du LCS dans la boîte crânienne chez le rat. Le bénéfice sera de disposer d’un abaque de références physiologiques décrivant les écoulements sanguins et du liquide cérébrospinal chez le rat sein. Ces résultats seront publiés et mis à disposition de la communauté scientifique. Ces informations seront utiles comme références pour potentiellement diagnostiquer et étudier les mécanismes sous- jacents aux pathologies cérébrales liées à la vascularisation ou la pression intracrânienne. Dans plusieurs maladies neurodégénératives, il existe entre autres une accumulation des protéines Tau et bêta amyloïde normalement évacuées par le réseau glymphatique qui fait actuellement l’objet de nombreuses études. Ce réseau microscopique est en lien directe avec la macro circulation du sang et du LCS. Le bénéfice de notre étude est de mettre en relation les données concernant la dynamique macro circulatoire avec celle de la micro circulation du système glymphatique. Les résultats obtenus seront utilisés pour préciser les similitudes existantes entre le rat et l’homme sur le plan dynamique des flux cerveau. Le bénéfice direct sera d’utiliser ces données inédites comme entrée d’un modèle numérique de la dynamique intracrânienne. Par ailleurs, Les résultats vont compléter les connaissances et les récentes découvertes concernant les écoulements et les interactions des neurofuildes chez l’humain. Les données issues de l’animal et de l’humain peuvent alors être comparées et analysées entre elles.
Procédures
Lors de la dernière séance d’acquisition d’images, l’implantation d’un cathéter en voie veineuse se fera sous anesthésie générale chez les 32 rats. Les animaux subiront par la suite une injection intraveineuse du produit de contraste sans effets indésirables notoires par le biais de ce cathéter. La durée d’acquisition de cette série d’images sera de 30 minutes environ pour chaque animal. A la fin de l’acquisition des images, le cathéter sera retiré de l’animal sous anesthésie avec une brève compression au point de ponction. Les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil. Lorsqu’ils auront repris conscience la température, l’apparence et l’état physique de l’animal seront contrôlés. Chaque animal ne sera pas injecté plus d’une fois la dose du produit de contraste.
Impact sur les animaux
L’IRM est une technique d’imagerie qui n’utilise aucun rayonnement ionisant et n’a pas d’effets secondaires sur l’organisme qui sont connus à ce jour et quel que soit le nombre d’examen. Il n’a pas été mentionné dans la littérature que des examens d’IRM répétés pourraient induire une situation de stress chez l’animal de laboratoire. Les seuls effets indésirables potentiels sont ceux liés aux procédures de l’anesthésie gazeuse à l’isoflurane (classée légère) bien connues et couramment utilisées dans ce type d’étude. Les animaux subiront une injection d’un produit de contraste à base de gadolinium (en intraveineuse à une dose de 0,03 mmol/kg) sous anesthésie lors de la dernière séance d’acquisition par IRM. Des effets secondaires tels que l’altération du gout, des nausées et des céphalées ont été rapportés chez certaines personnes ayant eu des IRM avec cet agent de contraste. Des facteurs de risques associés à l’emploi d’agents de contraste à base de gadolinium ont été également rapportées chez des patients présentant une insuffisance rénale sévère ou une transplantation hépatique. Chaque animal ne sera pas injecté plus d’une fois la dose du produit de contraste à base de gadolinium pendant toute la durée de cette étude..
Devenir
Tous les animaux seront gardés à vie jusqu’à la fin du projet. Dans le cas où ils ne peuvent pas être donner pour d’autres expériences, ils seront mis à mort à la fin du projet.
Remplacement
Les alternatives qui existent actuellement sont celles des modèles issus de fantômes. La complexité du système craniospinal limite l’utilisation de ces modèles, car certains paramètres comme la compliance, la pulsatilité et la viscosité du sang, de même que les effets des mouvements physiologiques du cœur et ceux des poumons ne sont pas pris en compte dans ces modèles de fantôme. Le rat est le modèle animal largement utilisé dans l’étude des maladies neurodégératives qui sont potentiellement liées à la vascularisation cérébrale et à la dynamique du LCS. Malheureusement il n’existe, pour l’heure, aucune valeur de référence permettant de comprendre ces perturbations au sein du modèle de référence utilisé. C’est pour répondre à cette problématique que le choix du modèle animal s’est porté sur le rat. Ces nouvelles données permettront aussi d’alimenter des modèles numériques, qui éviteront le recours aux modèles animaux dans le futur. Ces valeurs de référence permettront également d’évaluer l’impact de la dynamique des neurofluides sur l’homéostasie du système nerveux central (SNC) des modèles animaux étudiés.
Réduction
Au total 32 animaux répartis dans deux groupes de 16 mâles et 16 femelles seront utilisés sur 3 ans au maximum dans cette étude. La réduction du nombre d’animaux utilisés est rendue possible en faisant plusieurs acquisitions sur le même animal sans effets secondaires. Ces données d’imagerie nous permettrons d’analyser plusieurs paramètres IRM. L’objectif principal n’est pas d’établir des différences inter-groupe sur ces paramètres, mais d’établir des valeurs de référence concernant ces paramètres mesurés. C’est une étude pilote, à notre connaissance, il n’existe pas dans littérature des données relatives à la variance de ces paramètres ainsi qu’à leur distribution. Le nombre d’animaux (16 par sexe) a été réduit au minimum sur la base de nos connaissances et de notre expertise sur la conception de ce type d’étude chez l’humain. Les mesures répétées sur chaque animal nous permettrons de réaliser une analyse de la variabilité inter-individuelle ainsi que la variance sur des mesures répétées.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables dans des conditions de température, d’hygrométrie et de ventilation optimales. Ils bénéficieront d’un enrichissement varié de leur milieu (buchette, litière foisonnante, tube en carton, atténuation du bruit environnant, musique diffusée, …). Durant toute la durée d’acquisitions des images IRM, les paramètres physiologiques de l’animal seront surveillés par un système de monitoring non invasif (température, rythme cardiaque, fréquence respiratoire). La procédure d’imagerie IRM n’induit pas de souffrance, les rats seront anesthésiés tout au long de l’acquisition des images. Durant l’examen IRM, l’opérateur sera en mesure d’ajuster la dose d’anesthésie et/ou la température de la couverture chauffante lorsque la température corporelle de l’animal est inférieure à 35°C (ou supérieure à 37°C), son rythme respiratoire inférieur à 50 battements/min (ou supérieur à 150 battements/mn) ou sa fréquence cardiaque inférieure à 350 battements/mn (ou supérieure à 550 battements/mn). En cage d’hébergement, une surveillance accrue sera faite pour tout animal présentant une perte de poids comprise entre 5 et 20%, associée ou non à d’autres signes pouvant évoquer une situation de détresse de l’animal (pelage mal entretenu, dos vouté, dysorexie, anorexie, démarche altérée, isolement, explore très peu son milieu, …). En cas de signes évoquant une douleur légère ou modérée, une prise en charge par administration d’un antalgique non stéroïdien sera faite par voie orale. Si les signes de douleur persistent, une prise en charge par administration d’un analgésique en sous-cutanée sera envisagée sous anesthésie. S’il n’y a pas d’amélioration ou en cas de perte de poids supérieure à 20% l’animal sera alors euthanasié sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Les pathologies touchant le système nerveux central font l’objet de nombreuses études scientifiques. La plupart de ces études sont conduites sur des rongeurs qui constituent les modèles de référence. Or, depuis quelques années, plusieurs articles scientifiques ont montré que chez l’homme et chez les rongeurs l’existence d’altérations de la macrocirculation des écoulements des neurofluides dans différentes pathologies neurodégénératives. Malheureusement chez le rongeur il n’existe pas actuellement de valeurs de référence de la macro-circulation qui permettent d’interpréter ces perturbations. Notre choix s’est porté sur le rat, d’une part, par sa vascularisation qui est proche de celle de l’homme, dont son développement peut être suivi au cours d’une période relativement courte. D’autre part, le rat est largement utilisé comme modèle de pathologies cérébrales humaines neurovasculaires comme par exemple les hydrocéphalies et l’hypertension intracrânienne qui sont particulièrement étudiées dans notre équipe de recherche.
Effet des épisodes répétés d’hypercalcémie sur la fonction rénale des rats hypoparathyroïdiens suivant une thyroparathyroidectomie (EU 2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Vingt rats subissent l'ablation des glandes thyroïde et parathyroïdes sous anesthésie, dix un simulacre d'opération, puis tous sont transportés trois heures par la route jusqu'au site d'expérimentation. 30 rats vont être utilisés au total, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Suivent l'implantation d'une minipompe sous la peau, cinq séjours de deux jours en cage à métabolisme, quinze injections dans l'abdomen et cinq ponctions de la veine de la queue, pour savoir si des excès de calcium répétés abîment le rein. Le porteur énumère lui-même les atteintes attendues, douleur opératoire, hémorragie, infection de plaie, hypocalcémie, insuffisance thyroïdienne, angoisse en cage à métabolisme et douleur à chaque piqûre.
Objectifs
L’hypoparathyroïdie est une maladie endocrine rare et complexe, caractérisée par une concentration basse ou indétectable d’hormone parathyroïdienne (PTH) entrainant une hypocalcémie et une hyperphosphatémie lorsqu’elle n’est pas traitée. Le traitement conventionnel est une association de métabolite de la vitamine D et de sels de calcium. Un effet secondaire habituel de ce traitement est une hypercalciurie ainsi que des épisodes d’hypercalcémie. Les 2 sont dus à une augmentation de l’absorption intestinale de calcium et à une diminution de la réabsorption tubulaire rénale de calcium, due à l’absence de PTH. L’hypoparathyroïdie et/ou le traitement conventionnel sont associés à une augmentation de la morbidité rénale, sous forme d’une lithiase rénale et/ou d’un néphrocalcinose et/ou d’une insuffisance rénale. Selon les séries, la prévalence de l’insuffisance rénale s’étend de 14 à 41 pour cent, dans tous les cas beaucoup plus élevée que dans la population générale. Epidémiologiquement, le risque d’insuffisance rénale est associé au nombre d’évènements hypercalcémiques et à la durée de la maladie. L'objectif du projet est de déterminer expérimentalement s'il existe un lien de causalité entre la survenue d'épisodes répétés d'hypercalcémie et la survenue d'une insuffisance rénale, et, si oui, d'en déterminer le mécanisme.
Bénéfices attendus
Le projet a pour objectif principal de déterminer l'éventuel lien de causalité entre épisodes répétés d'hypercalcémie, induite par un surdosage thérapeutique (fréquent en médecine humaine) et la survenue d'une dégradation de la fonction renale, une des principales morbidités observées au cours du suivi des patient.es avec hypoparathyroïdie. La démonstration du lien de causalité aurait 2 conséquences -
Procédures
Voici la liste des interventions réalisées chez les animaux. Une ablation des glandes thyroïde et parathyroïdes (ou un simulacre) est réalisée, sous anesthésie générale et analgésie (30 minutes, 1 fois). Les animaux sont transporté du site d'élevage (où a lieu la chirurgie) au site d'expérimentation, par transport routier agréé (3 heures, 1 fois). Un traitement par hormone thyroïdienne dans l'eau de boisson est apporté aux animaux ayant subi une ablation des glandes thyroïde et parathyroïdes pendant 71 jours. Une minipompe sous cutanée est implantée sous anesthésie générale et analgésie (5 minutes, 1 fois). Les animaux subissent une acclimatation à l'hébergement en cage à métabolisme pour habituation (animal vigile, 3 jours, 1 fois). Dix animaux reçoivent un régime riche en calcium (animal vigile, 3 jours, 5 fois). Les animaux reçoivent une injection intrapéritonéale quotidienne (animal vigile (1 minute par injection), 3 jours de suite, 5 fois). Les animaux sont hébergés en cage à métabolisme pour recueil d’urine (animal vigile, 2 jours, 5 fois). Un prélèvement sanguin par ponction de la veine de la queue est réalisé chez les animaux (animal vigile, 1 minute, 5 fois); le volume prélevé est conforme aux recommandations. Une euthanasie est pratiquée chez les animaux sous anesthésie générale et analgésie par une méthode réglementaire (10 minutes, 1 fois).
Impact sur les animaux
Tous les animaux subissent une chirurgie cervicale : il s’agit d’une ablation des glandes thyroïde et parathyroïdes (thyroparathyroïdectomie) chez 20 d’entre eux et d’un simulacre chez 10 d’entre eux. La plaie opératoire peut être à l’origine de douleurs ou d’inconfort, la thyroparathyroïdectomie cause une hypocalcémie et une insuffisance thyroïdienne. La chirurgie peut être cause d’hémorragie et d’infection de plaie. Tous les animaux sont transportés du site de l’éleveur au site d’expérimentation par transport routier, ce qui peut induire un stress. Les animaux de tous les groupes subissent une chirurgie sous anesthésie pour implantation de la pompe sous-cutanée : la plaie opératoire peut être à l’origine de douleurs ou d’inconfort. Par ailleurs, la chirurgie peut être cause d’hémorragie et d’infection de plaie. Tous les animaux sont hébergés périodiquement en cage à métabolisme : cet hébergement peut être à l’origine d’une perte de poids transitoire, toujours inférieure dans notre expérience à 10 pour cent du poids initial, d’angoisse et d’intolérance à l'hébergement en cage à métabolisme. Des injections intrapéritonéales de calcitriol ou de placebo, et d’anesthésiques sont réalisées chez les animaux, causant une douleur au point d'injection. Des ponctions veineuses sont réalisées de manière itérative chez tous les animaux : ces ponctions causent une douleur et peuvent causer une hémorragie.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés selon une méthode réglementaire, avant le prélèvement de tissus pour analyse moléculaires (ARNm et protéines)
Remplacement
La complexité des mécanismes contrôlant la valeur de calcium dans le sang et la fonction rénale est telle que le remplacement n'est pas possible puisqu'il s'agit d'étudier les conséquences des épisodes d'hypercalcémie sur un organisme entier, avec toute sa complexité et ses capacités d'adaptation. Il n'y a pas d'alternative à cette étude, les modèles cellulaires existant ne permettant pas de rendre compte de la complexité du fonctionnement de l'organisme intact.
Réduction
Trente (30) animaux seront utilisés dans cette étude. Le nombre d’animaux par groupe est déterminé de façon à assurer des observations fiables et utilisables. Les mesures réalisées dans la domaine de l'homéostasie tiennent compte de l'état de l'art de manière à avoir la meilleure performance des mesures réalisées et réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux par groupe a été calculé en tenant compte de la variabilité des paramètres d’intérêt en fonction des conditions expérimentales; les nombres d'animaux nécessaires ont été déterminés en s’appuyant sur un calcul de puissance ; les comparaisons des résultats entre les groupes se feront grâce à des tests statistiques validés.
Raffinement
Toutes les procédures le nécessitant seront réalisées sous anesthésie. Par procédure le nécessitant, est définie toute procédure générant une douleur ou une souffrance supérieure à une piqure transcutanée par une aiguille. L’anesthésie est encadrée par une analgésie lors de l’implantation des pompes ; après la chirurgie, l’analgésie est maintenue systématiquement pendant 48 heures. Dans la mesure du possible, en fonction des contraintes des procédures, les animaux bénéficient d’un environnement enrichi (l’environnement est enrichi par des tunnels en carton et/ou des abris en plastique, et des boules de ouate) et leur souffrance est prise en compte et atténuée au maximum. Lorsqu'un hébergement en cage à métabolisme est nécessaire, les animaux sont préalablement acclimatés à cet environnement, et la durée d'hébergement est réduite au strict nécessaire. Des soins peuvent être mis en place en fonction des signes de souffrance observées (soins médicamenteux, raffinement des conditions d’hébergements, et des techniques de chirurgie etc…). Des points limites ont été définis et les animaux font l'objet d'une surveillance au cours des différentes procédures exposées dans la demande
Choix des espèces
L'espèce étudiée est le rat chez qui l’homéostasie du calcium est proche de celle de l’humain et chez qui la thyroparathyroïdectomie est techniquement réalisable. La stade de développement est celui du jeune adulte, ce qui correspond à l’âge auquel sont souvent réalisées les thyroparathyroïdectomies chez l’humain.
Etude des voies d’entrée du calcium dans les neurones chez la souris et de leur régulation par des systèmes enzymatiques.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une injection unique dans le ventre, quelques secondes de contention, puis la mise à mort entre une et vingt-quatre heures plus tard : 80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le composé injecté vise une enzyme abondante dans le cerveau, et il s'agit de repérer à quel délai les modifications moléculaires sont les plus marquées. Le décompte que donne le porteur s'arrête à 32 animaux, vingt pour balayer les délais d'une à huit heures, quatre pour le délai retenu et huit pour vingt-quatre heures, sans qu'il explique les 48 restants. Toutes sont tuées pour que leur cerveau soit disséqué et les protéines extraites.
Objectifs
Les protéines sont des composants essentiels des cellules vivantes, jouant des rôles enzymatiques et structuraux. Leur synthèse et dégradation sont des processus finement contrôlés notamment par des enzymes appelées déubiquitinases. Dans le cerveau, l’enzyme UCH-L1 est la plus abondante de ces enzymes. Chez la souris, l’absence ou des mutations de UCH-L1 s’accompagnent d’un phénotype caractéristique de certaines pathologies neurodégénératives. Par ailleurs, des mutations sur le gène humain de cette enzyme ont été retrouvées dans des formes familiales de la maladie de Parkinson. Ces données indiquent que l’enzyme UCH-L1 est essentielle au bon fonctionnement des cellules nerveuses car son absence ou ses mutations provoquent de graves altérations des neurones. Or, à ce jour, on sait peu de choses sur les mécanismes par lesquels elle intervient dans la physiologie neuronale. Notre projet vise à mieux comprendre les actions de l’enzyme UCH-L1 dans le fonctionnement des cellules nerveuses en se focalisant plus spécifiquement sur l’impact de l’enzyme sur l’entrée du calcium dans les neurones. De nombreuses études ont mis en évidence le rôle central de la dérégulation des ions calcium dans diverses pathologies neurologiques. A terme, ce projet devrait permettre d’éclairer les relations entre les mécanismes de dégradation des protéines, la prise en charge du calcium par les neurones et les processus à l’origine du développement des pathologies neurodégénératives.
Bénéfices attendus
UCH-L1 est une enzyme fortement exprimée dans le cerveau et très abondante. Elle participe au contrôle de l’élimination des protéines cellulaires mais à ce jour on connait mal l’identité de ses cibles et ses mécanismes d’action. Notre projet est principalement un projet de recherche fondamentale. Il vise à comprendre le rôle de cette enzyme dans la prise en charge du calcium par les cellules nerveuses. Ce travail fournira de précieuses données à la fois en neurosciences fondamentales mais aussi en neurophysio-pathologie. En effet, plusieurs gènes ont été identifiés comme étant susceptibles de contribuer au développement de la maladie de Parkinson.
Procédures
L’unique intervention prévue consiste en une seule injection par voie intrapéritonéale sur animaux vigiles d’un composé pharmacologique suivie de l’euthanasie de l’animal. La durée de l’injection (de quelques secondes) sera réduite au strict minimum afin de permettre à l’animal de retrouver le plus rapidement possible son environnement quotidien.
Impact sur les animaux
La seule intervention prévue sur les animaux consiste en une injection unique en intra péritonéal (i.p). Cette procédure va transitoirement augmenter le stress de l’animal lors de sa manipulation qui consiste en la réalisation d’une injection qui s’accompagnera d’une douleur légère. L’état de l’animal sera surveillé ne post-injection.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car l’objectif étant de caractériser les modifications des protéines intracérébrales il est nécessaire d’euthanasier les animaux pour pouvoir disséquer le cerveau et extraire les protéines.
Remplacement
L’objectif du protocole est de prélever du tissu (cerveau) afin d’extraire des protéines. Ces expériences ne peuvent pas être réalisées sur des lignées cellulaires qui sont très souvent des cellules transformées ou issues de tumeurs dont les caractéristiques sont différentes de celles des tissus natifs, non cancéreux. Les expériences ne peuvent pas être réalisées in silico ni in vitro. L’objectif premier est de déterminer l’impact in vivo de l’altération de l’activité d’une enzyme sur la prise en charge du calcium par les neurones du cerveau.
Réduction
Comme indiqué plus haut, le protocole vise à définir la durée optimale post-injection induisant des changements moléculaires. Pour cela plusieurs durées seront évaluées. Pour les traitements allant de 1h à 8h, 4 animaux par temps seront testés, soit 20 animaux. Une fois cette durée optimale définie, les injections seront effectuées sur un groupe d’animaux n =4 à un seul temps (celui pour lequel les modifications sont les plus marquées). Ces données (n=4) seront ajoutées à celles obtenues lors des expériences préliminaires (n=4). Par ailleurs, des souris (n=8) seront euthanasiées au temps t=24h.
Raffinement
Les nuisances sur les animaux seront extrêmement limitées. Les animaux étant euthanasiés au maximum 24 h après l’injection. Nous surveillerons leur comportement général après l’injection pendant quelques heures. Des points limites seront définis comme un changement de comportement, l’apparition de signes éventuels de douleurs post-injection ou de manifestation de stress. Si un animal atteint l’un de ces points limites, des mesures seront prises pouvant aller jusqu’à l’euthanasie.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée est la souris. Plusieurs raisons expliquent ce choix. Il s’agit d’une espèce animale facile à élever. C’est un des modèles animaux de référence pour les études biologiques. Nous disposons ainsi d’une importante source d’informations et de références bibliographiques qui nous aident à construire notre travail. Le modèle rongeur est un des modèles de référence pour l’étude des propriétés des cellules nerveuses et il est pertinent pour la compréhension des mécanismes moléculaires neuronaux. Comme tous les protocoles et méthodologies ont déjà été mis au point, peu de travaux exploratoires sont nécessaires. Ceci devrait donc permettre de limiter le nombre d’animaux au strict minimum nécessaire. Collaborant avec des collègues issus d’autres laboratoires, travailler sur un animal commun permet de partager les extraits protéiques récoltés. Ceci permet de minimiser le nombre d’animaux nécessaires aux expériences. Nous réaliserons une étude comparative dans laquelle nous comparerons les résultats obtenus sur des cerveaux adultes (âgés de 3 à 6 mois) à ceux provenant d’animaux sénescents (âge >12 mois). L’aspect temporel est important car l’âge est un facteur prédisposant à la survenue de pathologies neurodégénératives.
Évaluation d’un nouveau mécanisme comme cible thérapeutique dans la résistance acquise aux thérapies ciblées du mélanome
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
246 souris reçoivent une injection de cellules tumorales de mélanome puis un gavage quotidien pendant quinze à vingt semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur tumeur est mesurée au pied à coulisse trois fois par semaine, et une partie d'entre elles reçoit en plus une injection tous les deux à quatre jours. Le porteur indique que le gavage quotidien peut irriter le larynx et gêner la déglutition, et que la tumeur peut finir par empêcher l'animal de se déplacer, de s'alimenter et de s'hydrater. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes, au terme d'une étude qui vise à confirmer chez la souris un résultat déjà obtenu en culture cellulaire.
Objectifs
Les mélanomes avec mutations activatrices d’un gène particulier peuvent être traités par des thérapies ciblées entrainant une rémission rapide chez 65-70% des patients. Cependant, la majorité des cas développent des résistances au traitement, parfois au bout d’un an seulement. Certaines cellules de la tumeur,, appelées « cellules persistantes », auraient un rôle essentiel dans le développement de ces résistances. Les « cellules persistantes » sont en effet capables de survivre aux thérapies ciblées en engageant des changements qui leur permettent de s'adapter au traitement. Or, ces cellules constituent un réel problème clinique car elles peuvent évoluer en cellules qui résistent de façon permanente à la thérapie. Cette évolution vers des cellules résistantes implique l'introduction d'erreurs dans l'ADN, appelées mutations, qui leur permettent de proliférer et de survivre malgré le traitement. Une étude a mis en évidence que, pour survivre à la thérapie ciblée, les cellules persistantes de mélanome modifient le processus qui permet aux cellules de fabriquer des protéines à partir d'une copie de l'ADN, appelée ARN messager. En effet, lors de thérapie ciblée, il y a une augmentation de la production de certaines protéines, dont l’une d’elles peut potentiellement favoriser l’introduction des erreurs dans la séquence de l'ADN. Afin d'offrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour surmonter cette résistance chez les patients atteints de mélanome, ce projet a pour objectif de démontrer que l'inhibition de la production de cette protéine peut supprimer, ou au moins retarder, la résistance aux thérapies ciblées.
Bénéfices attendus
Environ 50 % des mélanomes présentent une mutation activatrice d’un oncogène (gène dont l’expression favorise la survenue de cancers) particulier. L'inhibition, par thérapie ciblée, de la protéine issue de cet oncogène, permet d'obtenir des réponses thérapeutiques efficaces. Cependant, ces réponses sont souvent limitées dans le temps et la moitié des patients rechutent après 12 à 15 mois. La compréhension des mécanismes à la base de cette résistance est nécessaire, et l'identification du déterminant moléculaire de cette résistance peut offrir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer le pronostic des patients. Les expériences in vitro dans les cellules de mélanome traitées par thérapie ciblée montrent un rôle de notre protéine clé dans l'augmentation de l'instabilité génétique, qui est la cause principale de la résistance aux thérapies. Ce projet a donc pour objectif de confirmer l’implication de notre protéine clé dans cette résistance dans un contexte in vivo. De plus, nos expériences in vitro ont permis d’identifier une molécule_actuellement utilisée dans des essais cliniques pour le traitement d'autres types de cancer_ qui peut empêcher les mutations lors de la réparation des dommages à l’ADN et donc limiter la résistance thérapeutique aux thérapies ciblées. Nous devons confirmer ces résultats dans un contexte in vivo. L'objectif à long terme est d'apporter des bénéfices aux patients atteints de mélanome en améliorant le taux de survie des patients .
Procédures
Dans une première procédure, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience- durée du geste inf à 10 sec). Les animaux seront ensuite traités à raison d’1 fois par jour pendant toute la durée de l'expérience (administration des traitements par gavage sur animaux vigiles pendant environ 15-20 semaines-durée du geste inf à 10sec)). Dans une seconde procédure, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience durée du geste inf à 10sec). Les animaux seront ensuite traités à raison d’1 fois par jour par gavage. Les animaux seront ensuite traités à raison d’1 fois tous les 2 jours pendant 22 jours avec un second traitement (administration des traitements par injection aux animaux vigiles durée du geste inf à 10sec). Enfin, dans une troisième procédure, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience durée du geste inf à 10sec). Les animaux seront ensuite traités à raison d’1 fois par jour pendant toute la durée de l'expérience (administration des traitements par gavage sur animaux vigiles pendant environ 15-20 semaines durée du geste inf à 10sec). Les animaux seront aussi traités à raison d’une fois tous les quatre jours pendant 3 semaines (administration des traitements par injection i sur animaux vigiles durée du geste inf à 10sec). Pour tous ces animaux, la croissance tumorale sera mesurée trois fois par semaine sur animal vigile à l’aide d’un pied à coulisse (durée du geste inf à 15 sec).
Impact sur les animaux
La greffe sous-cutanée de cellules tumorales peut amener une gêne qui peut s’amplifier avec le développement de la tumeur, pouvant aller jusqu’à une modification de l’état physiologique de l’animal (manque de toilettage, prostration, difficulté à se déplacer, s’alimenter et à s’hydrater). Ces effets ne sont attendus qu’en fin d’expérience. Le gavage quotidien peut amener une irritation du larynx pouvant amener des difficultés à s’alimenter, à déglutir. L’injection des médicaments peut entrainer une gêne liée à la piqûre elle-même juste après l’injection.
Devenir
Mise à mort pour prélèvements post-mortem d'organes et de tissus aux fins d'analyses.
Remplacement
Notre étude in vitro utilisant différentes lignées cellulaires de mélanome a permis de déterminer l'implication du processus de production de notre protéine d’intérêt dans la résistance acquise du mélanome à la thérapie ciblée. De plus, nos résultats obtenus in vitro ont montré que l'inhibition de ce processus peut limiter la résistance acquise. La variété et la complexité des cancers, ainsi que leur incidence élevée, rendent l’utilisation de modèles animaux cruciale pour comprendre comment le cancer se développe et pour améliorer les stratégies préventives, de diagnostiques et thérapeutiques. De plus, Il n'existe, à ce jour, pas de modèle in vitro suffisamment robuste pour tester des synergies thérapeutiques. L'utilisation de modèles animaux comparables par de nombreux aspects au corps humain est donc indispensable pour l'évaluation des nouvelles approches thérapeutiques.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de résultats fiables et statistiquement significatifs, nous avons déterminé le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental à l’aide d'outils statistiques.
Raffinement
Pour limiter le stress des animaux, l’attention est portée sur leurs conditions d’hébergement. De plus, un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place de la procédure expérimentale pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Les animaux seront surveillés tous les jours lors de la procédure , qui est raffinée par l’établissement de points limites précoces, entrainant et la mise en place de soins (supplément alimentaire, administration de solutés) voire la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. La présence de souffrance sera recherchée en utilisant les critères habituels (état général, sous-alimentation, état du pelage, prostration). Les souris seront également surveillées quotidiennement afin de déceler le plus précocement possible l’apparition de points limites. Trois fois par semaine, les animaux seront pesés et les tumeurs mesurées.
Choix des espèces
Le génome de la souris a été séquencé et de nombreux outils ont été développés pour étudier ce modèle. La souris est le modèle de choix pour les études de cancérologie : les souches sont parfaitement définies et la production de souris immunodéficientes nous permet de travailler sur des modèles cellulaires d’origine humaine. De plus, on observe une croissance tumorale rapide chez ce modèle. La souris est donc le modèle de choix pour l'étude des cancers. Le projet nécessite des souris adultes (5-8 semaines) sans plus de contraintes sur l’âge. Ceci se justifie par l’âge de la population humaine touchée par le mélanome et ciblée par les éventuels traitements.
Test d’antidiabètique sur des ilots humains transplantés chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 450 souris subissent une greffe chirurgicale de cellules pancréatiques humaines, 780 sont rendues diabétiques par cinq injections, et 50 passent six semaines sous régime hyperlipidique. 2 850 souris immunodéficientes vont être utilisées au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, avec des prélèvements sanguins tous les quinze jours sur animal vigile. Le porteur écrit pourtant que 1 450 animaux "sont prévus dans ce projet général", chiffre qu'il obtient en multipliant dix souris par groupe par cinq répétitions, sans expliquer d'où viennent les 1 400 autres. Toutes sont tuées à la fin pour explanter les greffons et récupérer les organes.
Objectifs
L’objectif de cette étude est de déterminer l’effet du GABA, de la Sitagliptin et de l’Omeprazole et d'autres molécules qualifiées "d'antidiabétiques" pour la transformation des cellules humaines non-Beta (qui ne secrétent pas l'insuline) en cellules Beta (cellules qui secrètent l'insuline) et sur la fonctionnalité de ces cellules Beta pancréatiques nouvellement formées greffées chez des souris immunodéficientes. Cela permettrait à terme de déboucher sur un traitement des patients diabétiques en rétablissant une sécrétion d'insuline jusqu'alors réduites ou inexistantes et aisni rétablir une glycémie normale (taux de sucre dans le sang).
Bénéfices attendus
La thérapie cellulaire du diabete reste freinée par le manque de matériel issu de donneur, la nécessité de médicaments immunosuppresseurs et ne conviennent qu'à une niche de patients atteints de formes sévères de diabète (
Procédures
Les animaux seront soumis à : - chirurgie de transplantation de cellules pancréatiques humaines (1450 souris) - 1 fois - prélèvements sanguins sur animaux vigiles (1450 souris) - 1 fois par 15 jours. - induction du diabete ( 780 souris) - 5 injections - diabete traité par les traitements et/ou greffe de cellules. - régime hyperlipidique (50 souris) - 6 semaines.
Impact sur les animaux
Les nuisances induites :sont de plusieurs types mais dans tous les cas seront paliées par des tratiements adaptés. Pour la procédure chirurgicale (modérée), des traitements anti-douleur locaux et systémiques seront utilisés. Dans le cas d'utilisation de souris diabètiques (classe modérée), ce diabète sera modéré et un traitement à l'insuline pourra être prévu si besoin. Un change plus régulier des cages sera également effectué. Pour les traitements (classe légere), aucun effet délétère n'est attendu.
Devenir
Les 1450 animaux controles ou diabétiques recevront une greffe d'ilots, 750 rendus diabétiques puis seront traités pour la plupart (1400). A la fin des procédures, les animaux seront tous mis à mort afin d'explanter les greffons cellulaires et récupérer des organes post-mortem.
Remplacement
A l'heure actuelle, il n'existe pas de moyen permettant le remplacement de l'animal pour l'étude des cellules humaines au long court, qui plus est sous traitement médicamenteux. De rares modeles de culture 3D existent mais ne permettent de reproduirent l'impact de molecules sur un organisme entier (y compris les organoïdes, et les organ-on-a-chip). De plus, il s'agit ici d'étudier les cellules dans le contexte de la transplantation pour être au plus près des effets cliniques, seul le recours à l'a nimal permet d'en étudier la question. Enfin, les molécules ici tester seront "qualifiées" par des études in vitro préalables (toxicité cellulaire, potentiel sécrétoire amélioré). Seules les plus prometteuses seront testées in vivo. EN parallèle, nous essayons de développer un modele de périfusion cellulaire (cellules humaines ex vivo) seulement à ce jour, elle ne permet des etudes en continue sur le long teme.
Réduction
1450 animaux sont prévus dans ce projet général. Nous avons estimé avec les moyens statistiques le nombre de souris par groupe à 10 afin d'obtenir des résultats robustes. L'expérience sera fait 5 fois soit 1450 animaux au total.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés dans des cages de 5 animaux maximum dans un portoir ventilé. Ils auront accés ad libitum a l'eau et nourriture et traités avec soin (visite quotidienne, cycle jour/nuit régulier, enrichissement par nid+tunnel). La chirurgie sera pratiquée sous anesthésie gazeuse et traitement de la douleur (local+systémique). De plus, un complément alimentaire sous forme gélifié est prévu juste après la chirurgie pour une meilleure récupération. Le bien être animal sera observé au quotidien, et tout constat de mal-être pourra être traité à l'aide d'un arbre décisionnel construit pour ce projet. Il permettra le traitement des douleurs/mal être de façon gradée pour éviter d'atteindre un point-limite.
Choix des espèces
Nous avons en possession l'ensemble du materiel adequat pour l'exploitation des données issues de la souris (anticorps). De plus, sa petite taille permet un hébergement compact dans une structure avec un statut sanitaire type SPF à minima.