Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
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Criblage comportemental sur larves de Xénope de composés pharmacologiques photosensibles agissant sur des protéines neuronales
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
7 260 larves de xénope vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 6 300 d'entre elles et modéré pour 960. Chacune est incubée jusqu'à une heure quinze dans des composés pharmacologiques, isolée jusqu'à une heure trente dans un appareil de comportement, soumise à six flashes lumineux d'une minute et transférée cinq fois entre milieux, avant d'être tuée par surdose d'anesthésique. Le porteur anticipe une paralysie ou une nage erratique selon les doses, un inconfort oculaire lié aux flashes, et la mort d'une partie des larves par toxicité des composés. Les 960 larves de la phase pilote servent précisément à repérer les concentrations toxiques, et les larves témoins sont tuées elles aussi parce qu'il préfère des animaux "naïfs" à chaque expérience.
Objectifs
Les neurones, cellules du cerveau, communiquent entre elles par le liais de protéines appelées récepteurs. Ces récepteurs jouent un rôle central dans les processus tels que l’apprentissage et de la mémoire. La dysfonction de ces récepteurs est impliquée dans de nombreuses maladies neurologiques et psychiatriques (épilepsie, retard mental, autisme, schizophrénie). Il est donc important de développer des composés pharmacologiques à visée thérapeutique agissant sur ces récepteurs. Les composés pharmacologiques ciblant actuellement les nos récepteurs d’étude sont cependant limités par des problèmes d’effets secondaires importants chez l’animal et l’homme. L’utilisation de la lumière pour contrôler l’activité des molécules permet de s’affranchir de la plupart de ces effets secondaires. L’idée est d’administrer un composé photosensible dans sa forme inactive et de l’activer dans une région définie et pendant une durée précise afin d’éviter les effets secondaires liés à la présence prolongée du composé dans tout le corps. Le projet consiste à caractériser l’activité sur la locomotion des larves de Xénopes (Xenopus laevis) de composés pharmacologiques en fonction de différentes conditions de lumière. De par leur nombre, taille et transparence, les larves d’animaux aquatiques (poisson zèbre ou xénope) constituent en effet des modèles avantageux pour le criblage in vivo de molécules et les approches utilisant de la lumière. Ce projet devrait amener à la découverte de nouvelles molécules d’intérêt thérapeutique mieux tolérées ainsi qu’à la création d’outils pour l’étude de l’implication des récepteurs dans le fonctionnement du système nerveux.
Bénéfices attendus
Les récepteurs neuronaux jouent un rôle clé dans le développement du cerveau, ainsi que dans les processus de mémoire et d’apprentissage. Le developpement d’outils contôlables par la lumière ciblant des populations particulières de récepteurs neuronaux permettra de mieux comprendre les rôles de ces populations de récepteurs dans le cerveau, ainsi que l’intérêt thérapeutique de cibler ces populations. En effet, beaucoup de troubles neurologiques et psychiatriques (épilepsie, retards mentaux, schizophrénie, dépression) s’expliquent par un mauvais fonctionnement des récepteurs neuronaux. Actuellement, un grand nombre de molécules développées pour cibler les récepteurs neuronaux échouent en phase clinique à cause d’effets indésirables (somnolence, problèmes de mémoire, hallucinations, toxicité). Le développement de composés pharmacologiques dépendants de la lumière (photosensible), dont l’activité peut être contrôlée précisément dans l’espace et le temps grâce à leur illumination, devrait amener à de nouveaux médicaments mieux tolérés. En effet, l’idée serait d’administrer un medicament photosensible non actif au patient puis de l’activer temporairement au niveau de la zone concernée par la pathologie, limitant ainsi l’effet délétère que ce médicament pourrait avoir sur d’autres organes.
Procédures
IDurant la procédure, les larves de xénope (7260 animaux) seront soumises aux interventions suivantes : - Incubation dans des composés pharmacologiques. Durée : 1h15 maximum, 1 fois par animal - Isolement et nage libre dans l’appareil de comportement. Durée : 1h30 maximum, 1 fois par animal - Soumission à des flashes de lumière. Durée : 6 flashes de 1 minute au maximum, 1 fois par animal - Transfert des animaux vigiles entre leurs différentes conditions de milieux. Durée : quelques secondes, 5 fois par animal - Euthanasie par surdose d’anesthésique.
Impact sur les animaux
Nous anticipons les nuisances suivantes sur les larves de Xénope : - Potentielle toxicité des composés pharmacologiques appliqués entraînant la mort des animaux selon les doses appliquées - Potentielle paralysie ou nage erratique des larves en fonction de la dose/efficacité des composés testés, les récepteurs ionotropiques au glutamate jouant un rôle dans la locomotion des larves de Xénope. - Influence directe de certaines longueurs d’onde de lumière sur la nage des larves, léger inconfort oculaire lié à l’utilisation de flashes lumineux. - Potentielle légère gène des larves lors de leur transfert d’un contenant à un autre. - Potentiel léger stress lié à l’isolement durant l’expérience
Devenir
A l’issue de la procédure, les larves des groupes témoins ont été exposées à des composés pharmacologiques dont nous ne connaissons pas les effets à long-terme sur le développement. Nous ne pouvons donc pas laisser grandir ces animaux pour les replacer dans d’autres laboratoires. En outre l’expérience de comportement qu’ils ont subie est susceptible de modifier leur comportement futur (distance parcourue dans les puits, vitesse de nage, liée à une potentielle habituation). Pour une meilleure reproductibilité des expériences nous préférons donc utiliser des animaux « naïfs » à chaque fois, même pour les groupes contrôle. Enfin, nous serons éventuellement amenés à effectuer des prélèvements post-mortem sur certains animaux pour étudier la pénétration du composé dans le cerveau ou le type de toxicité induite. Tous les animaux seront donc euthanasiés à la fin de la procédure.
Remplacement
Un criblage in silico et des expériences de caractérisation in vitro seront réalisés en amont de ce projet afin de limiter le nombre de composés pharmacologiques à tester et donc limiter le nombre d’animaux à utiliser. La validation in vivo est indispensable pour apréhender les propriétés de toxicité, métabolisme, pénétration dans le cerveau et excrétion des composés pharmacologiques ainsi que d’évaluer leurs conséquences sur le comportement dans le cadre d’un système neuronal intégré. En effet les methodes in vitro et in silico ne prennent pas en compte la complexité du milieu biologique et l’influence possible de ce dernier sur l’activité des composés pharmacologiques.
Réduction
Un criblage in silico et des expériences de caractérisation in vitro seront réalisés en amont de ce projet afin de limiter le nombre de composés pharmacologiques à tester et de déterminer la fenêtre de concentration à tester, ainsi que les longueurs d’onde idéales pour la photomodulation. Cela permettra donc de limiter le nombre d’animaux à utiliser. L’étude du comportement des larves en plaques 12 puits avec, pour chaque expérience, deux groupes contrôle et un groupe témoin dans la même plaque permettra de diminuer la variabilité liée aux conditions d’expérimentation, permettant ainsi d’améliorer la puissance statistique des résultats. Le nombre d’animaux estimé pour ce projet est de 7260 : (i) 960 animaux pour une phase pilote permettant d’évaluer les concentrations effectives des composés et leur potentielle toxicité, et (ii) 6300 animaux pour la phase expérimentale à proprement parler. Le calcul des effectifs a été établi par un calcul de puissance. Une analyse statistique sera nécessaire pour l’interprétation des résultats.
Raffinement
Hébergement : Les larves seront élevées en groupes d’individus (maximum 50 par boîte de Pétri) dans un milieu physiologique adapté à leur physiologie dans un incubateur à 23 dégrés jusqu’à ce qu’elles atteignent le stade adéquat. Les larves seront nourries 2 fois par jours à partir du stade 45 avec de la spiruline en poudre. Leur eau sera nettoyée une heure après avoir nourri les larves. Après la procédure, les larves seront remises en groupes de plusieurs individus (correspondant aux groupes expérimentaux) dans un milieu physiologique adapté à leur espèce. L’isolement est évité au maximum. Procédure : Les larves seront habituées pendant 15 min dans l’appareil d’expérimentation avant réalisation de l’expérience. Les expérimentations seront réalisées dans une pièce climatisée à 19 degrés et de l’eau sera ajoutée entre les puits d’expérimentations pour limiter la chauffe du milieu des larves par les flashes de lumière. Les puissances des flashes de lumière seront réglées au minimum nécessaire pour la bonne conduction de l’expérience afin de diminuer un éventuel inconfort oculaire et des réactions parasites à la lumière. Des périodes sans illumination de trois minutes entre chaque flash lumineux sont prévues pour permettre aux larves de récupérer d’un éventuel inconfort lié à la stimulation lumineuse. La toxicité des composés pharmacologiques sera évaluée à deux moments : (1) en amont de l’expérience après une phase d’incubation (30 min) dans les composés photodépendants ; et (2) le lendemain : les larves exposées à nos composés photodépendants seront gardées en observation après l’expérience et leur comportement (nage, orientation du corps, couleur) sera étudiée le lendemain pour estimer le caractère délétère de l’expérience. Les larves seront gardées en groupes de plusieurs individus après la procédure (correspondant aux groupes expérimentaux) dans un milieu physiologique adapté à leur espèce. Les points limites suivants seront considérés : si la santé des larves se détériore après la phase d’incubation ou au cours de l’expérience de comportement (nage frénétique ou paralysie irréversible, décoloration, basculement sur le côté), ou si elles présentent des malformations, l'expérience est immédiatement arrêtée et les larves euthanasiées. Les conditions expérimentales (concentration de composés pharmacologiques, puissance des flashes lumineux) seront alors revues afin d'éviter une souffrance ou un stress aux animaux.
Choix des espèces
L’espèce Xenopus laevis est particulièrement adaptée à notre étude car les protéines que nous étudions sont très proches entre les xénopes et les humains. Ces protéines sont impliquées dans le mouvement des larves de Xénope : il est ainsi facile d’étudier l’effet d’un composé chimique sur la protéine en observant le comportement de l’animal. Les composés chimiques entrent directement par la peau des animaux et la transparence des larves permet une bonne pénétration de la lumière. On peut donc contrôler la locomotion des larves de xénopes grâce à des composés chimiques et de la lumière sans méthodes invasives. Enfin, La reproduction des xénopes produit des centaines de larves. Leur nombre et leur petite taille (1 cm) permettent des études de comportement impliquant beaucoup d’animaux à la fois ce qui augmente la robustesse des résultats et permet, in fine, de limiter le nombre d’expériences nécessaires. Nous utiliserons ces larves aux stades embryonaires 45 à 50 (4 à 15 jours après fécondation à température ambiante). En effet le stade 45 correspond au stade auquel les larves de xénope commencent à nager de manière spontanée, c’est-à-dire sans avoir besoin de les stimuler.
Evaluation de la réponse immunitaire de nanoparticules peptidiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Tuées pour qu'un volume de sérum jugé suffisant soit prélevé, 20 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent trois injections vaccinales, aux premier, quatorzième et vingt-huitième jours, un prélèvement sanguin précède la première dose, et leur sang est collecté après leur mise à mort. Le porteur indique n'avoir identifié, lors des essais antérieurs, aucun symptôme, ni rougeur, ni lésion cutanée, ni kyste au point d'injection. L'enjeu est industriel autant que scientifique, comparer ses nanoparticules peptidiques aux nanoparticules lipidiques déjà commercialisées, une formulation stable à 4 °C qui "simplifierait grandement" la préparation des doses et abaisserait les coûts de production.
Objectifs
Ce projet repose sur de nouvelles formulations permettant le transfert intracellulaire d’ARN messagers (ARNm). Jusqu’à présent, les ARNm sont exclusivement formulés avec des cocktails de lipides. Or ces complexes lipidiques présentent des stabilités limitées dans le temps, rendant nécessaire de les transporter et de les stocker à basses, voire très basses, températures (-20 à -80°C). Une fois une fiole décongelée et diluée dans les conditions adaptées à une injection intramusculaire, il est préconisé par Pfizer/BioNTech de ne pas utiliser ces préparations au-delà de 6 heures et de les éliminer. De notre côté, nous avons mis en évidence la très bonne stabilité des particules peptidiques que nous formons, sur plusieurs semaines après leur formulation et un simple stockage à 4°C. Récemment, nous avons réalisé une phase de vaccination sur des lapins et des souris et nous avons obtenu des évidences claires que les nanoparticules à base de peptides généraient une réponse immune. Cependant, nous n’avons pas pu établir une comparaison quantitative et qualitative de la réponse immunitaire chez l'animal entre nos nanoparticules peptidiques et les nanoparticules lipidiques actuellement sur le marché. Ainsi, nous souhaitons comparer la réponse immunitaire chez la souris avec ces deux types de formulations.
Bénéfices attendus
L’évaluation de l’efficacité des nanoparticules à générer une réponse immunitaire est un point crucial pour notre étude. Cependant, si nous avons des éléments expérimentaux démontrant une réponse immunitaire chez l’animal (souris et lapins), nous n’avons pas la possibilité expérimentale de savoir si cette réponse est aussi efficace que celle obtenue avec les ARNm commerciaux. Dans le cas d’une réponse immunitaire comparable selon les deux procédés, les perspectives pour le développement d’une formulation exclusivement réalisée avec un peptide seraient de nature à simplifier grandement les protocoles de préparations des doses vaccinales qui seraient alors basées sur un simple mélange entre ARNm et peptide, à température ambiante, et avec un transport et un stockage ultérieurs qui seraient grandement facilité. Ce nouveau type de formulation permettrait de réduire les couts de production des préparations vaccinales. Les résultats de ces études seront publiés et accessibles à la communauté scientifique et médicale.
Procédures
Le nombre d’intervention prévu chez les animaux sont au nombre de cinq. Une première intervention le premier jour permettra sur quelques minutes d’une part un prélèvement de sang chez l’animal non-traité, couplé à l’injection classique en intramusculaire d’une première dose vaccinale. Une deuxième injection vaccinale se déroulera au 14eme jour de l’expérimentation sur un processus global d’une minute. Une dernière injection sur une minute le 28eme jour assurera un « rappel vaccinal ». L’animal sera alors euthanasié (une minute) et son sang collecté pour réaliser de analyses ultérieures.
Impact sur les animaux
Les études expérimentales réalisées préalablement à cette phase n’ont pas permis d’identifier de symptômes de quelque nature que ce soit (rougeurs, lésions cutanées, kystes au point d’injection…).
Devenir
Afin d’obtenir des volumes de serum conséquents, les souris seront euthanasiées et le sang prélevé afin de procéder aux dosages d’anticorps correspondants aux types de vaccins utilisés.
Remplacement
Une réponse immunitaire globale est régie par une multitude de processus qu’il est impossible de mimer en milieu ex corpus. De fait, seules des injections selon des protocoles proches de ceux adoptés lors de stratégies vaccinales permettront d’évaluer tous ces paramètres.
Réduction
Nos procédures sont peu ou non-invasives, ce qui nous permet de maximiser le nombre d'expériences réalisées par la suite tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés au départ. Pour établir une signification précise de la réponse immunitaire obtenue, nous avons déterminé que des groupes de dix animaux était requis pour avoir une idée objective de la réaction des différents animaux aux types de vaccination reçue. Dix animaux par groupe sont ainsi nécessaires et suffisants.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions d’hébergement qui respectent leur bien-être (contrôle de la température et de l’hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence d’enrichissement, change régulier des litières, eau et nourriture à volonté, surveillance quotidienne des animaux). Toutes les procédures sont réalisées de façon à limiter le stress et la souffrance des animaux (anesthésie et antalgique en cas de douleur). Les souris seront surveillées quotidiennement par nos soins et du personnel qualifié pour détecter le moindre signe de souffrance de l’animal. Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux (grilles d’évaluations et points limites) sera strictement respecté, et effectué régulièrement en concertation avec l'équipe de zootechnie.
Choix des espèces
Il s’agit de souris tout à fait adaptées à des études générales incluant des analyses de toxicologie, de tératologie, de pharmacologie ou de physiologie. Nous souhaitons, dans le cadre de ce programme de recherche, mettre en évidence une méthodologie alternative de préparations vaccinales pour induire une réponse immunitaire. Nous recevrons donc des animaux âgés de 2 mois, un âge reconnu pour avoir un système immunitaire mature., Ces animaux seront suivis pour une durée de 5 semaines (injections de 3 préparations vaccinales à J0, J14 et J28, et prélèvement sanguin final à J35).
Effet de la mise en groupe des mères et de la mise à l’extérieur des lapereaux sur les profils épigénétiques sanguins de lapins de chair (2/2).
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Pour comparer les profils de méthylation de l'ADN de lapins élevés en cage et de lapins ayant accès à un parcours herbagé, et mesurer si ces marques se transmettent à la génération suivante, 240 lapins de chair vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'acte contraignant tient en une prise de sang unique à l'oreille, de moins de cinq minutes, à partir de soixante-dix jours d'âge. Le porteur reconnaît la douleur liée à l'aiguille et à la contention, ainsi que le stress thermique auquel l'accès au parcours herbagé expose les lapins au printemps. Aucun n'est tué pour l'expérience, tous poursuivent leur engraissement et partent à l'abattoir à soixante-dix-sept jours, dans un projet dont le porteur attend qu'il aide la filière à améliorer le bien-être des animaux non-humains.
Objectifs
Contexte : Le mode d’élevage des animaux est aujourd’hui critiqué par la société car jugé non respectueux du bien-être animal. En France, l’élevage de lapins est réalisé en grande majorité dans des cages grillagées de petite taille (
Bénéfices attendus
L’objectif principal du projet est l’acquisition de connaissances sur l’impact de l’environnement d’élevage de lapins sur leur mémoire cellulaire. Cette acquisition de connaissance pourra à terme, et dans sa mesure, aider la filière à améliorer le bien-être et la santé des animaux en proposant des systèmes d’élevage adaptées à la physiologie et aux besoins des animaux. Une potentielle application possible serait le développement de biomarqueurs sanguins des conditions d’élevages des animaux, qui pourraient permettre une traçabilité.
Procédures
Les interventions contraignantes sont les suivantes : Pour 240 lapins maximum, une prise de sang unique d'un petit volume de sang réalisée à 70 jours d’âge minimum (durée < 5 minutes).
Impact sur les animaux
Certaines actions sont stressantes pour les animaux : (a) la contention et la douleur liée à l’introduction d’une aiguille pour la prise de sang, (b) l'élevage en semi plein-air avec un accès libre à une pâture herbagée expose les lapins aux conditions extérieures et peut engendrer un stress thermique pendant le printemps.
Devenir
L'expérience ne nécessite pas de mise à mort. Après la prise de sang, les lapins poursuivront leur élevage puis intégreront la chaîne alimentaire à 77 jours d’âge (vente à un abattoir commercial).
Remplacement
Le projet vise à caractériser l’impact de changements de méthodes d’élevage sur la mémoire cellulaire des animaux. Il n’est pas pertinent dans ce cadre d’utiliser des méthodes (in vitro, simulations) alternatives car elles ne récapitulent pas les conditions de vie d’un animal.
Réduction
Quatre lots de 60 animaux sont prévus (soit 240), pour en prélever 50 par lots en fin de croissances toute en tenant compte de pertes éventuelles lots de la croissance. Nous estimons que des groupes de 50 animaux nous permettrons de détecter des changements de l’ADN.
Raffinement
Les méthodes de prélèvements employées sont peu invasives (prise de sang à l’oreille), et sont mises en œuvre par un personnel formé et disposant des autorisations nécessaires à l'expérimentation animale, et expérimenté dans la manipulation des lapins, utilisant une contention manuelle douce et rassurante pour l'animal. Le parcours herbagé sera équipé de 2 zones d’ombrage de 2m² chacun pour limiter le stress thermique. En cas de pic de chaleur, seront aussi mis en place l'arrosage du bâtiment et une brumisation / aspersion sur le parcours, ainsi que des ventilateurs à l'intérieur du bâtiment. L'état de santé (présence de diarrhées, poil piqué, animal abattu) sera surveillé au quotidien. Les animaux malades qui ne présenteraient pas de perspectives de guérison seront euthanasiés. Les traitements seront décidés selon les recommandations du vétérinaire sanitaire. Les animaux seront vaccinés contre la myxomatose et la maladie hémorragique du lapin (VHD1 et 2). Les 120 lapins transportés de l'établissement 1 vers l'établissement 2 seront placés par dix dans des caisses de transport en plastique ajouré, homologuée pour le transport des lapins. Le camion de transport est ventilé, le trajet fait 15 minutes. Le transport sera reporté en cas de température extérieure supérieur à 25°C car les lapins sont très sensibles au stress thermique.
Choix des espèces
Les travaux ont un objectif d’acquisition de connaissances dans le cadre de changement de systèmes d’élevages de la filière de production de lapins française. Il n’est donc pas pertinent de choisir une autre espèce animale que le lapin. Les animaux seront utilisés entre le sevrage (35 jours) et la fin de l’engraissement (77 jours), pour se rapprocher les plus des conditions usuelles d’élevages dans la filière.
Rôle du ganglioside A2B5 dans la réponse immunitaire dans le glioblastome
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
La mise à mort est déclenchée dès qu'une souris perd 20 % de son poids, convulse, se paralyse, se prostre ou n'arrive plus à se déplacer. 68 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit une greffe intracérébrale de cellules de glioblastome au cours d'une intervention chirurgicale d'environ trente minutes, et la tumeur provoque ensuite une perte d'appétit, une malnutrition puis une perte de poids, le porteur ne qualifiant de "douleur légère de courte durée" que les injections. Il vise à comprendre le rôle d'une molécule, A2B5, dans la réponse immunitaire, ce qui "permettrait" selon lui de nouvelles thérapies contre une tumeur cérébrale aujourd'hui sans traitement curatif.
Objectifs
A2B5 est une molécule exprimée par les cellules tumorales de glioblastome (tumeur cérébrale). L'objectif est d’analyser le rôle de la molécule A2B5 dans la réponse immunitaire. Pour cela, nous étudierons l'impact de l'expression de A2B5 dans l'activation du système immunitaire et dans le développement de la tumeur.
Bénéfices attendus
Le glioblastome est une tumeur cérébrale est une pathologie fatale (médiane de survie de 1 an) et pour laquelle il n’existe aucun traitement curatif. Une meilleure compréhension du rôle joué par la molécule A2B5 (exprimé par la tumeur) dans les mécanismes immunitaires permettrait la mise en place de nouvelles thérapies pour les patients atteints de glioblastome.
Procédures
Les animaux recevront une greffe intracérébrale de cellules tumorales de glioblastome (68 animaux, une seule intervention de 30 minutes environ). Les greffes intracérébrales sont des procédures chirurgicales.
Impact sur les animaux
La manipulation, contention des animaux, les injections d'anesthésiques pour la réalisation de la craniotomie sont générateurs de stress pour les animaux. Par ailleurs les injections entrainent également une douleur légère de courte durée. La progression tumorale induite par la maladie (glioblastome) provoque à terme une perte d'appétit, donc une malnutrition et finalement une perte de poids.
Devenir
L'ensemble des souris impliquées dans ce projet feront l’objet d’une analyse du système immunitaire et de l'évolution tumorale, ce qui nécessitera leur mise à mort.
Remplacement
Les nombreux partenaires (cellulaires et moléculaires) des processus dynamiques immunitaires et tumoraux nécessitent une approche expérimentale in vivo car il n’existe pas à ce jour de système suffisamment fiable pour mimer cette complexité biologique.
Réduction
Le nombre d'animaux prévu dans chaque groupe est basé sur un calcul d'effectif permettant de prédire que nous avons 80% de chance d’obtenir un résultat statistiquement significatif.
Raffinement
La détection de toute souffrance de l’animal sera assurée et le niveau de souffrance évalué en fonction d’une grille de score. Les animaux seront euthanasiés dès l’apparition d’un signe de détresse (perte de poids supérieure ou égale à 20% du poids initial, convulsions, paralysie, prostration, difficulté à se déplacer). Pour le bien-être de l'animal, les souris seront logées selon les normes requises avec un enrichissement (copeaux de bois, dômes) et en groupes de 5 individus par cage afin d’éviter le stress de l’isolement.
Choix des espèces
Les données bibliographiques démontrent que le modèle murin est le plus adapté pour aborder les questions relatives aux tumeurs cérébrales et à l'immunité tumorale. Les tumeurs de glioblastome générées dans ce modèle animal précis sont particulièrement similaires aux tumeurs humaines. Les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 6 semaines et utilisées à l’âge de 7 semaines, en accord avec les protocoles décrits pour ce modèle physiopathologique classique.
Inflammation pulmonaire et altérations cardiovasculaires dans un modèle de Bronchopneumpathie Obstructive Chronique (BPCO)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
352 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 198 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et chacun subit la totalité des gestes du protocole. Sur animal éveillé, ils passent quinze minutes en pléthysmographie, quinze minutes d'épreuve d'effort sur tapis, quinze minutes de mesure de pression artérielle à la queue, et une prise de sang deux jours après une infection pulmonaire simulée. Sous anesthésie, un emphysème leur est induit, leur fonction cardiaque est mesurée par échographie et une sonde relève la pression transœsophagienne. Comme effets attendus, le porteur ne décrit pourtant qu'une "difficulté respiratoire modérée à l'exercice", une réduction de l'activité physique et un stress lié aux manipulations sur animal éveillé.
Objectifs
Les changements rapides dans notre environnement peuvent perturber l'équilibre délicat de nos poumons, entraînant des problèmes de santé tels que l'asthme et la Bronchopneumopathie Obstructive chronique (BPCO), une maladie pulmonaire chronique. Les substances que nous respirons peuvent également affecter d'autres parties de notre corps, comme le cœur, les vaisseaux sanguins, le cerveau, les muscles et les reins. Les infections virales ou bactériennes peuvent aggraver la BPCO, et des problèmes cardiaques sont fréquents chez les personnes atteintes de BPCO ou d'emphysème qui est une maladie qui entraine la destruction des alvéoles des poumons. Cela rend la respiration difficile, car les poumons ont du mal à se remplir d'air et à expulser le dioxyde de carbone. Comprendre comment cette maladie se développe ou s'aggrave est complexe, et nous ne comprenons pas encore complètement comment ils progressent dans le temps. Pour mieux comprendre comment les problèmes cardiaques se développent chez les personnes atteintes de BPCO, nous avons créé un modèle chez le rat qui imite cette maladie. Notre objectif est d'étudier comment la taille de l'emphysème affecte le cœur et les vaisseaux sanguins chez les rats, et comment l'inflammation et le vieillissement contribuent aux problèmes respiratoires et cardiaques après une infection pulmonaire. Nous allons également tester différentes approches pour réduire les impacts sur le système cardiaque chez les personnes atteintes de BPCO.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de cette recherche seront principalement de comprendre et d'approfondir nos connaissances sur les mécanismes sous-jacents des répercussions cardiaques de l'emphysème. En analysant les composantes de l'inflammation et du vieillissement, nous visons à élucider les intrications complexes entre ces processus, offrant ainsi des perspectives plus approfondies sur les facteurs qui contribuent aux dysfonctionnements cardiaques observés dans le contexte de la BPCO. De plus, en éclaircissant les liens entre l'inflammation, le vieillissement et la pathologie cardiaque, cette recherche pourrait contribuer à la découverte de biomarqueurs potentiels et à la mise en évidence de voies thérapeutiques ciblées.
Procédures
La totalité des animaux seront soumis aux mêmes gestes techniques suivants: sur animal éveillé la pléthysmographie/fonction respiratoire (15 minutes par animal), tapis métabolique/épreuve d'effort (15 minutes par animal), mesure non invasive de la pression artérielle à la queue (15 minutes par animal), prélèvement sanguin de 0,1 mL sera effectué à la queue deux jours après avoir mimé une infection pulmonaire (environ 1 minute par animal). L'animal sera anesthésié pour induire l'emphysème (10 minutes au total), analyser la fonction cardiaque par échographie (environ 15 minutes par animal) et enfin mesurer la pression transœsophagienne (environ 15 minutes par animal).
Impact sur les animaux
Nous avons maintenant plus de 5 ans de recul sur ce modèle. Les animaux peuvent présenter les symptômes classiques de l'emphysème pulmonaire chez l'homme, tels qu'une difficulté respiratoire modérée à l'exercice et une réduction de l'activité physique. De plus, un stress lié aux manipulations non invasives sur animal éveillé peut exister chez l'ensemble des animaux (prise de la pression artérielle, prise de sang et épreuve d'effort).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de permettre des prélèvements d'organes. L'objectif principal de cette euthanasie est de réaliser une exploration histologique approfondie, mettant particulièrement l'accent sur des organes tels que le cœur et les poumons. Ce processus est essentiel pour une compréhension détaillée des éventuelles altérations histopathologiques et pour valider les atteintes pulmonaires et cardiaques.
Remplacement
Il n'existe pas de méthode en laboratoire capable de reproduire les conditions exactes rencontrées chez les personnes atteintes d'emphysème ou de BPCO. Pour mieux comprendre ces maladies et leurs mécanismes, des expériences sur des rats sont nécessaires. Cela nous permet d'étudier les processus inflammatoires qui se produisent dans les poumons lors de la BPCO. Ces expériences sont difficiles à réaliser chez les humains, et il n'existe pas de modèle cellulaire qui puisse reproduire parfaitement la maladie.
Réduction
Nous avons maintenant plus de 5 ans de recul sur ce modèle, ce qui nous permet de réduire le nombre d'animaux à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats, en utilisant les données publiées de notre équipe de laboratoire pour une procédure similaire et des études fonctionnelles au niveau cardiaque chez le rat. Nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés grâce à une approche rationnelle et organisée des protocoles : des études échographiques, hémodynamiques et biologiques sont réalisées sur le même rat, ce qui permet de diminuer le nombre de rats et d'optimiser les interprétations. De plus, à la fin du protocole, les animaux sont utilisés par plusieurs groupes de recherche de l'équipe pour étudier les fonctions pulmonaires, cardiaques, vasculaires et musculaires. Afin de réduire le nombre d'animaux et d'augmenter la puissance statistique, un maximum de déterminations seront réalisées sur tous les animaux. Le nombre d'animaux utilisés dans ce protocole (22 animaux par groupe, soit un total de 352 animaux) a été calculé afin d'obtenir des résultats significatifs grâce à des outils statistiques.
Raffinement
Notre objectif est de réduire au strict minimum la détresse imposée aux animaux. Les rats seront hébergés de manière appropriée, avec un enrichissement du milieu permettant de répondre à leurs besoins physiques et comportementaux. Les animaux seront surveillés de près et les points limites établis seront appliqués. Nous évaluerons les critères de souffrance animale (rythme cardio-respiratoire, reprise de mouvement, état de prostration, hydratation) ; en cas de détresse anormale, les animaux seront euthanasiés par injection létale d'anesthésique. Chaque jour, les animaux seront contrôlés par un zootechnicien formé lors de sa visite de zone.
Choix des espèces
Le modèle de rat est largement caractérisé sur le plan cardiovasculaire, avec un nombre important de travaux décrits dans la littérature quant à sa faisabilité. La physiologie cardiaque des rongeurs et notamment du rat présente de grandes similitudes avec celle de l’homme, tant au niveau des régulations que de la structure morpho-fonctionnelle. Le modèle rongeur présente l’avantage de permettre des investigations depuis l'échelle cellulaire et moléculaire jusqu'aux mesures sur l'animal en laboratoire, en utilisant les mêmes techniques exploratoires employées chez l’homme. Les études sont réalisées sur des animaux adultes mâles âgés de 8 semaines, ainsi que sur des mâles âgés de 18 mois, afin d'étudier l'effet du vieillissement.
Détermination de l’efficacité d’un pansement liquide nouvelle génération pour le traitement de plaies cutanées cicatrisants par seconde intention chez le lapin
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Pour constituer le dossier préclinique d'un pansement liquide avant son marquage CE, 18 lapins subissent chacun quatre plaies cutanées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie générale de trente à quarante-cinq minutes, chaque lapin reçoit quatre plaies et quatre pansements, et quatre anneaux de silicone sont suturés à sa peau au fil non résorbable pour empêcher la rétraction, anneaux qui restent en place les trente jours de l'étude. Les deux semaines précédant l'opération, les lapins sont habitués à porter un gilet de protection, jusqu'à dix heures consécutives le dernier jour. Tous sont tués à trente jours pour prélever la plaie cicatrisée, le porteur affirmant que "3 animaux par groupe est le minimum acceptable pour pouvoir conclure statistiquement" dans une étude qu'il présente par ailleurs comme pilote et destinée surtout à de l'imagerie.
Objectifs
La peau est le plus étendu des organes du corps humain qui assure plusieurs fonctions vitales pour l’organisme. Cet organe est soumis tout au long de la vie à de nombreux dommages, provoqués par des facteurs extérieurs d’origine physique (coupures), mécanique (ulcères), thermique (brûlures) et/ou chimique (radiations). La sévérité des dommages couplés à d’autres facteurs, tels que l’âge, le diabète et la nutrition, peuvent conduire à une mauvaise voire non-cicatrisation des plaies, appelées les plaies chroniques. Elles impactent fortement la qualité de vie des patients, jusqu’à engager leur pronostic vital. Ce problème de santé publique est amené à s'accroître avec le vieillissement de la population et l'augmentation de la prévalence du diabète et de l'obésité. L’objectif de cette étude est de déterminer l’efficacité de différentes solutions de pansement liquide nouvelle génération développées par notre laboratoire (comparativement à des techniques utilisées couramment) le soin de plaies cicatrisant par seconde intention (plaies chronique ou aigüe) 1 – évaluer la qualité de la cicatrisation en fin du processus cicatriciel : un prélèvement histologique sera réalisé à J30 à la fin de la phase de ré-épithélialisation de la plaie. 2 – évaluer la durée de cicatrisation : un contrôle visuel 2 fois par semaine permettra d’évaluer le stade de cicatrisation de la plaie. Parmi les modèles de cicatrisation cutanée qu'on retrouve dans la littérature, nous avons retenu celui faisant appel à une biopsie cutanée suivie de la mise en place de disque de silicone permettant d’éviter la rétraction spontanée de la peau. Ce modèle présente l’avantage de refléter au mieux le phénomène de cicatrisation humaine. Par ailleurs, les tests précliniques sont indispensables à l’évaluation d’un dispositif médical avant le passage aux tests cliniques chez l’Homme. La formule sélectionnée pourra alors passer à l’étape suivante du marquage CE : l’étude clinique
Bénéfices attendus
Au travers de cette étude, nous espérons observer une diminution du temps de cicatrisation avec nos formulations comparativement aux pansements standard. Mais également une amélioration de la qualité de la cicatrise via une observation histologique en fin de cicatrisation. Par ailleurs, ces essais nous permettrons d’obtenir des preuves précliniques qui seront utilisées dans le cadre de la demande d’autorisation de mise sur la marché.
Procédures
Procédure chirurgicale induction des plaies et pansement sous anesthésie générale. L’anesthésie durera 30-45 min. 1 injection d’anesthésique 4 injections d’anti-inflammatoire 4 plaies cutanées 4 poses de pansement Suture de 4 anneaux sur la peau au fil non résorbable. Ces anneaux resteront en place durant toute la durée de l’étude
Impact sur les animaux
Hypothermie liée à l'anesthésie Douleur post opératoire Perte d’appétit, deshydratation
Devenir
Tous les animaux de l’étude seront mis à mort. A 30 jours, à la fin de la phase de ré-épithélialisation de la plaie, les animaux seront mis à mort et un prélèvement de la plaie cicatrisée sera réalisé pour évaluer la qualité de la cicatrisation.
Remplacement
Les plaies cicatrisants par seconde intention sont des plaies complexes qui touchent les différentes structures de la peau (allant de l’hypoderme à l’épiderme) et qui subissent des forces mécaniques qui peuvent être importantes en fonction de la localisation de la plaie. Par ailleurs, les méthodes d’analyse in vitro ne prennent pas en considération l’environnement locale et systémique impliqués dans le processus de cicatrisation. Il n’existe donc pas de modèles in vitro permettant de prendre en compte tous ces paramètres. De plus, dans le développement d’un dispositif médical innovant, il est nécessaire de tester les formulations sélectionnées sur des modèles animaux afin d’appréhender la biocompatibilité et l’efficacité des dispositifs avant le passage chez l’Homme. .
Réduction
Cette étude est une étude pilote qui nous permet principalement de faire de l’imagerie pour observer les différences sur le processus cicatriciel en fonction de la solution de pansement utilisée. Pour chaque formule trois réplicas seront réalisés afin de pouvoir observer et comparer la cicatrisation sur 3 individus (lapins). Ces 3 réplicas nous permettrons également de comparer la différence de temps de cicatrisation entre différentes solutions de suture. 3 animaux par groupe est le minimum acceptable pour pouvoir conclure statistiquement sur l’étude. 4 plaies seront réaliser sur le dos d’un animal afin de réduire le nombre d’animaux dans l’étude.
Raffinement
Les animaux bénéficient de plateforme dans leurs cages, de jouets et de morceaux de bois à ronger dans leur environnement de vie. Les animaux font l’objet d’une surveillance quotidienne de la naissance à la mort par le personnel animalier. Ainsi qu’une visite quotidienne la première semaine post opératoire puis deux fois par semaine de la part de l’opérateur de l’étude. Au cours de l’étude, l’animal devra porte un gilet de protection des pansements. Les 2 semaines précédant la chirurgie, les animaux sont progressivement habitués au port du gilet. Jour 1 : le gilet est déposé dans la cage quelques minutes, Jour 2 : le gilet est mis en place sur l’animal 2 minutes. La durée augmente graduellement sur 2 semaines. Le dernier jour de l’habituation, l’animal porte le gilet 10 heures consécutives. L’animal sera placé sous anesthésie générale lors de la chirurgie. Les animaux recevront un traitement anti-inflammatoire et antalgique les 3 premiers jours post opératoire qui permettra de réduire la douleur ressentie. Le traitement pourra se poursuivre en fonction des signes cliniques observés quotidiennement les jours suivants. Les animaux seront suivis quotidiennement durant environ 30j (le temps de la cicatrisation) puis seront mis à mort. Au cours de l’anesthésie, l’animal pourrait se refroidir. Pour pallier cet inconfort qui pourrait engendrer une mauvaise récupération des suites de l’anesthésie, l’animal sera placé sur un tapis chauffant tout le long de la chirurgie, jusqu’à son réveil.
Choix des espèces
Les modèles animaux préférentiellement utilisés dans la littérature dans ce type d’expérimentation sont les rongeurs, le lapin ou encore le porc. Les rongeurs ont tendance à retirer/arracher tout corps étranger présent sur leur peau, ce qui empêche toute chance de conclusion sur l’efficacité d’un système de pansement de plaie. Chez le lapin, il est possible de protéger la zone lésée grâce à un gilet de protection conçu sur mesure. Ce gilet permet à la plaie de cicatriser sans sollicitations de l’animal. Animaux choisis : adulte, 2.5kg Poids des animaux adaptés au gilet de protection fait sur mesure pour des animaux matures. Surface (cm²) du dos adaptée à la réalisation des 4 pansements. Animal mature avec structure anatomique de la peau et système immunitaire adaptés au besoin de l’étude.
Validation de l’immunisation contre des protéines membranaires impliquées dans le processus de carcinogenèse chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit cinq injections intramusculaires ou sous-cutanées et subit huit prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, avec un risque de plaie ou d'infection aux points de piqûre que le porteur mentionne. L'objet immédiat reste de vérifier que les souris fabriquent des anticorps contre des protéines repérées par criblage cellulaire, et que l'immunisation tient sur une année d'observation, l'effet anticancéreux n'étant abordé qu'ensuite. Le porteur écrit qu'il "apparaît nécessaire" de tester le rôle de ces protéines dans un modèle animal complexe, et renvoie la validation de leur intérêt thérapeutique à "d'autres projets déposés ultérieurement", donc à d'autres animaux.
Objectifs
Le vieillissement cellulaire est caractérisé par un arrêt de la prolifération cellulaire, qu’elle soit physiologique (vieillissement naturel) ou accéléré (stress oncogénique notamment). Considérée dans un premier temps comme bénéfique en permettant l’élimination de cellules anormales (cellules « âgées » ou présentant des mutations) ce vieillissement cellulaire est présenté actuellement comme pouvant avoir également une facette délétère. En effet une trop grande quantité de cellules vieillissantes peut induire la production de facteurs sécrétés qui vont jouer un rôle favorable dans le processus de carcinogenèse, aussi bien dans l’initiation que dans la propagation du Cancer. En combinant un criblage cellulaire et l’analyse de bases de données publiques des protéines membranaires impliquées dans le processus pro-tumoral ont pu être mise en évidence, afin de pouvoir développer de nouvelles approches thérapeutiques, soit prophylactique soit curative. Dans un premier temps chaque candidat identifié subira une étape de validation avec une approche in vitro. Ensuite il faut induire dans un modèle animal la production d’anticorps dirigés contre less candidats cibles. Pour chaque candidat cible 3 voies d'immunisation seront utilisées : une approche novatrice avec l’utilisation d’ARNm, une approche plus classique dite approche peptidique et une troisième approche combinant les deux. La production d’anticorps dirigés contre les protéines d’intérêt sera vérifiée ainsi que la durabilité de l’immunisation en observant sur une année les souris immunisées. Enfin si ce projet montre la capacité à « vacciner » sans effet secondaire les animaux contre ces protéines membranaires alors l’impact de cette vaccination comme thérapie anticancéreuse sera testé, soit dans une approche prophylaxique soit dans une approche curative.
Bénéfices attendus
Ce projet est un projet qui vise à démontrer la capacité à induire la production d’anticorps dirigés contre des protéines potentiellement impliquées dans le Cancer. Le but étant ensuite, au travers d’autres projets déposés ultérieurement, de valider l’impact de l’inhibition de ces protéines comme potentiel outil thérapeutique. La vaccination étant une voie novatrice explorée actuellement pour lutter de façon prophylaxique ou curative contre des maladies comme le Cancer.
Procédures
Lors de toutes les interventions décrites ci-après les animaux seront anesthésiés (anesthésie gazeuse) et un anesthésique local sera également appliqué (pommade, collyre). Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, 8 au total. Chaque prélèvement sanguin durera entre 3 et 5 minutes (de l'endormissement au réveil de l'animal). Pour immuniser les animaux ils recevront 5 injections qui pourront être intra-musculaires (ARNm), sous-cutanées (peptides), ou bien 2 intra-musculaires et 3 sous-cutanées. Chaque injection durera 5 à 6 minutes (endormissement, rasage, antalgique, injection, réveil).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront ressentir un stress modéré lors de la manipulation (pesée hebdomadaire, observation) et lors de l’initiation de l’anesthésie gazeuse. Les animaux pourront ressentir de la douleur lors de chaque prélèvement sanguin ainsi que lors de chaque injection, qu’elle soit réalisée en intra-musculaire ou en sous-cutanée. Risque de plaie ou d’infection au point d’injection ou au point de prélèvement.
Devenir
A l'issu de la procédure les animaux seront mis à mort. Du sang sera prélevé ainsi que les organes lymphoïdes (impliqués dans la réaction immunitaire) et un maximum d'organes afin d'étudier les modifications éventuelles liées à l'immunisation.
Remplacement
Des études montrent que les acteurs du vieillissement peuvent être impliqués dans le Cancer. Des analyses haut débits ont permis d'identifier certains de ces acteurs. Après avoir validé ces acteurs par des expériences in vitro, il appraît nécessaire de tester le rôle réel de ces acteurs dans un modèle animal complexe. Pour cela des animaux seront alors immunisés contre ces acteurs du vieillissement. Une fois que la production d'anticorps contre ces cibles aura été validé alors l'effet de cette "vaccination" pourra être testée dans des modèles de cancer.
Réduction
Ce protocole cherchera à réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés. La capacité à immuniser des souris contre des protéines d’intérêt, qui sont produire à un faible niveau dans les conditions physiologiques, sera testée, après que les candidats cibles aient subi un maximum de test in vitro. Il n’y aura pas de tests statistiques dans ce protocole, le but étant pour chaque cible de voir quelle voie d’injection permet la production maximale d’anticorps, s’il y a bien production d’anticorps. Les deux sexes seront utilisés car, même si aucun effet sexe, nous ne pouvons l’exclure de façon définitive pour chaque cible. Enfin la collaboration pour ce projet avec une équipe qui a une très forte expertise concernant l'immunisation des souris permettra d'utiliser directement les concentrations optimales, ce qui permettra également de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Dès leur arrivée dans l’animalerie les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation aux expérimentateurs. Les animaux seront pesés une fois par semaine, et observés à la fois par le personnel animalier (une fois par semaine lors du change) et les expérimentateurs (une à deux fois par semaine, hors geste expérimental) dans le cadre du suivi de l’état général des souris. Une liste précise permettant de scorer les signes éventuels de souffrance sera alors utilisée afin d’évaluer si les animaux présentent des signes de souffrance ou d’atteinte d’un point limite qui entrainerait leur mise à mort. Afin de diminuer au maximum le stress et la douleur des animaux ils seront anesthésiés et recevront l'analgésie appropriée lors des injections et des prélèvements sanguins. Les animaux seront hébergés dans des cages présentant des enrichissements comme du coton de nidation, des batonnets de bois et éventuellement des tunnels.
Choix des espèces
Le modèle murin est un modèle de choix pour les études sur l’animal (1) de par son homologie avec le génome humain (plus de 90% d’homologie) et également (2) de par les différents modèles génétiques qui ont été développés chez la souris. Une fois que la production d'anticorps contre les cibles aura été validé, il sera nécessaire d'aller plus loin en testant l'impact de cette vaccination dans des modèles de cancer chez la souris (modèles génétiques de susceptibilité au Cancer). Les animaux seront utilisés à un stade jeune adulte car ce projet nécessite des animaux dont le système immunitaire est mature.
IMPLICATION ET POLARISATION DES CELLULES MYELOIDES AU COURS DE L’ONCOGENESE
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Tatouées aux phalanges à trois semaines puis biopsiées à la queue pour génotypage, les souris reçoivent à l'âge adulte une injection intrapéritonéale de cellules tumorales qui déclenche un adénocarcinome ovarien, colorectal ou pancréatique. 2 493 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 2 448 d'entre elles, avec des traitements administrés par gavage, dans l'eau de boisson ou par voie intrapéritonéale tous les quatre jours pendant soixante jours. Le porteur décrit une accumulation de liquide d'ascite dans le péritoine aux stades tardifs et une altération de l'état général, tout en affirmant que des résultats antérieurs ont permis de vérifier que ces points limites ne sont pas atteints, le seuil de mise à mort étant fixé à 40 % de prise de poids. Toutes sont tuées à la fin pour prélever le sang et les organes.
Objectifs
Il est reconnu que les cellules du microenvironnement tumoral, et plus particulièrement les macrophages, sont des acteurs clé dans le contrôle de la progression tumorale et de la réponse aux traitements. Plus récemment, d’autres cellules de la lignée des cellules myéloïdes, dont font partie les macrophages, ont été décrites et seraient recrutées au niveau de la tumeur. Au cours de la carcinogénèse, les macrophages, cellules de la défense immunitaire, basculent d’un phénotype anti-tumoral vers un phénotype favorisant la croissance tumorale. Ainsi, trouver des cibles et des traitements permettant de moduler le recrutement et le phénotype des cellules myéloïdes pourraient faire avancer les stratégies thérapeutiques du cancer. Nous avons en partie défini le rôle des macrophages, au cours de la progression tumorale dans différents cancers (adénocarcinome ovarien, carcinose péritonéale d’origine colorectale, cancer du pancréas). Pour la suite de ce projet, nous souhaitons tester l’efficacité de différents traitements pharmacologiques. Nous disposons de souris délétées spécifiquement au niveau des cellules myéloïdes pour des facteurs clé de la polarisation (Récepteur nucléaire PPAR-γ, facteurs de transcription LRH-1). Ainsi nous pourrons identifier plus clairement les voies de signalisation impliquées dans l’effet de nos agents pharmacologiques sur le recrutement et la polarisation des cellules myéloïdes dans la progression tumorale. Ces agents pharmacologiques pourraient agir en synergie avec les traitements de chimiothérapie conventionnelle ou éviter une rechute due à l’acquisition d’une chimiorésistance. Ainsi, nous souhaitons en parallèle étudier l’association de ces agents pharmacologiques avec le traitement de référence. Nous utiliserons ensuite des modèles déplétés pour différentes populations immunitaires (macrophages, ou lymphocytes) afin d’évaluer la part respective des différents acteurs cellulaires dans l’effet des agents pharmacologiques testés. Une autre approche thérapeutique envisagée serait le transfert adoptif de cellules myéloïdes polarisées en vue de bloquer la progression tumorale.
Bénéfices attendus
La recherche des mécanismes modulant le recrutement et les caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques des cellules myéloïdes au cours de la progression tumorale dans des modèles expérimentaux de cancers chez la souris, nous permettra de définir des cibles thérapeutiques pertinentes. L’évaluation de l’effet de différents agents pharmacologiques dans différents modèles de cancers (ovarien, colorectal et pancréatique) de proposer des thérapies ciblées selon le type de cancers.
Procédures
Les souris seront identifiées au sevrage (à 3 semaines) par tatouage au niveau des phalanges afin de pouvoir suivre de manière individuelle chaque animal. Une biopsie de queue sera effectuée pour le génotypage. Lorsque les souris sont adultes, un adénocarcinome ovarien sera induit par une injection intra-péritonéale de cellules tumorales. les souris seront ensuite traitée à l’aide d’agents pharmacologiques avec un suivi sur 60 jours (observations, suivi du poids). Deux autres types de cancers seront étudiés, un adénocarcinome colorectal et cancer du pancréas induits par une injection intra-péritonéale de cellules tumorales avec un suivi de 15 jours. Les traitements seront administrés par voie orale (eau de boisson ou par gavage) ou par voie intrapéritonéale tous les 4 jours pendant 60 jours ou tous les jours pendant 15 jours selon le modèle. Les observations et suivi dupoids nous permettront de suivre l'évolution de la maladie. Au sacrifice, des prélèvements (sang, différents organes), nous permettront d'étudier le dévéloppement des cellues tumorales et l'effet des traitements.
Impact sur les animaux
Les modèles murins trangéniques dont nous disposons dans cette étudene présenta pas de phénotype dommageable. Des tests de cytotoxicité des agents pharmacologiques seront réalisés au préalable avant l’administration des traitements aux souris afin d’éviter toutes nuisances ou effets indésirables. Dans ces modèles murins de carcinose, un liquide d’ascite s’accumule dans le péritoine lors des stades tardifs de la progression tumorale. Le développement tumoral peut engendrer un gain de poids important des souris avec une altération de l’état général. Les animaux seront mis à mort si la prise de poids est supérieure à 40% du poids initial, si les animaux présentent des signes de mutilations, des difficultés respiratoires. La durée de l’étude est définie selon des résultats antérieurs qui ont permis de vérifier que ces points limites ne sont pas atteints. Pour le traitement par injection intrapéritonéale, le point d’injection sera désinfecté et surveillé journalièrement. Pour le traitement par gavage ou dans l’eau de boisson, la prise hydrique sera évaluée journalièrement.
Devenir
A la fin de la procédure les animaux seront euthanasiés ce qui permettra de réaliser différents prélèvements d’organes
Remplacement
Nous testerons plusieurs types de molécules (agents pharmacologiques) qui sont susceptibles de pouvoir moduler les caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques des cellules myéloïdes au cours de la progression tumorale. Ces molécules, auront été présélectionnées via des résultats préliminaires basés sur des tests in vitro qui permettent d’appréhender les effets potentiels d’une molécule sur les processus tumoraux. Des tests de cytotoxicité de ces molécules seront réalisés au préalable avant l’administration des traitements aux souris afin d’éviter toutes nuisances ou effets indésirables. Ces tests seront réalisés sur des cellules myéloïdes, population cible des molécules, et sur les lignées tumorales utilisées pour les modèles tumoraux chez la souris. Cette étape est essentielle pour éliminer les molécules pouvant induire la prolifération des cellules tumorales et pour estimer la concentration à administrer aux souris. Cette démarche permet de sélectionner les molécules et de limiter le nombre d’animaux utilisé.
Réduction
Les résultats actuels ont permis de valider, en fonction des différents et nombreux paramètres évalués, qu’un nombre de 6 souris par lot est nécessaire afin d’acquérir des données suffisantes et permettre d’effectuer des tests statistiques fiables. L’expérience et les données déjà acquises sur des souris contrôles nous permettrons de comparer la fiabilité de nos données et d’éviter l’utilisation inutile d’animaux (éviter le double emploi). Le projet sera conduit en progressant par étape afin de limiter le nombre d’animaux. Une étude pilote sera menée pour déterminer l’innocuité et le choix d’agents pharmacologiques et de la durée de traitement Le choix des modèles transgéniques sera également réduit en fonction des résultats obtenues dans les premières étapes de ce projet et les approches in vitro qui seront menées en parallèle.
Raffinement
L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux adaptée à l’expérience et aux potentiels effets indésirables des procédures sur l’état de santé global des animaux. Les conditions d’hébergement permettront de conserver le comportement social des souris et de limiter le stress par l’enrichissement (papier pour la nidification, tunnel). le développement tumoral des animaux sera surveillé ainsi que son état général. Un animal sera mis à mort s’il présente un des points limites d’arrêt de la procédure, définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Le prélèvement de sang sera effectué sous anesthésie générale et anesthésie locale. Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux en collectant le plus de données possibles. Les mécanismes impliqués dans le développement des cancers sont complexes. Ainsi, cette étude permettra d’étudier dans leur contexte physiopathologique les cellules myéloïdes, cibles thérapeutiques potentielles, et ne peut pas être mimée par une approche de culture cellulaire.
Choix des espèces
La souris offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèle dans ce type de projet: faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés qui nous permettront d’explorer l’implication de différentes voies de signalisation, cibles pertinentes pour des approches pharmacologiques dirigées. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc …) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Adultes, souris âgées de 8 à 20 semaines afin d'avoir des souris avec un système immunitaire mature.
Effet de la modulation du microbiote intestinal par antibiothérapie sur les cellules entéroendocrines de souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
800 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à cinq gavages, subir dix-huit prélèvements sanguins et cinq mises à jeun, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles boivent des mélanges d'antibiotiques pendant quelques jours à deux mois, pour que leur flore intestinale soit détruite, puis passent jusqu'à quatre tests métaboliques comportant chacun six heures de jeûne et quatre prises de sang. Le porteur écrit que ce protocole produit "a priori peu d'effets indésirables", tout en listant déshydratation, perte de poids et diarrhées. Toutes sont tuées pour que leurs cellules intestinales productrices d'hormones soient triées, au service d'une question posée en termes de santé humaine, l'obésité et les maladies inflammatoires de l'intestin.
Objectifs
Les intestins sont un organe majeur pour la santé car ils sont à l’interface entre alimentation, les bactéries intestinales et l’organisme. L’intestin permet notamment la digestion et l’absorption des aliments, tout en faisant barrière aux microbes et aux toxines. L’intestin produit également des hormones qui régulent les fonctions de différents organes, modulant ainsi par exemple le comportement alimentaire, la régulation énergétique ou les fonctions intestinales (transit intestinal, digestion…) elles-mêmes. Ces hormones sont produites par des cellules intestinales spécifiques, appelées cellules entéroendocrines (EECs). Ces cellules libèrent les hormones en réponse à des modifications de leur environnement. Des modifications des fonctions intestinales et notamment des hormones intestinales sont associées à différentes maladies telles l’obésité ou des maladies digestives. Ces maladies sont également associées à une modification des bactéries intestinales. Il a été montré que la déplétion complète du microbiote intestinal induit une modification importante des EECs et une augmentation des niveaux circulant de certaines hormones. Notre travail de recherche vise à mieux caractériser comment les bactéries de l’intestin influent sur les hormones intestinales et les cellules qui les produisent. Dans ce projet, nous modulerons le microbiote intestinal par l’action d’antibiotiques, mesurerons le niveau des hormones et analyserons précisément ces cellules grâce à l’utilisation de souris exprimant une fluorescence associée à ces cellules et permettant de les isoler. Nous chercherons notamment à identifier quelles sont les bactéries ou leurs produits responsables des modifications observées des EECs, ainsi qu’aux conséquences fonctionnelles des niveaux élevés de certaines hormones intestinales.
Bénéfices attendus
Le rôle de l’intestin et en particulier des hormones intestinales pour la santé de l’homme apparait comme étant très important, en particulier dans l’obésité ou les maladies inflammatoires de l’intestin, qui touchent plus de 650 millions d’individus à travers le monde. Un lien entre microbes et les cellules produisant les hormones intestinales a déjà été établi. Cette étude nous permettra d’identifier plus précisément comment certains produits microbiens ou certaines bactéries modulent les fonctions des EECs et quelles sont les conséquences sur la physiologie de l’hôte. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris permettant de trier cette population cellulaire rare, et mesurerons les niveaux d’hormones après différentes stimulations. Cela nous permettra d’identifier comment ces cellules sont régulées dans différents contextes microbiens et d’en déduire les produits microbiens qui régulent ces cellules. Compte tenu des fonctions importantes de ces hormones pour la santé, ce projet permettra de proposer de nouvelles voies modulant leurs niveaux et ainsi agir sur les fonctions quelles régulent, notamment dans le cas de maladies où ces fonctions sont altérées.
Procédures
Les 800 animaux recevront des mélanges d’antibiotiques dans leur eau de boisson pendant quelques jours à deux mois. Toutes les expérimentations seront réalisées sur animaux vigiles. Les animaux seront pesés deux fois par semaine, et leur consommation alimentaire mesurée en parallèle. Au maximum quatre tests métaboliques seront réalisés sur tous les animaux. Chaque test comporte une phase de jeûne (6h), quatre prélèvements sanguins au maximum, et un gavage ou une injection d’un stimulus d’intérêt Certains animaux recevront une injection préalable à l’administration du stimulus. La durée d’un test métabolique n’excède pas deux heures entre la première prise de sang et la dernière et chaque prélèvement de sang en lui-même n’excède pas trente secondes. Un gavage supplémentaire au moment de la mise à mort (entre 10 minutes et une heure avant l’euthanasie) sera également réalisé sur des animaux mis à jeun pendant 2 à 6 heures pour la mesure du transit intestinal. Des prélèvements de sang seront réalisés lors de la mise à mort, avant le gavage et au moment de la mise à mort. Lors des mesures de transit, certains animaux recevront également une injection préalable pour étudier le rôle des hormones. Au total, les 800 animaux pourront recevoir jusqu’à 5 gavages, être prélevés pour leur sang 18 fois et mis à jeun 5 fois, en recevant les traitements antibiotiques pendant un maximum de deux mois.
Impact sur les animaux
Ce protocole produit a priori peu d’effets indésirables sur les animaux : la consommation des antibiotiques dans l’eau de boisson a déjà été pratiquée à de nombreuses reprises sans impact sur la santé et le comportement des animaux. Les effets indésirables des antibiotiques peuvent être une déshydratation, une perte de poids ou l’apparition de diarrhées. Les injections, gavages et prélèvement de sang peuvent induire une légère douleur et un stress du fait de la contention. Les jeûnes peuvent conduire à une perte de poids réduite, rattrapée les jours suivants. Les stimuli administrés n’ont pas d’effet indésirable connu chez les animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de récolter leurs tissus pour l’isolement des cellules produisant les hormones intestinales par tri cellulaire. Les fonctions des cellules pourront alors être analysées par différentes techniques
Remplacement
L’utilisation de souris pour cette expérimentation est nécessaire par l’impossibilité d’étudier in vitro ou de modéliser l’interaction entre les bactéries et l’intestin du fait de l’absence de modèles pour cultiver un microbiote complexe en contact direct avec un épithélium intestinal dans des conditions physiologiques. De plus, il n’existe pas actuellement de modèle in vitro permettant d’étudier l’ensemble des EECs.
Réduction
Dans ce projet, nous utiliserons des groupes de 8 animaux de même sexe. Ce nombre a été évalué comme suffisant par l’analyse statistique des variations de chaque variable au sein d’un groupe lors de projets précédents La rareté des cellules entéroendocrines nécessitant l’utilisation de tissus entiers pour chaque application. Le projet sera réalisé sur des souris mâles et femelles car l’effet sexe est inconnu. Des analyses statistiques permettront d’étudier l’effet sexe sur la déplétion du microbiote.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter, d'un abri en propylène rouge, et d’un support suspendu et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum et seront hébergés à plusieurs par cage pour éviter l'isolement. Les animaux seront surveillés quotidiennement. Une grille de décision (points limites) est établie.Les volumes de gavage seront adaptés aux poids des animaux. Les animaux seront habitués à être manipulés avant et pendant toute la durée de l’expérimentation afin de diminuer leur stress lors de la contention et les prélèvements.
Choix des espèces
Les souris utilisées sont issues d’une lignée génétiquement modifiée pour exprimer une protéine fluorescente dans toutes les cellules entéroendocrines. Cette lignée est un modèle particulièrement utile pour l’étude des cellules entéroendocrines, permettant de les trier ou de les distinguer facilement lors de l’analyse des tissus. L’étude portant sur les cellules entéroendocrines matures, des souris adultes (8 à 12 semaines au démarrage du protocole) seront utilisées. Les hormones intestinales et le système digestif de la souris étant très proche de celui de l’Humain, l’utilisation du modèle souris apporte des connaissances généralisables pour la santé humaine.
Compréhension de la relation entre le mucus intestinal et le système myentérique dans la prévention par les acides gras oméga3 de l’hyperperméabilité intestinale induite par l’obésité alimentaire
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Pour savoir si des souris génétiquement modifiées, dont les tissus sont riches en oméga 3, résistent mieux que les autres à l'obésité provoquée, 96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles passent quatorze semaines sous un régime dont 45 à 60 % des calories viennent des graisses, sont pesées chaque semaine, isolées quelques minutes à trois reprises pour la récolte de crottes, et tuées à la fin par ponction dans le cœur. Le porteur reconnaît que l'excès de poids peut gêner leurs déplacements, leur toilettage et leur accès à l'eau. Il indique avoir défini "un point limite adapté en lien avec l'obésité attendue" sans dire lequel.
Objectifs
Au cours de l’installation de l’obésité alimentaire, la mise en place d’une altération du microbiote intestinal contribue à perturber la fonction barrière de l’intestin. Ces altérations conduisent au passage dans le plasma des lipopolysaccharides des bactéries à Gram négatif de la flore microbienne intestinale et donc à une inflammation chronique. En tant que molécules nutritionnelles thérapeutiques, les acides gras polyinsaturés (AGPI) oméga3 sont connus notamment pour améliorer la fonction barrière intestinale et diminuer la production de molécules pro-inflammatoires lors de l’hyperperméabilité intestinale. Dans ce contexte, nous avons montré que les AGPI oméga3 endogènes tissulaires, chez un modèle murin transgénique, préviennent de l’obésité alimentaire et maintiennent l’imperméabilité intestinale en conservant en autre l’intégrité de la couche de mucus qui tapisse l’intestin. Se faisant, ils protègent ainsi les animaux d’une inflammation chronique de bas grade, ce phénotype étant transférable par le microbiote intestinal. L’obésité alimentaire est également connue pour induire, au niveau intestinal, une altération de la motilité qui est régulée par le système nerveux entérique (SNE). La neuroplasticité induite par des régimes hyperlipidiques inclut ainsi des altérations structurales et fonctionnelles du SNE mais pourrait également affecter le volume, la viscosité et la porosité du mucus. Dans le contexte de lutte contre l’obésité, le SNE constitue ainsi une nouvelle cible d’étude, en particulier dans la compréhension des phénomènes contribuant à la mise en place des altérations de la perméabilité intestinale conduisant à une inflammation chronique. Ainsi, les objectifs de ce projet de thèse sont de décoder la contribution relative des fortes teneurs en AGPI oméga3 tissulaires endogènes chez un modèle de souris transgénique sur le SNE dans un contexte d’inflammation de bas grade induite par une obésité alimentaire en lien avec l’étude des différentes composantes de la perméabilité intestinale, en particulier au niveau de du mucus colique.
Bénéfices attendus
L’obésité est associée à une hyperperméabilité intestinale entrainant le passage des lipopolysaccharides bactériens dans la circulation sanguine, ce qui pourrait être en partie responsable d’une inflammation chronique de bas bruit. Le traitement de l’obésité et de ses désordres métaboliques est donc un enjeu majeur de santé publique ; l’impact de l’alimentation et en particulier des AGPI oméga3 étant une piste privilégiée. Cependant, les études nutritionnelles apportant des AGPI oméga3, tant chez l’homme que le rongeur, présentent de nombreux biais rendant les données existantes peu concluantes. Un modèle de souris transgénique présentant un enrichissement tissulaire endogène en AGPI oméga3 élevé représente donc une alternative de choix dans l’étude de l’impact de ces acides gras sur les désordres métaboliques associés à un régime hyperlipidique inducteur d’obésité. Nous avons montré ce bénéfice sur la prise de poids, l’insulinorésistance périphérique et le maintien de la fonction barrière de l’intestin via la préservation de la composante épithéliale et de la couche de mucus qui le tapisse. L’obésité alimentaire est également connue pour induire, toujours au niveau intestinal, une altération de la motilité qui est régulée par le système nerveux entérique (SNE). La neuroplasticité induite par des régimes hyperlipidiques inclut ainsi des altérations structurales et fonctionnelles du SNE mais pourrait également affecter le volume, la viscosité et la porosité du mucus. Dans le contexte de lutte contre l’obésité, le SNE constitue ainsi une nouvelle cible d’étude, en particulier dans la compréhension des phénomènes contribuant à la mise en place des altérations de la perméabilité intestinale conduisant à une inflammation chronique. Ainsi, dans un contexte d’inflammation de bas grade induite par une obésité alimentaire, décoder la contribution relative des AGPI oméga3 tissulaires endogènes sur le SNE lors des perturbations de la fonction barrière de l’intestin et le lien entre SNE et structuration du mucus qui en particulier hébergent des bactéries commensales d’intérêt pourrait émerger comme un facteur important pour de futures thérapies chez l’homme.
Procédures
Les animaux seront manipulés de façon hebdomadaire afin d’évaluer leur poids. Au départ de la mise sous régime puis aux semaines 8 et 13, des fèces seront collectés (3 à 4 crottes sur une durée d’une dizaine de minutes) Un prélèvement terminal sera effectué à la fin de la semaine 14 via une ponction intracardiaque nécessitant une à deux minutes par animal.
Impact sur les animaux
Le maintien des animaux sous un régime hyperlidique (45 ou 60% kcal de lipides) durant 14 semaines peut être considéré comme une nuisance car l’excès de poids peut provoquer des difficultés de mobilité, de toilettage ou un problème d’accès à l’eau de boisson. Un potentiel stress pourra subvenir lors de la contention des souris effectuée au moment de la pesée ou lors du bref isolement (quelques minutes) permettant la récolte de fèces.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue du projet afin de réaliser des prélèvements de différents tissus (sang, colon)
Remplacement
Un modèle de souris transgénique dont les tissus sont intrinsèquement riches en AGPI oméga3 est un modèle précieux car cette souris possède un niveau d’enrichissement qui n’existe dans aucun autre modèle murin et qui est non atteignable par des stratégies alimentaires. D’une part, l’ubiquitisme de l’enrichissement tissulaire en AGPI oméga3 et d’autre part les taux tissulaires obtenus rendent impossible le remplacement de ce modèle de souris par des modèles in vitro. De plus, le protocole décrit vise à étudier le SNE du côlon lors de l’altération de la fonction barrière de l’intestin et en particulier lors de la formation du mucus colique par deux niveaux de régimes hyperlipidiques (45 et 60 % kcal de lipides). Il est impossible de complètement modéliser ce processus et ces interactions à travers des approches in vitro. En effet, si la co-culture de cellules entériques gliales et de lignées cellulaires coliques secrétant de mucus pourrait être envisagée, un tel modèle ne permettrait pas de reproduire in vitro la complexité des interactions entre le SNE et ces cellules coliques qui secrètent le mucus, mucus qui apparait bicouche avec une structuration très organisée in vivo. Cette structuration très organisée représente un enjeu essentiel pour le maintien de la perméabilité intestinale et le dialogue entre le SNE, le mucus et le microbiote qui y vit. Enfin, cette étude est menée dans un contexte d’obésité alimentaire. Ce contexte est difficile à modéliser en raison de la complexité des impacts métaboliques observés et de la diversité des approches de régimes utilisés. Cet aspect ne peut donc également pas s’affranchir de l’utilisation d’animaux. Cette étude est donc unique dans l’approche de l’étude de l’impact des AGPI oméga3 sur le SNE et le mucus colique dans un contexte d’obésité alimentaire et de ses pathologies associées.
Réduction
Les effectifs ont été optimisés sur la base des coefficients de variabilité reportés dans la littérature et les différences attendues entre les différents groupes pour les paramètres clés de l’étude. Lors de la conception du protocole expérimental nous avons déterminé le nombre de 8 animaux par groupe nécessaire et suffisant à l'obtention de résultats statistiquement exploitables. De plus, les animaux sont élevés par génotype afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Notre expérience dans le domaine et notre retour statistique des études précédentes nous permettent de valider cette approche. Les statistiques seront réalisées au moyen d’un test statistique approprié.
Raffinement
Les animaux sont maintenus en groupe afin de réduire le stress dû à la captivité. Toutes les souris auront accès à des enrichissements de milieu dans chaque cage, constitués de carré de coton et/ou papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Une attention particulière sera également portée à la surveillance de la prise de nourriture et aux comportements liés au stress. Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée en secteur conventionnel et intégration dans le projet. Un point limite adapté en lien avec l’obésité attendue a été défini. Si ce point limite défini est atteint, un arrêt de la souffrance engendrée sera effectué par mise à mort de l’animal après anesthésie profonde puis dislocation cervicale.
Choix des espèces
La détermination de l’impact d’un régime obésogène sur la perméabilité intestinale et la relation entre le SNE et le mucus est primordiale dans notre étude. Cet aspect ne peut s’affranchir de l’utilisation d’animaux afin de mimer au mieux un contexte d’inflammation bas grade induit par l’obésité. Bien que relativement éloignée de l’Homme, l’espèce murine est l’espèce animale de référence dans ce domaine de recherche et la plus utilisée en recherche préclinique avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. Le modèle de souris transgénique utilisé est un modèle précieux qui rend cette étude unique dans l’approche de l’impact des AGPI oméga3 sur la prévention de l’hyperperméabilité intestinale induite par un régime obésogène et le dialogue entre le SNE et le mucus colique. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 12 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids supérieur à 20g. En effet, nous nous intéressons à l’obésité et aux conséquences métaboliques associées développées par les jeunes adultes car il a été montré que l’augmentation de l’obésité touche toutes les tranches d’âge mais que la fréquence semble plus élevée dans les tranches 25-34 et 35-44 (de l’ordre de 8% par an). De telles données sur le jeune adulte ont été également confirmées aux Etats-Unis et récemment en France. De plus, les études précédentes au laboratoire mettant en évidence la transmission de la résistance partielle de l’induction de l’obésité alimentaire par le microbiote de souris fat-1 à des souris sauvages a porté sur l’animal jeune adulte. Nous souhaitons pouvoir inscrire ces nouvelles expérimentations dans notre objectif thématique plus global.
Etudes fondamentales et appliquées des interactions entre bactériophages et bactéries chez l’animal
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système respiratoire
Instillations dans le nez ou la trachée sous anesthésie, gavages jusqu'à six fois dans la même journée, injections dans le ventre ou dans la veine, infections bactériennes du poumon ou de l'intestin : 14 416 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées, sans possibilité d'être réutilisées ni adoptées, parce qu'elles ont été infectées par une bactérie pathogène qu'elles pourraient porter et transmettre. Le projet vise à comprendre comment les bactériophages, virus qui n'infectent que des bactéries, se comportent chez un hôte vivant, en vue d'élargir leur usage thérapeutique face à l'antibiorésistance. Le porteur annonce des groupes de six souris au maximum et trois répétitions par expérience, sans expliquer comment on arrive à 14 416 souris.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de faire avancer les connaissances sur l’utilisation thérapeutique des bactériophages. Les bactériophages sont des virus qui infectent uniquement les bactéries. Ils peuvent donc être utilisés pour tuer les bactéries résistantes aux antibiotiques. Ils présentent l’intérêt d’être très spécifiques des bactéries ciblées. D’autre part, les bactériophages font partie de la flore naturelle au même titre que les bactéries. Très abondants dans le tube digestif des animaux ils jouent un rôle important dans le maintien de la santé de l’appareil digestif. Leur utilisation (transplantation virale) pour rétablir une homéostasie intestinale est soutenue par des données cliniques préliminaires encourageantes. Ainsi, nous étudierons les interactions dynamiques entre les bactériophages et les bactéries dans deux organes cibles : les poumons et les intestins. Les connaissances qui seront acquises au cours de ce projet permettront de mieux appréhender le potentiel thérapeutique des bactériophages dans le but de permettre leur utilisation plus large en clinique.
Bénéfices attendus
Les avantages escomptés sont la compréhension des mécanismes mis en jeu lors d’une phagothérapie. Ces mécanismes recouvrent non seulement les interactions entre les bactériophages et les bactéries mais aussi celles avec l’hôte et notamment son système immunitaire. La meilleure compréhension de l’utilisation thérapeutique des bactériophages permettra d’augmenter le nombre de patients traités dans des conditions optimales d’efficacité. Permettre à des patients d’accéder à ce type de traitement alors que les antibiotiques ne sont plus efficaces permettra de réduire le nombre d’impasses thérapeutiques et le coût des frais hospitaliers mais surtout d’améliorer les conditions de vie de ces patients.
Procédures
Les prélèvements sur animaux vigiles seront limités à un seul prélèvement sanguin (quelques secondes), ou des prélèvements fécaux (chaque animal est placé dans une boite pendant quelques minutes et jusqu’à 2 fois par jour). Les administrations par gavage (quelques secondes) seront limitées à 2 par jour.
Impact sur les animaux
Nous veillerons dans nos expériences à impacter le moins possible le bien-être des souris. Les expériences consistent essentiellement à - des injections intrapéritonéales ou intraveineuses une fois ou sur quelques jours. La piqure d'aiguille pour effectuer ces injections entraine une douleur légère de courte durée. - des gavages intragastriques jusqu’à six fois sur une journée qui nécessitent une contention brève - des installations intranasales ou intratrachéales sur animaux anesthésiés - des protocoles infectieux qui entraineront un inconfort et une douleur de sévérité modérée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront été infectés par une bactérie pathogène. Cela implique que 1) leur défense immunitaire sera différente d’autres animaux non exposés à ce même pathogène et 2) ils sont potentiellement devenus porteurs asymptomatiques de cette bactérie pathogène et seraient donc susceptible de la transmettre s’ils étaient réutilisés. De plus, la plupart d’entre eux seront mis à mort pour analyser des organes vitaux.
Remplacement
L’évaluation des différents points évoqués dans le résumé du projet ne peut malheureusement pas s’envisager dans des systèmes in vitro, qui sont inappropriés pour reproduire la complexité d’un organisme entier et sa réponse à l’infection (système immunitaire). Par ailleurs, s’agissant de bactériophages, l’évaluation pharmacocinétique ne peut s’appuyer sur l’existence de modèles mathématiques. De même, l’étude in vitro des communautés microbienne d’un tube digestif prenant en compte la structuration spatiale des organes n’est pas encore disponible.
Réduction
D’une part, en amont des expériences conduites chez l’animal nous effectuons de nombreuses expériences in vitro afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires. D’autre part, autant que possible, le nombre maximal de paramètres sera collecté pour chaque animal de façon à limiter le nombre total d’animaux utilisé. Un maximum de 6 souris par groupe sera utilisé afin d’assurer une représentativité statistique minimale. Au maximum 3 répétitions seront réalisées de façon indépendante pour valider les résultats expérimentaux et augmenter la puissance des analyses statistiques. Pour les données quantitatives, la distribution normale des variables sera vérifiée et les tests statistiques appropriés seront alors choisis. Pour les variables qualitatives d’autres tests seront effectués. Les éventuels effets confondants (sexe et cage par exemple) seront pris en compte au moment de l’analyse en utilisant des modèles linéaires à effets mixtes. L’outil de bioluminescence sera utilisé pour évaluer l’évolution de l’infection in situ, pour suivre le même animal au cours du temps, limiter les variations inter-individuelles et ainsi diminuer le nombre d’animaux requis.
Raffinement
Les animaux infectés seront observés 2 à 5 fois au cours du premier jour puis au moins une fois par 24h durant les 2 jours suivants puis ensuite une fois par période de 48h. Ils seront pesés au moins une fois par période de 48h dès le début du protocole. Une grille d’évaluation à 3 niveaux (0, 1, 2) permettra de suivre l’état de santé de chaque animal. Le score de 1 déclenchera l’ajout d’un diet gel pour faciliter l’alimentation et l’hydratation. Le score 2 sera attribué aux animaux ne bougeant plus et ayant une posture prostrée, ou présentant une perte de poids supérieur à 20%, ou présentant de signes de diarrhée pendant plus de 48h. Tout animal présentant un score de 2 pour l’un des critères sera mis à mort. Au cours des expériences, toute modification des procédures visant à réduire la douleur des animaux (par exemple, réhydratation sous-cutanée, chauffage des cages) sera évaluée avant d’être mise en place.
Choix des espèces
A ce stade expérimental du développement de la phagothérapie, la souris représente l’espèce la plus pertinente pour l’évaluation des paramètres pharmacocinétiques et l’innocuité du traitement. Il s’agit d’un mammifère dont le système immunitaire est bien connu et comporte de très grandes analogies avec celui de l’homme. L’utilisation d’autres animaux plus proches de l’homme (primates) ou de références en pharmacocinétique (porc Yucutan) ne peuvent représenter des animaux de première intention à ce stade de nos travaux. De même, la disponibilité d’élevages de souris gnotobiotiques est un outil de choix qui n’est pas encore disponible pour d’autres espèces. Dans tous les cas, seuls des animaux adultes seront utilisés (>= à 7 semaines) car leur système immunitaire est arrivé à maturité au contraire d’animaux plus jeunes.
Etude du rôle de deux protéines et des défenses immunitaires dans la guérison de la leucémie.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
3 402 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles reçoivent des cellules leucémiques dans la veine de la queue, parfois après une irradiation de cinq minutes sans anesthésie destinée à détruire une partie de leurs défenses, puis une injection quotidienne dans l'abdomen pendant vingt et un jours, une capsule implantée sous la peau du dos et des ponctions de moelle osseuse dans le fémur. Une partie d'entre elles est laissée aller jusqu'au point limite terminal pour mesurer la durée de survie. Le porteur justifie le choix de la souris par le fait qu'elle partage 99 % de ses gènes avec l'être humain et que sa génétique et son comportement sont "parfaitement connus", ce qui permettrait selon lui de "mesurer très facilement" leur bien-être, leur souffrance et leur angoisse.
Objectifs
Notre projet s’intéresse à un sous-type de cancer du sang appelé leucémie. Cette maladie est causée par une modification des molécules d’ADN présentes dans les cellules à l’origine des globules rouges et blancs. On observe chez les patients atteints d’une leucémie un blocage de la production de globules blancs fonctionnels, qui s’accumulent dans la moelle osseuse. Les études menées sur des modèles souris de leucémie ont permis d’identifier le rôle essentiel de deux éléments cellulaires (on parle de protéines) dans la réponse au traitement. En effet, en absence de traitement, ces protéines sont déréglées dans les cellules leucémiques et ne contrôlent donc plus leur survie et leurs fonctions. Les précédents travaux ont identifié deux médicaments qui permettent l’élimination des cellules leucémiques notamment en redonnant à ces protéines leur rôle de régulateur de la survie des cellules. Nous cherchons maintenant à déterminer le rôle respectif de chacune de ces protéines et aussi quelle partie de l’une de ces protéines permet d’éliminer les cellules leucémiques en réponse au traitement. Nous disposons au laboratoire d’un modèle de souris qui possède la même modification d’ADN que les patients et développe spontanément une leucémie. Lorsque ces souris tombent malades, nous pouvons récupérer les cellules leucémiques et les injecter dans de nouvelles souris pour obtenir un modèle fiable, répétable, que nous pouvons analyser en profondeur. Dans ce projet, nous produiront de nouvelles cellules leucémiques qui présentent différentes variations des protéines pour tester leur réponse au traitement. Des traitements allant de 3 heures à 21 jours seront administrés aux souris malades. Nous utiliserons également des souris ne possédant pas de système de défense immunitaire pour déterminer si ces défenses sont importantes pour guérir de la leucémie. Enfin, nous analyserons directement les cellules leucémiques pour comprendre comment elles réagissent au traitement. Nous mettrons également en place un système utilisant des souris afin d'obtenir un grand nombre de cellules à l'origine des cellules sanguines. Ce système permettra de faire des analyses approfondies au niveau de la cellule en utilisant un nombre réduit de souris.
Bénéfices attendus
Ces nouveaux travaux permettront de mieux comprendre le rôle de ces protéines dans la guérison de la leucémie ainsi que le rôle que joue le système immunitaire dans la réponse au traitement. A plus long-terme, comprendre les mécanismes qui permettent l’initiation de la leucémie mais également l’élimination des cellules cancéreuses après thérapie pourra amener à de nouveaux traitements dans les autres types de leucémie qui présentent un très mauvais pronostic.
Procédures
Les cellules leucémiques récupérées des souris développant spontanément la leucémie seront injectées par voie intra-veineuse (dans la veine caudale sur souris éveillée, durée de l'injection : 1 min) dans des souris ayant ou non un système immunitaire (cela permettant de déterminer le rôle du système de défense dans l'effet des traitements). Dans le cas des injections à des souris possédant un système immunitaire, une étape d'irradiation (permettant de détruire partiellement ces cellules de défense; durée 5 minutes sans anesthésie) sera parfois utilisée afin de faciliter la prise de greffe des cellules cancéreuses. Cette injection permettra le développement de la leucémie dans ces souris. Nous mettrons en place la stratégie thérapeutique en utilisant une combinaison de médicaments couramment utilisés pour traiter ce type de cancer. Cela correspond en l'administration quotidienne d'une molécule thérapeutique par injection intra-péritonéale (dans l'abdomen de la souris éveillée, durée de l'injection : 10 s) pendant 21 jours, pouvant être combiné à la mise en place sous la peau du dos de la souris d'une capsule permettant la libération continue du second médicament (implantation réalisée sous analgésie et anesthésie générale, l’opération dure une dizaine de minutes). Dans certaines expériences, d’autres traitements seront évalués en parallèle. Ils seront administrés soit dans l'eau de boisson, soit par injection intra-péritonéale quotidienne (2 à 6 jours max), pendant toute la durée de l'expérience. Le suivi du développement du cancer sera suivi par un prélèvement de la moelle osseuse au niveau du fémur. Il ne sera pas réalisé systématiquement, puisque le développement de la maladie peut être également détecté par une palpation de l'abdomen de la souris (détection d'une masse témoignant d'une prolifération importante des cellules cancéreuses dans la rate). Néanmoins, nous souhaiterons, sur quelques souris, vérifier la présence des cellules cancéreuses avant de détecter cette masse abdominale ou vérifier l'efficacité de nos traitements. Pour cela les souris seront anesthésiées et recevront un traitement anti-douleur préventif. Le prélèvement sera réalisé 2 fois maximum durant la vie des animaux (avant et après traitement) avec un intervalle de 2 semaines (durée 3 min). Pour le modèle permettant la production d'un grand nombre de cellules à l'origine des cellules sanguines, les souris recevront une unique injection en intraveineuse (durée 30 s, sans anesthésie).
Impact sur les animaux
Dans les modèles leucémiques, des signes cliniques de la maladie peuvent apparaître durant sa progression. Ces signes incluent des modifications de l’apparence (manque de toilettage, yeux clos…) ou du comportement (mobilité, agitation) et une augmentation de la taille de la rate. Les prélèvements de la moelle osseuse avant et après traitement pourraient induire une douleur pendant quelques heures après l’intervention. Les traitements utilisés dans ce projet peuvent induire des nuisances. Tout d’abord, l’implantation de la capsule sous la peau du dos peut entraîner une gêne dans le déplacement. Dans les jours qui suivent l'implantation, une irritation et une rougeur au niveau des points de suture peuvent être observées. Ensuite, les injections dans l'abdomen sont réalisées quotidiennement jusqu’à 21 jours consécutifs, pouvant générer une douleur localisée au site d'injection et un stress lié à la manipulation quotidienne des souris. Enfin, les différents traitements peuvent conduire à une perte de poids des animaux, poids regagné aussitôt le traitement terminé pour les souris dont la survie est étudiée après la fin du traitement. Le condition des souris avant l'injection des cellules cancéreuses peut entrainer un affaiblissement de la souris (perte de poids, diarrhée).
Devenir
La majorité des animaux seront euthanasiés à la fin du traitement afin de prélever un maximum d’organes et ainsi évaluer les mécanismes d'action de ces molécules thérapeutiques dans le cas des cancers du sang. Certains des animaux seront utilisés pour déterminer la survie des animaux traités jusqu’à l’atteinte des points limites terminaux (euthanasie dès l'atteinte d'un point limite terminal).
Remplacement
Un grand nombre de tests a déjà été effectué sur des cultures de cellules (in vitro). Mais ces modèles sont limités car ils ne reproduisent pas la complexité d'un organisme vivant (absence d'interaction entre cellules saines et cancéreuses). De plus la distribution des traitements dans l’organisme joue un rôle important dans l’effet thérapeutique d’une molécule et cela est impossible à reproduire sans l’utilisation d’animaux. Enfin, les souris disposent d’un système immunitaire proche de celui de l’humain qui permet d’étudier les interactions entre les cellules immunitaires et la leucémie. Toutefois, le développement de modèle cellulaire ex vivo pour certains aspects de notre projet devrait nous permettre, à terme, de diminuer le nombre d’animaux engagés dans des procédures expérimentales.
Réduction
Grâce à une analyse statistique et à notre expertise sur ce type d’expériences, nous avons réduit le nombre de souris utilisés au maximum tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, nous optimisons nos expériences pour réaliser le plus d'analyses possibles sur les cellules obtenues à partir d'un même animal (récupération dans une seule expérience d’un grand nombre d’organes du système immunitaire afin de réaliser le maximum d’analyse et de conserver des prélèvements pour des études ultérieures.).
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi (présence de papier kraft pour la création de nid et de buchette en bois à ronger). Un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Une fois par semaine, nous réaliserons un suivi clinique des animaux à l'aide d'une grille de score permettant de déterminer des points limites précoces qui conduiront à l'euthanasie des animaux. Un traitement anti-douleur sera administré avant chaque geste pouvant générer une douleur (implantation de la capsule sous la peau du dos, prélèvement de la moelle osseuse dans le fémur) ainsi que lorsque des signes de douleur sont observé lors de l'examen clinique. En absence d'amélioration, l'animal sera euthanasié.
Choix des espèces
La souris est un mammifère de petite taille dont la génétique et le comportement sont parfaitement connus. Cela permet de mesurer très facilement le bien-être, la souffrance et l’angoisse des animaux et de pouvoir y remédier le cas échéant. De plus, la souris et l’homme partagent 99 % de leurs gènes. Ainsi, les résultats des expériences réalisées chez la souris pourront être facilement transposables à l'être humain et donc améliorer l'étude des pathologies humaines et leurs traitements. Les souris utilisées dans le cadre de ce projet seront des souris adultes afin de reproduire le plus fidèlement possible la pathologie humaine et l'effet des traitements ainsi que d’étudier le rôle d’un système immunitaire mature.