Recherche fondamentale

Élevées sans aucune cachette sous une lumière colorée de 3 000 lux douze heures par jour, 240 jeunes seiches européennes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique qu'il ne peut pas enrichir les bacs, un abri permettant aux animaux d'échapper à la lumière et ruinant du même coup l'expérience. Toutes sont tuées par refroidissement progressif, dix à quinze minutes entre l'anesthésie sous six degrés et la mort sous quatre, pour prélever et fixer leurs tissus. Parmi les bénéfices annoncés, le projet doit "optimiser les conditions d'élevage et d'hébergement" d'une espèce dont le porteur précise que les standards restent en cours d'élaboration.

Objectifs

Parmi les animaux aquatiques, les céphalopodes montrent des capacités de camouflage complexes et uniques. Le camouflage est permis par les motifs colorés qui sont dynamiques et changeants. Les couleurs sont dues aux pigments contenus dans les chromatophores, organes dont l’activité est contrôlée directement par le cerveau, permettant ainsi des modifications rapides des motifs. Notre espèce est la seiche européenne dont le développement et les premiers mois de vie se déroulent en milieu côtier. La pigmentation de la peau par les chromatophores a lieu dès la phase embryonnaire et les motifs se complexifient après éclosion, en lien avec les facteurs environnementaux directs, comme la lumière et le fond sur lequel elles vivent. Ce projet a pour objectif de tester différents facteurs comme l’effet d’un éclairement de “couleur” différente et la couleur du bac sur le niveau de pigmentation des animaux au cours de leur développement après éclosion. Par une expérimentation conduite sur des juvéniles de seiche, nous déterminerons si la “couleur” différente de la lumière d’éclairement et la couleur du bac modifient 1) les régulations moléculaires en lien avec la synthèse des pigments et 2) la couleur générale adaptée au fond et au type de lumière. Ce projet permettra une meilleure connaissance des adaptations et des effets des changements environnementaux sur le cycle de vie de ces animaux marins, il permettra d’élaborer des hypothèses évolutives et fonctionnelles sur l’influence du facteur couleur du bac et couleur de la lumière au cours du développement, chez l’embryon et chez le juvénile après éclosion. Ce projet permettra également d’optimiser les conditions d’élevage et de maintien des juvéniles Des caméras situées au-dessus des bacs permettent d’évaluer l’intensité de pigmentation des juvéniles en expérimentation par acquisitions d’images.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’identifier si la couleur de la lumière et la couleur du bac sont des facteurs importants dans le contrôle de la mise en place de la pigmentation. L’approche par l’expression des gènes permet de tester les régulations moléculaires mises en place par l’animal face à son environnement et de les corréler avec la pigmentation observée (plus ou moins foncée) et son comportement de camouflage. Il a été montré chez des poissons que la “couleur” d’éclairement et la couleur du bac entrainaient des différences de pigmentation. Nous avons observé une pigmentation plus importante des jeunes seiches élevées sur bac de couleur noire et nous souhaitons confirmer ou infirmer cette observation. Tester chez la seiche l’ effet éventuel de la “couleur” de lumière et de la couleur du fond permettrait d’apporter des éléments de réponse à la mise en place et la régulation des motifs colorés, qui conditionnent chez l’adulte la qualité du camouflage. En plus de mieux comprendre les facteurs conditionnant la mise en place des motifs colorés, ce projet permettra d’optimiser les conditions d’élevage et d’hébergement et le bien-être animal de cette espèce pour laquelle les standards d’élevage sont en cours d’élaboration.

Procédures

Les animaux sont soumis à des éclairages différents (photopériode de 12h de lumières et 12h de nuit). Les animaux ne subissent aucune intervention avant leur mise à mort. Lorsqu’ils sont retirés des bacs à l’épuisette, ils sont immédiatement transférés dans un récipient. La mise à mort dérogatoire par le froid amène progressivement les animaux vers une anesthésie (

Impact sur les animaux

Trois prélèvements manuels à l’épuisette d’une durée de 10 à 20 secondes sont prévus par aquarium sur toute la durée de l’expérimentation, ce qui peut occasionner un stress passager. En l’absence de cachettes, on ne peut exclure que l’éclairement appliqué avec une intensité peu élevée d’environ 3000 lux et le type de couleur d’éclairement puissent occasionner une nuisance.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissus. Pour étudier l’expression des gènes dans les tissus, il est nécessaire que les organes soient extraits et fixés, ce qui implique la mise à mort des animaux. Il n’est pas possible de prélever une partie de l’animal sans causer des dommages irréversibles (pas de survie après prélèvement des organes/tissus d’intérêt).

Remplacement

Ce projet est un projet de recherche fondamentale qui cherche à comprendre la mise en place chez la seiche des motifs colorés qui constituent un élément fort du comportement de camouflage. Le développement requiert l’implication des organes du système nerveux (entre autres) qui contrôle ces éléments cutanés. Il s’agit donc d’un projet nécessitant un organisme entier intègre. Il n’y a pas d’alternative in vitro à l’heure actuelle

Réduction

La mise en place de collecteurs (support de ponte artificiel) relevés tous les jours dans le milieu naturel permet de récolter le nombre d’œufs nécessaires pour réaliser cette expérimentation en s’affranchissant de la conservation d’un stock de géniteurs en laboratoire. Il n’y a donc pas de maintenance de géniteurs sauvages. Le nombre de juvéniles est réduit mais optimisé pour cette expérimentation afin d’éviter de la répéter ultérieurement si les résultats n’étaient pas satisfaisants. Expérimentalement et statistiquement, le nombre de 10 animaux par groupe est un minimum afin de respecter les limites acceptables de la validité scientifique.

Raffinement

Les juvéniles éclosent dans leur aquarium d’origine (où ont été déposés les œufs); ils ne sont donc pas déplacés. Ils sont nourris à satiété avec des crevettes de taille adaptée (petites crevettes et mysis sp.) deux fois par jour (matin et après-midi). L’acquisition de données relatives à la pigmentation des animaux est réalisée sur photos prises par une caméra directement installée au-dessus du bac afin de limiter l’intervention humaine. Les rations sont réévaluées quotidiennement pour adapter la quantité d’aliment distribué à la biomasse de l’aquarium. Il n’est pas possible d’ajouter un enrichissement physique sous la forme de cachettes diverses (pièces en plastique) car cela contrecarrerait les objectifs du projet en permettant aux animaux de ne plus être sous l’influence de la lumière. L’éclairement est appliqué sur une période de 12h ; l’intensité de l’éclairement est d’environ 3000 lux grâce à la mise en place d’un variateur permettant la modulation de l’intensité. La mise en route ou l’arrêt de l’éclairement s’effectue sur une période de 30 min. Le bien être des animaux est évalué quotidiennement par une feuille de suivi permettant de quantifier l’expression de points limites en expérimentation.

Choix des espèces

Les céphalopodes sont les seuls mollusques possédant des capacités cognitives et des comportements élaborés. La seiche européenne pond des œufs sur nos côtes. Contrairement à d’autres espèces de céphalopodes comme les pieuvres, il n'y a pas de larves chez les seiches et les juvéniles se développent en 2 mois maximum ce qui permet de réaliser des observations. Les individus du projet sont des juvéniles après éclosion, pour évaluer la pigmentation et son contrôle nerveux, l’animal étant en lien direct avec les facteurs environnementaux.

Injectées d'antigènes, prélevées par ponction dans l'orbite de l'œil sous anesthésie à quatorze, vingt-huit et quarante-deux jours, puis exposées à cinq moustiques chacune pendant qu'elles sont endormies : 295 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Neuf jours après les piqûres, de nouveaux prélèvements rétro-orbitaires suivent, puis des biopsies de peau, pour un objectif que le porteur situe à long terme, un vaccin universel contre tous les flavivirus. Une partie des souris fournit le sérum, collecté par ponction dans le cœur juste après leur mise à mort, sérum ensuite injecté à d'autres souris exposées aux mêmes moustiques. Toutes sont tuées, les dernières par dislocation cervicale sous anesthésie après le prélèvement de la peau, avant tout réveil.

Objectifs

Le projet de recherche permettra de tester une nouvelle stratégie de lutte contre tous les flavivirus, tel que la dengue, le Zika et la fièvre jaune. L’objectif est de déterminer l’effet d’une immunisation contre un nouveau facteur de transmission chez le moustique et de déterminer le mécanisme. Ces données fourniront la base nécessaire au développement d’une stratégie vaccinale contre tous les flavivirus. Il sera réalisé sur deux établissements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme sont : i) Identifier une cible vaccinale contre tous les flavivirus, ii) Comprendre l’effet de l’immunisation contre la cible vaccinale sur la transmission. A long terme, les résultats permettront le développement d’un vaccin universel contre tous les flavivirus, lesquels infectent un demi-milliard de personnes et en tuent 250000 par an.

Procédures

D'abord, nous optimiserons l’immunisation contre le facteur de transmission. La procédure durera 42 jours. Nous injecterons les souris avec des antigènes et ferons des prélèvements sanguins à 14, 28 et 42 jours par ponction rétro-orbitaire sous anesthésie volatile. Ensuite, nous testerons l’effet de l’optimisation sur la transmission d’un flavivirus par piqûre de moustique. La procédure durera 52 jours. Les souris seront injectées avec les antigènes, exposées aux moustiques sous anesthésie générale et nous effectuerons à 3, 6 et 9 jours post piqûre des prélèvements par ponction rétro-orbitaire sous anesthésie. Puis, nous déterminerons si la protection contre la transmission est liée à l’immunité humorale (c.-à-d. les anticorps), en testant l’effet d’une immunisation passive par injection de sérum immune sur la transmission par piqûre. La procédure durera 52 jours. Nous injecterons les souris avec les antigènes, collecterons le sang par ponction cardiaque après euthanasie, injecterons le sérum immun dans d’autres souris, exposerons ce second lot de souris aux piqûres de moustiques et effectuerons à 3, 6 et 9 jours post piqure de moustiques des prélèvements sanguin par prélèvement retro-orbitaires sous anesthésie. Enfin, nous décrypterons comment l’immunisation contre le facteur de transmission affecte l’infection de la peau par piqûre du moustique. La procédure durera 52 jours. Nous injecterons les souris avec les antigènes, les exposerons aux piqûres de moustiques sous anesthésie et collecterons des biopsies cutanées à l'endroit de piqures de moustiques avec des punch et sous anesthésie. Les animaux seront sacrifiés juste après la réalisation des biopsies.

Impact sur les animaux

- Il est possible qu'une douleur légère soit occasionnée lors d'injection de l'anesthésique ou de l’antisérum. Toutes les autres interventions seront réalisées sous anesthésie. -Perte de poids, mobilité réduite ou inactivité, mauvais état corporel, stress, comportement anormal, troubles neurologiques liés à l’infection par le virus.

Devenir

Les souris dans toutes les procédures seront mises à mort sous anesthésie. Toutes les souris dédiées à la production des sérums seront prélevées par ponction intracardiaque juste après leur mise à mort. Les souris seront mises à mort après la réalisation de biopsies cutanées sous anesthésie et avant leur réveil.

Remplacement

Dans notre cas, le modèle animal est incontournable. Aucun modèle, à par le modèle animal, ne nous permettra de faire un test d’immunisation. Néanmoins, nous avons générés les données préliminaires nécessaires, supportant notre hypothèse, sur des modèles in vitro. De plus, nous caractériserons la fonction des gènes régulés identifiés par le scRNAseq (expérience 4) sur des modèles in vitro en utilisant des cellules primaires.

Réduction

-Afin de réduire le nombre de souris, nous allons utiliser une seule dose (la plus élevée) dans les groupes contrôles pour déterminer les meilleures conditions d’immunisation (procédure 1) -Dans les procédures 2, 3 et 4, nous exposerons chaque souris à 5 moustiques pour réduire le nombre d’animaux nécessaire aux tests de survie et à la collecte des biopsies de peau.

Raffinement

-Les souris seront manipulées de façon à réduire au maximum le stress, la douleur et la souffrance. Elles seront anesthésiées avant les prélèvements sanguins ou leur exposition aux moustiques pour limiter la gêne de la piqûre. Nous utiliserons des coussins chauffants et une lampe chauffante pour maintenir la température des souris anesthésiées. Un contrôle régulier, toutes les 15 min, sera effectué pour déceler toute possible anomalie liée à la narcose : suivi des grandes fonctions et desséchement de la cornée. En dehors des expériences, le suivi des souris s’effectuera chaque jour. - Les souris infectées seront mises à mort après la collecte des biopsies cutanées par dislocation cervicale sous anesthésie. - Nous ajouterons du gel ophtalmique pour palier au dessèchement de la cornée. - Les souris seront maintenues par 3 à 5 individus / cage avec de la litière et des enrichissements en alternance. Nous changerons la litière tous les 3 jours.

Choix des espèces

Nous allons utiliser des souris C57BL/6J. Contrairement aux autres modèles d’infection pour les flavivirus, ces souris ne sont pas immunodéprimées. Les modèles de transmission des flavivirus utilisent généralement des souris transgéniques avec une immunité innée déficiente. Notre projet vise à étudier la réponse immunitaire et nécessite un modèle animal avec une immunité fonctionnelle. De plus, nous avons déjà validé et établie les conditions pour infecter les C57BL/6J par piqûre de moustique. Par ailleurs, les souris sont des animaux de petites tailles, faciles à manipuler. Les constantes physiologiques seront facilement mesurables avec des outils adaptés. Nous allons utiliser des sujets adultes de 6 semaines, qui ont une taille corporelle et un système immunitaire mature permettant une réponse immunitaire adéquate, une piqûre par plusieurs moustiques simultanément et leur manipulation.

Deux chirurgies du crâne de deux heures chacune, puis une injection sous-cutanée quotidienne pendant six à neuf semaines : 104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une lentille optique implantée dans le cerveau et vivent seules en cage individuelle huit à seize semaines, avec une alimentation contrôlée pour rester motivées à chercher des récompenses dans une enceinte de test. Le porteur affirme que son dispositif miniature a "gommé" la plupart des limitations éthiques de l'imagerie in vivo et n'entrave pas les comportements normaux de la souris, quand l'isolement prolongé et la restriction alimentaire figurent au même protocole. Toutes sont tuées pour prélever le cerveau et vérifier que la lentille était bien placée.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer de quelle manière un traitement antidépresseur peut modifier le traitement de l’information et les codes neuronaux de la région cérébrale appelé hippocampe, une région essentielle pour la mémoire et l’adaptation aux conditions de stress. Cet objectif sera réalisé à travers (1) l’étude du comportement de souris traitées à un antidépresseur ou à un placebo lors de l’exposition à de nouveaux environnements couplée à (2) l’enregistrement simultané de neurones de la région d’intérêt. Pour cela, nous allons utiliser une technologie de pointe basée sur un système ultra miniaturisé et portatif permettant d’imager de manière longitudinale l’activité individuelle de multiples neurones en même temps chez l’animal libre de ses mouvements. La plupart des limitations habituelles éthiques et techniques liées à l’imagerie in vivo ont été gommées grâce à la conception de notre système d’imagerie : miniaturisation (moins de 2 cm et de 2 grammes) permettant de le placer directement sur la tête de l’animal de manière amovible comme un chapeau et sans entraver sans comportement normal. En outre, il permet de visualiser simultanément, à haute résolution et de manière répétée un nombre important de neurones par animal (jusqu’à plusieurs centaines) offrant ainsi une qualité de données et une puissance statistique inatteignable avec les autres techniques implantables.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d’apporter des éléments de connaissances des mécanismes et impacts des antidépresseurs à des niveaux cognitifs et neuronale permettant de comprendre comment les antidépresseurs peuvent induite leurs effets thérapeutiques et à l’avenir créer de nouvelles apporches favorisant ces effets

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 interventions chirurgicales (d’envrion 2h chacune) et un traitement antidépresseur quotidien par voie subcutanée pendant 6 à 9 semaines. Entrainements et tests comportementaux correspondant à une exploration libre de la souris d’une enceinte à la recherche de récompenses alimentaires (séance quotidienne de 30 à 40 minutes, ~6 semaines)

Impact sur les animaux

- Les chirurgies stéréotaxiques permettant l’injection du vecteur et l’implantation de la lentille optique avec son receptacle peuvent induire des douleurs post-opératoires légères à modérées avec un impact réduit dans le temps (quelques jours) sur le bien-être animal, les animaux étant traités avec un analgésique et récupérant rapidement de ce type de chirurgie. - Encombrement du système d’imagerie lors des tests, qui reste toutefois limité et léger (fibre optique et réceptacle seuls : < 0,2 g, miniscope < 2g), et n’entrave pas les mouvements et comportements normaaux de la souris après une première séance d’habituation. - Souris isolées après l’implantation du réceptacle, lors des phases d’entrainements et lors des tests (souris hébergées en cage individuelle pour une durée totale comprise entre 8 et 16 semaines). - Douleur légère au niveau du site d’injection (ip, sc)

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de récupérer le cerveau pour confirmer par histologie le bon positionnement de la lentille optique dans la zone cérébrale à imager puis doser l’expression de protéines cérébrales et comment celle-ci a été influencée par le traitement antidépresseur.

Remplacement

Ce modèle s'intéressant à l’activité du cerveau, aux effets cognitifs et comportementaux à la suite de traitement antidépresseur. Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique permettant une réduction des effectifs optimisée selon les recommandations éthiques. En outre, le nombre d'animaux pourra être réduit en fonction des résultats et notamment de l’efficacité de l’implantation (maximum 104 souris avec un taux de succès attendu de 50% d’après la société du système et notre expérience ; minimum 52 souris avec un taux de succès de 100%).

Raffinement

Les méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont optimisés : Les injections/implantations intracérébrales se feront sous anesthésie générale par des chercheurs formés et expérimentés. Les animaux recevront un traitement analgésique avant l’intervention chirurgicale, un traitement anti-inflammatoire après l’intervention et 24 heures après. Pendant la chirurgie, chaque animal sera placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie et les cornées sont protégées de la déshydratation. L’anesthésie gazeuse est ici privilégiée pour mieux contrôler la profondeur d’anesthésie et pour une meilleure récupération post-opératoire. Une surveillance post-opératoire d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris et intervenir si nécessaire (si reprise de poids déficiente ou température élevée, traitement antibiotique de penicilline). En cas de plaie, les animaux recevront un traitement analgésique. La plaie est désinfectée par l’application de bétadine dermique. Une surveillance accrue d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris montrant des signes de mal-être (hypothermie, prostration...) et intervenir si nécessaire (injection de saline pour l’hydratation, nourriture appétente...). Les injections sous-cutanées sont préférées aux intra-péritonéales pour leur plus grande sûreté et leur moindre invasivité. Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. Les expérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. Des points limites sont appliqués: les animaux surveillés sont pesés et oscultés quotidiennement (hydratation, température, état de la blessure si blessure). La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout d’une semaine. D’un point de vue scientifique, le système utilisé représente la méthode d’imagerie de résolution neuronale la plus moderne, performante et spécifique, permettant de visualiser simultanément à haute résolution un nombre important de neurones (jusqu’à plusieurs centaines) offrant ainsi une qualité de données et une puissance statistique inatteignable avec les autres techniques d’imagerie.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par la similarité entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, espèce modèle dans le domaine des pathologies psychiatriques. En outre, les traitements de référence ont démontré leur efficacité dans cette espèce. Les souris utilisées seront des individus adultes, l’étude ayant comme objectif d’améliorer la compréhension des mécanismes sous-tendant les effets cognitifs et thérapeutiques des antidépresseurs qui sont prescrits en premier lieu pour la dépression majeure de l’adulte chez l’homme.

Pour savoir si la présence d'un congénère modifie la consommation d'héroïne, 1 910 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit au moins une chirurgie sous anesthésie générale, injection intracérébrale d'une heure trente, implantation d'électrodes ou de fibres optiques de trois heures, pose de cathéter d'une heure, puis porte un capuchon de ciment dentaire sur le crâne. Une partie s'auto-administre l'héroïne, d'autres sont placés en position d'observateurs. Le porteur indique que la surconsommation peut conduire à une overdose et à la mort, que les rats sont isolés après l'opération et que leur alimentation reste contrôlée pour les garder motivés. Il justifie le recours au rat par le fait qu'il "s'auto-administre l'ensemble des agents toxicologiques consommés par l'humain" et par l'interdiction, en France, de fournir des drogues d'abus dans une expérimentation humaine.

Objectifs

Le rôle du contexte social dans la consommation de drogue n’est pas bien déterminé. Chez le rat, la diffusion d’un enregistrement de vocalises ultrasoniques, que les rats émettent pour communiquer les uns avec les autres, diminue la consommation de cocaïne, de même que la présence physique d’un congénère avec lequel il peut interagir. Cette diminution est d’autant plus forte lorsque le congénère est inconnu plutôt que familier (c’est à dire le partenaire de cage). Ces effets peuvent varier en fonction du type de drogue ou de son mode d’administration. On observe ainsi à l’opposé une augmentation de la consommation d’alcool chez le rat mis en présence d’un congénère. Ce projet vise à évaluer l’impact de ces contextes sociaux sur la consommation d’un autre type de drogue, l’héroïne. Le noyau subthalamique (NST) est impliqué dans les comportements de recherche et consommation de drogue et son implication dans l’influence de la présence d’un congénère ou la diffusion d’un enregistrement de vocalises ultrasoniques a été mis en évidence. Ses connections avec d’autres structures cérébrales, pourraient, elles aussi, être impliquées dans ces processus. Le but de ce projet est donc de caractériser les réseaux cérébraux liés au NST responsables des modulations de la prise d’héroïne dans les contextes sociaux décrits précédemment. Nous utiliserons différentes techniques afin d’évaluer sélectivement le rôle de chaque connexion. Notre objectif est également de mettre en évidence d’éventuelles différences en fonction du sexe des individus, en étudiant à la fois des rats mâles et femelles. Dans son ensemble, ce travail conduira à une meilleure compréhension des substrats neurobiologiques d’un effet du contexte social, déterminant pour la réduction des risques de consommation de drogues.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de découvrir quels sont les substrats cellulaires et moléculaires du NST et de son réseau pour mieux comprendre les processus émotionnels en lien ou non avec la prise de drogue, notamment l’effet du contexte social, qui peut être protecteur ou non en fonction de la drogue consommée. Pour cela, nous utiliserons la présence d’un observateur, qui permet une approche plus écologique et plus réaliste de la consommation de drogue chez l'humain. L’identité du congénère variera en fonction de sa familiarité, de son sexe et de son historique de consommation afin de déterminer l’impact de chaque paramètre social sur la consommation d’héroïne. En plus d’améliorer les modèles animaux d’addiction, ce projet générera des résultats à fort impact translationnel, apportant de nouvelles perspectives sur la physiopathologie de l’addiction, des potentiels effets réducteurs de risques des interactions sociales et confirmera le potentiel de la manipulation du NST pour le traitement de cette pathologie. Il permettra aussi de mieux comprendre les potentiels effets secondaires de la manipulation du NST. De plus, il permettra de mettre en évidence le rôle du NST dans la motivation et les comportements sociaux, et d’appréhender de nouvelles bases neurales de certains troubles liés, comme celui du spectre autistique.

Procédures

L'ensemble des animaux de ce projet seront soumis au moins une fois à un acte chirurgical, réalisée sous anesthésie générale. Ces interventions peuvent être de différents types : injection intracérébrale (1h30), implantation d’électrodes ou de fibres optiques (3h), pose de cathéter (1h).

Impact sur les animaux

* Les nuisances attendues sont les conséquences « classiques » à court terme des interventions chirurgicales. Durant les jours suivant l’opération, les animaux peuvent perdre un peu de poids, présenter une activité réduite. Dans le cas de l’implantation de fibres optiques, de même que celle des électrodes, les animaux peuvent ressentir une gêne due au poids du chapeau protecteur fait en ciment dentaire. Plus rarement, les animaux peuvent présenter un saignement au niveau des cicatrices. En général, ces nuisances s’estompent en 2-3 jours. Les animaux sont isolés durant cette période. * Un autre type de nuisance, pouvant engendrer du stress, est l’appariement fait entre les animaux de façon aléatoire à la réception des individus. Lorsque l’alimentation devient contrôlée (les animaux ne sont pas restreints, mais pas ad libitum), un sujet très dominant peut empêcher son partenaire de cage de s’alimenter correctement. * Les matériaux utilisés pour fabriquer et maintenir les cathéters ou fibres optiques ou électrodes, peuvent parfois engendrer des ‘bagarres’ entre partenaires de cage. En effet, les éléments en plastique, plus ou moins mous, les constituant, peuvent être ‘rongés’ par l’un des rats, provoquant ainsi une gêne et/ou un stress chez l’autre individu * La consommation d’héroïne n’induit pas d’augmentation générale de l’activité de l’animal, mais au contraire peut avoir un effet sédatif. Ces effets diminuent rapidement (environ 1h) après la dernière dose auto-administrée. * La surconsommation de drogue peut conduire à une overdose et la mort de l’animal. * Après une perte de contrôle de la consommation de drogue (protocole d’escalade de la consommation), l’animal n’ayant pas accès ad-libitum à la drogue, il peut présenter des symptômes de manque. * Les injections éventuelles d’analgésiant et d’anesthésique, de même que l’entretien du cathéter peuvent également engendrer du stress.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort après les études comportementales afin de vérifier que les injections des virus et implantations de fibres optiques et le cas échéant, d’électrodes d’enregistrement aient été correctement localisées. Cela est nécessaire afin de confirmer que les effets observés sur les comportements des rats soient liés aux structures cérébrales ciblées.

Remplacement

Ce projet a pour but d'étudier l'état fonctionnel d'un réseau cérébral dans une pathologie précise. L'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l'animal soit vigile et libre de ses mouvements. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, ne pouvant être remplacé pour ce genre d’étude. Le recours à des méthodes invasives exclut de fait les études chez le sujet humain, d’autant qu’il est interdit en France de fournir des drogues d’abus dans le cadre d’expérimentation humaine.

Réduction

L’expertise acquise dans l’équipe sur ce type d’expérience nous a permis de fixer a priori le nombre d’animaux nécessaires. Par expérience, 10 animaux sont nécessaires par condition testée pour permettre de mettre en évidence un effet comportemental dans les protocoles d'auto-administration de drogues ; ce nombre prenant en compte l’exclusion de certains individus suite à d’éventuels problèmes inhérents à ce type d’étude (infection, cathéter bouché etc…). Pour les études combinant auto-administration et optogénétique et electrophysiologiques, 15 animaux par condition testée sont nécessaires pour anticiper de possibles mauvais placements des fibres ou électrodes. Pour la photométrie, 5 animaux par groupes sont suffisants. Les rats observateurs naïfs à la drogue pourront venir d’autres protocoles de l’équipe après accord de la SBEA (Structures chargées du Bien Etre des Animaux) afin de diminuer le nombre d’animaux nécessaire. Les rats observateurs non naïfs à la drogue seront les mêmes que les rats sujets qui s’auto-administreront la drogue.

Raffinement

Les animaux auront une période d'acclimatation à l'animalerie ainsi qu'aux expérimentateurs avant le début des expérimentations afin de réduire au maximum le stress potentiel. La gestion de la douleur pendant et après les procédures douloureuses et les expérimentations est toujours prise en compte par des personnels compétents et sera améliorée si besoin par injection d'analgésiques spécifiques. Une grille de score sera utilisée systématiquement en période post-opératoire, ainsi que tout au long de l’expérimentation pour le suivi du bien-être des animaux, afin de surveiller au mieux les animaux et prendre les décisions les plus adaptées sans attendre. La souffrance des animaux sera limitée au maximum par une surveillance quotidienne. Les animaux seront hébergés si possible par 2 dans leur cage à l'animalerie, avec accès ad libitum à l'eau. La nourriture sera contrôlée afin de garder les animaux motivés. Les cages sont enrichies grâce à la présence d'objets divers et variés (bâtonnets en bois, rouleau en carton…changés régulièrement afin de diversifier au maximum l'environnement des animaux). La gestion de la douleur pendant et après les procédures douloureuses et les expérimentations est toujours prise en compte par des personnels compétents et sera améliorée si besoin par injection d'analgésiques spécifiques.

Choix des espèces

Le rat est un modèle animal de choix pour l'étude de l'addiction. En effet, les modèles comportementaux de référence sont connus et maîtrisés, et il existe de nombreux tests comportementaux permettant de tester les différents symptômes de la pathologie. Par ailleurs, l'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l'animal soit vigil et libre de ses mouvements. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, puisqu'il s'auto-administre l'ensemble des agents toxicologiques consommés par l’humain. De plus le rat est un animal social dont le comportement se rapproche de l’humain, avec mise en place d’un système hiérarchique et organisé, un communication visuelle, olfactive, auditive et tactile. C’est un bon modèle d’étude du comportement social. Afin d'améliorer la précision de nos chirurgies, et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous réaliserons nos expériences chez des rats adultes (>7-8 semaines), un stade du développement cérébral en adéquation avec notre question scientifique.

56 rats Wistar vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit un capteur cardiaque implanté sous anesthésie, puis subit échocardiographies, mesures de pression artérielle et prélèvements sanguins répétés, et vingt-quatre d'entre eux une ligature de l'artère coronaire gauche que le porteur reconnaît potentiellement létale. L'intoxication par la ciguatoxine peut provoquer diarrhées, troubles neurologiques et cardiovasculaires, les rats perdant plus de 15 % de leur poids étant alors mis à mort. Le porteur revendique de vouloir "exploiter au maximum chaque animal inclu dans le protocole" et prévoit le prélèvement des tissus cardiaques, neuronaux, adipeux et musculaires après la mise à mort.

Objectifs

La ciguatera (CG) est une maladie induite par les ciguatoxines (CTXs), naturellement prduites par certaines algues (microscopiques). Elles sont responsables d'intoxication alimenatire non bactérienne aux fruits de mer la plus courante dans le monde. L'explosion du trafic maritime, s'accompagnant de l'augmentation du volume des eaux de ballast transportées et mélangées, contribue considérablement à la propagation du plancton des zones tropicales contaminées, plus particulièrement d'Asie et d'Asie du Sud-Est, vers les côtes tempérées sujettes au réchauffement climatique. La CG, pourrait largement se propager, nottamment en méditérranée et prendre la forme d'une pandémie. L'absence de tests de détection rapide augmente l’exposition à la CG. De plus, aucun traitement ciblé n'est actuellement disponible en raison d'un manque d'identification précise des mécanismes moléculaires, physiologiques et pathologiques associés. La CG se manifeste par de multiples symptômes indéfinis (gastro-intestinaux, cardiaques, neuronaux, cutanés et inflammatoires), accentués en cas d'antécédents cliniques. Plusieurs cibles de canaux ioniques (canaux sodiques, potassiques et calciques), protéines essentielles au bon fonctionnement des cellules sont suspectées dans la CG. Les CTXs seraient capables de moduler l’activité de ces protéines canal pour modifier, notamment, les flux ioniques responsables du fonctionnement cardiaque et neuronal. Notre objectif est de caractériser le mode d’action et conséquences des CTXs sur la fonction cardiaque/vasculaire et le système nerveux in vivo. Nous souhaitons savoir si les effets liés à une intoxication aux CTXs et nottament à la Ciguatoxine 1B (CTX1B), peuvent être modulés par différents traitements préventifs et curatifs. Dans un second temps, ceci pourrait permettre de déterminer de nouveaux outils de diagnostic de la CG ainsi que de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser in vivo la nature des effets induits par une intoxication à la Ciguatoxine 1B (CTX1B). En particulier, nous determinerons la nature des altérations cardiaques (structurelle et/ou fonctionnelle) et vasculaires ainsi que le rôle des atteintes du système nerveux autonome dans ces conséquences délétères. A partir ders pélèvements sanguins, nous determinerons si certains marqueurs sanguins sont augmentés/diminués après une contamination à la CTX1B. De récentes études cliniques ont montrées une augmentation de lactate dans le sang évoquant une hypoxie tissulaire en rapport avec une insuffisance cardiovasculaire. Le suivi ECG nous permettra de voir si la CTX1B module le rythme cardiaque chez les sujets contaminés. Les prélèvements post-mortem permettrons de faire une exploration plus approfondie des tissus cardiaques et neuronaux, afin de voir les effets directs de la CTX1B, mais aussi sur les tissus adipeux et du muscle squeletiques pour détecter le site de stockage de la CTX1B dans l’organisme.

Procédures

La totalité des animaux (soit 56 animaux) seront tous soumis aux mêmes gestes techniques : échocardiographie (environ 15 min/ animal), électrocardiogramme (ECG, recueil des données pendant 24h/animal de façon non invasive) par télémétrie, prélèvement de sang (quelques secondes/animal), mesure non invasive de la pression artérielle (environ 15 minutes/animal). Ces gestes techniques seront chacun réalisés à 3 reprises sur la durée du protocole expérimental (19 jours pour 32 animaux et 24 jours pour 24 animaux). Vingt-quatre animaux seront soumis à ces gestes techniques à 4 reprises ainsi qu'à une chirurgie via la ligature de l'artère coronaire gauche. Il existe un risque que cette chirurgie nécessaire à l'induction d'une sensibilisation aux arythmies cardiaques soit léthale. Cette chirurgie, d'environ 1 heure/ animal, nécessitera une anesthésie générale des animaux. Des soins particuliers leur seront administrés en pré et post-opératoire. De plus, la totalité des animaux sera soumise à une chirurgie nécessitant une anesthésie générale pour l'implantation du capteur permettant le recueil des paramètres ECG d'une durée d'environ 25 min/ animal. Des soins particuliers leur seront administrés en pré et post-opératoire afin d'éviter toute douleur de l'animal.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront d'une part ressentir les symptômes classiques de la CG chez l’Homme, tels que : - Troubles gastro intestinaux (48-72h post infection) - Troubles neurologiques (48-72h post infection) - Troubles cardiovasculaires. (48-72h post infection). Ces troubles, notamment gastro intestinaux, peuvent induire des phénomènes de diarrhées pouvant mener à une perte de poids de l’animal. Si une perte de poids > 15% du poids initial est constatée, alors le point limite de l’expérimentation sera atteint et nécessitera la mise à mort de l’animal. Les groupes d'animaux sensibilisés pour les arythmies cardiaques via la ligature d'une artère coronaire ont un risque élevée de mortalité inhérent à la procédure. Le projet necessite l'enregistrement de l'électrocardiogramme par système holter implanté. Ces animaux implantés devront être isolés en cage unique uniquement pendant l'enregistrement de l'ECG (24h/ acquisition).

Devenir

A la fin des protocoles expérimentaux tous les animaux seront mis à mort afin d'effectuer des prélèvements post-mortem (tissus cardiaques, neuronaux, adipeux, musculaires).

Remplacement

La CG est une pathologie syndromique incluant de nombreux effets systémiques. Il n’existe pour l'heure pas de modèle in vitro sur lequel ont été relevés les effets cardiaques, effets vasculaires et effets sur le système nerveux autonome grâce à un modèle capable de mimer les conditions physiopathologiques induites par la Ciguatoxines 1B (CTX1B). .

Réduction

Nous avons réduit au maximum le nombre d'animaux via l'utilisation d'outils statistiques et en couplant plusieurs approches (echocardiographie, ECG par télémétrie, prélèvement de sang, mesure non invasive de pression arterielle), compatibles entre elles, et effectuables sur un même animal. Un suivi dans le temps sera également éffctué. L'ensemble des animaux sera prélevé post-mortem (tissus cardiaques, neuronaux, adipeux, musculaires) pour exploiter au maximum chaque animal inclu dans le protocole.

Raffinement

Notre objectif est de réduire au strict minimum la détresse imposée aux animaux. Les rats seront hébergés par groupes de 3 par cages dans un environnement calme, sous contrôle de luminosité, de l'hygrométrie et de la température, de manière appropriée avec un enrichissement du milieu (barre de bois, cabane, carré de ouate) permettant de répondre à leurs besoins physiques et comportementaux. Après chirurgie pour mise des télétransmetteurs, les animaux seront placés en couveuse thermorégulée et surveillés pendant un minimum de 3 heures. Les animaux seront surveillés quotidiennement et les points limites établis dans ce projets seront appliqués. Nous allons fournir les soins per- et post-opératoires appropriés via l'administrations d'anesthésiques et d'analgésiques. Nous évaluerons entre autres les critères de souffrance animale communément utilisés (rythme cardio- respiratoire, reprise de mouvement, un état de prostration, l’hydratation). En cas de détresse anormale, les animaux seront euthanasiés par surdose d’anesthésique, après analgésie.

Choix des espèces

Le modèle de rat Wistar est un modèle largement caractérisé sur le plan cardio-vasculaire, dont un nombre important de travaux est décrit dans la littérature (inculant ceux du laboratoire). La physiologie cardiaque des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme (régulations et structure morpho-fonctionnelle, régulation par le système nerveux autonome). Le modèle rat a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in vivo selon les mêmes techniques exploratoires employées chez l’homme. Les animaux entreront dans le protocole à un stade mature pour éviter tout problème lié au développement.