Recherche fondamentale

Injectées dans l'abdomen avec Plasmodium berghei, piquées à la queue tous les deux jours pour un frottis, contenues à la main deux à trois minutes par jour pendant cinq jours pour recevoir un traitement, 160 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À partir du onzième jour, elles peuvent présenter des signes neurologiques comme une paralysie, et sont alors tuées afin de prélever leurs organes. Quatre d'entre elles servent uniquement à entretenir la souche parasitaire par prélèvement sanguin derrière l'œil, avant d'être tuées elles aussi. Le porteur écrit que les points limites ont été fixés de façon à prendre en compte les signes neurologiques "sans compromettre le suivi et l'acquisition des données de recherche", et toutes les souris finissent tuées pour l'analyse de leur cerveau, de leur cœur, de leur foie, de leur rate, de leurs poumons et de leurs reins.

Objectifs

L’objectif du présent projet est d’utiliser, pour la première fois, l’approche innovante du MALDI-IMS pour améliorer nos connaissances sur les mécanismes physiopathologiques d’infections/évolutions palustres en utilisant un modèle murin avec atteinte neurologique. Il est nécessaire de présenter l’approche par MALDI IMS. La spectrométrie de masse par imagerie (IMS) par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) permet l'analyse de molécules directement à partir de coupes de tissus, permettant l'étude de la distribution spatiale des composés, qui peuvent être des molécules biologiques telles que des protéines et des peptides, lipides, éléments chimiques, métabolites. Ainsi, la spectrométrie de masse par imagerie (IMS) par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) est capable de déterminer la distribution de centaines de molécules à la fois directement à partir de coupes de tissus. Puisque les tissus sont analysés intacts sans homogénéisation, les relations spatiales des molécules sont préservées. L’objectif du présent projet est donc d’ouvrir de nouvelles pistes sur la compréhension des infections palustres dans un modèle animal en utilisant pour la première fois l’imagerie par spectrométrie de masse MALDI ou MALDI-IMS, mais également de faire la preuve du concept de l’intérêt de cette technologie pour évaluer la distribution d’un traitement anti-palustre et notamment déterminer si la molécule thérapeutique co-localise avec la cible parasitaire, et connaitre les conséquences de ce traitement au niveau des lésions neuronales. Enfin, savoir si la molécule thérapeutique est dégradée au niveau central avec la détection de changements métaboliques. Il est également envisagé d’étudier les effets indésirables du traitement tels qu’une activité hors cible et son effet toxique (eg, altération du fonctionnement d’un organe sain). Outre une analyse sur des coupes de cerveaux, le cœur, le foie, la rate, les poumons et les reins seront prélevés pour les analyses en MALDI IMS

Bénéfices attendus

Ce projet améliorera notre compréhension des partenaires protéiques participant à la formation des obstructions capillaires et il permettra d’identifier des marqueurs protéiques pour le diagnostic précoce d’une atteinte cérébrale. Par ailleurs, il améliorera notre connaissance sur les mécanismes neurodégénératifs de cette atteinte centrale, une analyse spatiale et temporelle de ces marqueurs protéiques semble indispensable. L’imagerie MALDI ou MALDI-IMS est un outil de choix pour répondre à ces attentes. Cette technologie a déjà fait ses preuves pour d’autres pathologies avec atteinte centrale offrant la possibilité d’identifier rapidement et facilement des zones cibles du cerveau ainsi que la bio distribution d’un médicament. La visualisation de la distribution des médicaments dans les tissus a permis d’orienter les chercheurs sur le développement de nouvelles cibles thérapeutiques ainsi que de mieux comprendre les mécanismes physio-pathologiques.

Procédures

Il faudra injecter aux souris avec une souche donnant des atteintes neurologiques (injection intrapéritonéale dure moins d'une minute). Les souris seront piquées pour administrer les traitements par voie intrapéritonéale avec contention (prise manuelle) pendant 3 jours consécutifs après détection des premiers parasites sanguins (la contention et la piqure dure entre 2 à 3 minutes). Les souris subiront également des piqures sans contention au niveau de la queue pour les frottis tous les 2 jours (la piqure à la queue dure moins d'une minute). 4 souris subiront un prélèvement sanguin rétro orbitaire afin d'entretenir la souche mais également assurer l'infection des lots expérimentaux (l'ensemble du rétro orbitaire dure environ 5 minutes). Une pesée sera également réalisée en alternance avec les frottis tous les 2 jours (la pesée dure 2 minutes). Les souris pourront avoir des signes neurologiques à partir de J11 (paralysie par exemple) dès l’apparition des symptômes les souris seront euthanasiées afin de prélever les organes. L’apparition des symptômes est importante pour avoir une chronologie des mécanismes cérébraux impliqués.

Impact sur les animaux

L'infection des groupes « infectés » et « infectés traités » entrainera des atteintes neurologiques, et la mort pour les souris concernées. L'administration des médicaments et les infections obligeront les souris à être manipulées, contentionnées - les souris concernées ne seront pas libre de leur mouvement pendant 1 à 2 minutes (pendant 5 jours consécutifs). Le recueil de la goutte de sang pour les frottis entrainera une piqure et une douleur au niveau de la queue pendant 1 minutes tous les 2 jours. La réalisation des lots expérimentaux grâce aux 4 souris entrainera consécutivement l'anesthésie, le prélèvement rétro orbitaire (5 minutes environ) et l'euthanasie de ces 4 souris. La pesée entrainera une manipulation de moins de deux minutes. Les souris pourront avoir des signes neurologiques à partir de J11 (paralysie par exemple) dès l’apparition des symptômes les souris seront euthanasiées afin de prélever les organes. L'infection des souris entrainera également une perte de poids modérée 1 à 2 grammes pendant 2 jours (3 jours après l'infection).

Devenir

L'étude se portant sur la recherche de marqueurs protéiques et tissulaires propre au paludisme, l'ensemble des souris seront euthanasiées

Remplacement

Les objectifs généraux sont de réaliser pour la première fois, des cartes protéiques permettant de visualiser les variations d’expression et d’abondance protéique en fonction de leur localisation in situ mais également suite à l’atteinte cérébrale par une infection palustre, et enfin étudier les conséquences d’un traitement anti-palustre sur ces répertoires protéiques. Afin de mener à bien ce projet, l’utilisation d’un modèle murin est indispensable. Plasmodium berghei, qui est la souche spécifique du paludisme murin, peut léser, en plus du système nerveux central, un certain nombre d’organes simultanément. La complexité de son cycle ainsi que notre intérêt pour l’analyse de répertoires protéiques, pour une méthode inédite, obligent à l’utilisation d’un modèle animal. Les modèles de cultures cellulaires ne permettront pas de répondre aux objectifs fixés dans le présent projet. Ce projet nécessite donc de travailler sur un organisme entier. Par ailleurs il n’existe pas pour le moment de modèle alternatif complet ou même partiel d’organoïdes, sphéroïdes ou organe sur puce reproduisant la complexité du système nerveux et sa réponse immunitaire face à une infection

Réduction

En accord avec le principe de réduction des effectifs, le nombre de souris par groupe sera calculé par rapport au nombre statistique d’échantillon nécessaire à une analyse en MALDI-MSI (triplicate) tout en tenant compte de la prévalence de la forme neurologique dans ce modèle et de la contribution des deux sexes. Nous avons trouvé un effectif minimum de 6 souris par groupe. Nous prenons 8 individus par groupe infecté pour les deux expériences car si n< 6 l’analyse des données sur les souris restantes ne sera pas possible et demanderait de recommencer la manipulation. Ces nombres ne compromettent pas les objectifs du projet en permettant l’utilisation de tests statistiques appropriés.

Raffinement

En accord avec le principe de raffinement, les signes de souffrance seront systématiquement recherchés et évalués. Une attention particulière sera portée à l’enrichissement des rongeurs, de manière à limiter l’anxiété des animaux. Des abris, des morceaux de cartons et des éléments à ronger seront placés dans les cages et les souris seront habituées à la manipulation. N’ayant pas trouvé de donnée contraire dans la littérature scientifique sur l’utilisation d’anesthésiant dans le cadre du MALDI MIS toutes les mesures correctives possibles nécessitant une analgésie ou une anesthésie seront utilisée afin de soulager les signes de douleurs. Les animaux sont hébergés en groupe afin de maintenir les interactions sociales. Des points de soin (point of care) et des points limites ont été mis en place afin de prendre en compte les signes neurologiques sans compromettre le suivi et l'acquisition des données de recherche.

Choix des espèces

Afin d’atteindre les objectifs de cette étude, une modèle animal comprenant un parasite du genre Plasmodium et un hôte permissif pour ce parasite afin de développer des atteintes centrales proches du paludisme cérébral humain est indispensable. Ce modèle doit permettre de mettre en évidence les molécules protéiques impliquées dans l’initiation et maintien d’une atteinte parasitaire centrale mais également de l’effet « recovery » du traitement anit-palustre. Le système « souris + P. berghei » est un modèle reconnu pour l’analyse de l’invasion centrale par le parasite ainsi que pour évaluer un composé à activité antipaludique. Nous choisirons des souris C57BL6J pour leur aptitude à développer aussi bien les formes cérébrales que de fortes parasitémies. Les souris C57BL6 seront des individus adultes âgés de 6 à 7 semaines à l’arrivée dans l’animalerie mais de 8 à 10 semaines au début des expériences. Cela est dû à la phase de stabulation et d’habituation a la manipulation. Cet âge est compatible avec les procédures expérimentales du projet. Cet âge correspond à l’âge de maturité sexuelle (adulte).

980 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, certaines recevant une injection sous la peau chaque jour pendant un mois. Elles subissent une irradiation myéloablative suivie d'une greffe de moelle osseuse injectée dans le sinus rétro-orbitaire, une transplantation de macrophages dans les poumons par voie intratrachéale ou nasale, puis une infection virale ou une chimiothérapie, les prélèvements sanguins étant eux aussi pratiqués derrière l'œil. Le porteur décrit une douleur légère à modérée aux poumons, à l'œsophage ou à l'œil, ainsi qu'une fatigue, un inconfort respiratoire et une perte de poids pendant quinze jours. Les retombées annoncées, améliorer la réponse immunitaire des personnes âgées, restent au conditionnel, et l'effectif justifié dans le texte, 960 souris, ne correspond pas aux 980 déclarées.

Objectifs

L'objectif de notre recherche est d'étudier les mécanismes qui influencent la multiplication et le maintien des macrophages résidant dans les poumons. Ces cellules jouent un rôle essentiel dans la défense immunitaire, en éliminant les toxines et en contribuant à l'immunité et à la régénération pulmonaire. La capacité proliférative des macrophages alvéolaires diminue au cours du vieillissement. Le projet vise à étudier les effets d'une induction de la prolifération des macrophages pulmonaires de souris âgées sur la défense immunitaire et la régénération pulmonaire en réponse à des traitements chimiothérapeutiques ou des infections virales affectant les poumons.

Bénéfices attendus

D'un point de vue recherche fondamentale, le projet permettra une avancée dans la compréhension de la perte de fonction des macrophages alvéolaires lors du vieillissement et notamment lors de réactions inflammatoires dans les poumons induites par certains traitements chimiothérapeutiques ou infections virales. Ces résultats pourraient conduire à des stratégies thérapeutiques visant à améliorer la réponse des personnes âgées lors de ces réactions. Cela pourrait être réalisé en stimulant la prolifération des macrophages alvéolaires ou en effectuant des transplantations de ces cellules prolifératives.

Procédures

Les procédures utilisées sont : injection de molécules permettant l'expression de gènes (injection en sous cutanées quotidiennement pour une durée de 1 mois ou une unique ingestion par gavage), transplantation de macrophages dans les poumons par injection intratrachéale ou intranasale (unique), transplantation de moelle osseuse par unique injection en intraveineuse dans le sinus retro-orbital après traitements myéloablatifs (une unique dose d'irradiation et une unique injection en intrapéritonéale d’une molécule), traitement chimiothérapeutique ou infection virale par injection intratrachéale ou nasale (unique), prélèvement sanguin dans le sinus retro-orbital.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent présenter des signes de stress liés à leur capture lors des expérimentations. Les procédures sont classées modérées de par la répétition des gestes expérimentaux sur une durée maximale de 1 mois et la douleur que peut ressentir l’animal. Les souris peuvent présenter : -une sensibilité de la peau au niveau des zones d’injection pendant une durée de 1 mois. - une douleur de légère à modérée au niveau des poumons, de l’œsophage ou de l’œil pour une durée de 5 min minimisée par antalgique et anesthésique. - une fatigue, un inconfort respiratoire et perte de poids pendant 15 jours. Le phénotype des lignées génétiquement modifiées n’induit pas de douleur.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure en vue d'analyses.

Remplacement

Dans ce projet, nous souhaitons déterminer si l'induction de la prolifération des AM peut permettre d'améliorer la réponse immunitaire à un traitement chimiothérapeutique ou une infection pulmonaire virale. L’inflammation pulmonaire induite est une réponse immunitaire intégrant des systèmes de communications cellulaires complexes (endothélium, système lymphatique et vasculaire, système neuronal) que l’on ne peut actuellement pas reproduire in silico, ni in vitro, ni ex vivo. Il n’existe pas de méthodes in vitro (cultures cellulaires, organoïdes) permettant d’étudier une réponse immunitaire globale comme possible sur animal entier. L’induction de la prolifération des macrophages alvéolaire n’est à ce jour possible que par l’utilisation de modification génétique. Des alternatives ex vivo à l’expérimentation à l’utilisation animale ont été réalisées afin de montrer que l’expression des macrophages alvéolaires augmentent leur prolifération avec notre modèle et une première série d’expérience a pu démontrer que ces macrophages sont plus fonctionnels. Cependant, afin d’analyser leurs capacités de régénération à une inflammation pulmonaire, il est nécessaire d’avoir une approche globale. Dans ce sens, le modèle murin est particulièrement bien adapté à ces différentes problématiques. Il n’y a donc pas d’alternative actuellement à l’utilisation des souris pour atteindre l’objectif de ce projet.

Réduction

le nombre minimum de souris nécessaires (n=960) a été évalué afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les expérimentations seront réalisées en veillant à réduire, supprimer ou soulager tout inconfort, douleur ou angoisse subis par les souris afin d'améliorer leur bien-être. Pour cela, les procédures seront effectuées sous anesthésie générale, dans des conditions stériles, et si nécessaire, un analgésique sera administré. L'état de santé des souris sera surveillé quotidiennement à l'aide d'une grille d'évaluation de la douleur, permettant de déterminer les niveaux de douleur afin de prendre les mesures nécessaires pour la limiter. Tout au long de l'étude, les souris seront hébergées dans des conditions conformes à la réglementation européenne en vigueur. Cela inclut un environnement contrôlé avec une température et une ventilation régulées, une lumière suivant un cycle de 12 heures, et une hygrométrie adaptée. Les souris auront un accès constant à la nourriture et à l'eau. Elles seront maintenues en groupes de 3 à 5 animaux par cage. Leur environnement sera enrichi avec des dômes en carton ou du coton.

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme. Animal de petite taille et à reproduction rapide. Bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. De nombreuses souches d'animaux génétiquement modifiés permettant de poser les questions biologiques qui nous intéressent existent déjà. Nous utiliserons dans ce projet : - des souris adultes jeunes (entre 6 semaines et 3 mois) et âgées (entre 12 et 27 mois) car nous étudions le vieillissement - des souris nouveaux nés (moins de 1 semaine) car leur niche alvéolaire est vide permettant ainsi de faire des transplantations de macrophages alvéolaires.

Les souris dont le poids passe sous un seuil de référence, qui présentent des difficultés respiratoires ou une fibrose avancée au scanner sont mises à mort. 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses post-mortem. Une partie reçoit une irradiation du thorax à 13 ou 15 grays, qui provoque une inflammation pulmonaire pendant un à trois mois puis, en cas de forte toxicité, une fibrose des poumons à quatre ou cinq mois. Les autres reçoivent des cellules tumorales sous la peau de la patte, avec des risques de dermite, d'ulcération et de nécrose cutanée, pour comparer un nouveau faisceau d'électrons de haute énergie à un faisceau témoin en vue de son intégration dans de futures machines de radiothérapie.

Objectifs

La radiothérapie induit des effets secondaires qui affectent la qualité de vie des patients atteints de cancers. Pour améliorer les traitements de la radiothérapie et limiter ses effets secondaires, nous explorons de nouvelles méthodes d’irradiation comme la radiothérapie utilisant des particules de haute énergie. Afin de pouvoir explorer son potentiel clinique, nous caractériserons dans ce projet les effets biologiques de cette nouvelle méthode de radiothérapie en étudiant d’une part, les toxicités qu’elle pourrait induire, et d’autre part, son pouvoir à éliminer les cellules tumorales.

Bénéfices attendus

A l’issue de ce projet, nous aurons déterminé le potentiel clinique d’une nouvelle méthode de radiothérapie utilisant des particules de haute énergie. En cas de résultats positifs, cette nouvelle méthode pourrait être intégrée, aux futures machines de radiothérapie et permettre une amélioration des traitements par radiothérapie (i.e. moins d’effets secondaires) pour les patients atteints de cancer.

Procédures

Dans une première procédure, 3 lots d’animaux seront irradiés avec une nouvelle méthode de radiothérapie et ils seront ensuite suivis par scanner pour petit animal. Ils seront anesthésies pendant 5 à 10 minutes pendant l’irradiation et environ 5 minutes pour chaque scanner mensuel. Dans une seconde procédure, des cellules tumorales seront injectées par voie sous cutanée aux animaux vigiles constituant 3 lots d’animaux : - 1 premier lot ne subira aucun autre geste technique - 1 second lot sera anesthésié en vue d’être irradié avec le faisceau contrôle sur les tumeurs implantées en sous cutanées. La durée de l’anesthésie sera de 2 minutes par animal - 1 troisième lot sera irradié avec le faisceau d’intérêt sur les tumeurs implantées en sous cutanées. L’anesthésie durera entre 5 et 10 minutes.

Impact sur les animaux

Pour l’étude de la toxicité sur tissu sain, les animaux, ayant reçu une irradiation thoracique, développeront une phase d’inflammation pulmonaire(1 à 3 mois post-irradiation) qui évoluera après 4 ou 5 mois vers une fibrose pulmonaire en cas de forte toxicité radio-induite (dose de 13 et 15 Gy). Suite au développement de la fibrose, une perte de poids des animaux pourra être observée. Pour l’analyse de l’efficacité antitumorale, les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée au niveau de la patte développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. L’injection de cellules tumorales provoquera une douleur et gêne de courte durée. Les potentielles toxicités cutanées (dermites, ulcération, nécrose) à court terme induites par le traitement seront évaluées par une grille de score adaptée

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Des modèles in vitro (i.e lignée de cellules en culture) existent et sont utilisés dans le cadre d’études préliminaires des effets radiobiologiques d’un faisceau d’irradiation. Des études préliminaires ont été réalisé avec certains de ces modèles au laboratoire et nos résultats préliminaires sont encourageants (lignée de cellules tumorales/modèle ex vivo de coupes d’organe mis en culture. Cependant, ces modèles restent simples et ne permettent pas de prendre en compte la complexité du développement des toxicités induites par la radiothérapie chez le patient, ce qui nécessite le recours à l’animal

Réduction

Plusieurs mesures ont été prises pour réduire le nombre d’animaux à utiliser tout au long du projet : 1-Des études pilotes ont été réalisées sur un autre faisceau d’irradiation (faisceau contrôle) au laboratoire afin de déterminer les doses optimales pour évaluer les effets radiobiologiques du nouveau faisceau. De la même manière, des études pilotes utilisant des tumeurs greffées sous la peau nous ont permis d’évaluer les temps optimaux d’irradiation post-greffe ainsi que les doses de traitements adaptées 2-Dans le cadre de l’étude des effets secondaires de la radiothérapie dans le poumon, le bras contrôle avec notre faisceau se base sur des données déjà acquises par le laboratoire ce qui nous permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés pour cette étude. 3-Du fait d’études pilotes antérieures, le nombre d’animaux par groupe est optimisé pour avoir une puissance statistique suffisante lors de la comparaison des différentes modalités de radiothérapie. 4-L’optimisation et l’utilisation d’un suivi du développement des complications pulmonaires par imagerie scanner permet de suivre les animaux tout en évitant de multiplier les prélèvements ainsi que le nombres d’animaux utilisés pour cette étude. Les tests statistiques adaptés seront utilisés pour étudier la « survie sans complication » des animaux dans le cadre de l’étude sur le tissu sain. Pour la partie tumorale, des tests seront réalisés pour l’étude de la survie avant qu’un point de limite éthique soit atteint.

Raffinement

Pour la procédure d’évaluation des effets secondaires de la radiothérapie, plusieurs critères seront pris en compte : 1-Le poids des animaux sera suivi de manière hebdomadaire dans la période de 1 à 4 mois post-irradiation (i.e. pendant la phase de pneumopathie). Ensuite, de 5 à 7 mois post-irradiation, le poids des animaux sera suivi de manière bi-hebdomadaire (en début et fin de semaine) afin de surveiller les potentielles pertes de poids. Les animaux pour lesquels le poids sera inférieur au poids limite de référence seront mis à mort pour éviter toutes souffrances. 2-Si des difficultés respiratoires et/ou un isolement sont observés, l’animal sera mis à mort pour éviter toutes souffrances. 3-Le suivi scanner sera également un point majeur de notre évaluation du développement de effets secondaires. Si un animal présente des signes de fibrose avancée sur les images scanner, l’animal sera mis à mort pour éviter toutes souffrances. Pour la procédure d’évaluation de la réponse antitumorale sur un modèle de tumeurs sous cutanée, plusieurs critères seront pris en compte : 1-La taille de la tumeur sera un élément important et déterminant pour assurer le bien-être de l’animal. Le poids des animaux et la taille de leurs tumeurs seront évalués de manière bi-hebdomadaire. 2-De potentielles lésions cutanées peuvent survenir dans la zone d’irradiation de la tumeur. Une grille de score spécifique mise en place lors d’études pilotes et antérieures permettront d’évaluer le grade de ces lésions et limiter les douleurs chez l’animal (mise en place de traitements antalgiques ou mise à mort de l’animal si stade trop avancé) Pour les deux procédures, une anesthésie générale ainsi qu’une contention physique sur un support adaptée sera réalisée au moment de l’irradiation pour éviter tout inconfort et douleurs des animaux. Aucune douleur n’est attendue au moment de l’irradiation dans ces conditions. Les animaux seront hébergés dans des conditions standards

Choix des espèces

La souris est le modèle classiquement utilisé dans les études de toxicité radio-induite car il présente plusieurs avantages : i) il s’agit d’un modèle préclinique pertinent pour la radiothérapie car les réponses moléculaires et cellulaires (e.g. fibrose radique) des tissus murins à l’irradiation sont comparables à celles observées chez l’Homme ii) la souris est un mammifère génétiquement proche de l’Homme iii) son usage en préclinique a permis de mettre au point un grand nombre de nouveaux traitements Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 semaines à 10 semaines Les organes étudiés sont alors matures, limitant les potentiels biais expérimentaux induits par l’irradiation d’organes à des stades de maturation différents. De plus, les animaux adultes supportent également mieux l’anesthésie et l’irradiation.

Deux heures de chirurgie cérébrale par animal, pour implanter des fibres optiques après injection intracérébrale : 260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique des douleurs, un inconfort, une perte de poids possible et une mobilité réduite les deux jours suivant l'opération. Elles inhalent ensuite du protoxyde d'azote ou un gaz témoin, dans une boîte en plexiglas qu'il qualifie lui-même d'anxiogène, pour observer en direct l'activité de leurs neurones et clarifier les mécanismes d'un gaz déjà employé en clinique psychiatrique. Le choix de la souris repose sur des homologies avec l'humain dans l'organisation des systèmes de neurotransmission, et sur le fait que la technologie d'imagerie n'est validée que dans cette espèce.

Objectifs

Outre la souffrance engendrée, l’impact socio-économique croissant des maladies psychiatriques liées au stress telles que la dépression et le trouble de stress post-traumatique est particulièrement important. La découverte de nouveaux traitements efficaces, sûrs et d’action rapide pour lutter contre ces troubles psychiatriques est donc toujours un enjeu majeur, en particulier devant l’efficacité toute relative des traitements actuels. Récemment, certaines études cliniques ont pu montrer que l’exposition au protoxyde d’azote (gaz hilarant) induisait une amélioration clinique des symptômes de la dépression dans les heures suivants l’exposition et maintenue au moins 2 semaines voire plusieurs mois pour certains patients. Si la littérature est moins abondante, certaines études suggèrent également un potentiel effet facilitateur de l’exposition au protoxyde d’azote sur la réduction des mémoires intrusives liées au trauma, conférant un intérêt certain pour le traitement du trouble de stress post-traumatique. Si cette efficacité doit continuer d’être documentée en clinique, il est egalement important de clarifier les mécanismes neurobiologiques susceptibles de participer aux effets thérapeutiques ou indesirables du traitement dans un cadre expérimental contrôlé. Malgré son utilisation en routine comme agent anesthesique et anxiolitique, les mécanismes d’action du protoxyde d'azote sont en effet assez méconnus. L’objectif de ce projet sera donc d’appliquer, pour la première fois, une technique d’imagerie cellulaire in vivo chez l’animal éveillé afin de caractériser comment l’exposition aigue à ce gaz modifie l’activité des neurones responsables de la libération des principaux neurotransmetteurs du cerveau. Cette étude pilote est importante car elle conditionnera la faisabilité d’études futures utilisant les mêmes outils dans un contexte pathologique.

Bénéfices attendus

Bien qu’utilisé en routine dans certaines applications médicales comme calmant et anesthésique, l’effet du protoxyde d’azote sur le système nerveux central reste très mal caracterisé. Cette étude sera la première a implémenter une technologie d’imagerie cellulaire in vivo pour apporter des réponses claires sur les effets aigus de cette molécule, en particulier sur les principaux neurotransmetteurs du cerveau. Par ailleurs, étant donné que le protoxyde d’azote commence à être utilisé dans des protocoles de recherche clinique afin d’étudier ses propriétés antidépressantes, il est fondamental de mieux connaitre ce fonctionnement. A la fois pour informer sur les mécanismes neurobiologiques susceptibles de participer à cette action therapeutique, mais également sur les dangers potentiels de cette utilisation, ce qui est difficile à anticiper sans une idee claire de son action centrale.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à des injections intracérébrales et à l’implantation de fibres optiques sous anesthésie générale, l’intervention durant environ 120 minutes.

Impact sur les animaux

- Injections intra-cérébrales et implantations de fibres optiques : la chirurgie est susceptible d’induire douleurs physiques et inconfort chez l’animal, avec perte potentielle de poids et mobilité réduite dans les 2 jours qui suivent la procédure (pour l’implantation de la fibre optique, l’injection seule étant bien tolérée). Les animaux récupèrent cependant rapidement de ce type de chirurgie, et l’encombrement et le poids de l’implant (canule, et fibre pendant les enregistrements) sont faibles : de nombreux laboratoires ont déjà utilisé ce type d’approche sans encombre sur l’animal mobile et éveillé sans gêne majeure.

Devenir

Les animaux expérimentaux seront euthanasiés à l’issue des enregistrements mesurant les effets de l'exposition au gaz témoin ou au protoxyde d'azote en vue du prélevement des cerveaux afin de réaliser des marquages cellulaires.

Remplacement

Aucune méthode alternative in vitro ou in silico n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. La souris est par ailleurs un choix pertinent de par les homologies structurelles qui existent avec l’homme dans l’organisation des systèmes de neurotransmission et les structures cérébrales visées dans le projet.

Réduction

Les effectifs (65 par groupe et par sexe, soient 260 au total) ont été calculés pour garantir la fiabilité statistique de nos conclusions . Ces effectifs prennent par ailleurs en compte qu’il faut mitiger les déviations potentielles des coordonnées ciblées lors des implantations et des injections cérébrales, correspondant à un taux de succès de 75%.

Raffinement

En plus des normes en vigueur, l'hébergement des souris sera enrichi avec des buchettes en bois et du matériel de nidification additionnel. En ce qui concerne les chirurgies stéreotaxiques, les soins pré- et post-opératoires sont bien établis afin de minimiser les risques de porter atteinte au bien-être de l’animal (antalgie, anesthésie locale, traitement anti-inflammatoire et antibiotique si nécessaire), et la formation rigoureuse de l’expérimentateur assure un respect de ces bonnes pratiques. Les points limites bien établis permettront de s'assurer de l'arrêt de l'expérimentation pour tout animal montrant des signes objectifs de souffrance. Une attention accrue sera portée aux animaux pour les soins post-opératoires. De la nourriture appétante et riche en énergie pour les souris (biscuits) sera deposée dans la cage d'hébergement des souris après opération en guise de récompense et pour stimuler leur rétablissement. Le même type de récompense sera sporadiquement administré aux souris pendant les phases d'habituation aux dispositifs expérimentaux afin de minimiser le caractère anxiogène de la boîte en plexiglas.

Choix des espèces

Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris font de cette espèce le modèle animal le plus pertinent pour ce projet, en particulier de part l’organisation cellulaire et la connectivité des systèmes de neurotransmission. Les outils permettant notamment l’application d’imagerie cellulaire in vivo de ces systèmes est par ailleurs validé dans cette espèce. Toutes les souris commenceront le projet à 10 semaines, c’est-à-dire l’âge adulte.

Toutes tuées pour extraire leur cerveau et vérifier que la lentille optique était au bon endroit, 96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit deux opérations du crâne d'environ deux heures, reçoit un inhibiteur de la synthèse des protéines, et vit isolée en cage individuelle entre huit et seize semaines pendant les phases d'entraînement. Les séances consistent à explorer une enceinte à la recherche de récompenses alimentaires, vingt à quarante minutes par jour pendant environ huit semaines. Le porteur retient un effectif de 96 souris sur la base d'un taux de réussite d'implantation attendu de 50 %, et affirme que l'étude de ces circuits cérébraux exige un "organisme entier vivant".

Objectifs

L’objectif de cette saisine est de mettre en évidence le phénomène de marquage et capture synaptique (STC) chez l’animal vigile et de caractériser pour la première fois son implication fonctionnelle dans l’association temporelle de trace mnésique. Cet objectif sera réalisé à travers (1) l’étude du comportement lors de l’exposition à de nouveaux environnements couplée à (2) l’enregistrement simultané de l’activité calcique de neurones de l’hippocampe une région essentielle pour encoder la mémoire, (3) en présence ou en l’absence d’un inhibiteur de la synthèse protéique selon les environnements et les jours de tests, permettant ainsi d’utiliser chaque animal comme son propre contrôle (et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés) en comparant les résultats obtenus dans les environnements sans inhibition et avec inhibition. Pour cela, nous allons utiliser une technologie de pointe basée sur un système ultra miniaturisé et portatif permettant d’imager de manière longitudinale l’activité individuelle de multiples neurones en même temps chez l’animal libre de ses mouvements. La plupart des limitations habituelles éthiques et techniques liées à l’imagerie in vivo ont été gommées grâce à la conception de notre système d’imagerie : miniaturisation (moins de 2 cm et de 2 grammes) permettant de le placer directement sur la tête de l’animal de manière amovible comme un chapeau et sans entraver sans comportement normal. En outre, il permet de visualiser simultanément, à haute résolution et de manière répétée un nombre important de neurones par animal (jusqu’à plusieurs centaines) offrant ainsi une qualité de données et une puissance statistique inatteignable avec les autres techniques implantables.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d’apporter des éléments de connaissances des mécanismes sous-tendant l’association temporelle des traces mnésiques, un élément fondamental pour comprendre comment se forme la mémoire autobiographique, comment chaque individu peut voyager dans le temps de ses souvenirs et comment il peut s’adapter aux conditions présentes et futures en se basant sur ses expériences passées

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 interventions chirurgicales (d’envrion 2h chacune) et une injection (subcutanée ou intrapéritonéale) entre les 2 séances d’exploration lors des entrainements et lors du test. Entrainements et tests comportementaux correspondant à une exploration libre de la souris d’une enceinte à la recherche de récompenses alimentaires (séance quotidienne de 20 à 40 minutes, ~8 semaines)

Impact sur les animaux

- Les chirurgies stéréotaxiques permettant l’injection du vecteur et l’implantation de la lentille optique avec son receptacle peuvent induire des douleurs post-opératoires légères à modérées avec un impact réduit dans le temps (quelques jours) sur le bien-être animal, les animaux étant traités avec un analgésique et récupérant rapidement de ce type de chirurgie. - Encombrement du système d’imagerie lors des tests, qui reste toutefois limité et léger (fibre optique et réceptacle seuls : < 0,2 g, miniscope < 2g), et n’entrave pas les mouvements et comportements normaaux de la souris après une première séance d’habituation. - Souris isolées lors des phases d’entrainements et tests après chirurgie (pour une durée comprise entre 8 et 16 semaines). - Douleur légère au niveau du site d’injection (ip, sc)

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de récupérer le cerveau pour confirmer par histologie le bon positionnement de la lentille optique dans la zone cérébrale à imager puis doser l’expression de protéines cérébrales et comment celles-ci ont été influencées par l’apprentissage.

Remplacement

L’étude de circuits cérébraux et de leur implication dans lacmémoire et les réponses comportementales et physiologiques ne peut être réalisée qu’à partir de cerveau et d’organisme entier vivant.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique permettant une réduction des effectifs optimisée selon les recommandations éthiques. En outre, le nombre d'animaux pourra être réduit en fonction des résultats et notamment de l’efficacité de l’implantation (maximum 96 souris avec un taux de succès attendu de 50% d’après la société du système d'imagerie et notre expérience ; minimum 48 souris avec un taux de succès de 100%).

Raffinement

Les méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont optimisés : Les injections/implantations intracérébrales se feront sous anesthésie générale par des chercheurs formés et expérimentés. Les animaux recevront un traitement analgésique avant l’intervention chirurgicale, un traitement anti-inflammatoire après l’intervention et 24 heures après. Pendant la chirurgie, chaque animal sera placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie et les cornées sont protégées de la déshydratation. L’anesthésie gazeuse (isoflurane) est ici privilégiée pour mieux contrôler la profondeur d’anesthésie et pour une meilleure récupération post-opératoire. Une surveillance post-opératoire d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris et intervenir si nécessaire (si reprise de poids déficiente ou température élevée, traitement antibiotique). En cas de plaie, les animaux recevront un traitement analgésique. La plaie est désinfectée par l’application de bétadine dermique. Une surveillance accrue d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris montrant des signes de mal-être (hypothermie, prostration...) et intervenir si nécessaire (injection de saline pour l’hydratation, nourriture appétente...). Les injections sous-cutanées sont préférées aux intra-péritonéales pour leur plus grande sûreté et leur moindre invasivité. Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. Les expérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. Des points limites sont appliqués: les animaux surveillés sont pesés et oscultés quotidiennement (hydratation, température, état de la blessure si blessure). La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout d’une semaine. D’un point de vue scientifique, le système utilisé représente la méthode d’imagerie de résolution neuronale la plus moderne, performante et spécifique, permettant de visualiser simultanément à haute résolution un nombre important de neurones (jusqu’à plusieurs centaines) offrant ainsi une qualité de données et une puissance statistique inatteignable avec les autres techniques d’imagerie.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par la similarité entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, espèce modèle dans le domaine des études des bases neurobiologique de la mémoire, de la formation des souvenir et de dysfonctions de la mémoire. Les souris utilisées seront des individus adultes, l’étude ayant comme objectif d’améliorer la compréhension des mécanismes normaux sous-tendant l’association temporelle de souvenirs et sa mise en mémoire dans des conditions normales. Il n’est pas nécessaire d’utliser des stades plus spécifiques du développement (précoce ou tardif).

Pour bloquer la transmission de la dengue, du Zika et de la fièvre jaune en immunisant contre une protéine du moustique, 295 souris C57BL/6J vont être utilisées dans ce second établissement, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est endormie pour recevoir cinq moustiques sur la peau, puis prélevée par ponction dans l'orbite de l'œil à trois, six et neuf jours après les piqûres. Le porteur indique que l'infection virale peut provoquer perte de poids, immobilité, mauvais état corporel et troubles neurologiques. Le vaccin universel contre tous les flavivirus qu'il annonce reste un objectif de long terme, quand l'infection des souris figure au protocole immédiat.

Objectifs

Le projet de recherche permettra de tester une nouvelle stratégie de lutte contre tous les flavivirus, tel que la dengue, le Zika et la fièvre jaune. L’objectif est de déterminer l’effet d’une immunisation contre un nouveau facteur de transmission chez le moustique et de déterminer le mécanisme. Ces données fourniront la base nécessaire au développement d’une stratégie vaccinale contre tous les flavivirus. Il sera réalisé sur deux établissements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme sont : i) Identifier une cible vaccinale contre tous les flavivirus, ii) Comprendre l’effet de l’immunisation contre la cible vaccinale sur la transmission. A long terme, les résultats permettront le développement d’un vaccin universel contre tous les flavivirus, lesquels infectent un demi-milliard de personnes et en tuent 250000 par an.

Procédures

D'abord, nous optimiserons l’immunisation contre le facteur de transmission. La procédure durera 42 jours. Nous injecterons les souris avec des antigènes et ferons des prélèvements sanguins à 14, 28 et 42 jours par ponction rétro-orbitaire sous anesthésie volatile. Ensuite, nous testerons l’effet de l’optimisation sur la transmission d’un flavivirus par piqûre de moustique. La procédure durera 52 jours. Les souris seront injectées avec les antigènes, exposées aux moustiques sous anesthésie générale et nous effectuerons à 3, 6 et 9 jours post piqûre des prélèvements par ponction rétro-orbitaire sous anesthésie. Puis, nous déterminerons si la protection contre la transmission est liée à l’immunité humorale (c.-à-d. les anticorps), en testant l’effet d’une immunisation passive par injection de sérum immune sur la transmission par piqûre. La procédure durera 52 jours. Nous injecterons les souris avec les antigènes, collecterons le sang par ponction cardiaque après euthanasie, injecterons le sérum immun dans d’autres souris, exposerons ce second lot de souris aux piqûres de moustiques et effectuerons à 3, 6 et 9 jours post piqure de moustiques des prélèvements sanguin par prélèvement retro-orbitaires sous anesthésie. Enfin, nous décrypterons comment l’immunisation contre le facteur de transmission affecte l’infection de la peau par piqûre du moustique. La procédure durera 52 jours. Nous injecterons les souris avec les antigènes, les exposerons aux piqûres de moustiques sous anesthésie et collecterons des biopsies cutanées à l'endroit de piqures de moustiques avec des punch et sous anesthésie. Les animaux seront sacrifiés juste après la réalisation des biopsies.

Impact sur les animaux

- Il est possible qu'une douleur légère soit occasionnée lors d'injection de l'anesthésique ou de l’antisérum. Toutes les autres interventions seront réalisées sous anesthésie. -Perte de poids, mobilité réduite ou inactivité, mauvais état corporel, stress, comportement anormal, troubles neurologiques liés à l’infection par le virus.

Devenir

Les souris dans toutes les procédures seront mises à mort sous anesthésie. Toutes les souris dédiées à la production des sérums seront prélevées par ponction intracardiaque juste après leur mise à mort. Les souris seront mises à mort après la réalisation de biopsies cutanées sous anesthésie et avant leur réveil.

Remplacement

Dans notre cas, le modèle animal est incontournable. Aucun modèle, à par le modèle animal, ne nous permettra de faire un test d’immunisation. Néanmoins, nous avons générés les données préliminaires nécessaires, supportant notre hypothèse, sur des modèles in vitro. De plus, nous caractériserons la fonction des gènes régulés identifiés par le scRNAseq (expérience 4) sur des modèles in vitro en utilisant des cellules primaires.

Réduction

-Afin de réduire le nombre de souris, nous allons utiliser une seule dose (la plus élevée) dans les groupes contrôles pour déterminer les meilleures conditions d’immunisation (procédure 1) -Dans les procédures 2, 3 et 4, nous exposerons chaque souris à 5 moustiques pour réduire le nombre d’animaux nécessaire aux tests de survie et à la collecte des biopsies de peau.

Raffinement

-Les souris seront manipulées de façon à réduire au maximum le stress, la douleur et la souffrance. Elles seront anesthésiées avant les prélèvements sanguins ou leur exposition aux moustiques pour limiter la gêne de la piqûre. Nous utiliserons des coussins chauffants et une lampe chauffante pour maintenir la température des souris anesthésiées. Un contrôle régulier, toutes les 15 min, sera effectué pour déceler toute possible anomalie liée à la narcose : suivi des grandes fonctions et desséchement de la cornée. En dehors des expériences, le suivi des souris s’effectuera chaque jour. - Les souris infectées seront mises à mort après la collecte des biopsies cutanées par dislocation cervicale sous anesthésie. - Nous ajouterons du gel ophtalmique pour palier au dessèchement de la cornée. - Les souris seront maintenues par 3 à 5 individus / cage avec de la litière et des enrichissements en alternance. Nous changerons la litière tous les 3 jours.

Choix des espèces

Nous allons utiliser des souris C57BL/6J. Contrairement aux autres modèles d’infection pour les flavivirus, ces souris ne sont pas immunodéprimées. Les modèles de transmission des flavivirus utilisent généralement des souris transgéniques avec une immunité innée déficiente. Notre projet vise à étudier la réponse immunitaire et nécessite un modèle animal avec une immunité fonctionnelle. De plus, nous avons déjà validé et établie les conditions pour infecter les C57BL/6J par piqûre de moustique. Par ailleurs, les souris sont des animaux de petites tailles, faciles à manipuler. Les constantes physiologiques seront facilement mesurables avec des outils adaptés. Nous allons utiliser des sujets adultes de 6 semaines, qui ont une taille corporelle et un système immunitaire mature permettant une réponse immunitaire adéquate, une piqûre par plusieurs moustiques simultanément et leur manipulation.

Ouvertes sous anesthésie pour que leurs embryons reçoivent une injection intracrânienne suivie d'une impulsion électrique, les femelles gestantes de ce projet risquent l'avortement ou une mise bas prématurée. 2 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur note que les embryons peuvent ressentir une douleur de courte durée au moment de l'injection, leur crâne étant "encore totalement mou à ce stade", et que les cerveaux sont prélevés sur les souriceaux trois à cinq jours après la naissance pour cultiver des explants. Il affirme que ces cultures "permettent de réduire considérablement le nombre de souris utilisées puisqu'une seule souris permet de réaliser plusieurs essais", pour un effectif déclaré de 2 100 animaux.

Objectifs

Des altérations de la neurotransmission sont à la base de toutes les pathologies du cerveau. Le contrôle de la neurotransmission permet d’adapter les réponses des neurones et donc du cerveau aux modifications de l’environnement. Les microglies, qui sont les macrophages du cerveau, sont fortement impliquées dans le contrôle de la fonction synaptique. Un tel contrôle est important pour la physiologie du cerveau puisque les microglies représentent jusqu'à 20 pourcent des cellules du cerveau et qu'elles contactent en permanence 1 à 10 pourcent des synapses. En particuliers, les microglies sont nécessaires à la régulation des synapses inhibitrices : quand l’activité neuronale augmente, un rétro contrôle induit une augmentation du nombre de récepteurs au neuromédiateurs aux synapses inhibitrices ; ce rétro-contrôle ne peut pas se faire sans cytokines produites par les microglies. Le présent projet s’appuie sur ces observations et cherche à mieux comprendre les mécanismes de la régulation des synapses inhibitrices et à décrire les interactions morphologiques et fonctionnelles entre la microglie et les synapses.

Bénéfices attendus

Les microglies sont les macrophages du cerveau. Elles representent jusqu’à 20 pourcent des cellules selon les régions du cerveau. En permanence, elles envoient et retractent leurs prolongements qui contactent en permanence 1 à 10 pourcent des synapses. Pourtant, on ne sait pas encore à quoi servent ces interactions. Notre projet permettra de le comprendre. De plus, les microglies sont activées dans la quasi-totalité si ce n’est dans toutes les pathologies du cerveau, et elles ne sont donc plus dans un état physiologique. Il est donc probable qu’une perte des fonctions microgliales fasse partie de l’étiologie des pathologies du cerveau. Comprendre ces fonctions physiologiques a donc un intérêt majeur dans la compréhension des pathologies.

Procédures

Les femelles gestantes subiront une chirurgie unique sous anesthésie et analgésie d’une durée de 30 minutes. Les embryons subiront lors de cette chirurgie une injection intracrânienne suivie d’une impulsion électrique (électroporation in utéro). Les animaux seront ensuite euthanasiés par différentes méthodes réglementaires en fonction des analyses nécessaires

Impact sur les animaux

Les femelles gestantes subiront une unique chirurgie pouvant entraîner un stress thermique et des risques liés à l’anesthésie (détresse respiratoire, mauvais endormissement, etc.). Les femelles pourront également ressentir de la douleur en post-opératoire avec également un risque infectieux ou de dessiccation. Au cours de cette chirurgie, les embryons seront manipulés afin de réaliser une électroporation in utero (injection d’une solution intracrânienne suivie d’une application d’un courant électrique sur la tête). Les embryons seront susceptibles de ressentir de la douleur de courte durée lors de l’injection. Il est à noter que le crâne est encore totalement mou à ce stade. Un risque d’avortement ou de mise bas prématuré existe également avec ce type de chirurgie.

Devenir

Nos études se fondent sur des cultures d'explants de cerveaux ou de cellules de cerveau dissociées. Il est donc indispensable d'euthanasier les animaux pour extraire leur cerveau.

Remplacement

Les études des interactions entre les microglies et les synapses doivent se faire dans un système qui récapitule les interactions spatiales et temporelles qui ont lieu dans le cerveau. A notre connaissance, ces interactions ne sont pas reproduites dans des systèmes en culture, mais sont acceptables dans des cultures organotypiques que nous utiliserons. De plus, nous souhaitons étudier l'importance cytokines et des mouvements des microglies et nous utiliserons des outils génétiques disponibles chez la souris qui permettent de les étudier.

Réduction

Nous utiliserons 2100 souris. Notre projet s'appuie sur des cultures d'explants qui permettent de réduire considérablement le nombre de souris utilisées puisqu'une seule souris permet de réaliser plusieurs essais. La taille des échantillons est calculée sur la base de nos études précédentes.

Raffinement

Les procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de papier kraft ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons systématiquemnet de raffiner nos procédures pour optimiser le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études . Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (analgésique, soins, etc.) et la structure de bien être animale et ou la vétérinaire pourra être sollicitée. Les animaux sont hébergés dans des conditions standard : Hébergement en cages ventilées individuellement (moins de 6 souris/cages) - Salle d’hébergement en surpression - Cycle nycthémère de 12h (7h - 19h) - Hygrométrie de 55 plus ou moins 5 pourcent - Température 22 plus ou moins 2C - Change litière/abreuvement/nourriture 1 fois par semaine + vérification quotidienne - Enrichissement du milieu : papier kraft.

Choix des espèces

La souris est choisie pour plusieurs raisons dont les plus importantes sont la disponibilté des modèles transgéniques et de manipulations génétiques multiples, et l'existence de nombreuses études antérieures qui nous permettent d'étayer notre projet. Les électroporation in utéro se font entre 13,5 et 15, 5 jours après fécondation (début du 3eme tiers de la gestation) , au moment où les neurones qui nous interessent sont générés. Les cultures organotypiques de cerveaux se réalisent à partir de cerveaux de souris 3 à 5 jours après la naissance et on sait que dans ces conditions, les régulations microglies-synapses sont conservées .

2 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'équipe implante une tumeur sous la peau du flanc sur animal vigile, puis mesure cette tumeur deux à trois fois par semaine pendant qu'elle grossit, avec gêne à la mobilité, frottement, ulcération et nécrose possibles. Le porteur écrit qu'aucun dommage majeur n'est attendu, les produits testés étant déjà évalués chez l'être humain dans un essai clinique qu'il référence. Ces études servent à compléter des dossiers réglementaires auprès de l'ANSM et de la FDA, puis une demande d'autorisation de mise sur le marché.

Objectifs

Le Projet est une étude Préclinique de Pharmacologie expérimentale. Il a pour principal but de valider le mécanisme d'action de différents candidats Immunothérapeutiques via l'étude de l'activité antitumorale et de la réponse immunitaire induite sur souris porteuses de tumeurs. Nos candidats immunothérapeutiques seront administrés sous forme de cellules à récepteur antigénique chimérique (CAR), peptidique ou sous forme d'anticorps. Ces candidats seront spécifiques de différents antigènes de tumeurs déterminés par des études de recherche cognitive.

Bénéfices attendus

Ce projet de Pharmacologie s'inscrit dans une phase de développement préclinique de différents candidats immunothérapeutiques destinés à lutter contre les différentes formes de cancer chez l'Homme. Ces études, nous permettront la complétion de dossiers réglementaires pour obtenir l'accord de l'Agence Nationale de Sécurité du Médicament (ANSM (France) ou FDA (US)) pour évaluer l'efficacité de nos candidats immunothérapeutiques dans des phases cliniques sur des patients atteints de cancers. D'autre part elles seront constitutives d'une partie du dossier de demande d'autorisation de mise sur le marché (AMM). En effet, ces produits d'immunothérapie devront répondre à des normes internationales de qualité scientifique et clinique qui seront étroitement évaluées par les autorités de santé pour la délivrance de l'AMM.

Procédures

Les animaux de ce projet seront soumis à une procédure comprenant l'identification (animaux vigiles, 1 fois, 1 minute/animal), des pesées (animaux vigiles, 2 à 3/semaine, 1 minute/animale), des traitements (animaux vigiles, en injection sous cutanée, intrapéritonéale ou intraveineux en fonction du produit testé et du schéma de traitement qui est à déterminer : dose unique ou dose répétée), d'implantation de tumeurs sous cutanées (animaux vigiles, 1 fois, 1 minute/animale) et de mesures tumorales (animaux vigiles, 2 à 3 fois/semaine, 1 minute/animale). Pour certaines études, un suivi de la réponse dans le sang pourra être envisagé. Pour cela un prélèvement de sang périphérique sera effectué à la veine retro-mandibulaire. En fonction de la cinétique, au maximum une fois par semaine en respectant les volumes autorisés : 0.5% du poids de l'animal pour un intervalle d'une semaine, 0.75% pour 2 semaines et 1% pour 3-4 semaines. Les animaux seront ensuite mis à mort pour le prélèvement de sang et organes en point finale pour les évaluations pharmacologiques ex vivo.

Impact sur les animaux

Les agents thérapeutiques utilisés au cours de ce projet ayant déjà montré leur innocuité chez la souris sont en cours d'évaluation chez l'Homme (NCT05672459). De ce fait, aucun dommage majeur / effet indésirable lié au traitement n'est attendu dans le cadre de nos études. Cependant, une nuisance qui sera surveillée et contrôlée par le suivi et le respect des points limites, peux intervenir après injection de cellules tumorales et développement de la tumeur en sous cutanée sur le flanc de la souris (gêne à la mobilité lors du grossissement de la tumeur, frottement ulcération et nécrose). Il est important de noter que l'expérimentation animale sera utilisée de manière rationnelle et selon les réglementations en vigueur qui garantissent un traitement éthique de l'animal de laboratoire (application des 3R), avec pour objectif le raffinement, la réduction de l'utilisation de l'animal de laboratoire ou son remplacement par des modèles in vitro (ou autres) lorsque cela est possible.

Devenir

En fin d'étude les animaux seront mis à mort et certains organes (rate, poumons, foie, ganglions, sang, cerveau, tumeurs) seront prélevés pour des études de Pharmacocinétiques et de Pharmacodynamie.

Remplacement

Dans un premier temps, les différents candidats immunothérapeutiques feront l'objet d'une sélection et d'un développement préclinique in vitro, sur divers modèles cellulaires, afin de confirmer leur fonctionnalité. Par la suite, les modèles murins ayant leurs propres limitations pour les études de toxicologie sur des cibles humaines, des méthodes in vitro et/ou ex vivo seront mises en place avec l'utilisation notamment de culture 3D organoïdes, cellules primaires humaines ou banque de protéines d'expression sur modèles cellulaires.

Réduction

Chaque étude fera l'objet d'une rédaction de protocole expérimental, afin de garantir l'optimisation des expériences. L'optimisation du nombre d'animaux : entre 5 et 10 souris par groupe seront utilisées pour évaluer et interpréter l'efficacité antitumorale des différents candidats. La réduction des répétitions inutiles et optimisation du nombre d'animaux contrôles entre les différentes expériences réalisées dans les mêmes conditions. Les critères d'optimisation du nombre d'animaux contrôles vont dépendre du design de l'expérience (nombre de groupes expérimentaux) et des résultats des expériences précédentes / antérieures. La réduction du nombre d'animaux ne devra néanmoins pas se faire au dépend de la fiabilité des résultats. Lorsque cela est possible, et principalement pour les souris provenant de fournisseurs agréés, l'utilisation d'animaux homogènes (même sexe, même âge, même état sanitaire) sera privilégiée. Cette précaution sera prise afin de réduire autant que faire se peut la variabilité d'un individu à l'autre. Le nombre d'animaux utilisé dans les études a été déterminé pour permettre une étude statistique non paramétrique. Pour les études qui impliquent la comparaison de 2 groupes nous utiliserons un test de Mann-Whitney et pour les études impliquant des comparaison multi-groupes, nous utiliserons un test de Kruskal-Wallis avec correction de Dunn.

Raffinement

Utilisation des mesures de raffinement suivantes chaque fois que possible : - Procédures non invasives - Assurer les soins pré-, per- et postopératoires adéquats - Recours à l'anesthésie / analgésie - Application des points limites établis préalablement - Utilisation des procédures d'euthanasie appropriées - Utilisation de litière chirurgicale pour limiter les frottements/blessures/ulcérations de la tumeur lié à la litière - Utilisation de portoirs et cages ventilées - Enrichissement du milieu (maison, matériel de nidification) - Désinfection à l'aide de désinfectant iodé - Application d'Aluspray en aide à la cicatrisation

Choix des espèces

Les différents candidats immunothérapeutiques seront d'abord évalués par des tests cellulaires in vitro pour confirmer leur fonctionnalité et leur innocuité. Néanmoins, il n'existe pas actuellement de tests de remplacement ou d'alternatives à l'utilisation d'animaux de laboratoire pour étudier la réponse immunitaire et l'efficacité antitumorale. Ces deux critères sont essentiels et critiques pour évaluer le potentiel thérapeutique réel des immunothérapies développées. Aujourd'hui, la souris est le principal modèle utilisé / étudié en recherches anticancéreuses et en immunologie. Pour notre projet, nous utiliserons des modèles de souris, dans lesquelles de nombreux modèles de tumeurs ont été isolés / développés et sont parfaitement caractérisés. Souris adultes entre 5 et 10 semaines : âge compatible avec le monitoring d'une réponse immunitaire et l'implantation de cellules tumorales en sous cutanées ou injection intraveineuse.