Recherche fondamentale
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Réparation de la moelle épinière lésée à l’aide de l’implantation d’un hydrogel contenant un facteur du système du complément chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
100 rats mâles vont être utilisés, tous tués pour prélèvement de leur système nerveux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La moelle épinière cervicale de chacun est sectionnée sur la moitié de sa largeur au cours d'une chirurgie d'une heure, avec pose d'un hydrogel, puis suivent douze semaines de tests comportementaux hebdomadaires et une séance d'électrophysiologie sous anesthésie. Le porteur indique que la lésion entraîne des pertes de motricité et de sensibilité sous le niveau lésé, des troubles de la vessie et de la régulation cardiovasculaire, et rarement de l'automutilation, tout en soulignant que le côté intact permet à l'animal de compenser. Sur le remplacement, il conclut que l'utilisation de rongeurs est "absolument indispensable et nécessaire", et retient le rat plutôt qu'une autre espèce en partie parce que son animalerie n'est habilitée que pour les souris et les rats.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’efficacité d’une protéine faisant partie de l’immunité innée dans la réparation de la moelle épinière. Il s’agira d’étudier chez le rat mâle Sprague Dawley, une nouvelle stratégie thérapeutique consistant, après une demi-lésion de la moelle épinière haute, à réparer ou préserver la moelle épinière à l’aide d’un hydrogel contenant une protéine d’intérêt. L’objectif principal étant de réduire les déficits post-traumatiques et d’entraîner des récupérations sensitives et motrices les plus complètes possible. A terme, ces résultats pourraient être transférés aux bénéfices des patients ayant subi des dommages de la moelle épinière. L’évaluation qui portera sur les récupérations sensitives et motrices et l’activité électrique des réseaux de neurones sera complétée par des analyses histologiques et biochimiques.
Bénéfices attendus
Les protéines de l’immunité innée apparaissent comme une alternative prometteuse pour préserver et réparer la moelle épinière endommagée. En effet, ces protéines ont été décrits comme participant à la réaction inflammatoire et dans le recrutement de cellules souches. Notre étude pré-clinique vise à tester l’efficacité thérapeutique d’une de ces protéines sur la réaction inflammatoire post-traumatique et la régénérescence nerveuse centrale en vue de proposer une thérapie innovante transférable à l’Homme spino-lésé. Dans le domaine de la réparation de la moelle épinière, malgré une recherche intensive depuis les cinquante dernières années, à ce jour aucune stratégie thérapeutique n’a été proposer afin de limiter la progression des déficits fonctionnels post-lésionnels et d’entraîner des récupérations sensori-motrices suffisantes permettant une récupération de l’autonomie des patients. Notre étude représente donc une étape très importante avant un transfert vers la clinique humaine.
Procédures
Chirurgie Lésionnelle (sous anesthésie) : Durée 1h / Evaluation comportementale (animaux vigile) : 1 fois/semaine pendant 12 semaines, Durée : 15 min / Electrophysiologie (sous anesthésie) : Durée 1h
Impact sur les animaux
La lésion de la moelle épinière entraîne des déficits sensorimoteurs sous-lésionnels (perte de motricité, de sensibilité, troubles végétatifs : régulation cardio-vasculaire, fonction vésicale…). Les autres nuisances éventuelles pouvant être rencontrées chez les animaux sont les infections liées à la chirurgie, les effets secondaires post-anesthésie, les douleurs post-traumatiques ou liées aux injections intrapéritonéales, le stress liés à leur manipulation (pour anesthésie, mesure périodique du poids…) ou lors des tests comportementaux, et l’hébergement individuel. Il faut également noter que les lésions nerveuses centrales peuvent rarement conduire à de l’automutilation. Toutefois, l’expérience montre que l’hémisection (lésion de la moitié) cervicale de la moelle épinière n’entraîne que rarement une perte de poids, des problèmes de miction (élimination de l’urine par la vidange de la vessie), de déshydratation ou une dénutrition post-chirurgicale. En effet, le côté de la moelle épinière laissé intact permet à l’animal de compenser les déficits végétatifs et de conserver une autonomie suffisante pour lui permettre de subvenir à des besoins.
Devenir
Mise à mort afin de prélever le système nerveux pour analyse histologique.
Remplacement
Dans le cadre de l'étude des stratégies de réparation/récupération de la moelle épinière traumatisée, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d'animaux. Les études in vitro réalisées à partir de cellules issues de mammifères livrent une quantité́ infime d’informations au regard de ce qu’il pourrait se passer chez l’Homme. Notre projet vise donc à proposer une nouvelle stratégie de préservation et/ou réparation de la moelle épinière directement transférable vers la clinique humaine. Pour cette raison, l’utilisation de mammifères (rongeurs) est absolument indispensable et nécessaire. Il n’existe pas d’alternative au modèle animal in vivo.
Réduction
Afin de mener à bien notre projet, nous devons constituer 4 groupes expérimentaux. Ces groupes seront constitués de rats males Sprague Dawley d’environ 250 g (environ 2 mois d’âge) lors de la chirurgie initiale. Des males seront choisis en raison de l’absence d’importants cycles hormonaux mensuels pouvant introduire une grande variabilité dans les résultats attendus. Dans un souci de réduction du nombre d’animaux, chaque animal opéré sera engagé dans les 3 étapes expérimentales successives décrites dans la chronologie du protocole. Dans la mesure où la comparaison des résultats entre les groupes sera réalisée avec des tests statistiques paramétriques (analyse de la variance), nous prévoyons, au regard de nos expériences passées, d’inclure initialement dans chaque groupe au maximum 25 animaux, soit un total de 100 animaux. Toutefois, afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, nous enrôlerons, dans un premier temps, 5 animaux par groupe, soit un total de 20 animaux. A l’issue de cette première vague expérimentale, nous calculerons, au regard des résultats obtenus et de la variabilité intergroupe, d’une puissance de 80% et d’un seuil de significativité de 5%, avec un test statistique approprié (ANOVA Power, Test de puissance, calcul du risque alpha et béta), les effectifs nécessaires pour pouvoir montrer une différence entre le groupe traité et ceux non-traités. Si le calcul indique que les effectifs nécessaires sont supérieurs à ceux envisagés initialement ou qu’aucune différence intergroupe ne peut être dégagée pour un nombre d’animaux par groupe inférieur ou égal à celui initialement prévu, nous abandonnerons l’étude et conclurons à l’inefficacité du traitement thérapeutique.
Raffinement
Du gel ophtalmique sera utilisé au cours de la chirurgie afin d’éviter l’assèchement de la cornée. Une injection de sérum physiologique glucosée permettra de réhydrater les animaux en fin de chirurgie. Une couverture antibiotique, ainsi qu’un traitement antalgique seront administrés au cours de la semaine suivant la chirurgie afin de réduire les éventuelles infections et douleurs post-chirurgicales. L’observation détaillée quotidienne (7j/7) de l’état de santé des animaux et l’évaluation de l’expression faciale permettront de prendre l’ensemble des mesures destinées à réduire la douleur et le stress. Les animaux atteignant le point limite seront euthanasiés selon la procédure réservée aux animaux éveillés décrite dans la partie « Méthode de mise à mort ». Au cours des 7 jours suivant la chirurgie, les animaux seront placés seuls dans une cage le temps que les plaies cicatrisent afin d’éviter les blessures et réouverture des plaies que pourraient occasionner les congénères. Toutefois, même si les animaux sont placés seuls dans leur cage enrichie avec des objets (tubes en polycarbonate rouge…) et de l’eau et de la nourriture à proximité (gel), ils ne seront pas à l’isolement. Leurs cages seront placées sur des portoir de cages à côté des cages des autres animaux. De l’eau et de la nourriture seront données ad libitum. A l’issue de cette période critique, ils seront replacés avec leurs congénères dans des cages enrichies avec des objets (tubes en polycarbonate rouge…) et de l’eau et de la nourriture données ad libitum. L’hébergement des animaux sera réalisé dans l’animalerie du laboratoire dont la température des locaux est aux environs de 22°C avec un cycle jour/nuit 12h/12h. Nous nous efforcerons à chaque instant d’affiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive, et des soins et des gestes adaptés, avec notamment, pour ces derniers, une diminution de l’angoisse et du stress des animaux par manipulation avant, pendant et après tout prélèvement, intervention et test comportemental.
Choix des espèces
Les mécanismes neurobiologiques mis en œuvre chez les mammifères après une lésion de la moelle épinière sont proches de ceux de l’humain. Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de mammifères pour réaliser notre étude pré-clinique. Par ailleurs, nous avons choisi d’utiliser des rats plutôt que des primates non humains, des bovidés, des porcidés, des canidés, des félidés… ou des murinés du genre Mus dont nous n’avons aucune expertise en termes de récupération après une lésion de la moelle épinière et dont la littérature scientifique est très pauvre en ce qui concerne l’utilisation de ces genres. De plus, notre animalerie est uniquement habilitée pour héberger des murinés des genres Mus et Rattus et nous disposons de plateformes d’analyse du mouvement et des dispositifs d’enregistrement électrophysiologiques uniquement destinés à ces familles. Les animaux seront des jeunes adultes de 250 g, c’est-à-dire de 2 mois d’âge environ. Afin d'étudier les processus régénératifs et la plasticité nerveuse, il est impératif d'utiliser des jeunes adultes. L'étude de ces procéssus ne pourraient pas être réalisée chez des animaux vieillissants ou des animaux imatures.
Exploration de l’activité neuronale chez un modèle murin (souris) de la maladie d`alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune subissant deux chirurgies du crâne puis cinq à six semaines dans une cage divisée par une cloison de plexiglas, une souris par compartiment. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré. La première chirurgie dure environ 45 minutes, la seconde de 90 à 120 minutes, et une sédation d'une heure sert à fixer une prothèse sur la tête, que l'animal apprend ensuite à porter au cours de séances de deux à six minutes avant une tâche comportementale que le porteur qualifie de légèrement désagréable. Le bénéfice annoncé, repérer un oubli anormal comme marqueur précoce de la maladie d'Alzheimer, reste une piste pour des travaux ultérieurs, quand la séparation des congénères et les deux ouvertures du crâne sont, elles, programmées.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer (MA) est une affection progressive et mortelle, représentant la maladie neurodégénérative la plus répandue. Un diagnostic précoce s'avère crucial dans la recherche préclinique et clinique sur la MA, car il ouvre une fenêtre thérapeutique opportune pour initier des interventions avant l'installation d'un déclin cognitif sévère. L'accumulation de la protéine bêta-amyloïde dans la partie frontale du cerveau est associée à une perte de mémoire rapide, constituant un symptôme précoce de la MA détectable par des évaluations cognitives expérimentales et cliniques bien avant l'apparition d'une démence sévère. En effet, les déficits d'apprentissage et de mémoire sont parmi les premiers signes signalés par les proches des patients. Fondée sur ces découvertes et sur des données préliminaires obtenues dans notre laboratoire, qui indiquent une activité neuronale anormale dans diverses conditions pathologiques, notre étude actuelle vise à explorer les changements des circuits cérébraux liés à l'intégration d'informations nécessaires à la consolidation de la mémoire et à l'oubli.
Bénéfices attendus
Ainsi, l'oubli précoce pourrait constituer une cible potentielle pour des études précliniques visant à prévenir ou retarder l'émergence de formes plus graves de la maladie d'Alzheimer (MA). Nos recherches antérieures et actuelles sur le rôle des modifications de l'excitabilité neuronale dans le processus de formation de la mémoire nous conduisent à proposer une exploration des altérations des circuits du cortex préfrontal en tant que marqueur précoce d'un oubli anormal dans la MA. En se basant sur les données obtenues, nous pourrions identifier des cibles prometteuses pour de nouvelles approches thérapeutiques.
Procédures
Tous les animaux subiront deux interventions chirurgicales sous anesthésie : la première intervention durera environ 45 minutes ; la deuxième intervention durera de 90 à 120 minutes. Ils subiront également une intervention sous sédation (sans acte invasif, d'une durée d'environ 60 minutes) pour la pose d’une prothèse sur la tête. Après la deuxième intervention chirurgicale et jusqu'à la réalisation des études d'imagerie calcique et de comportement, les animaux seront placés dans des cages collectives séparées en deux zones par une séparation en plexiglas transparent (deux souris par cage, une souris par zone) pendant une période de 5 à 6 semaines. Ils seront progressivement entraînés (lors de séances de durée croissante de 2 à 6 minutes) à accepter la pose d'un objet sur leur tête. Ils effectueront une tâche comportementale légèrement désagréable d’environ 6 minutes en présence de l’appareil d’imagerie (posé sur la tête). Ils seront ré-exposés au même dispositif de comportement le lendemain et 14 jours plus tard (pendant environ 6 minutes) afin d'évaluer leur mémoire.
Impact sur les animaux
Les animaux subissent deux interventions chirurgicales : le risque d’inconfort, de douleur, d’infection et/ou de perte de poids est inhérent à ces procédures. Ils seront endormis une fois de plus, ce qui pose un risque d'hypothermie ou de problèmes respiratoires temporaires. Ils seront soumis à une tâche comportementale qui est légèrement désagréable et stressante pour l’animal. Celui-ci est entraîné à porter l'appareil d'imagerie sur sa tête, ce qui représente une contrainte pour sa posture. La pose de la prothèse implique également une contrainte pour l'animal et nous oblige à adapter les conditions d'hébergement.
Devenir
Toutes les souris seront euthanisiées et leurs cerveaux seront prélevés pour des analyses post-hoc.
Remplacement
Le projet porte sur l'étude des mécanismes qui sous-tendent la formation et le stockage de la mémoire dans le cerveau et leur changement dans MA. Pour mener à bien notre étude, nous aurions besoin d'un modèle : i) complexe et intact, ii) qui se prête facilement à la modification de son ADN, iii) possédant un néocortex, la partie la plus récente et la plus évoluée du cortex cérébral chez les mammifères, iv) adapté aux approches expérimentales invasives. En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, nous avons réfléchi à nos expériences afin d'intégrer les approches alternatives si possibles. A notre connaissance, seuls les modèles mammaliens, et plus particulièrement la souris, répondent à tous ces critères. Les études humaines ne sont pas adaptées à notre question scientifique car des tests invasifs sont nécessaires pour détecter et analyser les neurones et leur altération dans MA. De plus, nous étudions le stade précoce de la maladie, lorsque les symptômes n'apparaissent pas nécessairement chez l'homme. Le tissu post-mortem humain n'est pas disponible et les biopsies ne sont pas pratiquées pour cette condition. Les modèles informatiques actuellement disponibles ne permettent pas la modélisation au niveau du cerveau entier. Pour toutes ces raisons, et malgré notre réflexion, le recours à l'animal est malheureusement nécessaire.
Réduction
Afin de n'utiliser qu'un nombre minimal d'animaux nécessaire, nous avons estimé, sur la base des études précédentes, le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une signification statistique (stratégie : études antérieures au sein de l'équipe et étude bibliographique). Nous sommes très attentifs à l’objectif de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés. Pour cette raison, nous proposons d'adopter une stratégie expérimentale permettant une analyse précoce de nos données au fur et à mesure (c.à.d. analyse effectuée en petits lots avec une expérience par jour). Cela nous permettra de modifier la taille de l'échantillon si nécessaire, selon les premiers résultats obtenus. L'utilisation de ces petits groupes permettra également de repérer rapidement les problèmes potentiels de la procédure et de modifier notre approche si nécessaire pour le lot suivant.
Raffinement
Les mesures de raffinement comprennent observation quotidienne des animaux et vérification de l'état de l'animal (avant chaque manipulation) en utilisant des critères généraux ainsi que des signes cliniques spécifiques à la manipulation. Les critères pour évaluer la souffrance incluent l'apparence et le comportement général de l'animal. Tout signe de souffrance, de douleur ou de détresse (comme un comportement inhabituel ou un pelage négligé) entraînera une réponse immédiate et adaptée. Cela peut inclure des mesures conservatoires comme isoler temporairement l'animal, administrer du glucose, le réchauffer dans une couveuse ou soigner les blessures en cas de bagarre avec d'autres animaux. Si l'état de l'animal ne s'améliore pas après ces mesures, l'expérimentateur décidera de l'euthanasier si nécessaire, en consultation avec le vétérinaire et l'équipe des soigneurs. Les animaux sont manipulés quotidiennement avant les expériences pour réduire leur niveau de détresse. Les conditions d'hébergement sont adaptées en maintenant les animaux dans des cages collectives contenant des enrichissements tels que des tubes en carton et du matériel pour la nidification. Pour intégrer de nouvelles techniques de raffinement, les expérimentateurs reçoivent une formation régulière et consultent des sites éducatifs comme NC3R.
Choix des espèces
Nous utiliserons la souris car nous souhaitons exploiter un modèle impliquant la production d'amyloïde bêta. À ce jour, la souris est la seule espèce mammifère pour laquelle il est possible, de manière routinière, de modifier l'ADN et pour laquelle les modèles créés ont été caractérisés au niveau comportemental et moléculaire. Les souris auront entre 8 et 10 semaines au début des procédures (c'est-à-dire la chirurgie) et entre 14 et 18 semaines au moment du test comportemental. Selon les données précédemment rapportées et nos données préliminaires sur le développement de la pathologie, il s'agit de l'âge auquel les animaux commencent à développer les premiers signes de la maladie avant l'apparition de la maladie grave. Nous voulons étudier la phase précoce qui se situe vers 14-18 semaines d'âge. Les animaux seront utilisés pour un test de comportement qui nécessite l'utilisation d'animaux adultes. Cet âge a également été choisi pour être cohérent avec les études publiées et les expériences antérieures dans notre équipe.
Rôle et régulation de la thrombopoïèse pulmonaire lors d’une infection virale pulmonaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Une partie des souris est génétiquement modifiée pour porter le récepteur humain du SARS-CoV-2, ce qui les rend infectables par les variants humains du virus. 5 040 souris vont être utilisées, 4 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 240 opérées sous anesthésie sans réveil. Sept jours après inoculation, le porteur décrit chez ces souris une température corporelle tombée à 25 degrés et une perte de poids supérieure à 20 %, et prévoit par ailleurs des chirurgies pulmonaires de quatre à cinq heures, des interventions sur les os du crâne, jusqu'à cinq prélèvements de sang sous la mâchoire et des injections derrière l'œil. Toutes sont tuées pour prélever sang, poumons, rate et moelle osseuse, ce cumul de prélèvements sur un même animal étant présenté comme une mesure de réduction.
Objectifs
Les mégacaryocytes sont des cellules qui se développent dans la moelle osseuse et qui permettent la formation de plaquettes dans le sang, nécessaire notamment à la coagulation sanguine. Récemment, nous avons démontré que cette formation de plaquettes n’est pas restreinte à la moelle osseuse mais qu’elle peut aussi avoir lieu dans les poumons. Des études récentes et nos données préliminaires suggèrent que cette formation de plaquettes dans les poumons pourrait jouer un rôle clef lors d'une infection virale pulmonaire. Chez l’homme au cours des infections à Sars-CoV-2 une augmentation très importante de ces mégacaryocytes pulmonaires a été reportée chez les patients atteints de COVID-19 en comparaison à d’autres patients atteints d’autres causes de détresse respiratoire. Nous pensons que la formation de plaquettes au niveau des poumons augmente au cours des infections pulmonaires, et cette augmentation semble liée à une aggravation de la détresse respiratoire et à une inflammation aigüe. Les mécanismes y conduisant ne sont pas connus et ce sont donc ces mécanismes que nous proposons d’identifier en utilisant des modèles d’infections pulmonaires chez la souris et des techniques de microscopie intravitale. L’identification de ces mécanismes devrait nous permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques non seulement pour les infections pulmonaires comme la COVID-19 mais aussi pour d’autres pathologies inflammatoires pulmonaires comme l’asthme ou les fibroses pulmonaires où l'activation des plaquettes contribue au développement de la pathologie
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de : (i) déterminer l’implication bénéfique ou délétère de la production de plaquettes dans les poumons au cours des infections virales ; (ii) étudier la cinétique de production de plaquettes dans les poumons au cours des infections virales pulmonaires et de l’inflammation pulmonaire ; (iii) caractériser et identifier de nouveaux mécanismes de la biologie plaquettaire (production, modifications, rôles) ; (iv) identifier potentiellement des nouvelles cibles thérapeutiques dans les pathologies pulmonaires dans lesquelles les plaquettes sont impliquées.
Procédures
Dans ce projet, - Les souris sous anesthésie générale subiront une injection de virus. L’injection ne dépasse pas 1 minute. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront une injection de cellules ou de molécules. Les injections ne dépassent pas 2 min. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront entre un et cinq prélèvement sanguin. Les prélèvements ne dépassent pas 2 min. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront une injection de cellules ou de molécules puis une chirugie quelques jours plus tard. Les souris sous anesthésie generale et locale subiront une procédure de chirurgie pulmonaire sans réveil. Les injections ne dépassent pas 2 min, et la chirrugie dure 4h. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront une injection de cellules ou de molécules puis une chirugie quelques heures ou minutes plus tard. Les souris sous anesthésie generale et locale subiront une procédure de chirurgie pulmonaire sans réveil. Les injections ne dépassent pas 2 min, et la chirrugie dure 4h. - Les souris sous anesthésie generale et locale subiront une injection de molécules puis une chirugie quelques heures ou quelques minutes plus tard. Les souris anesthésiées subiront une procédure de chirurgie sur les os du crane. Les injections ne dépassent pas 2 min, et la chirrugie dure 4h. - Les souris anesthésiées subiront une injection de virus, puis quelques jours plus tard une injection de cellules, et quelques heures après ils seront mis à mort par anesthésie. Les injections ne dépassent pas 2 min. - Les souris sous anesthésie generale subiront une injection de virus. Puis quelques jours plus tard une injection de cellules sous anesthésie generale et locale. Les injections ne dépassent pas 2 min.
Impact sur les animaux
Dans ce projet nous utiliserons un variant du SARS-CoV-2 adapté pour infecter les souris qui induit des pertes de poids inférieures à 10% sur toute la durée de l’infection ainsi qu’une faible baisse de la température corporelle
Devenir
Toutes les souris de ce projet seront mises à mort pour des prélevements de tissus et de sang.
Remplacement
Notre projet a pour but de mieux comprendre la production de plaquettes sanguines au cours des infections virales pulmonaires. Afin de répondre à nos questions biologiques, nous avons besoin de travailler sur des organismes vivants ayant une réponse immunitaire suffisamment proche de l’homme. Il est impossible de ne travailler sur des modèles in vitro strictement cellulaires car il n'est pas possible pour l'instant d'obtenir en dehors d'un organisme vivant la production de plaquettes pleinement fonctionnelles. En effet cette production est dépendante du flux sanguin et de nombreuses interactions cellulaires. Ainsi notre projet nécessite l’utilisation d’un organisme entier, le plus adapté étant la souris.
Réduction
Des expériences préliminaires ont fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les analyses statistiques seront réalisées sur un logiciel d’analyse en combinant les résultats de n=4 expériences indépendantes avec 5 souris par lot (soit 20 animaux par groupe). En fonction des résultats obtenus lors de certaines étapes clés de notre projet, nous poursuivrons ou arrêterons certaines expériences. Après mise à mort de l’animal, des prélèvements seront réalisés, afin d’obtenir le plus d’informations possibles sans avoir à utiliser d’autres animaux. Nous prélèverons par exemple à la fois le sang, les poumons, la rate et la moelle osseuse, ce qui nous permettra de réaliser plusieurs tests à partir d'un seul animal.
Raffinement
Dans ce projet, il existe différentes étapes susceptibles de générer de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse chez les animaux. Pour chaque étape, des mesures adéquates ont été mises en place pour suivre et réduire au maximum ces nuisances. Les conditions d'hébergement et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute angoisse ou dommage durable que pourraient subir les animaux. Les injections sont réalisées sous anesthésie générale. Pour la chirurgie qui est une procédure sans réveil nous utilisons aussi une anesthésie générale, combinés à des anesthésiques locaux et un analgésiant. La température corporelle et l’hydratation des animaux sont maintenues tout au long de la procédure grâce à une caisse chauffante et des injections régulières de solution saline. Un gel est appliqué sur les yeux afin de prévenir leur assèchement. Les souris infectées seront surveillées quotidiennement jusqu’à l’arrêt des procédures. La température, le poids, l’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux seront prises en compte à chaque observation et les animaux présentant des signes de souffrance seront immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Pour notre projet visant à explorer la biologie des plaquettes sanguines dans les infections par des virus, la souris constitue le modèle de choix en raison i) de l'excellente caractérisation des fonds génétiques ii) de l’utilisation de souris génétiquement modifiées déjà présentes dans l’équipe permettant de suivre les plaquettes et les mégacaryocytes, et iii) du fort degré de convergence des paramètres de l'immunité et de la biologie plaquettaire chez l'homme par rapport aux autres espèces envisageables. De plus, notre projet est basé sur l’étude de la dynamique de production de plaquettes par une technique de microscopie intravitale qui n’est applicable que chez la souris. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes majoritairement âgées entre 8 et 12 semaines, mais également certaines de plus de 40 semaines afin d’étudier notre modèle à différents âges chez la souris. A ces stades de développement, les souris ont un système immunitaire suffisamment mature.
Caractérisations fines du sommeil et des cataplexies d’un modèle unique de rat narcoleptique à l’aide d’un dispositif d’enregistrement autonome et sans fil.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, 120 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 120 un niveau léger. À six jours, chaque raton est immobilisé sans anesthésie pendant trente secondes pour un prélèvement de génotypage. Les 120 porteurs de la mutation subissent ensuite, adultes, une chirurgie du crâne de deux heures pour implanter un dispositif d'enregistrement du sommeil, puis sont tués pour vérifier sur leur cerveau l'absence d'orexine. Le porteur indique que la taille des groupes a été fixée empiriquement, faute d'études antérieures, et affirme que l'étude des cataplexies exige un animal vigile qu'aucun modèle in vitro ne remplace.
Objectifs
La narcolepsie de type 1 (avec cataplexie) est une maladie neurologique rare qui se caractérise par une hypersomnolence pendant la journée et une intrusion de composantes du sommeil paradoxal (SP) pendant l’éveil. Nous avons montré que cette pathologie est la conséquence de la dégénérescence des neurones qui fabriquent le neuropeptide « hypocrétine » aussi appelé « orexine ». L’un des symptômes majeurs est la cataplexie. Les épisodes de cataplexie sont des pertes de tonus musculaire induites pendant l’éveil, lors d’un contexte émotionnel positif fort, provoquant souvent la chute de la personne. Les chutes peuvent être brutales et conduire à des blessures. Les circuits neuronaux responsables de la cataplexie sont très mal compris. Notre projet de recherche a pour objectif de caractériser et étudier un modèle original et unique de rats narcoleptiques. Afin d’objectiver et évaluer la sévérité des symptômes, nous réaliserons des enregistrements et des analyses polysomnographiques, c'est à dire l'analyse des états de vigilance (éveil et sommeil) et de la cataplexie en mesurant l'activité cérébrale (électroencéphalogramme) et l'activité musculaire (électromyogramme) chez des rats déficients en orexine, comparés à leur contrôles non déficients. La qualité du sommeil et la présence de cataplexie sont évaluées chez des rats mâles et femelles homozygotes pour la délétion du gène prépro-hypocrétines. L’étude de la microarchitecture du sommeil et des différents symptômes observés fera l’objet de cette procédure. Elle nous permettra également de créer une base de données d’enregistrements en condition contrôle qui pourra être reprise dans des études futures.
Bénéfices attendus
Aujourd’hui, la prise en charge des cataplexies est uniquement symptomatique, du fait du manque de connaissance scientifique des circuits neuronaux exécutifs. La caractérisation des symptômes dans ce modèle unique et novateur de rat narcoleptique, nous permettra ensuite l’identification précise des circuits impectés et le développement de traitements ciblés.
Procédures
Tous les animaux (n=240) seront soumis, à l’âge de 6 jours, à un prélèvement pour génotypage, dont le degré de souffrance est léger. Cet acte, réalisé par du personnel dédié et formé, dure 30 secondes comprenant l’immobilisation du raton non anesthésié et le prélèvement. Il n’a aucun impact sur son comportement dès son retour dans la portée. 50% de ces animaux (n=120) seront ensuite soumis, à l’âge adulte, à une seule intervention chirurgicale sous anesthésie générale avec réveil, d’une durée estimée à 2h et d’un degré de souffrance modéré. Les nuisances attendues sont la manipulation de l’animal avant la chirurgie, la chirurgie stéréotaxique implantatoire elle-même, la récupération de l’anesthésie générale en post-opératoire ainsi que la douleur post-opératoire due à la plaie.
Impact sur les animaux
Tous les animaux (n=240) feront d’abord l’objet d’un prélèvement à l’âge de 6 jours post naissance, dont le degré de souffrance est considéré comme léger. Cette procédure induit des nuisances de stress lié à la manipulation de l’animal, et de douleur brève du fait du prélèvement. Toutefois, la souffrance est légère et de courte durée. Les rats sélectionnés ayant le bon génotype (n=120) subiront à l’âge adulte une chirurgie, sous anesthésie générale, d’une durée approximative de 2h00, d’un degré de souffrance considéré comme modéré. Les nuisances attendues sont le stress modéré lié à la manipulation de l’animal avant la chirurgie, la chirurgie elle-même, l’état vaseux en sortie de chirurgie due à la récupération de l’anesthésie générale ainsi que la douleur post-opératoire. Les infections suite à la chirurgie sont extrêmement rares. Bien qu’elles ne soient pas attendues, elles ne sont pas exclues.
Devenir
Tous les animaux inclus dans la procédure seront mis à mort. En effet, une analyse post mortem des cerveaux des animaux sera nécessaire afin de s'assurer de l'absence d'orexine, molécule dont l'absence dans la région de l'hypothalamus est responsable de la pathologie et de comparer avec les cerveaux des animaux contrôles.
Remplacement
Le sommeil et les cataplexies sont des phénotypes complexes mettant en jeu de nombreuses structures cérébrales et plusieurs organes (cerveau, muscles) nécessitant pour son étude l’animal entier. Les cataplexies sont déclenchées par des émotions positives, leur étude nécessite donc que l’animal soit vigile. Aucun modèle in vitro ne permet à ce jour de remplacer l’animal vigile pour l’étude de ces comportements.
Réduction
Les données qui seront acquises étant originales, nous ne pouvons pas nous appuyer sur des études antérieures pour calculer la taille du lot nécessaire pour l’obtention d’une puissance statistique suffisante. La taille du lot de rat est donc calculée empiriquement sur la base de nos expériences physiologiques antérieures chez la souris en tenant compte du nombre de cataplexies par session d’enregistrement, et des échecs éventuels. Les données expérimentales générées seront traitées à l’aide de tests d’analyses de variance. Les résultats seront exprimés en moyennes affectées de l’erreur standard. La distribution normale des données sera d'abord testée et si tel est le cas les tests paramétriques seront utilisés sinon les tests non paramétriques équivalents seront utilisés.
Raffinement
Pour minimiser le stress individuel et maintenir les interactions sociales, les rats sont hébergés par lot de 2-5 par cage. Cependant, l’agressivité interindividuelle peut parfois augmenter chez certains mâles avec le temps, nous obligeant alors à les séparer du groupe. Le cas échéant, les animaux séparés sont placés dans une cage double munie d’un séparateur grillagé. De cette façon, les animaux peuvent interagir sans pouvoir s’agresser mutuellement. Des enrichissements systématiques sont mis en place afin de permettre une augmentation autant que possible du bien-être de l’animal. Quelques jours avant, après la chirurgie sous anesthésie générale et pour toute la durée de la procédure, les animaux sont placés par deux dans une cage double et suivis régulièrement avec une attention quotidienne lors de la phase postopératoire et l’optimisation de la récupération (ajout d’anti-inflammatoire non stéroïdien si nécessaire, suivi du poids, de la mobilité et du comportement) grâce à l’utilisation d’une grille de score post-opératoire. Notre préoccupation sera ensuite d’évaluer quotidiennement, grâce aux fiches de scorage, l’évolution des paramètres physiologiques afin de détecter toute dégradation de l’état de santé général. Celles-ci constituent le point limite des expérimentations avec mise à mort des animaux pour prévenir l’apparition d’une quelconque souffrance. L’utilisation d’un dispositif d’enregistrement du sommeil sans fil permettra, contrairement aux dispositifs filaires habituellement utilisés pour ce genre d’étude, de ne plus isoler les animaux durant les phases d’enregistrement de sommeil. L’interaction sociale sera donc maintenue chez les animaux durant toute la procédure.
Choix des espèces
Le rat narcoleptique a été créé sur la base des nombreuses données disponibles sur les souris, un modèle animal reconnu de la pathologie étudiée. Ces dernières expriment l’ensemble des symptômes observés chez l’homme. L’autre modèle animal reconnu et actuellement existant est le chien narcoleptique mais nous ne sommes pas en mesure d’étudier cet animal. L'intérêt de travailler sur le modèle rat est multiple. Le principal est qu'il sera possible d'étudier la pathologie des animaux en groupe (avec conservation des interactions sociales, pouvant avoir une importance sur le degré de la pathologie) contrairement à la souris. En effet, il n'est actuellement pas techniquement possible d'étudier le sommeil et la narcolepsie avec un dispositif sans fil chez la souris (modèle animal trop petit) et donc en groupe. Il s’agira de rats adultes (12-16 semaines au début de la procédure) ayant atteint leur maturité cérébrale, possédant déjà un système locomoteur mature, un cycle circadien et ultradien veille-sommeil stabilisé et consolidé, en cohérence avec les données rapportées dans nos précédentes publications et d’une manière générale dans la littérature chez le rat dans ce domaine des neurosciences.
Rôle des gènes de Salmonella dans la colonisation, la virulence et la persistance de cette bactérie– Développement/Tests d’inhibiteurs des produits de ces gènes ou de la viabilité de Salmonella
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Infectées par Salmonella par voie orale à deux reprises en vingt-quatre heures, puis suivies par imagerie trois fois dix minutes par jour pendant trois jours, des souris subissent aussi une chirurgie de deux heures sur les anses intestinales, menée sous anesthésie sans réveil. 6 600 souris vont être utilisées, 3 300 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 3 300 opérées sans réveil, toutes tuées pour prélèvement des organes. L'objet est d'identifier les gènes qui permettent à la bactérie de coloniser son hôte, et de tester des inhibiteurs. Pour 3 300 souris en souffrance sévère, le porteur résume les nuisances attendues à une perte de poids et une diarrhée, tout en décrivant par ailleurs des animaux tués dès que l'expérimentateur estime qu'ils mourraient dans la demi-journée.
Objectifs
Salmonella est une bactérie pathogène importante en santé publique. Elle est responsable, suivant le sérotype, d’infections systémiques létales, de gastroentérites ou encore d’un portage asymptomatique chez l’homme et les animaux. Chez l’homme, la fièvre typhoïde touche encore 22 millions de personnes chaque année et on estime à 1,3 milliard le nombre de cas de gastroentérites à Salmonella chaque année dans le monde. Comprendre les mécanismes d’interactions d’un pathogène avec son hôte est indispensable au développement de méthodes de prophylaxie ou de thérapeutiques. Notre projet vise à (1) identifier les gènes de Salmonella impliqués dans la colonisation, la réponse de l’hôte, la virulence et la persistance de cette bactérie chez son hôte et à caractériser leur rôle ; et/ou (2) à tester des inhibiteurs des produits de ces gènes ou de la viabilité des salmonelles. Après caractérisation des gènes et/ou développement/analyse d’inhibiteurs in vitro, l’expérimentation animale est nécessaire pour valider les résultats obtenus in vitro, c’est à dire l’implication du gène d’intérêt dans la virulence de Salmonella, l’efficacité de l’inhibiteur. Elle permet également de caractériser plus finement le rôle du gène d’intérêt in vivo.
Bénéfices attendus
Comprendre les mécanismes d’interactions d’un pathogène avec son hôte est indispensable au développement de méthodes de prophylaxie ou de thérapeutiques. Notre projet vise à (1) identifier les gènes de Salmonella impliqués dans la colonisation, la réponse de l’hôte, la virulence et la persistance de cette bactérie chez son hôte et à caractériser leur rôle ; et/ou (2) à tester des inhibiteurs des produits de ces gènes ou de la viabilité des salmonelles. Après caractérisation des gènes et/ou développement/analyse d’inhibiteurs in vitro, l’expérimentation animale est nécessaire pour valider les résultats obtenus in vitro, c’est à dire l’implication du gène d’intérêt dans la fitness et/ou la virulence de Salmonella, l’efficacité de l’inhibiteur. Elle permet également de caractériser plus finement le rôle du gène d’intérêt in vivo.
Procédures
Les animaux seront soumis à une infection à salmonella par voie orale (2 fois à 24h d'intervalle) . Ils pourront ensuite être soumis à des prélèvements sanguins afin d'étudier la perméabilité intestinale (1 fois), à un suivi par imagerie in vivo (3 x 10 min par jour pendant 3 jours). L'inoculation de salmonella sera également réalisé grâce à la méthode des anses intestinales ( 1 fois x 2heures; chirurgie sans réveil) .
Impact sur les animaux
Dans le cas de l'infection par voie orale les animaux pouront perdre du poids et développer une diarrhée
Devenir
Mise à mort afin de réaliser le prélèvement des organes
Remplacement
Une caractérisation préalable des gènes est réalisée in vitro pour permettre la sélection des gènes les plus pertinents et pour orienter le choix des voies d’inoculation à mettre en oeuvre. Le principe de remplacement n'est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne reproduisent pas l'ecosystème complexe au cours de l'infection et par conséquent ne permettent pas l'obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine.
Réduction
L'utilisation de l'IVIS (In Vivo Imaging System) permet de suivre les souris au cours du temps et permet donc l'étude de la cinétique de la colonisation sur une même souris là où il aurait fallu les sacrifier à différents temps sans cela. Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux. De plus, nous avons déjà validé certaines de nos approches expérimentales in vitro permettant d'optimiser l'utilisation des animaux. Les rongeurs utilisés sont consanguins et de même âge réduisant la variabilité entre les animaux et donc le nombre nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Une étude statistique est réalisée sur les données brutes d’immunohistochimie ou de FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) obtenues à partir des organes prélevés. Les tests appliqués sont des tests non paramétriques (Kruskall-Wallis one-way analysis of variance suivi d’un Mann-Whitney en post-test). Pour les niveaux de colonisation des organes par les bactéries, les tests utilisés sont des tests paramétriques (ANOVA suivi d’un posttest Tukey-Kramer) car le cumul de l’ensemble des données que nous avons obtenues depuis plus de 10 ans concernant ce caractère montre que ces données suivent une loi normale. Ceci nous permet lorsque nous souhaitons uniquement comparer le niveau de colonisation de plusieurs souches de diminuer le nombre d’animaux pour obtenir la même puissance de test.
Raffinement
Le bien-être de l’animal, outre les considérations éthiques, est aussi un facteur de variabilité expérimentale, qui est pris en compte et réduit grâce au suivi rapproché quotidien des animaux, l’enrichissement de leur environnement (coton ou sopalin afin qu'ils puissent faire un nid) et le respect de l’aspect social du groupe (pas d’isolement ni de changement de cage). De plus une période d'acclimatation d'une semaine sera respectée avant l'expérimentation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé quotidiennement. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. Dans le cas du modèle de portage, les souris ne présentent aucun symptôme. Un animal est euthanasié lorsqu’il présente des difficultés à se mouvoir après une stimulation et que l’expérimentateur juge que l’animal décèdera dans la ½ journée suivante c’est-à-dire avant la prochaine visite de l’expérimentateur afin d’éviter toute souffrance inutile. Ceci est rendu possible grâce à l’expérience acquise par l’équipe depuis plus de 15 ans. Les expérimentateurs « novices » travaillent en binôme tant qu’ils n’ont pas acquis l’expérience nécessaire De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L’apprentissage et la maitrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées. Lorsque la procédure le nécessite les animaux seront anesthésiés à l’isofurane.
Choix des espèces
La souris est particulièrement pertinente pour étudier les infections à Salmonella en choisissant la bonne lignée de souris puisque nous reproduisons ainsi une infection naturelle. Le modèle gastroentérite a été montré dans la littérature comme reproduisant l’infection et la réponse immunitaire au cours d’une gastroentérite chez le veau, où Salmonella est responsable naturellement d’une gastroentérite. L’utilisation de ce modèle murin de « gastroentérite » est justifiée par rapport au modèle bovin par le moindre coût, la moindre lourdeur et la plus grande disponibilité des animaux. Les souris utilisées sont adultes, elles ont entre 8 et 12 semaines et ce, conformément aux modèles établis dans la littérature
Etude de l’inactivation des microARNs cérébraux via les vecteurs viraux adéno-associés à différents temps du dévéloppement
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des femelles gestantes, des souriceaux nouveau-nés et des souris adultes vont être utilisés, chaque groupe correspondant à une voie d'injection différente. 396 souris en tout, 228 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 168 un niveau léger. Les adultes subissent une chirurgie intracérébrale pouvant durer deux heures, les gestantes une injection dans la veine de la queue ou dans le plexus derrière l'œil, les nouveau-nés une injection le jour de leur naissance, avec pour risque documenté le cannibalisme de la mère. Toutes sont tuées deux à six semaines après l'intervention, pour vérifier que trois microARN du cerveau ont bien été inactivés, une validation d'outil qui précède l'étude proprement dite.
Objectifs
Les troubles psychiatriques comme la dépression ou la schizophrénie affectent une partie de plus en plus importante de la population. Bien que leur origine soit multifactorielle, l’environnement joue un rôle majeur dans le déclenchement, le développement et/ou l’évolution de ces troubles. Les mécanismes épigénétiques sont connus pour réguler l'expression génique et moduler l'adaptation à l'environnement. Leur dérégulation est associée à nombreuses maladies psychiatriques et ils seraient des pistes intéressantes pour des nouvelles thérapies. Nous avons déjà montré que le changement de l'environnement social (niveau de soins maternels) a des effets sur le comportement de la souris et peut engendrer aussi une vulnérabilité à la dépression. D'ailleurs, nous avons identifié des voies épigénétiques altérées en fonction des niveaux de soins maternels, notamment des microARNs. Dans ce projet, nous cherchons à valider in vivo l’efficacité des vecteurs viraux AAVs permettant l’inactivation des 3 microARNs précis, miR-218, miR-124 et miR-132. Les vecteurs AAVs seront validés (via des analyses anatomiques, histologiques et moléculaires) dans un premier temps chez la souris adulte via des injections intra-cérébrales. Comme les changements de soins maternels que nous utilisons opérent juste après la naissance, nous voudrions tester deux autres mode d’administration permettant une inactivation perinatale (injections rétro-orbitales ou systémiques chez la femelle gestante) et sur des souriceaux nouveau-nés. Ces différentes procédures chirurgicales seront effectuées une seule fois par animal.
Bénéfices attendus
La validation des outils viraux et les voies d’administration proposées dans ce projet est l'étape préalable pour pouvoir étudier l'implication de miR-218, miR-124 et miR-132 dans les maladies psychiatriques.
Procédures
Les animaux adultes seront soumis à des procedures chirurgicales (injections intracérébrales), 1 fois par animal et avec une durée max de 2h. Des femelles gestantes subiront des injections dans la veine caudale ou dans le plexus rétro-orbitale (1 seule fois, durée max 5 min). Des souriceaux seront injectés à la naissance (1 seule fois, durée max 5 min)
Impact sur les animaux
Tous les animaux subiront une seule procédure chirurgicale suivi d’une mise à mort 2-6 semaines plus tard. Les nuisances potentielles sont liées a la procédure (i. e. infections) ou à la récuperation de la chirurgie (i.e. perte de poids ou retard de la croissance). Les injections chez le nouveau-né peuvent aussi induire du cannibalisme de la mère.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour les analyses moléculaires et anatomiques requis pour la validation de l'inactivation des miR-218, miR-124 et miR-132
Remplacement
Le but de cette étude est de déterminer l’efficacité d’inactivation des outils viraux dans le cerveau . Comme le but ultime est d'utiliser ces approches pour comprendre l'implication des microARNs précis sur les comportements dits, dépressifs, cet objectif ne peut être atteint qu’en étudiant l’animal dans son ensemble et il ne peut être réalisé sur le sujet humain. Nous avons choisi la souris, étant une espèce suffisamment proche de l'Homme et dans laquelle les comportements dits dépressifs peuvent être induits de façon expérimentale. Par contre, nous avons utilisé des données obtenues chez l'Homme et chez la souris pour determiner quels etaient les microRNA cibles qui présentareaient plus d'intéret pour la recherche chez le patient.
Réduction
Nous allons limiter au maximum le nombre d’individus à utiliser pour ce projet. Le fait d’utiliser des vecteurs viraux évitera la génération de nouvelles souches transgéniques présentant des anomalies/handicaps. Nos données préalables ainsi que des approches statistiques largement utilisées par la communauté scientifique ont permis un calcul approximatif de la taille optimale des cohortes pour ces expériences. Cela permet de limiter le nombre d’animaux sans diminuer pour autant la puissance de nos analyses. De plus, l'ensemble des échantillons supplémentaires (protéines, ARN, coupes) seront mis à disposition pour d’autres membres de l’équipe ou du laboratoire travaillant sur des thématiques similaires afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans l'ensemble de l'institut.
Raffinement
L’hébergement se fait dans un environnent (température, luminosité et hygrométrie contrôlées) et matériel (cage, portoirs et biberons) adaptés à la souris. Un enrichissement de régulier de leur milieu (avec des quarts de coton, des bouts bois …) est prévu pour les animaux tout au long de leur vie. Lors de la chirurgie, les animaux sont anesthésiés et ils reçoivent une injection de lidocaine au lieu de l'incision et une analgésie sous-cutanée (buprénorphine : 0.05 mg/kg) 30 min avant et 24h après la procédure. Dans les injections sur les nouveau-nés, le plus gros problème rencontré dans nos procédures est le cannibalisme maternel. Afin de diminuer au maximum ce phénomène, nous mettons en place plusieurs actions : 1- seules les femelles qui ne présentent pas de signes de stress sont utilisées 2- nous favorisons l'utilisation de femelles non primipares 3- une grande quantité de matériel de nidification est fournie 4- les femelles ne sont manipulées qu'avec des tunnels 5- deux à trois fois par semaine pendant la gestation, nous fournissons quelques friandises ou du gel nourrissant aux femelles afin qu'elles associent notre intervention à quelque chose de positif. Les procédures 1 et 2 seront réalisées sur des portées de souriceaux. Des points limites adaptés (notamment la croissance pondérale, marqueur de bonne santé chez les souriceux apuisqu'elle indique que l'individu arrive à se nourrir) a été mis en place. Ainsi tout individu qui présente une croissance pondérale altérée est, selon le degré, suivi de plus près (point limite) ou euthanasié (point d'arrêt).
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris, étant une espèce suffisamment proche de l'Homme et dans laquelle les comportements dits dépressifs peuvent être induits de façon expérimentale. Nous allons utiliser des femelles gestantes, des nouveau-nés et des souris adultes car, dans ce projet, nous cherchons à évaluer les effets de nos manipulations à différents stades du développement cérébrale
Immunothérapies antitumorales renforcées par un complexe organométallique
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Le volume de la tumeur greffée sur le flanc est plafonné, au-delà l'animal est tué. 325 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tumeurs et leurs ganglions, 300 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 25 un niveau léger. Chacune reçoit une injection de cellules cancéreuses sous la peau du flanc, puis des injections tous les trois jours pendant vingt et un jours, avec mesure de la tumeur au pied à coulisse quatre fois par semaine. Ce travail s'inscrit dans un projet de maturation financé par un service de valorisation, l'enjeu étant de positionner un composé organométallique comme renfort d'immunothérapies anticancéreuses.
Objectifs
Le nombre de nouveaux cas de cancer a augmenté ces dernières années en France métropolitaine avec plus de 430.000 (en 2023) tous cancers confondus. Malgré les progrès dans leur diagnostic et leur traitement, certains ont encore un pronostic défavorable. Le système immunitaire joue un rôle primordial pour éliminer les cellules cancéreuses. Cependant, l’environnement au sein de la tumeur permet aux cellules cancéreuses d’échapper aux cellules du système immunitaire. L’essor de nouvelles thérapies ciblant le système immunitaire a montré des résultats prometteurs. Toutefois, seulement 20-30% des patients répondent efficacement à ces traitements. C’est pourquoi de nouvelles stratégies sont en cours de développement, pour améliorer la prise en charge des patients non répondeurs. Dans ce contexte, nos travaux actuels portent sur l'étude d'un nouveau composé pouvant altérer les cellules cancéreuses et favoriser la réponse immunitaire. C'est pourquoi, l’objectif de ce projet est de développer des nouvelles associations de traitements couplant les propriétés de notre composé à l’utilisation d’immunothérapies afin de développer nouvelles stratégies thérapeutiques dans le domaine de la cancérologie.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un projet maturation soutenu et financé par le service de valorisation afin de pouvoir positionner un nouveau composé comme agent thérapeutique pouvant potentialiser l’efficacité de traitements anticancéreux par immunothérapie afin d'améliorer la réponse immunitaire antitumorale.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection unique de cellules cancéreuses au niveau du flanc pour développer le modèle (durée < 5 minutes par souris). Une fois que les tumeurs auront commencées à se développer, les souris recevront des injections tous les 3 jours pour administrer les traitements d’intérêt (notre composé et/ou immunothérapies), sur une durée de 21 jours à compter de l'injection de cellules cancéreuses. Au cours des expériences, la croissance de la tumeur sera suivie 4 fois par semaine. Le temps de chaque intervention, injection des cellules cancéreuses, injections des traitements et mesure de la taille des tumeurs se fera en moins de 5 minutes par souris et par manipulation.
Impact sur les animaux
Les injections, ainsi que la contention des souris nécessaire pour réaliser ces injections, nécessaire pour l’ensemble de la procédure peuvent entrainer un état de stress chez ces dernières. C’est pourquoi nous avons choisi d’effectuer ces gestes sur souris anesthésiées. Un suivi quotidien des animaux (évaluation du comportement, alimentation, hydratation) et l’évaluation 4 fois par semaine de la courbe de poids ainsi que de la croissance tumorale (à l’aide d’un pied à coulisse sur animal vigile) provoquera peu de nuisance/stress et permettra la surveillance d’apparition des points limites définis Le développement de la tumeur sur le flanc (qui sera limité à un volume maximal) pourrait provoquer une gêne légère de la souris – c’est pourquoi déplacements et activité seront particulièrement observés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les tumeurs et les ganglions lymphatiques Application de la règle des «trois R»
Remplacement
Ce projet est basé sur des études préliminaires réalisées sur cellules en culture montrant un effet fort du composé testé à la fois sur les cellules cancéreuses et les cellules immunitaires. Toutefois, ces études sur cellules ne permettent pas de prendre en considération les échanges qu’il peut y avoir entre elles, ni l’impact des tissus autour de la tumeur sur la réponse au traitement anticancéreux. A ce jour, seules les expériences in vivo permettent de prendre en considération l’ensemble de ces paramètres.
Réduction
L'effectif du nombre d'animaux requis par groupe expérimental a été calculé statistiquement en nous basant sur des études similaires menées au sein de notre laboratoire.
Raffinement
Les expérimentations débuteront après une période d’acclimatation de 7 jours aux conditions de l’animalerie. Les souris femelles seront hébergées par 5 en cages filtrées, à une température de 22±2°C et une humidité relative de 50±20%. Les souris seront soumises à un cycle lumière-obscurité inversé de 12h. Elles auront accès à volonté à eau et nourriture et disposeront d’un enrichissement (frisures de papier graft pour faire des nids, bûchettes de peuplier à ronger, tunnel ou dôme, pour se cacher et grimper). Les injections seront effectuées sur animaux anesthésiés. Des critères d'arrêt anticipé de l'expérimentation en cas de survenue d'une complication ont été identifiés.
Choix des espèces
Les deux modèles de souris sélectionnés possèdent un système immunitaire efficace et sont les modèles animaux le plus appropriés pour pouvoir induire un développement d’une tumeur et étudier l'impact de traitement anticancéreux. souris adultes, dont le système immunitaire est mature.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Infestés volontairement par deux espèces de nématodes gastro-intestinaux, 40 agneaux subissent des prises de sang à la jugulaire deux fois par semaine et des prélèvements du contenu du rumen par une sonde enfoncée dans l'œsophage. Ils relèvent d'un niveau de souffrance modéré et passent des périodes en case individuelle sur caillebotis, parfois enfermés dans une chambre respiratoire pour mesurer le méthane qu'ils émettent. Le porteur écrit que l'infestation parasitaire n'entraîne aucune douleur ni nuisance, tout en fixant comme points limites une anémie sous 18 % d'hématocrite, une perte de 15 % du poids en trois semaines et l'apparition de diarrhées. Tous sont abattus à la fin de l'essai pour compter les parasites de leur tube digestif et analyser leur muscle, la qualité de la viande figurant parmi les résultats attendus d'un aliment destiné à la commercialisation.
Objectifs
L’objectif de cette étude est de tester un prototype d’aliment contenant un sous-produit de l’agro-industrie chez des agneaux en croissance, parasités et non parasités par des nématodes gastro-intestinaux (NGIs). Des mesures de quantités ingérées, de digestibilité, d’émission de méthane entérique, de bilan azoté, de performance, de parasitisme et de qualité de la viande seront réalisées in vivo ou après abattage. Une de nos hypothèses de travail est que le parasitisme augmente indirectement la production de méthane chez les ruminants. Nous chercherons donc à savoir dans quelle mesure le parasitisme par les NGIs augmente les émissions de méthane tout en affectant négativement la santé digestive des animaux. La seconde hypothèse est que la présence de métabolites secondaires bioactifs en concentration suffisante dans la ration contribue à moduler les fermentations ruminales, réduire l’émission de méthane et perturber la biologie des NGIs. Dans ce cadre, nous testerons un prototype d’aliment incluant un sous-produit de l’industrie de la vigne (issus de l’économie circulaire et locale) riche en composés polyphénoliques et préalablement sélectionné pour sa capacité à réduire à la fois les émissions de méthane et le parasitisme (études in vitro réalisées au préalable afin de choisir le meilleur sous-produit parmi 16 d’entre eux, sous-produits ayant un effet à la fois sur les larves et œufs de 2 espèces de NGIs et la production de méthane). Dans notre étude, des analyses de composition du microbiote ruminal et de la qualité de la viande seront également réalisées pour accéder aux mécanismes d’action et aux performances des animaux, respectivement. Tous les ingrédients présents dans le prototype d’aliment testé ont une autorisation de mise sur le marché en tant que complément alimentaire.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus sont dans un premier temps une réduction des émissions de méthane et une perturbation de la biologie des NGIs chez les animaux alimentés avec le prototype d’aliment riche en polyphénols. Ce prototype est formulé pour garantir une bonne productivité des agneaux (gain de poids des animaux), et une bonne qualité de la viande (à travers le profil en acides gras du muscle notamment). De par la présence du prototype riche en polyphénols, il est aussi attendu des changements dans la composition du microbiote ruminal entre les animaux parasités et non parasités et ceux alimentés avec ou sans le prototype. L’aspect innovant de ce projet est lié à la valorisation de sous-produits de l’agro-industrie dans l’alimentation animale, mais aussi à la compréhension du lien entre la production de méthane, le parasitisme et le microbiote ruminal. A moyen terme, cette expérimentation a pour but de mettre sur le marché un aliment qui pourrait conduire à prévenir le parasitisme, réduire l’utilisation des anthelminthiques de synthèse, améliorer la santé des animaux, contribuer à réduire les émissions de gaz à effet de serre, en promouvant l’économie circulaire et locale à travers la valorisation de sous-produits non utilisés pour l’alimentation humaine. D’un point de vue sanitaire, les anthelminthiques de synthèse sont les médicaments couramment utilisés en médecine vétérinaire pour gérer les infestations parasitaires. Cependant, des métabolites ou des molécules non dégradées se retrouvent dans les produits dédiés à la consommation humaine (viande, lait, fromage), et peuvent impacter indirectement la santé humaine. Pour certaines molécules, des conséquences environnementales ont aussi été signalées. Des temps d’attente sont donc à respecter avant de commercialiser et consommer ces produits animaux. De plus, ces dernières années, une multiplication des résistances aux anthelminthiques de synthèse est observée dans les élevages ovins et caprins. Pour pallier à ces problèmes, l’exploitation dans la ration de métabolites secondaires bioactifs comme les polyphénols (flavonoïdes, tanins) naturellement présents dans certaines ressources végétales est une méthode alternative prometteuse à l’emploi des traitements chimiques. Ces métabolites sont en effet connus pour impacter et affecter les parasites et donc à terme améliorer la santé des animaux.
Procédures
Les prises de sang se feront deux fois par semaine après trois semaines de la phase 3 et pendant la phase 4, à hauteur de 5mL. Le contenu ruminale par sonde oesophagienne sera prélevé entre chaque phase, entre 5 et 10mL. Les fèces seront collectées, à une quantité minimale de 3 grammes pour les analyses de parasitologies.
Impact sur les animaux
La procédure de mesure d'ingestion et de digestibilité implique une période de mesures individuelles en dispositif de case individuelle sur caillebotis en bois (qui sera soit placée dans la chambre respiratoire, soit placée au sol). Ce dispositif individuel peut entrainer du stress aux animaux lié à leur isolement partiel malgré une installation dans une même pièce. Pour pallier à ce stress, des phases d’habituation au dispositif seront mises en place. De plus, la stalle permet aux agneaux de se lever et de se coucher sans entrave et leur disposition permet aux animaux de se voir, se sentir et de s’entendre. Le contenu ruminal sera prélevé par sonde œsophagienne. Ce prélèvement peut engendrer du stress physique, une douleur ponctuelle et une diminution de l’ingestion L’ensemble de ces manipulations dure 1 à 3 minutes par animal et sera réalisée par du personnel compétent. Les prises de sang seront réalisées à la veine jugulaire. Même si les prélèvements se feront à une fréquence faible (deux fois par semaine) par du personnel expérimenté, il est possible de provoquer des hématomes, induisant une douleur légère. L’acte d’infestation parasitaire n’entraine aucune douleur ou nuisances à l’animal. Les 2 espèces de NGIs utilisées dans le protocole sont naturellement présentes dans les élevages et pourraient avoir des conséquences pathophysiologiques différentes. L’espèce de l’abomasum (Haemonchus contortus) est hématophage et peut provoquer avant tout une anémie ; l’espèce intestinale (Trichostrongylus colubriformis) peut induire des lésions des muqueuses et des perturbations de la physiologie digestive (mal digestion/mal absorption) pouvant conduire à des diarrhées. Une perte d’appétit et une perte de poids dues à la présence de ces parasites peuvent se traduire par des changements de comportements et aussi par des signes cliniques (anémie, diarrhée).
Devenir
Tous les animaux seront abattus à l'issue de la procédure afin de permettre des prélèvements de contenus ruminaux et intestinaux (pour quantification et étude des parasites présents et des différents stades associés), ainsi que des prélèvements de tissus musculaires.
Remplacement
Plusieurs essais in vitro ont été réalisés en amont de cet essai pour choisir le sous-produit à tester in vivo (essais de fermentation ruminale in vitro pour évaluer le potentiel de réduction des émissions de CH4 et essai in vitro pour évaluer le potentiel anthelmintique sur 2 espèces de parasites). L’étude in vivo est indispensable pour étudier le lien entre le parasitisme et les émissions de méthane (aucun essai in vitro ne regroupe les deux aspects) ainsi que les effets sur la croissance des agneaux et sur le microbiote ruminal. La mesure in vivo de digestibilité est la méthode de référence pour quantifier la digestibilité des fourrages et des rations. Des méthodes alternatives (in vitro) existent pour classer différents aliments en fonction de leur digestibilité mais sont moins fiables. La mesure de digestibilité in vivo est incontournable pour une caractérisation fine et l'établissement utilisateur a obtenu l'accréditation du comité d’éthique régional. De nombreuses mesures ne sont possibles qu’en expérimentation in vivo : bilan azoté (analyses sur les urines, les fèces et le sang), mesures de parasitologie (évaluation individuelle indirecte de la charge parasitaire par analyses coproscopiques sur les fèces et suivi de l’anémie par prise de sang), étude des performances zootechniques (gain de poids) et de la qualité de la viande sur la carcasse. De par son caractère générique, les résultats qu’il permet d’obtenir sont le plus souvent extrapolables aux autres catégories de ruminants (bovins, caprins, brebis et agneaux).
Réduction
Le nombre d’animaux a été optimisé et réduit au minimum pour : - S’assurer d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour des analyses statistiques fiables des paramètres de parasitologie (mesure de coproscopie individuelle) et de pathophysiologie (hématocrite) sur les animaux infestés - Tenir compte de la variabilité individuelle observée dans la composition du microbiote digestif - Assurer des répétitions pour obtenir la puissance statistique nécessaire pour arriver à faire le lien entre infestation parasitaire et émission de méthane - Etudier et différencier les effets avec et sans le prototype d’aliment riche en polyphénols, mais aussi avec et sans infestation parasitaire. Comme la variabilité entre animaux est plus importante pour l'ingestibilité que pour la digestibilité (la variabilité entre animaux de l’ingestibilité est de l’ordre de 9 % alors que celui de la digestibilité est de l’ordre de 3 %), il est recommandé d’utiliser un minimum de 8 animaux. Ce nombre est aussi le minimum d’individus requis pour interpréter les données liées aux infestations par les NGIs. Des conséquences cliniques trop sévères associées aux parasites pouvant entrainer le retrait de l’expérimentation d’un animal, 2 animaux parasités par période expérimentale seront gardés en réserve, alimentés avec et sans le prototype d’aliment riche en polyphénols. 4 comparaisons seront réalisées d’un point de vue statistique. Une première entre les animaux parasités et les animaux non-parasités nourris sans le prototype, une seconde identique mais nourris avec le prototype, une troisième entre les animaux parasités, avec et sans le prototype, et une quatrième entre les animaux non-parasités, avec et sans le prototype. Des analyses de comparaison de moyennes et de variances sont prévues.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un bâtiment d’expérimentation agréé. La taille des stalles de digestibilité est adaptée au gabarit de l’animal, permet aux agneaux de se lever et de se coucher sans entrave. Les animaux peuvent se voir, s’entendre, se sentir et interagir. Ils auront eau et alimentation à volonté, et une pierre à sel afin d'éviter l'apparition de maladies métaboliques ou de carences. Les fèces et les urines seront récoltés tous les jours dans les bacs situés sous le caillebotis, pesés, et échantillonnés. L’état de santé des agneaux sera évalué quotidiennement par un animalier habilité. Tout changement de comportement (abattement, baisse d’appétit), comportement anormal, ou signe subclinique (ex diarrhée) considéré comme points limites sera signalé et pris en charge, consigné dans le cahier d’expérimentation. Des évaluations comportementales et des mesures sanguines et fécales permettront de surveiller la santé globale de l’animal et d’objectiver les conséquences. Les mesures sanguines permettront de contrôler toute anémie importante (hématocrite
Choix des espèces
L’étude vise à tester un prototype d’aliment pour ruminant, qui réduirait le parasitisme et les émissions de méthane. Notre étude a pour objectif de faire le lien entre ces 2 problématiques via un essai in vivo, car aucune expérimentation in vitro n’est possible pour étudier ces 2 paramètres ensemble. D’autres mesures seront réalisées telles que l’ingestion, le gain de poids vif, le bilan azoté et la qualité de la viande : ces mesures sont impossibles à obtenir sans l’utilisation d’animaux. Les ovins sont des petits ruminants très sensibles au parasitisme, c’est pourquoi ils seront notre espèce dans cette étude. Le modèle de l’agneau en croissance permet de se placer au plus près des conditions d’élevage et de mesurer les impacts sur la productivité des animaux à travers leur gain de poids. Agneaux en croissance (entre 3 et 4 mois en début d’essai et 6 à 7 mois en fin de l’essai en fonction des périodes). Ce stade est favorable pour étudier les effets d’un prototype d’aliment sur la performance animale en vue de la commercialisation des carcasses.
Impact de l’hyperglycémie sur la réparation cérébrale chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour mesurer comment l'hyperglycémie freine la réparation du cerveau, 280 poissons zèbres adultes vont être utilisés, tous tués à l'issue pour analyse de leurs tissus. 140 relèvent de procédures menées sous anesthésie sans réveil, 140 d'un niveau de souffrance léger. Une partie des animaux passe quatorze jours immergée dans une eau sucrée à 20 grammes de glucose par litre, renouvelée deux fois par jour, et 140 subissent une lésion du cerveau sous anesthésie, l'acte durant moins de quinze secondes. Le porteur n'attend aucune nuisance notable tout en reconnaissant que la littérature ne rapporte pas cette information, et fixe comme points limites des nages en cercle, une flottabilité anormale, une couleur anormale ou l'incapacité de se nourrir.
Objectifs
Le diabète est une maladie caractérisée par une hyperglycémie chronique (glycémie à jeun supérieure à 1,26g/L). Cette pathologie constitue un enjeu majeur de Santé Publique à l’échelle mondiale car sa prévalence augmente depuis plusieurs décennies. De façon intéressante, il a été démontré que le diabète/hyperglycémie était associé à une perturbation de l’homéostasie cérébrale (trouble de la mémoire, perte de substance grise) favorisant les accidents vasculaires cérébraux et aggravant leurs conséquences neurologiques. Ainsi, la condition d’hyperglycémie semble être délétère pour le fonctionnement du cerveau. Plus largement, lors des dommages cérébraux, l'hyperglycémie/diabète a un impact négatif sur la taille des lésions et la récupération fonctionnelles (élocution, locomotion, sensibilité, ...). Cependant, les impacts réels de l'hyperglycémie sur les mécanismes propres à la réparation cérébrale ne sont pas bien connus. Les objectifs du projet sont de comprendre l'impact de l'hyperglycémie sur les mécanismes de réparation cérébrale en utilisant le poisson zèbre. Cet animal est un modèle reconnu de plasticité et de réparation cérébrales. C'est aussi un modèle permettant de mimer des situations d'hyperglycémies chroniques. Dans ce contexte, nos sous-objectifs sont de déterminer l'impact de l'hyperglycémie sur la mort cellulaire à la suite d'une lésion cérébrale, (2) sur l'angiogenèse régénérative (création de nouveaux vaisseaux), (3) sur le recrutement de la microglie (cellule immunitaire du cerveau) au site de la lésion, et enfin (4) la neurogenèse régénérative permettant de générer de nouveaux neurones pour remplacer ceux qui sont morts à la suite de la lésion.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu et affectés par l'hyperglycémie lors d'un dommage cérébral. Il pourrait permettre d'identifier des problèmes de réparation induite par l'hyperglycémie (ex: suractivation microgliale, problème d'activation des cellules souches). Ainsi, cette meilleure compréhension du fonctionnement régénératif en condition hyperglycémique pourrait permettre de mettre en œuvre des thérapies favorisant ou limitant ces processus (ex: limiter la mort cellulaire, limiter la neuroinflammation, favoriser la neurogenèse). A terme, ce projet a pour but de favoriser la réparation cérébrale dans des conditions qui lui sont délétères (ex: hyperglycémie) afin de limiter les conséquences de dommages cérébraux.
Procédures
La moitié des animaux (soit 70) sera plongée dans de l'eau contenant du D-glucose (20g/L) afin de mettre en place une hyperglycémie chronique chez ces derniers. Ce traitement est effectuée pendant une période de 14 jours. La solution eau/D-glucose dans laquelle sont immergés les animaux est renouvellée 2 fois par jour (une fois le matin et une fois le soir). L'eau des animaux contrôles est également changée deux fois par jour pour respecter les mêmes contraintes expérimentales (cela se fera donc sur les 70 animaux contrôles). Les animaux seront soumis à des lésions cérébrales (140 animaux) avant la fin de l'expérimentation pour étude de la mort cellulaire induite par la lésion cérébrale (1 jour après lésion, soit lésion à J13), de l’angiogenèse et réactivité des microglies (2 et 3 jours après lésion, soit lésion à J11 et J12) et neurogenèse (3 jours après lésion, soit lésion à J11). La durée de la lésion est de moins de 15 secondes une fois l'animal anesthésié. La durée totale anesthésie, lésion et réveil est inférieure à 5 minutes.
Impact sur les animaux
Des expériences précédentes sur les modèles de lésions chez le poisson zèbre n'ont pas révélé de nuisances notables (ex: surmortalité, troubles du comportement, stress, douleur). Il en est de même sur les modèles d'hyperglycémie chez le poisson zèbre. Aussi, même si des lésions cérébrales chez le poisson zèbre hyperglycémique pourraient impacter certains processus régénératifs, nous n'attendons pas de nuisances et/ou effets indésirables par rapport aux données précédentes de la littérature pour lesquelles ces informations importantes n’ont pas été rapportées, ni même observées au laboratoire.
Devenir
A la fin de l'expérimentation, tous les animaux seront euthanasiés pour analyse tissulaire par immunohistochimie.
Remplacement
La complexité des processus physiologiques se déroulant lors de la réparation cérébrale ne sont pas modélisables par des techniques in vitro. Les processus de réparation impliquent plusieurs types cellulaires: microglies, oligodendrocytes, macrophages, cellules endothéliales, neurones, et cellules souches neurales. De plus, plusieurs processus physiologiques se mettent en place lors de la réparation : hypoxie, inflammation, stress oxydatif, sécrétion de facteurs trophiques et neurotrophiques ainsi qu'endothéliaux. A l'heure actuelle, nous ne pouvons réaliser des procédures in vitro permettant d'intégrer l'ensemble de ces acteurs cellulaires et de signalisation.
Réduction
Chaque expérimentation sera scindée dans la mesure du possible en deux expériences indépendantes. Cela permettra de ne pas utiliser l'ensemble des animaux si nous observons que les résultats obtenus sont suffisamment étayés. De plus, si jamais une souffrance ou une mortalité inattendue venait à apparaitre, cela éviterait de relancer une expérimentation avec le deuxième groupe d'animaux. De part notre expérience et les données de la littérature, de tels effectifs permettent de fournir des données statistiques solides. Nous réaliserons des tests statistiques (t-test) pour déterminer la significativité de nos résultats.
Raffinement
Les animaux seront observés plusieurs fois par jour dans leur milieu contrôle et/ou hyperglycémique. Après lésion, ils seront observés de façon intensive dans les premières 30 minutes, puis une fois toutes les heures. Tout signe de souffrance ou de comportement anormal sera rapporté au vétérinaire référent afin de prendre les mesures adéquates. Un espace suffisant limitant au maximum les contraintes subies et permettant un comportement normal sera assuré. Les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale par une personne qualifiée. Différents points limites spécifiques tels qu'un comportement anormal (mouvements circulaires), nutrition anormale (voire incapacité à se nourrir), flottabilité anormale, couleur anormale seront analysés. Si un de ces paramètres ou points limites est atteint, nous en ferons part au vétérinaire pour arrêt de l’expérimentation et par conséquent euthanasie pour limiter les souffrances de l’animal (sédation profonde puis euthanasie). Les données bilbiographiques et notre expérience ne montre pas de signes de souffrance, stress, modifications majeures du comportement alimentaire et locomoteur à la suite de la balnéation dans le glucose ou de la lésion. Nous resterons néanmoins vigilants sur l'ensemble des points limites.
Choix des espèces
Le poisson zèbre partage de 70 à 85 % de gènes en commun avec l’espèce humaine, impliqués dans les processus physiologiques et pathophysiologiques, respectivement. La situation diabétique (d'hyperglycémie) peut être mimée en mettant les animaux dans de l'eau supplémentée en D-glucose. De plus, c’est également un modèle de réparation cérébrale reconnu avec des processus de réparation similaires à ceux des mammifères. Animaux adultes entre 3 mois et 18 mois. A ces stades, les activités neurogéniques sont globalement similaires.
Evaluation thérapeutique de l’électrostimulation du nerf splénique sur des modèles inflammatoires expérimentaux de la maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
528 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. 480 reçoivent une endotoxine bactérienne quatre jours de suite pour déclencher une neuroinflammation et détruire une partie de leurs neurones dopaminergiques, 288 se font implanter une électrode sur le nerf de la rate avec des connecteurs fixés au crâne, et 384 traversent une piste les pattes encrées pour mesurer leur longueur de foulée. Reliée trente-six jours par un fil à un stimulateur électrique, chaque souris opérée est séparée de ses congénères, et le bénéfice annoncé pour les personnes atteintes de Parkinson reste une piste thérapeutique à explorer. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'un tel travail ne peut être mené que sur des "organismes entiers" préservant les interactions entre système nerveux et système immunitaire.
Objectifs
L'objectif de ce projet de recherche est d'évaluer sur des modèles murins l'effet thérapeutique de l'électrostimulation du nerf splénique de la maladie de Parkinson. Ce modèle de Parkinson est caractérisé par une réponse pathogénique neuroinflammatoire médiée par le système immunitaire. Il a pour finalité éventuelle d'appliquer ce traitement par électrostimulation en clinique. La maladie de Parkinson est une maladie du cerveau qui entraîne de la neuroinflammation, des problèmes moteurs, des troubles de la santé mentale et du sommeil, ainsi que des douleurs et d’autres problèmes de santé. L'efficacité des traitements actuels est malheureusement inconstante, et épuisable obligeant à changer souvent de molécule. Il n’y a pas de traitements curatifs. Une thérapie basée sur l’électrostimulation des nerfs périphériques est une approche thérapeutique innovante et pourrait apporter une nouvelle alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements actuels. Nous avons ainsi récemment démontré que la stimulation du nerf de la rate (splénique) réduisait significativement la neuroinflammation dans un modèle murin de la sclérose en plaque. On sait que la stimulation de certains nerfs périphériques agit également directement sur les cellules du système immunitaire en inhibant leur activité inflammatoire. Toutefois, l’impact d’une stimulation chronique du nerf splénique sur l’évolution de la maladie de Parkinson n’a jamais été évalué. Le projet consiste à : 1- implanter chez une souris une électrode de stimulation au niveau du nerf de la rate (nerf splénique); 2- puis induire la maladie de Parkinson (modèle par injection intra-péritonéale d’une endotoxine bactérienne ; 3- puis réaliser ou non des sessions d'électrostimulation du nerf de la rate. La comparaison des scores cliniques entre les animaux ayant subi une électrostimulation du nerf splénique et ceux n'ayant pas subit cette électrostimulation nous permettra de déterminer l'effet de l'électrostimulation sur le développement de la maladie de Parkinson.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer l'effet thérapeutique de l'électrostimulation du nerf splénique dans un modèle murin de la maladie de Parkinson. Une thérapie basée sur l’électrostimulation des nerfs périphériques est une approche thérapeutique innovante, présentant une toxicité potentielle moindre comparée aux molécules de type stéroïdien par exemple. Déterminer si l’électrostimulation inhibe les principales cellules immunitaires pathogéniques impliquées dans la sclérose en plaque pourrait conforter l’utilisation de cette nouvelle alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements actuels.
Procédures
Induction de la maladie de Parkinson : 480 animaux Les animaux subiront une anesthésie générale gazeuse et recevront une injection d'endotoxine bactérienne tous les jours pendant 4 jours consécutifs afin d’activer le système immunitaire (durée de l'intervention: 10 minutes). Implantation électrode : 288 animaux. Les animaux recevront un analgésique 20 minutes avant l’opération puis subiront une anesthésie générale pendant 20 minutes. Une électrode sera implantée au niveau du nerf splénique et les connecteurs seront fixés au niveau du crâne. La durée prévue de l’opération est de 20 minutes. Le lendemain de l'opération, les animaux opérés recevront un traitement anti-inflammatoire maintenu pendant les 3 jours suivants. Mesure de la longueur de foulé : 384 animaux. Les longueurs de foulée sont mesurées sur une piste plein champ contenant une bande de papier et disposée pour déboucher sur de la nourriture. Les pattes antérieures et postérieures de la souris sont humidifiées au préalable avec de l'encre avant d'être relâchées pour traverser la piste éclairée. Pas de prélèvement sur animaux vigiles, pas de prélèvement sanguin.
Impact sur les animaux
1- Nuisances associés à l’induction de la maladie de Parkinson par injection d'endotoxine bactérienne : Dans ce modèle, la maladie de Parkinson est induite par injections d'une endotoxine bactérienne. Ces injections provoquent chez l’animal une réaction immunitaire induisant de la neuroinflammation et à terme la perte partielle de neurones dopaminergiques dès le 5ième jour. A partir du 19ème jour après la première injection , un déficit moteur modéré apparaît qui se traduit par une diminution maximale de la longueur de foulé de l’ordre de 8%. Le pic de la pathologie est atteint aux alentours du jour 19 post induction puis les symptômes associés à la maladie vont décroitre progressivement jusqu’à la fin de l’expérimentation (jours 36). 2- Nuisances associées à l’électrostimulation : Il n’y a pas de douleurs associées à l’électrostimulation du nerf splénique car ce nerf n’est pas constitué de fibres nerveuses sensitives. La procédure d'implantation d'une électrode sur le nerf de la rate et l'électrostimulation chronique de ce nerf est réalisée de manière récurrente au sein de notre équipe. Une douleur d’une durée estimée à 48 heures est par contre engendrée par la procédure chirurgicale permettant l’implantation de l’électrode de stimulation sur le nerf splenique du fait de l’incision de la peau et du péritoine. Lors de l'électrostimulation les animaux seront séparés les uns des autres car la stimulation électrique requiert une connexion à un stimulateur électrique externe par un fil incompatible avec une stabulation en groupe pendant 36 jours (risques de rognage de fils).
Devenir
Afin de limiter au maximum les souffrances potentielles associées à l'évolution de la pathologie, l'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue de chaque procédure
Remplacement
Ce type d’étude ne peut être envisagés que sur des organismes entiers préservant l’intégrité des interactions entre les systèmes immunitaires et nerveux dans un contexte pathologique et non pathologique.
Réduction
Les estimations du nombre d'animaux par condition expérimentale a été determiné par une approche statistique afin de calculer au plus juste le nombre d’animaux nécessaire au bon déroulé de l’expérimentation et donc de limiter le nombre d’animaux
Raffinement
Des mesures de raffinements seront mises en place afin de limiter au maximum les contraintes imposées aux animaux dans le contexte de cette étude : les interventions chirurgicales seront menées suivant un protocole d’anesthésie et d’analgésie en prenant soin de maintenir la température corporelle des animaux en les plaçant sur une couverture chauffante. Le suivi postopératoire inclura un traitement antalgique et une grille d’observation préétablie prévoyant des mesures correctives et la mise en oeuvre le cas échéant de points limites précoces et adaptés.
Choix des espèces
Le modèle souris a été choisi car c’est l’espèce animale de référence en Immunologie chez laquelle l’induction de la maladie de Parkinson par injection d'une endotoxine bactérienne a été bien caractérisée. Le projet portera sur des souris mâles C57Bl/6 âgées de 12 semaines permettant une chirurgie aisée (poids entre 20 et 25 gr).
Evaluation in vivo de membranes de régénération osseuse dans les pertes de substances critiques des membres
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
370 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacun subissant soit quatre membranes artificielles implantées sous la peau du dos, soit une perte de substance créée dans le fémur et fixée par une plaque vissée. Trente rats pour la première phase, cent dix pour la deuxième, deux cent trente pour la troisième. Après l'opération, ils sont placés seuls en cage jusqu'à sept jours, le temps que la douleur et la boiterie s'atténuent, et le porteur prévoit une hyperthermie possible par infection, une perte de poids et des anomalies de cicatrisation pendant une quinzaine de jours. Les bénéfices décrits concernent des patients humains, une seule chirurgie au lieu de deux et un retour plus rapide au travail, quand l'atteinte porte, elle, sur des fémurs de rats ouverts puis prélevés.
Objectifs
La gestion des pertes de substances osseuses critiques (supérieur à 5 cm) est une préoccupation quasi quotidienne en chirurgie orthopédique et traumatologique. Elle peut être prise en charge par la technique de la « membrane induite ». Cette technique consiste à placer une entretoise en ciment (PMMA ou polymethylmetacrylate) dans la zone de perte de substance osseuse. Une réaction autour du ciment permet la formation d’une membrane (en 2 à 3 mois environ) qui servira de réceptacle à une autogreffe osseuse prélevée sur le patient. Malgré les avancées permises par cette technique, il s’agit d’une procédure nécessitant le développement de cette membrane dans un délai assez long, requérant donc 2 interventions, retardant tout autant la récupération de l’autonomie du patient. De plus, la qualité de la membrane induite par l’organisme reste variable et dépendante du patient (âge, fumeur, comorbidités…), elle est hélas parfois quasi inexistante, friable et fragile, limitant les chances de succès et entraînant donc d’autres procédures chirurgicales plus agressives. L’immobilisation du patient et la mise en décharge plusieurs semaines présente des conséquences physiques lourdes à savoir : Amyotrophie, enraidissement articulaire mais aussi des conséquences socio-économiques avec une hospitalisation à deux reprises, souvent supérieures à 48-72h et un retard au retour aux activités personnelles et professionnelles (coût social de la perte d’activité). Ainsi, l’objectif de ce projet est d’être dans la mesure d’évaluer in vivo de membranes artificielles synthétiques, implantables, autorisant une consolidation osseuse en une chirurgie tout en ayant une maniabilité compatible avec le terrain chirurgical orthopédique et traumatologique. Ces membranes artificielles auront pour rôle d’être un soutien à la formation de la membrane induite naturellement par le corps mais également de servir de soutien à la greffe osseuse qui serait réalisée en un seul temps opératoire, optimisant donc la technique initiale sur les plans orthopédiques, rééducatifs mais aussi socio-économiques pour les patients.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont les suivants : - Limiter les échecs de la technique de la membrane induite dans sa forme actuelle en implantant un dispositif artificiel permettant de soutenir la formation de cette membrane induite, qui aurait donc des caractéristiques plus propices à la consolidation osseuse. - Limiter le nombre de chirurgies : en effet, il est impossible chez l’homme et chez l’animal de simplement greffer de l’os lorsque la perte osseuse est trop importante, cela résulte en une résorption du greffon et donc en un échec de la technique. Implanter une membrane artificielle aux propriétés supérieures permettrait de surseoir au temps de formation de la membrane induite, réduisant la chirurgie en 1 seul temps au lieu de 2. - Retirer le temps de formation de la membrane. Chez le rat, cette membrane se forme en 4 semaines mais chez l’homme celle-ci se forme en minimum 6 semaines (conditions idéales du jeune homme sans comorbidités) voire plusieurs mois (en moyenne 3 mois). Ce temps de formation chez l’homme, très long, limite grandement les capacités de mobilisation du membre concerné et donc la rééducation (avec pour conséquence une perte de musculature, un enraidissement articulaire), la reprise des activités professionnelles et personnelles. Les matériaux employés par les membranes artificielles ont pour objectif de maintenir l’autogreffe viable en 1 seul temps chirurgical, le temps d’obtenir une une consolidation osseuse indépendamment de la formation de la membrane induite et donc des comorbidités des patients et de la gravité de leur affection. - Au final : Limiter le temps d’immobilisation du patient, sa mise en décharge et ses conséquences : Perte musculaire, enraidissement articulaire, limitation des conséquences socio-économiques à savoir une double hospitalisation, souvent d’une durée supérieure à 48-72h, limiter le temps avant retour aux activités professionnelles et personnelles et donc limiter le coût socioéconomique de ces pathologies orthopédiques. - Accélération de la consolidation osseuse : les membranes artificielles, ayant des caractéristiques angiogéniques et ostéogénique ont pour objectif associé d’obtenir une consolidation du defect dans un délai plus rapide.
Procédures
Le nombre d'animaux se base sur une analyse de la littérature sur les mêmes modèles de defect femoral et d'implantation sous-cutanées du rat. La première phase du projet requiert 30 rats, la seconde 110 et la 3ème 230 (au maximum). Les résultats des matériaux étudiés permettront d'ajuster le nombre de rats nécessaires à l'étape 2 puis 3. La première phase consistera en l'implantation sous-cutanée de 4 membranes artificielles dans le dos des rats. Il s'agit de l'unique procédure chirurgicale réalisée par rat. L'objectif principal sera d'évaluer la capacité des matériaux à générer une membrane au propriétés histologiques supérieures à celle produite dans les groupes contrôles. Cette étape est la moins agressive et permettra de diminuer les nuisances animales. Le temps chirurgical est de 30 minutes pour les 4 implantations par rat. Pour la 2ème phase de l'étude, le groupe contrôle comportera 10 rats et 10 groupes de matériaux maximum seront analysés. L'objectif principal sera d'évaluer la capacité des matériaux à produire une membrane aux propriétés histologiques supérieures à celles produites dans le groupe contrôle. Une seule procédure sera réalisée par rat : la création d'un defect osseux fémoral et une stabilisation par plaque vissée (ostéosynthèse). Cela autorisera un appui sur le membre opéré juste après l'intervention. Cette procédure sera réalisée en 1h. Pour la 3ème phase de l'étude, une groupe contrôle de 15 rats sera requis et chaque groupe d'étude comportera 10 rats (10 groups maximum). L'objectif est d'étudier la consolidation en présence des membranes d'interêt comparé à la technique habituelle. L'analyse se fera à 2 points temporels différents. Le groupe contrôle comportera 15 rat car ce groupe requierts 2 chirurgies, augmentant le risque de complications. Cela correspond à ce qui est réalisé chez l'homme (temps de formation de la membrane induite autour du ciment). La greffe osseuse sera réalisée au cours de la 2nd chirurgie, 4 semaines plus tard. Les groupes d'étude ne comporteront qu'une seule chirurgie car il s'agit d'un des objectifs majeurs de ce projet (1 seul temps chirurgical). La greffe osseuse osseuse sera prelevée lors du même temps chirurgical et consistera au prélèvement de 2 à 3 vertèbres de la queue du rat, fragmentées et intégrées au defect osseux fémoral. La chirurgie est réalisée en 1h. Toutes ces chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale (gazeuse) associée à une analgésie multimodale.
Impact sur les animaux
Le projet est pourvoyeur de plusieurs nuisances et effets indésirables qui seront recherchés, anticipés et traités en cas d’apparition. En premier lieu, plusieurs données générales seront analysées notamment : - Douleur de palier modéré à sévère étant donné qu’il s’agit d’une chirurgie avec incision cutanée pour la phase 1 et orthopédique avec réalisation d’un defect osseux pour les phases 2 et 3, la douleur est également prévisible et sera surveillée tout au long de l’étude, particulièrement la 1ère semaine post-opératoire. - Hyperthermie : pouvant être due à une infection post-opératoire, ce risque est présent au moins les 15 premiers jours, le temps de la cicatrisation cutanée. Elle sera recherchée par la mesure de la température de l’animal. - Perte de poids : par douleur et/ou difficulté de mobilisation due à la chirurgie sur le membre inférieur de l’animal (phases 2 et 3), entrainant une restriction alimentaire et hydrique, la durée prévisible est 7 jours d’après les modèles retrouvés dans la littérature, les rats retrouvant une mobilité habituelle après ce délai. Elle sera dépistée par la pesée régulière de l’animal. - Anomalie de la cicatrisation cutanée : désunion, saignement, hématome, écoulement suspect (infection), ce risque est présent au moins les 15 premiers jours, le temps de la cicatrisation cutanée. Il sera recherché par l’inspection de la cicatrice en période post-opératoire. - Limitation de la mobilité de l’animal dans les suites opératoires : bien que la chirurgie permette la déambulation, une diminution de la mobilité dans les modèles similaires est observée la première semaine post-opératoire (phases 2 et 3 notamment). - Altération de l’état physiologique par stress postopératoire de l’animal : trouble de la posture, du toilettage, dépilation, durée prévisible de 7 jours post-opératoire. Cela sera limité par la médication antalgique associée à ce protocole de recherche.
Devenir
A l’issue de chaque étape de ce protocole il sera réalisé une euthanasie car il est nécessaire de prélever les membrane formées et les fémurs opérés pour analyse comparative. Les méthodes d’euthanasie employées seront le surdosage d’anesthésique, réalisé sur animal préalablement sédaté (anesthésie gazeuse) ou l’inhalation de CO2 par incrémentation progressive.
Remplacement
Le principe de la membrane induite repose sur la réaction de l’organisme à la présence d’un matériau (le ciment en PMMA) sur le lieu de l’implantation, provoquant une réaction tissulaire à corps étranger, vascularisée et riche en facteurs de croissance. Dans notre travail, différents biomatériaux auront pour vocation à remplacer le PMMA pour optimiser cette réaction. Le but étant de former une membrane « induite » optimisée autour du matériau. Il s’agit d’une réaction complexe mêlant à la fois une réaction immunitaire « à corps étranger », une hypervascularisation locale et une stimulation de la formation d'os sur un organisme vivant. Dans la membrane induite, il est retrouvé des éléments cellulaires de ces 3 lignées (immunitaire, vasculaire et osseuse) avec une différenciation qui a lieu sur plusieurs semaines avant d’obtenir une membrane induite mature. Il n’est pas retrouvé dans la littérature de modèle in vitro, ex vivo ou in silico permettant de reproduire l’ensemble des éléments et des étapes menant à la formation de la membrane induite et cela empêche l’analyse in vitro. La seule analyse préalable, permettant de réduire l’agressivité chirurgicale est l’implantation sous-cutanée, suffisante pour analyse la réaction tissulaire immunitaire et la formation de vaisseaux et limitant drastiquement la sévérité du geste sur l’animal. Néanmoins, avant réalisation des études sur animal, des analyses in vitro de cytotoxicité et cytocompatibilité sur les des cellules osseuses, vasculaires et immunitaires seront menées sur les matériaux sélectionnés pour remplacer le PMMA actuel afin de diminuer au maximum le nombre d’animaux nécessaires à l’analyse in vivo.
Réduction
La détermination du nombre d’animaux se base sur une analyse de la littérature étudiant le même modèle animal, sur le même sujet d’étude. 5 études d’implantation sous cutanée dans la littérature ont également été analysées. Le nombre moyen d’animaux par matériau analysé était de 10 pour l’implantation osseuse (10 échantillons par groupe). Pour l’analyse en implantation sous-cutanée, 5 échantillons de membrane induite étaient utilisés en moyenne par groupe. Une seule (defect osseux) étude publiée réalisait une analyse de puissance basée sur les résultats histologiques, avec un niveau de puissance de 80% et retrouvait un nombre requis minimal de 8 rats par groupe. En se basant sur ces différentes études et leurs résultats, un nombre de 10 rats par groupe a été sélectionné. La stratégie de réduction s’applique également dans le design de l’étude puisque pour limiter au maximum le nombre d’animaux nécessaires, la première phase consistera à étudier la formation de la membrane induite après implantation sous-cutanée du matériau et la seconde phase après réalisation du defect osseux. L’implantation sous-cutanée permet également d’implanter plusieurs matériaux (jusque 4) sur un seul rat ce qui n’est pas possible en implantation osseuse. L’ensemble des membranes artificielles aura eu préalable une analyse de cytotoxicité et de cytocompatibilité in vitro. Ces analyses ne permettent pas de reproduire le procédé in vivo de formation de la membrane induite qui intègre simultanément des phénomènes immunitaires, vasculaires et osseux. Cependant elle permettra de vérifier sur chaque lignée l’absence de cytotoxicité limitant l’implantation chez l’animal. De même, ce projet est réparti en 3 phases car à l’issue de chaque phase, des résultats inférieurs aux groupes contrôles entraîneraient le retrait du matériau lors des étapes suivantes de l’étude. Cela permettra de sélectionner les matériaux ayant les meilleurs résultats à l’issue de chaque étape tout en limitant l’agressivité chirurgicale des procédures.
Raffinement
En premier lieu les conditions de vie des animaux respecteront un cycle de 12h jour/nuit en alternance. Le milieu de vie sera dans une salle à flux d’air contrôlé, avec une température contrôlée (21°C). Les animaux disposeront d’un accès à l’eau et à l’alimentation à volonté, selon des aliments standards (pas de modifications du régime alimentaire habituel). Le milieu de vie sera enrichi et consistera en un sol dur comportant une litière, disposant de moyens d’exploration et de cachettes (tunnels en cartons par exemple, ou petits dômes en papier maché etc.). Des éléments permettant la nidification seront présents également, (cylindre de coton, carré de cellulose, rondelles de peuplier compressé), enfin des éléments permettant aux rats de ronger seront présent (morceaux de bois). Avant l’intervention, les rats seront placés en cages, avec 3-4 rats par cages afin de respecter leur comportement social. Cependant, après la chirurgie et devant les conditions diminuées de déambulation et de douleur post-opératoire (notamment phases 2 et 3), ils seront placés en cage seuls, pour une durée minimale mais pouvant aller jusqu’à 7 jours. Il s’agit du temps requis avant reprise d’une déambulation habituelle et sans douleur à l’issue de la procédure. Plusieurs éléments seront analysés pour contrôler le bien-être des animaux à savoir : le poids avec mesure bihebdomadaire pendant 7 jours post-opératoire puis une fois par semaine, la température à la recherche d’une hyperthermie, mesurée tous les jours en post-opératoire (recherche d’une infection post-opératoire). Une analyse de la plaie post-opératoire (désunion, saignement, hématome) sera quotidienne les 7 premiers jours postopératoire. Une évaluation quotidienne de la capacité de déambulation de l’animal qui doit progressivement devenir normale en 7 jours pour les phases 2 et 3. Enfin une analyse comportementale sera réalisée notamment la posture, la position des oreilles, l’enfoncement des yeux mais aussi si un manque de toilettage est constaté (à l’aide de l’échelle d’évaluation des expressions faciales du rats, édité par la NC3Rs). Les sources d’eau et de nourriture seront placés à des lieux accessibles à proximité de la zone de repos et stabilisés pour qu’ils ne soient pas renversés facilement.
Choix des espèces
L’espèce choisie pour cette étude est le rat. Il s’agit dans la littérature de l’espèce animale la plus utilisée. Dans une revue systématique publié en 2022, 70% (28/40) des études animales évaluant la membrane induite étaient réalisées sur un modèle de rat. Sur ces études sélectionnées et utilisant un defect fémoral (24 études), 20 étaient réalisées sur le rat. Le choix de cette espèce permet donc d’obtenir des résultats comparables avec la littérature. En outre, l'élevage de ces animaux est plus rapide et plus facile, avec des coûts considérablement réduits. Les rats seront à un stade adulte de leur développement, correspondant à 10 semaines de vie avec un poids de 400-450 gr. Cela correspond à l’âge d’un humain adulte d’environ 18 ans. En effet, la technique de la membrane induite est le plus fréquemment utilisée chez le jeune adulte dans le cadre d’accidents à haute cinétique de la voie publique (moto, voiture etc.). De plus, l’utilisation des moyens d’ostéosynthèse chez des rats non matures et plus jeunes expose à des difficultés techniques matérielles (moyen d’ostéosynthèse non adapté à la taille des fémurs de rats plus jeunes).
Etude des effets bénéfiques de la reprogrammation cellulaire partielle sur les altérations musculaires associées au cancer chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Des souris de 8 à 12 semaines sont retenues pour un muscle jugé proche de celui de l'humain, et pour un stade jeune adulte qui favorise la pousse tumorale. Elles sont 60, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une bague à l'oreille, un prélèvement au bout de la queue, puis une greffe de cellules tumorales dans le flanc, avant vingt et un jours de pesées quotidiennes et de mesures de tumeur trois fois par semaine, maintenue à la main une quinzaine de secondes à chaque fois. La tumeur peut affaiblir l'animal jusqu'à l'empêcher d'atteindre sa nourriture, et la mise à mort sert à prélever un tissu musculaire que le porteur indique ne pas pouvoir analyser sur un animal vivant.
Objectifs
Le développement d’une tumeur au sein du corps humain a des répercussions sur l’organisme entier. Plus particulièrement, il a été démontré que la croissance d’une tumeur conduit à une fonte du tissu musculaire notamment en altérant les capacités de régénération musculaire. Nous avons observé qu’un groupe de gènes est capable de favoriser la régénération musculaire. L’objectif du projet est d’évaluer l’impact de l’expression de ces gènes sur le système musculaire chez un modèle murin de greffe de cellules tumorales.
Bénéfices attendus
Le développement d’une tumeur engendre une fonte et une faiblesse du tissu musculaire, réduisant drastiquement la qualité et la durée de vie des patients ainsi que l’efficacité des traitements. Les bénéfices attendus sont donc d’avoir une meilleure compréhension des dysfonctionnements musculaires impliqués et de concevoir de nouvelles thérapies non pharmacologiques.
Procédures
Avant le début de la procédure, les souriceaux sont identifiés par la pose d’une bague à l’oreille et un prélévement est effectué afin d’identifier la génétique de chaque individu. Ces deux procédures sont réalisées lors de la même anesthésie générale, d'une durée inferieure à 1 minute par animal. Des cellules tumorales seront greffées dans le flanc des animaux. Cette procédure n’est réalisée qu’une fois par animal et sous anesthésie générale (durée totale de l’anesthésie inférieure à 5 minutes par animal, l’injection dure une quinzaine de secondes). Cette implantation va engendrer le développement d’une tumeur qui va provoquer une perte de poids. Le poids des souris, sera mesuré tous les jours et le diamètre des tumeurs 3 fois par semaine, pendant 21 jours ou jusqu’à un point limite. Pour permettre ces mesures, les animaux seront maintenus à la main pendant une quinzaine de secondes.
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables modérés sont attendus du fait d’un cumul d’actes (pose de la bague d’identification, prélèvement du bout de la queue, contentions, injections, mesures des tumeurs, anesthésies), qui induisent du stress. Le développement de la tumeur peut induire une perte de poids et diminuer les défenses immunitaires. La fonte musculaire peut engendrer une faiblesse de l’animal et une difficulté à accéder à la nourriture et au biberon.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse détaillée du tissu musculaire qui ne peut pas être réalisée sur un animal vivant.
Remplacement
Afin d’évaluer les effets de la perte de poids et de la fonte musculaire induites par le cancer, nous n’avons d’autres choix que d’utilisé un système intégré, en l’occurrence le modèle murin. En effet, il est impossible de modéliser une perte de poids à l’aide de modèle in vitro.
Réduction
L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales. Des analyses statistiques ont été réalisées afin de déterminer le nombre minimal requis pour générer des résultats significatifs.
Raffinement
Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. Le prélevement pour identification de la génétique de chaque individu est réalisé sous anesthésie générale. Les procédures expérimentales utilisées incluent un recours systématique à l'anesthésie générale adaptée lors de l’inoculation des cellules tumorales. Avant le début de l’expérimentation, les animaux seront habitués à être manipulés pendant une semaine dans le but de réduire leur stress lorsque l’expérimentateur devra les manipuler dans le cadre des suivis de pousse tumorale. Une fois les implantations réalisées, une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée afin de repérer au plus tôt toute douleur ou souffrance éventuelle. L‘implantation des cellules cancéreuses impliquant le développement tumoral et une fonte musculaire, un suivi de poids des souris sera effectué quotidiennement ainsi que de volume des tumeurs trois fois par semaine. De la nourriture et un hydrogel seront déposés à même la litière afin de prendre en compte la réduction de la mobilité de l’animal et le risque de ne plus pouvoir accéder facilement à la nourriture avec le développement de la tumeur. Une grille de cotation des critères de bien être est utilisée pour déterminer les points limites de manière objective. Notre expérience montre que cette stratégie est suffisamment prédictive pour que l’ensemble des animaux soit inclus dans l’étude.
Choix des espèces
L’espèce choisie sera la souris car elle présente un tissu musculaire très proche de celui de l’Homme dans sa structure et son fonctionnement. Les animaux seront âgés entre 8 et 12 semaines, nous permettant de mener nos projets sur un stade jeune adulte avec des muscles complètement développés. De plus, le stade jeune adulte favorise la pousse tumorale.