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Effet de l’enrichissement de l’environnement et de l’activité physique sur une maladie du cerveau EU1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour mesurer les effets de l'enrichissement du milieu et de l'exercice sur un modèle murin de maladie d'Alzheimer, 480 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélèvements post-mortem. L'étude des bienfaits de l'environnement passe par un isolement en cage individuelle de trois mois pour 240 d'entre elles, et par 33 jours d'isolement pour les tests comportementaux, que le porteur reconnaît générateurs de stress. Un de ces tests place les souris dans une eau à 22 °C quatre fois par jour pendant six jours, avec risque d'hypothermie transitoire. Le porteur affirme qu'aucune alternative cellulaire ne convient et que seul l'animal entier permet ce travail.
Objectifs
L’environnement, tel que l’augmentation des activités sociales, de la nouveauté et de l’activité physique, influence positivement l’expression des gènes nécessaires à la plasticité neuronale dans le cerveau. Cela est possible grâce à des mécanismes appelés épigénétiques, c’est à dire qu’ils permettent l’adaptation des programmes génétiques. L’objectif de ce projet vise à établir ces régulations génétiques/épigénétiques à l’échelle de tout le génome, c’est à dire de doser tous les gènes qui seront changés par les conditions d’hébergement, et leur régulation au sein même du génome, ainsi que ceux qui seront relargués dans le sang. Pour ce faire, nous utilisons un modèle animal (souris) de maladie du cerveau. Une fois les transcrits identifiés dans le sang, ils pourraient servir de biomarqueurs pour faire valoir de l’efficacité d’un hébergement enrichi (environnement ou exercice physique). De plus, ces études seront menées de façon cellule-spécifique (cellules neuronales et non neuronales) car toutes les cellules ne répondent pas de la même façon à l’environnement. Ce projet questionne les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents aux effets bénéfiques de ces changements d’environnement, leur efficacité au niveau cognitif (évaluations comportementales) et les modifications structurelles et fonctionnelles qu’ils induisent sur le cerveau (imagerie). Le projet sera mené sur des souris mâles et des souris femelles.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu de ces études est l'obtention de données claires démontrant si des (et quelles) modifications épigénétiques et programmes génétiques sous-tendent les effets bénéfiques de l’environnement enrichi et de l’exercice physique dans un modèle de maladie du cerveau aussi répandu que la maladie d’Alzheimer. De plus, cette étude apportera des réponses concrètes sur les mécanismes d’action impactés par l’environnement et l’exercice sur le plan comportemental, cellulaire et moléculaire : formation de la mémoire à long terme dans l’hippocampe et le cortex frontal, transcription des gènes dans l’hippocampe, formation d’épine dendritiques dans l’hippocampe, impact sur les différentes structures cérébrales. En apportant des bases mécanistiques, ces études permettront d’étayer les connaissances plus fondamentales de l’effet bénéfique de l’environnement et leur implication en santé humaine. Ces études apporteront des bénéfices en santé humaine car elles dévoileront des pistes et des preuves de concept pour la mise en place de stratégies de prévention. En fournissant des informations sur les mécanismes moléculaires/cellulaires, dépendants du sexe et de l'âge, qui sous-tendent les interventions non pharmacologiques telles que l'environnement enrichi et l’exercice physqiue dans les principales régions cérébrales affectées par la maladie d’Alzheimer, nos données offriront de nouvelles opportunités pour la personnalisation de la médecine et leur mise en place aux stades les plus précoces. Ce projet devrait in fine permettre un traçage biologique (dans le sang) visant à utiliser des stratégies thérapeutiques nouvelles, ou combinatoires soutenant des stratégies non pharmacologiques (épi-médicaments ou thérapies basées sur l'ARN). Ces études permettront aussi de mieux comprendre la maladie d’Alzheimer, son développement et sa progression dans les modèles animaux, qui pourront être ensuite rapportés/étudiés chez l’Homme. Enfin, ce projet comprend les analyses conjointes sur les souris mâles et femelles. Les taux de prévalence de la maladie d'Alzheimer varient en fonction de l'âge mais aussi du sexe, les femmes représentant deux tiers des patients atteints. En apportant une analyse complète (cognitif, moléculaire, imagerie cérébrale) des différences entre mâles et femelles, ce projet apportera donc un bénéfice sur la compréhension de mécanismes pouvant être spécifiquement liés au sexe.
Procédures
240 animaux vigiles seront hébergés en cage isolée avec dispositif de nidification pendant 3 mois (de 6 à 9 mois), 120 bénéficieront d’une roue d’activité sur laquelle ils pourront tourner, cette roue sera bloquée pour les 120 autres animaux. Comportement réalisé sur 160 animaux vigiles sur une période de 33 jours/animal, période durant laquelle les animaux sont hébergés en cage individuelle pour tester différents aspects comportementaux et mnésiques (en moyenne 15 minutes par jour) sur 13 jours environ avec des phases de repos de 3 jours entre les tests. Les souris transgéniques modèle de maladie développent des déficits mnésiques à l’âge de 9 mois.
Impact sur les animaux
L’isolement des congénères nécessaire pendant les tests comportementaux (33 jours) et pendant l’hébergement en cage d’exercice, ainsi que et leurs contrôles (3 mois) peut générer un stress. Dans un des tests comportementaux, les animaux sont placés dans l’eau à 22°C pendant un temps inférieur à une minute (4 fois/jour pendant 6 jours), ce qui peut produire un stress thermique ainsi qu’une hypothermie transitoire. Les études de comportement pourront induire du stress aux animaux.
Devenir
Tous les animaux (480) seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements et analyses post-mortem.
Remplacement
Dans la mesure où nos travaux portent sur les caractérisations comportementales et moléculaires suite à un changement des conditions environnementales (hébergement spécifique), il n’est pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier. Nous ne pouvons pas utiliser d’alternative cellulaire. Notons que les modèles murins (souris) récapitulent les symptômes majeurs de la maladie (déficit de mémoire) et restent ainsi des outils uniques pour l'étude des mécanismes physiopathologiques, la validation de cibles thérapeutiques et la réalisation de tests précliniques.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux pour permettre des analyses statistiques sur des groupes incluant mâles et femelles, soit 20 souris/groupe (10 mâles et 10 femelles) pour le comportement et l’imagerie cérébrale, et 6 souris/groupe (soit 3 mâles et 3 femelles) ainsi que 4 souris/groupe (soit 2 mâles et 2 femelles) pour les approches moléculaires. L’efficacité de chaque type d’hébergement sera effectuée à l’aide de tests statistiques adaptés. Les calculs fait tiennent compte de la variabilité interindividuelle. Ainsi, pour toutes nos analyses, nous utiliserons à la fois des animaux mâles et femelles dans nos expériences de manière à ne pas biaiser nos résultats, et les sexe ratios seront conservés entre les différents groupes.
Raffinement
Pour appliquer le principe de raffinement, un enrichissement environnemental est apporté dans les cages standards ainsi que dans les cages à roue : dispositif de nidification (certifié contact alimentaire) chaque semaine. Les changes seront opérés par les animaliers à l’aide de tunnels (polycarbonate transparent), permettant de réduire le stress des animaux, notamment efficace chez les souris (raffinement d’hébergement). Dans le cas d’hébergement en cage isolé (cages à roue et comportement), plusieurs cages (3 au minimum) seront maintenues côte à côte sur les rayonnages des racks de stabulation. Des points limites prédictifs sont mis en place pour limiter la souffrance : les souris sont observées lors de la visite journalière, et une surveillance plus détaillée des souris se fait tous les 15 jours (observation visuelle de l’aspect général, posture). Les souris sont habituées à la manipulation par l’expérimentateur pour réduire le stress lié à la manipulation lors des tests comportementaux. Les animaux sont testés dès le début de l’apparition des déficiences mnésiques afin de réduire le temps d’hébergement des animaux en animalerie. Les procédures incluant une perfusion sur cœur battant sous anesthésie profonde ou un prélèvement sanguin terminal sont réalisées sous anethésie additionnée d’une couverture analgésique locale. Pendant la semaine qui suit, le suivi quotidien est renforcé.
Choix des espèces
Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des maladies du cerveau ayant une origine génétique. En effet, les maladies du cerveau que nous étudions dans ce projet apparaissent à l’âge adulte (40-50 ans) lorsque ce sont des formes génétiques. Elles apparaissent plus tardivement, quand leur origine n’est pas connue, le vieillissement étant un facteur de risque majeur de ces pathologies. Ainsi, les animaux étudiés seront testés à l'âge de 9 mois, nos études antérieures ayant montré que cela correspond au moment où les premiers signes de déficits mnésiques apparaissent dans ce modèle. De plus, ces modèles permettent de répondre à la question posée car les souris possèdent des structures neuro-anatomiques comparables à celles du cerveau humain.
Test de faisabilité de l’imagerie par résonnance magnétique avec manganèse chez l’ovin
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumis à deux ou trois anesthésies en une semaine, à des injections dans la veine jugulaire et à cinq ou six prises de sang, neuf moutons seront tous tués, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur cale une technique d'IRM au manganèse sur le cerveau ovin et injecte un composé qu'il reconnaît neurotoxique à forte dose chez l'humain, en jugeant la toxicité aiguë "très peu probable" chez les ruminants. Les cerveaux sont prélevés après la mise à mort pour être réanalysés à plus haut champ. Parmi les bénéfices annoncés figure l'appui de futurs appels à projet.
Objectifs
L’objectif est de mettre en place la technique d’Imagerie par Résonnance Magnétique du manganèse in vivo à l'échelle du cerveau entier chez l’ovin. Les propriétés paramagnétiques du manganèse (Mn2+) permettent son utilisation comme agent de contraste pour l'IRM (MEMRI : IRM du ManganEse). C’est un composé qui pénètre et s'accumule dans les neurones actifs, donc sa concentration intracellulaire est le reflet direct de l'activité neuronale. Cette technique permet de visualiser les changements structurels et fonctionnels en réponse à des stimulis. La dynamique du Mn2+ (biodisponibilité, pharmacocinétique) dépend de l'espèce, il est donc nécessaire de réaliser des mises au point sur le cerveau d’ovin pour lequel aucune étude n’est disponible dans la littérature.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de définir la dose minimale de Mn2+ nécessaire pour l’obtention du meilleur contraste en IRM MEMRI. Il permettra également de se placer dans la fenêtre temporelle la plus favorable pour l’acquisition d’un contraste optimum. Les mises au point des conditions de dose et temps dans cette expérimentation préliminaire bénéficieront à des appels à projet ultérieurs.
Procédures
Les animaux de la procédure 1 subiront 2 anesthésies à 10 jours d'intervalle pour passage à l'IRM. La première durera 1 heure, la 2ème 6 heures. Ils recevront également une injection intra-péritonéale (durée totale contention comprise d'une minute). Ils subiront 2 injections par voie intraveineuse à la jugulaire pour induire les anesthésies, ainsi que 6 prises de sang vigiles (durée totale contention comprise d'une minute). Les animaux de la procédure 2 subiront 3 anesthésies réparties sur 7 jours pour passage à l'IRM. Chaque anesthésie durera 1 heure 30. Ils recevront également une injection intra-péritonéale sous anesthésie. Ils subiront 3 injections par voie intraveineuse à la jugulaire pour induire les anesthésies, ainsi que 5 prises de sang vigiles (durée totale contention comprise d'une minute).
Impact sur les animaux
Bien qu’il soit un élément nécessaire au bon fonctionnement de l’organisme, le manganèse est cependant neurotoxique à forte dose. Chez l’homme, il provoque maux de tête, insomnies, pertes de mémoire, instabilité émotionnelle, dystonie, tremblements, troubles du langage et des troubles de la marche. Selon la littérature, les cas de toxicité aigüe au manganèse chez les ruminants sont très peu probables. Nous n’attendons donc pas d’effets indésirables suite à l’injection de Mn2+, mais les animaux seront surveillés étroitement après l'injection. Pour chaque anesthésie les animaux pourront subir un stress lors de la manipulation. Un hématome peut apparaître lors de l’induction de l’anesthésie par voie intraveineuse, ou après les prises de sang à la veine jugulaire.
Devenir
A la suite des acquisitions, tous les animaux seront mis à mort toujours sous anesthésie générale, car leurs cerveaux seront prélevés et ré-analysés ex-vivo par IRM à plus haut champ.
Remplacement
Cette étude d‘imagerie cérébrale permettant de déterminer la dose minimale de Mn2+ et la fenêtre d’acquisition optimum pour obtenir le meilleur contraste ne peut être réalisée qu’in vivo. Il est en effet impossible d’étudier ou de reproduire ces expériences in vitro et encore moins in silico. Ce projet est un prérequis pour développer l’approche d’imagerie MEMRI qui permettra, ultérieurement, de mettre en place des projets longitudinaux, avec des nombres restreints d’animaux expérimentaux.
Réduction
Ce projet concerne 9 animaux expérimentaux maximum, qui seront utilisés pour tester trois doses de Mn2+ et déterminer la fenêtre d’observation optimale de l’activité cérebrale par IRM MEMRI. Pour cette expérience pilote, nous avons besoin de déterminer la dose minimale qui nous permet d’acquérir des images IRM informatives, et pour cela nous ne disposons que de quelques données dans la littérature sur les rongeurs uniquement. Par conséquent, il nous faut tester plusieurs doses. De la même manière, nous n’avons aucune donnée sur la biodisponibilité du manganèse dans l’organisme d’ovin et donc nous ne connaissons pas la cinétique de disponibilité du manganèse dans le cerveau.
Raffinement
Les animaux expérimentaux feront l’objet d’une surveillance accrue dans la période qui suivra l’administration de Mn2+ jusqu’à l’anesthésie pour l’imagerie. Au cours de cette période, l’apparition de tremblements, les difficultés de déplacement, la prise alimentaire seront particulièrement surveillés. Nous serons attentifs à la survenue de signes de mal être (position des oreilles, port de la tête, prostration). Dans le cas où de tels signes apparaitraient, un traitement analgésique sera administré. Pendant toute la durée de l’expérimentation, les animaux expérimentaux seront maintenus en groupe au sein d'un environnement social stable, dans des conditions adaptées aux herbivores, litière de paille et foin ad libitum. Ils seront manipulés dans le calme par des agents expérimentés. Ils arriveront la veille de l’anesthésie, et seront mis à jeun avant l’intervention, avec abreuvement adlibitum. Les brebis seront maintenues sous oxygène à la fin de la première anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé.
Choix des espèces
Nous souhaitons développer la technique de l’IRM réhaussé par le manganèse (MEMRI) chez l’ovin adulte pour plus tard étudier les mécanismes de plasticité cérébrale associés aux changement de photopériode chez cette espèce saisonnée. La dynamique du Mn2+ dépendant de l'espèce, il est donc nécessaire de réaliser des mises au point sur le cerveau d’ovin pour lequel aucune étude n’est disponible dans la littérature. Nous utiliserons des adultes pubères, de sexe indifférent.
Effets d’un médicament anti-rejet de greffe sur la sensibilité colique
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Elles reçoivent un immunosuppresseur par sonde orale à sept reprises, sont pesées dix-sept fois, puis subissent un test de distension colorectale de 40 minutes avant d'être tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur annonce comme effets attendus une perte de poids, de la diarrhée, du sang dans les selles et des douleurs digestives, l'objectif étant justement de provoquer ces troubles pour mesurer la sensibilité du colon. Il indique que les études in vitro ne reproduisent pas la complexité du tube digestif et des tissus qui l'entourent.
Objectifs
La transplantation d’organe est un traitement de choix pour certaines pathologies chroniques. La greffe améliore la qualité de vie et la survie des patients. Ces dernières années, l’augmentation de la survie du greffon est attribuée à l’utilisation des traitements immunosuppresseurs afin d'éviter tout rejet. Cependant l'utilisation des immunosuppresseurs peut provoquer de nombreux effets indésirables. Une meilleure gestion de ces effets pourrait contribuer à l’amélioration de la qualité de vie des transplantés. L'acide mycophénolique (MPA) est l'un des médicaments immunosuppresseurs les plus utilisés dans les transplantations d'organes solides, comme le rein ou le foie. Le traitement au MPA est associé à des effets indésirables, parmi lesquels les troubles gastro-intestinaux constituent une préoccupation majeure. En effet, plus de 30 % des patients présentent des effets indésirables gastro-intestinaux. La seule option thérapeutique actuelle consiste en une réduction de la dose ou de la fréquence d'administration, ou à un remplacement par d’autres molécules moins efficaces, ce qui augmente le risque de rejet de greffe. Le MPA est responsable d’altérations du microbiote intestinal, appelées dysbiose. Le microbiote intestinal, qui est constitué de microorganismes comme des bactéries, est nécessaire au processus de digestion et, à travers la production d’acides gras à chaine courte (AGCC) particuliers, il protège la paroi intestinale. Notre objectif est de confirmer le développement d'effets indésirables gastro-intestinaux suite à l'aministration de MPA chez la souris, principalement au iveau de la sensibilité colique, afin de pouvoir par la suite proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour lutter contre une entéropathie modérée provoquée par le MPA chez la souris.
Bénéfices attendus
Le MPA est l’immunosuppresseur le plus utilisé pour éviter le rejet de greffes d’organes solides. L’entéropathie induite par le MPA touche aujourd’hui plus de 30% des patients transplantés : sont proposés à ces patients une diminution de la dose de MPA ou une substitution de cet immunosuppresseur par une autre classe thérapeutique moins efficace sur le maintien et la tolérance de la greffe. L'étude de la sensibilité colique pourrait permettre de proposer de nouvelles approches thératpeutiques pour soulager ces patients.
Procédures
- Préhension pour pesée (animal vigile, tous les animaux, moins de 30 secondes par animal, 17 fois par animal) - Contention pour habituation à l’administration par voie orale à l’aide d’une canule (animal vigile, tous les animaux, moins de 1 minute par animal, 9 fois par animal) - Administration par voie orale à l’aide d’une canule (animal vigile, tous les animaux, moins de 1 minute par animal, 7 fois par animal) - Prélèvement sanguin (animal anesthésié, tous les animaux, moins de 1 minute par animal, 1 fois par animal) Les modes d’administration utilisés (administration par voie orale à l’aide d’une canule) ont été décrites dans la littérature pour ces molécules, et sont reconnues efficaces. Enfin, en fin de précédure 2, les souris subiront un dernier test (40 min par souris sur l'ensemble des souris), le test de distension colorectale, afin d'évaluer leur sensibilité colique avant d'être mis à mort à la suite de ce test de distension colorectale.
Impact sur les animaux
Des effets indésirables sont attendus pour les animaux traités à l’immunosuppresseur comme une perte de poids, de la diarrhée, la présence de sang dans les selles, des douleurs digestives et des altérations du comportement.
Devenir
A l'issu de l'ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements d'organes.
Remplacement
L’utilisation de cellules in vitro a permis de démontrer certains effets intéressants du médicament immunosuppresseur MPA et des AGCC. Cependant, les études in vitro ne permettent pas actuellement de reproduire la complexité du tube digestif et des tissus qui l’entourent. Or les effets globaux du MPA et des AGCC, s’ils existent, résulteront de l’interaction du médicament et des AGCC avec différentes cellules au sein de différents tissus et organes. A ce stade des travaux, les études in vitro doivent être complétée par des études sur l’animal afin d’apporter la preuve définitive de l’effet protecteur des AGCC vis-à-vis de l’entéropathie induite par le traitement immunosuppresseur chez les greffés.
Réduction
Dans le but de réduction du nombre d’animaux, le projet comprend 2 étapes : une étude pilote pour déterminer la dose de MPA à utiliser et l’étude à proprement parler des AGCC sur l’entéropathie induite par le MPA. Cette stratégie en deux étapes permet de limiter le nombre d’animaux utilisés dans l’étude de l’effet des AGCC. De plus, un test statistique dit puissance a été réalisé afin de déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser pour avoir des résultats exploitables. Enfin, des tests statistiques seront réalisés pour analyser les données.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à l’espèce et qui respectent leur bien-être : densité animale, température, hygrométrie contrôlées, présence d’enrichissement, eau et nourriture à volonté. Les animaux seront habitués aux expérimentateurs et aux manipulations. L’état général des animaux sera surveillé quotidiennement, voire deux ou trois fois par jour si l’état le nécessite. La douleur sera abrégée sans délai via l’administration d’antalgique dérivé de la morphine, ou si l’état le justifie, l’animal sera euthanasié. Les personnes qui manipuleront et observeront les souris sont expérimentées.
Choix des espèces
La souris est un modèle de référence pour l’étude des entéropathies que l’Homme développe. Les animaux utilisés seront des souris adultes d’un poids moyen de 24-26 g âgées de 8-10 semaines au début du projet. A ce stade de développement les souris présentent des caractéristiques physiologiques stables. De plus, ce stade de développement est celui utilisé dans les publications de référence pour le projet.
Etude de l’émergence de plusieurs populations de spermatogonies pendant la période prépubère chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Toutes tuées entre neuf et quatorze jours de vie, 280 souris subissent une biopsie de la queue puis l'administration d'une substance activant la voie de l'acide rétinoïque, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié des mâles, écartés après génotypage parce que leur génotype ne convient pas, sont tués sans même être prélevés. La mise à mort passe par une anesthésie à dose létale suivie d'une perfusion de dix minutes, pour prélever les testicules. Le porteur affirme qu'une approche sur animaux est "indispensable" et qu'un système in vitro est impossible, et cite un contraceptif masculin parmi les retombées envisagées.
Objectifs
L’acide rétinoïque et les récepteurs de l’acide rétinoïque sont indispensables à la différentiation des spermatogonies pendant la spermatogenèse. Nos études suggèrent l'existence de différentes populations de spermatogonies qui émergent à différents stades du développement prépubère et qui seraient contrôlées par l’un ou l’autre des récepteurs de l’acide rétinoïque. Dans ce projet nous induisons la différentiation de spermatogonies chez des souris présentant un arrêt de la spermatogenèse par administration de diverses substances activatrices de la voie de signalisation de l’acide rétinoïque. Les testicules des animaux traités sont soumis à des analyses visant à élucider l’émergence de plusieurs populations de spermatogonies pendant la période prépubère.
Bénéfices attendus
Dans la mesure où inhiber la synthèse d’acide rétinoïque bloque la différenciation des spermatogonies dans de nombreuses espèces, y compris les êtres Humains, il est logique de penser que les mécanismes régissant la spermatogenèse qui sont découverts ici chez des souris altérées dans la voie de signalisation de l’acide rétinoïque sont pertinents pour les êtres Humains. En comprenant comment la voie de signalisation de l'acide rétinoïque agit sur les spermatogonies chez la souris, nous obtiendrons des pistes pour évaluer si des cas d'infertilité Humaine, qui sont en augmentation constante dans le monde, sont liés à des altérations du fonctionnement de ces voies de signalisation. La possibilité de perturber temporairement la signalisation de l'acide rétinoïque représente également une stratégie pour développer de nouveaux contraceptifs masculins non chirurgicaux.
Procédures
Toutes les interventions décrites ci-dessous nécessitent d’immobiliser les souris avec la main (contention non traumatisante de 20 à 30 secondes). - Biopsie de queue (entre le 1e et le 3e jour ou entre le 5e et le 10e jour) sur animaux vigiles pour génotyper les animaux. Réalisée 1 fois dans leur vie. - Administration d’un médicament à l’âge de 4 jours, 8 jours ou 13 jours pour rétablir la différentiation des spermatogonies. Réalisée 1 fois dans leur vie. - Administration d’anesthésique en dose létale pour perfuser un fixateur histologique. Etape finale de mise à mort réalisée entre l’âge de 9 jours et 14 jours. Les souris sous anesthésie sub-létale/profonde en moins de 5 minutes. La perfusion (10 minutes) résulte en la mort de l’animal.
Impact sur les animaux
Nous générons des souris porteuses d’une mutation restreinte à un type cellulaire du testicule et aucun phénotype dommageable n’est attendu ; le phénotype attendu se limitant à une stérilité non obstructive chez les mâles. Une biopsie de la queue est réalisée pour le génotypage. L’administration de substances entraîne une douleur équivalente à celle de l’introduction d’une aiguille sous la peau.
Devenir
Après la réalisation du génotypage, les mâles ne présentant pas le génotype d'intérêt (contrôles non mutants) seront exclus de la procédure et euthanasiés sans prélèvement (1/2 des mâles). Tous les animaux mutants sont euthanasiés en fin de procédure pour prélever les testicules.
Remplacement
La spermatogenèse est un processus complexe impliquant divers types cellulaires du testicule. Les interactions entre les cellules somatiques et germinales sont cruciales pour assurer une production continue de spermatozoïdes. Notre étude vise à examiner le rôle de l'acide rétinoïque dans le maintien de ces interactions cellulaires dans un contexte physiologique. Il est important de souligner que l'utilisation d'une approche expérimentale avec des animaux est indispensable pour répondre à ces questions. Un remplacement par un système in vitro (conformément au 1e R de la règle des 3R) est impossible.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires est calculé de manière précise pour répondre aux exigences de réduction de l'utilisation d'animaux, tout en garantissant la qualité des résultats et la robustesse de leur validité statistique. Étant donné que notre étude se focalise sur la spermatogenèse, seuls les mâles (représentant statistiquement la moitié des naissances) sont inclus dans les expériences. Les traitements sont administrés exclusivement aux mâles mutants préalablement sélectionnés par génotypage. Les mâles mutants représentent la moitié des individus produits par les croisements, et cette proportion ne peut être augmentée. Les testicules controlatéraux de chaque mâle sont utilisés pour évaluer l'efficacité des traitements. Les deux testicules sont fixés de manière distincte et servent à deux voire trois types d'analyses, ce qui s'aligne parfaitement avec le 2e R de la règle des 3R en réduisant le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Dans le souci du bien-être des animaux, une surveillance constante de leur état de santé est assurée. En cas de souffrance ou de modification de leur comportement, des mesures correctives sont rapidement prises en concertation avec les responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) et le vétérinaire. Les animaux étudiés présentent des mutations dans les cellules de Sertoli du testicule, ce qui ne cause aucune souffrance car le phénotype attendu se limite à la stérilité non obstructive des mâles. Ce génotype d'intérêt concerne la moitié des mâles produits avec les croisements en place, et cette proportion ne peut être augmentée. Les procédures débutent par l'identification des mâles et la biopsie de queue pour le génotypage. Ces étapes sont effectuées avant l'administration du médicament, permettant ainsi une sélection visant exclusivement les animaux mutants d'intérêt. Ainsi, le raffinement (conformément au 3e R de la règle des 3R) est pleinement intégré dans notre projet.
Choix des espèces
La petite taille de la souris, ses nombreuses ressemblances génétiques avec l'Homme, et les facilités de modification de son génome, font d’elle un modèle animal de choix pour appréhender la physiopathologie des maladies humaines. Nous avons choisi une approche de génomique fonctionnelle pour laquelle la souris est particulièrement bien adaptée (possibilité de réaliser des mutations dans le génome : temps de génération court ; génome connu, outils moléculaires). D’autre part la souris possède 99% d’identité de gènes avec l’homme, et les mécanismes cellulaires à l’œuvre qui impliquent la voie de signalisation de l’acide rétinoïque sont conservés chez l’Homme. Nous identifions et génotypons tous les souriceaux mâles âgés de 1 à 10 jours pour choisir les mâles mutants qui seront traités par la suite. Les souris contrôles (non mutantes) dont le génotype n'est pas compatible à la suite de la procédure sont euthanasiées. Nous déclenchons la différenciation de toutes les spermatogonies à l'âge de 4 jours, 8 jours ou 13 jours en utilisant une méthode pharmacologique. Ces périodes correspondent aux moments où les gènes codant pour les récepteurs de l’acide rétinoïque commencent à s'exprimer, permettant une comparaison pertinente entre les moments d'expression et les moments d'administration des traitements. Nous analysons la différenciation des spermatogonies 24 heures après le traitement.
Evaluation de la capacité d’une hormone recombinante à induire des ovulations fertiles chez la brebis
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Mettre au point une hormone de reproduction recombinante, en vue d'un brevet, pour remplacer l'eCG tirée du sang de juments gestantes : 50 brebis vont être utilisées dans ce but, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque brebis passe trois séries d'expériences, chacune avec la pose d'une éponge dans le vagin, une injection d'hormone dans le muscle et quinze jours de prise de sang quotidienne à la jugulaire, soit 45 prises de sang. Le porteur présente comme premier bénéfice la réponse aux "attentes sociétales concernant le bien-être animal", en épargnant les juments saignées et souvent avortées pour produire l'hormone, et invoque aussi l'image des industriels et des éleveurs. Les 25 brebis traitées à l'eCG naturelle, autorisée, retournent dans l'élevage, et les 25 traitées à l'hormone recombinante, sans autorisation de mise sur le marché, sont tuées et envoyées à l'équarrissage.
Objectifs
La maîtrise de la reproduction en élevage des ruminants (bovins, ovins, caprins) ainsi que des porcins fait appel depuis 70 ans à une hormone naturelle très active, purifiée à partir de sang de juments gestantes (PMSG : Pregnant Mare Serum Gonadotropin, aussi appelée eCG : equine Chorionic Gonadotropin). Les fortes oppositions d’ordre éthique liées au bien-être animal nous ont conduit à envisager la production de cette hormone par génie génétique et sa production in vitro en cultures cellulaires, donc sans prélèvement de sang sur des « animaux-usines ». L’objectif du projet est de réaliser une preuve de concept de la capacité des eCG recombinantes d’induire une ovulation fertile chez la brebis avec une efficacité similaire à celle de la eCG extraite du sang des juments gravides. L’objetif final est le dépôt d’une demande de brevet pour les eCG recombinantes afin de proteger la proprieté intellectuelle.
Bénéfices attendus
Le principale benefice de l’eCG recombinante est de répondre aux attentes sociétales concernant le bien-être animal. En effet, on évitera de prélever de grands volumes de sang chez des juments gestantes, puis souvent de réaliser les avortements car les concentrations baissent fortement dans la deuxième moitié de la gestation et qu’il est plus rentable pour la production de l’hormone de redémarrer une gestation. Redistribuer à des millions d’animaux d’élevage une eCG partiellement purifiée provenant de sérums de multiples juments, au statut sanitaire inconnu, constitue un risque. En 2017 l’Union Européenne a publié un rapport dans lequel elle se dit "vivement préoccupée par l'importation et l'utilisation de médicaments vétérinaires contenant de la eCG". Cette situation impacte très négativement l’image des industriels et des éleveurs, lesquels se trouveraient par ailleurs en grande difficulté en cas d’interdiction de la eCG naturelle. Par ailleurs, en l’état, la capacité de synchroniser les ovulations par des méthodes sans hormone (effet mâle et photopériode pour les brebis) est insuffisante pour la pratique efficace de l’insémination artificielle, véritable pilier de la diffusion du progrès génétique en élevage. Le besoin d’une molécule de type eCG est réel et pressant pour les entreprises et les éleveurs, avec un cahier des charges exigeant, respectueux du bien-être animal. Notre proposition est le développement d’une eCG recombinante largement similaire à la eCG mais n’impliquant pas, de fait, le prélèvement de volumes sanguins très conséquents chez des juments gestantes. Ceci permettrait donc d’éliminer l’utilisation des juments pour la production de l’eCG et par consequant une amélioration du bien être animal.
Procédures
Chaque brebis sera soumise à 3 séries d’expériences et chaque expérience est constituée de la pose d'une éponge intravaginale et d’une injection intramusculaire d’hormone suivie par quinze jours de prélèvements sanguins à raison d’un prélèvement par jour et par brebis. Chaque prélèvement sanguin dure entre 3 et 5 seconds.
Impact sur les animaux
Les différentes prises de sang à la jugulaire peuvent engendrer une légère douleur ainsi qu’un hématome au niveau du site de prélèvement, les injections en intramusculaire peuvent également engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection. De plus, la contention pour ces différents actes peut stresser les animaux. La pose d’une éponge intravaginale peut être désagréable pour la brebis.
Devenir
Comme l’eCG naturelle possède une AMM (autorisation de mise sur le marché) les 25 brebis traitées avec cette eCG seront réplacées et retourneront dans l’élevage. Par contre, comme l’eCG recombinante n’a pas d’AMM les brebis traitées avec cette molécule seront euthanasiées et envoyées à l’équarissage.
Remplacement
La physiologie est bien plus que la somme des multiples niveaux d’action – que nous sommes loin d’appréhender. Et cette somme ne peut pas être anticipée ; notre niveau de connaissance est très insuffisant. Chaque niveau interagit avec celui ou ceux qui a (ont) engendré son activité, et réagit aussi en fonction des niveaux d’intégration supérieurs afin de produire la réponse physiologique la mieux adaptée (le nombre de paramètres intégrés nous échappe largement mais reste la clé de l’adaptation des organismes à leur environnement – laquelle est en perpétuelle évolution). Tout cela ne peut se produire que dans un organisme entier ; aucune possibilité de reproduire cette somme d’interactions dans un modèle in vitro – on parle ici assurément de multiples (dizaines?) de types cellulaires et d’organes « indépendants » - ou dans un quelconque modèle in silico – qui restera toujours borné par les informations (partielles et incomplètes) dont nous pouvons le nourrir. Aujourd’hui, aucune approche in vitro ou in silico ne peut rendre compte de la complexité de ce qui se passe dans un organisme entier. Ceci justifie pleinement l’emploi d’animaux entiers ; seuls à même de rendre compte de ce que signifie la physiologie, et seule option valide pour espérer modifier les paramètres de celle-ci
Réduction
Nous allons réutiliser le même lot de brebis pour réaliser les trois experiences prévues dans le projet. Nous allons utiliser deux lots de 25 brebis. Ce nombre a été éstimé en utilisant un test de comparaison de deux proportions (proportion de brebis ayant ovulé et nombre d'ovulations fertiles dans chaque groupe).
Raffinement
Suite à l’injection et au prélèvement de sang nous donnerons des granulés à manger comme renforcement positif. Tout au long des experiences les animaux seront régulierement surveillés pour identifier des possibles signes de douleurs ou d’inconfort. Tout signe d’inconfort et/ou de douleur sera pris en charge par des antalgiques locaux. Les brebis étant des animaux sociaux resteront en groupe tout au long de l’expérience afin d’éviter un stress d’isolement social. Un suivi journalier sera mis en place tout au long de la période des prélèvements pour évaluer l'état de bienêtre des animaux en s'assurant que les points limites ne soient pas atteints. Le comportement et l'apparence seront suivi avec attention pour détecter d'éventuels signes de souffrance et de détresse. En cas de signe de détresse et de malêtre significatif, les animaux seront traités comme suit : Anti inflammatoire non stéroïdien en intramusculaire éventuellement renouvelé 48H après si signes douloureux. Dans le cas où ces traitements ne résulteraient pas en une amélioration significative de l’état des animaux, ou dans le cas où certains comportements témoignant une douleur seraient détectés les animaux seraient alors euthanasiés par surdosage de barbituriques intraveineux.
Choix des espèces
La brebis est une des espèces cibles pour l’utilisation d' eCGs recombinante dans la maitrise de la reproduction en élévage. En outre la brebis est un modèle largement utilisé pour l’étude de la reproduction chez les animaux d’élevage et nous pouvons nous baser sur une littérature très riche sur ce modèle. Pour pouvoir étudier l'effet sur l'ovulation et la fertilité nous utiliserons des brebis adultes.
Etude histologique de l’évolution de l’ataxie de Friedreich sur les ganglions de la racine dorsale
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour étudier l'ataxie de Friedreich, 400 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance allant de léger à sévère, toutes tuées par perfusion intracardiaque afin de prélever leurs ganglions rachidiens. Le porteur indique que les souris porteuses de la mutation développent progressivement des signes de la maladie humaine, et fixe une grille de score, tremblements, hypolocomotion, dos voûté, perte de poids de plus de 10 %, au-delà de laquelle il les met à mort. La description des gestes infligés tient en une phrase, alors que la souffrance déclarée atteint le niveau sévère. Il affirme qu'aucune culture cellulaire ni modèle in silico ne permet d'étudier les cellules satellites gliales, "encore trop peu connues".
Objectifs
L’ataxie de Friedreich est une maladie neurodégénérative d’origine génétique. Elle est causée par une mutation du gène de la frataxine conduisant à une expression réduite de la protéine frataxine et à un dysfonctionnement des neurones présents dans des ganglions nerveux situés le long de la colonne vertébrale. Ces neurones sont recouverts de cellules satellites gliales qui contribuent à leur bon fonctionnement. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les rôles des neurones et des cellules satellites gliales dans le développement de l’ataxie de Friedreich. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris permettant d’induire la baisse d’expression de la frataxine uniquement dans les neurones des ganglions touchés par la maladie. La procédure sera optimisée afin de respecter les devoirs de Réduction et Raffinement et pour assurer l'absence de douleur. La surveillance continue de l'animal permettra d'arrêter la procédure expérimentale lorsque l'animal montre des signes d’anxiété. La procédure vise à optimiser le confort des animaux et réduire le nombre d'animaux.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de comprendre le rôle respectif des neurones proprioceptifs et des cellules satellites gliales dans le développement de l’ataxie de Friedreich, et de déterminer si les cellules satellites gliales peuvent constituer des cibles thérapeutiques potentielles.
Procédures
Les souris subiront une perfusion intracardiaque sous anesthésie chimique.
Impact sur les animaux
Dans notre étude, les animaux sont porteurs de la mutation de la frataxine seulement dans les neurones proprioceptifs vont progressivement développer certains des signes de la maladie humaine. Ils nécessiteront un suivi particulier et si une aggravation de leur état est observée, la procédure sera arrêtée pour ces animaux.
Devenir
A l'issue de la procédure 1, les animaux sont gardés en vie afin d'être inclus dans la procédure 2. En effet, la procédure 1 permet de produire les animaux utilisés dans la procédure 2. A l'issue de la procédure 2, les animaux seront mis à mort soit par perfusion intracardiaque précédée d’une anesthésie/analgésie chimique afin de prélever les ganglions rachidiens dorsaux et d’étudier au niveau cellulaire et moléculaire ces ganglions.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. L’utilisation de cultures de cellules satellites gliales ou de co-cultures neurones-cellules satellites gliales ne permet pas une étude physiopathologique des interactions propriocepteurs-cellules satellites gliales : les cultures induisent des altérations morphologiques et physiologiques majeures des propriocepteurs et des cellules satellites gliales ne reproduisant pas les mécanismes physiopathologiques existant in vivo. Il n’existe pas, dans notre domaine, d’alternatives satisfaisantes aux méthodes expérimentales proposées dans ce projet (expériences ex vivo et in vivo sur l’animal). Par ailleurs, aucun modèle in silico n'existe pour étudier les cellules satellites gliales, encore trop peu connues.
Réduction
Compte tenu de la littérature et de notre expérience, les expériences décrites nécessitent un minimum de 5 animaux. Nous utiliserons les tests statistiques appropriés pour analyser nos données. Les t-tests seront utilisés pour évaluer si deux groupes diffèrent l’un de l’autre. Les tests ANOVA seront utilisés pour réaliser des comparaisons multiples entre les différents groupes expérimentaux (plus de 2 groupes). Ces tests nécessitent d’avoir un nombre minimum d’animaux pour atteindre les seuils statistiques de significativité en fonction des expériences réalisées. De plus, les croisements et les lots seront optimisés selon les génotypes et les sexes afin d’avoir le plus d’animaux expérimentaux avec le bon génotype et avec une représentation homogène des sexes.
Raffinement
Les animaux seront placés dans des cages, en communauté de 2 à 5. L’eau, la nourriture et du matériel de nidification, seront placés dans chacune des cages. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité par du personnel qualifié, afin d’assurer un bien-être optimal, tout au long de l’étude. Les animaux seront suivis quotidiennement par les mêmes expérimentateurs afin de réduire leur stress au maximum. Dès l’apparition des symptômes sensorimoteurs, même mineurs, les animaux seront nourris avec de la nourriture humide au sol pour faciliter leurs apports en nutriments et en eau. Une surveillance quotidienne des points-limites (apparence, comportement, signes cliniques) et un suivi du poids hebdomadaire sera mis en place. Les points limites suivants seront évalués : 1. Apparence de l’animal : 0=normale ; 1=manque de toilettage ; 2=poil ébouriffé, dos voûté, prostration ; 2. Comportement (tenant compte des symptômes attendus): 0=normal ; 1=fort tremblement, hypolocomotion; 2=manque d’alimentation/déshydratation ; 3. Poids : 0= perte de poids comprise entre 0 et 5% ; 1=perte de poids comprise entre 5 et 10% ; 2=perte de poids de plus de 10%. Si un animal atteint le score de 2 pour un des paramètres ou si le score total est supérieur à 3, l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle standard pour l'étude des fonctions et dysfonctions du système nerveux des mammifères. L'anatomie, la morphologie cellulaire, la biochimie et la physiologie du système nerveux de la souris sont bien caractérisés. Il existe une vaste littérature sur le comportement sensorimoteur et sensoriel de la souris. De plus, la possibilité d’utiliser des souris génétiquement modifiées est un grand avantage pour les études physiologiques car les gènes codant certaines protéines peuvent être manipulés (activés, inactivités, surexprimés) ou des transgènes exprimés chez ces animaux afin d’aider à mieux comprendre certains mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les maladies neurodégénératives. Des souris adolescentes, jeunes adultes allant de 3,5 à 15,5 semaines seront utilisées afin de suivre l’évolution de la pathologie.
Impact du blocage de l’interaction du tPA avec les récepteurs NMDA dans la pathologie de l’Accident Vasculaire Cérébrale (AVC).
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
Soumises à une biopsie de la queue puis à l'induction d'un AVC ischémique ou hémorragique, 2 000 souris seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit des pertes de poids, des douleurs post-opératoires et des déficits fonctionnels ou cognitifs, avec mise à mort au-delà de 20 % du poids perdu ou d'un score supérieur à 7 sur l'échelle de grimace de la souris. Un groupe de 640 animaux cumule l'AVC provoqué et un diabète de type 1 servant de facteur de comorbidité. Le porteur affirme que ces procédures ont un caractère de "stricte nécessité" et qu'aucune méthode sans animaux vivants n'apporterait le même niveau d'information.
Objectifs
Le tPA est une sérine protéase principalement connue pour être synthétisée par les cellules endothéliales, puis libérée dans la circulation sanguine pour intervenir dans la fibrinolyse grâce à sa capacité à activer le plasminogène en plasmine. Ces propriétés font que le tPA est utilisé comme traitement pharmacologique de la phase aigüe des AVC ischémiques. Le tPA est également considéré comme un neuromodulateur au sein du système nerveux central (SNC). Il est produit par les neurones, les cellules gliales et les cellules endothéliales. Il est impliqué dans de nombreux processus physiologiques dont le développement cérébral, la plasticité synaptique, ainsi que dans des processus d’apprentissage et de mémoire. Grâce à ses différents domaines, le tPA interagit avec différents récepteurs tels que les N-methyl-D-aspartate (NMDAR). Cette interaction était impliquée dans certains processus physiologiques tels que la plasticité synaptique, la corticogenèse et pathologiques (AVC, sclérose en plaques/SEP, inflammation). Afin de mieux comprendre le rôle spécifique de cette interaction et de pouvoir élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à celle-ci, nous avons généré, avec la clinique de la souris une nouvelle souche de souris. La spécificité de cette nouvelle souche est une mutation entrainant le blocage de l’interaction tPA/NMDAR. Ainsi, l’objectif de ce projet est tout d’abord, d’évaluer l’impact du tPA endogène ou l’inhibition de son interaction avec le récepteur NMDA sur les lésions cérébrales, la réponse inflammatoire et la récupération fonctionnelle dans des modèles murins d’AVC ischémique ou hémorragique. De plus, il s’agit de démontrer l'effet ainsi que le potentiel thérapeutique de l’administration d’un anticorps monoclonal (le Glunomab®) dans ces modèles murins.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles ou appliquées menées pour différentes pathologies où cette interaction joue un rôle crucial (AVC, SEP et processus inflammatoires). En effet, une meilleure compréhension de cette interaction permettra de développer des stratégies thérapeutiques adéquates, permettant d’envisager d’améliorer les performances de patients dans ces différentes pathologiques.
Procédures
Biopsie de queue faite vers 6 jours pour chaque animal (n=2000). Procédure 1 (n=640) : Modèle d’AVC. Procédure 2 (n=640) : Modèle d’AVC. Procédure 3 (n=640) : Modèle d’AVC accompagné d’un facteur de comorbidité (diabète de type 1). - J0 : Induction de l‘AVC +/- Traitements à 20 minutes ou 4 heures. -J0+6h : Evaluation de l’inflammation cérébrale par IRM. - J+1, J+5 : Evaluation du devenir cérébral (lésions, transformations hémorragiques, perméabilisation) post-AVC par IRM. - J+1, J+3, J+5 : Etude de la récupération fonctionnelle des animaux. Procédure 4 (n=80) : Modèle d’AVC hémorragique. - J0 : Induction de l‘AVC hémorragique. - J+1, J+3 : Evaluation du volume de lésion hémorragique et de l’œdème, post-AVC par IRM. - J+1, J+3, J+5 : Etude de la récupération fonctionnelle des animaux.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les rongeurs seraient pour toutes les procédures : Biopsie de la queue (douleur légère de courte durée), une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification du traceurs injectés de l'intégrité anatomique et vasculaire du SNC.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines). Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'aisance des expérimentateurs (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse. L’ensemble des échantillons collectés permettra également un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. De plus, des méthodes d’études non invasives telle que l’IRM sont utilisées dans ce projet afin de faire un suivi longitudinal des animaux, permettant de recueillir de nombreuses données sans augmenter le nombre d’animaux. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes. Le bien-être des animaux est contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : 5 souris par cage, coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 20% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Les animaux recevront également une anesthésie locale sur la peau au niveau de l'artère cérébrale moyenne (ACM). Les yeux des souris seront couverts afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation. Après chirurgie, les souris disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du neurodéveloppement, les AVC, les modèles de SEP et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques, les souris KI-L178A déficientes pour le site d’interaction du tPA sur la sous-unité GluN1 du NMDAR. Ce modèle transgénique ne peut être réalisé que chez la souris (Mus musculus). Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 6-12 semaines seront nécessaires.
Étude de l’effet de l’Emicizumab dans des modèles murins de Maladie de Willebrand
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 068 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à modéré, une partie n'étant jamais réveillée. Elles reçoivent des injections sous anesthésie à 24 heures d'écart, un test de saignement de 30 minutes, puis un prélèvement sanguin final que le porteur décrit comme incompatible avec leur réveil, pour tester l'emicizumab dans plusieurs lignées murines de maladie de Willebrand. Le porteur annonce une preuve de concept à court terme et renvoie au long terme l'hypothèse d'essais cliniques chez les patients. Sur le remplacement, il indique que les tests sans animaux ne reproduisent pas l'intégralité du processus de coagulation.
Objectifs
La maladie de Willebrand (MW) est la maladie hémorragique la plus fréquente mais reste assez méconnue. Elle touche homme et femmes et affecte jusqu’à 1% de la population dans sa forme modérée. La maladie empêche d’arrêter les saignements. En fonction des différents défauts, les patients ont des formes plus ou moins sévères de la maladie. Les traitements disponibles sont lourds et pas toujours efficaces. Récemment, quelques patients avec la forme plus sévère de MW ont été traités avec emicizumab, un médicament approuvé pour une autre maladie hémorragique (l’hémophilie) avec des résultats prometteurs. Notre projet va consister à tester l’efficacité de ce nouveau médicament dans plusieurs modèles murins de maladie de Willebrand (diffèrent types) grâce à un modèle de saignement bien standardisé.
Bénéfices attendus
A court terme, les résultats de cette étude permettront d'établir la preuve de concept de l'efficacité de l'emicizumab dans la maladie de Willebrand et d'en comprendre les mécanismes associés. A long terme, ce projet pourra servir de base pour la mise en place d'essais cliniques visant à possiblement déployer l'emicizumab chez les patients avec maladie de Willebrand.
Procédures
Les souris seront soumises à plusieurs gestes sur une durée maximum de 5 jours: 2 injections rapides (5-10 secondes) sous anesthésie à 24 heures d'écart puis immédiatement après la seconde injection, un test de saignement d'une durée de 30 minutes, aussi sous anesthésie. Certaines souris sont soumises à une injection supplémentaires rapide 5-10 secondes. La plus part des souris seront soumises qu’à un seul geste tres rapide, un prélèvement sanguin (30-60 secondes), réalisé sous anesthésie profonde.
Impact sur les animaux
Douleur légère au réveil après la première injection. Stress lors de la préhension des animaux.
Devenir
Les procédures impliquent la perte ou prélèvement d’une quantité importante de sang (plus de 150microlitres) qui est incompatible avec leur réveil.
Remplacement
Le système de la coagulation est complexe, faisant intervenir de nombreux acteurs, que ce soit les cellules sanguines, les protéines qui circulent dans le sang mais aussi la paroi des vaisseaux sanguins. Actuellement les tests disponibles qui ne font pas appel aux animaux, même s’ils se sont beaucoup améliorés depuis quelques années, ne permettent pas de reproduire l’intégralité de ce processus.
Réduction
Afin de déterminer le nombre d’animaux approprié pour le projet, nous avons réalisé une analyse de puissance. Les hypothèses sous-jacentes à nos calculs sont basées sur la littérature existante et sur notre expérience en utilisant ces modèles en prenant en compte les variabilités de chaque test.
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien- être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques. Les animaux ne sont jamais seuls dans les cages d’hébergement et ils ont un accès libre à la nourriture et à l'eau. L’ensemble des expériences sera effectué par une personne habilitée à expérimenter sur animaux et la procédure aura lieu principalement sous anesthésie et sans réveil. Au cours de ce projet, les opportunités de raffinement seront régulièrement ré-évaluées pour nous assurer de la mise en place rapide de tout nouveau développement technique qui interviendrait pendant la période du projet. Les souris sont sous observation quotidienne (une fois pendant le weekend) et les points limites, susceptibles d'entraîner l'euthanasie immédiate de l'animal, seront strictement appliquée.
Choix des espèces
Ce projet fait appel à des modèles murins déjà développés qui reproduisent les pathologies étudiées (Maladie de Willebrand de différents sous-types). Ces modèles ont d’ores et déjà montré leur pertinence en tant que modèles des pathologies humaines. Les souris adultes, entre 8 et 14 semaines d’âge, des deux sexes seront utilisées.
Formation à la maitrise d’un modèle animal ayant pour objectif de comprendre le rôle du système cholinergique sur la mémoire à court-terme
- Enseignement supérieur
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à l'issue parce qu'elles ont reçu une injection de scopolamine, 130 souris sont utilisées dans un travail pratique étudiant, dans des procédures d'un niveau de souffrance déclaré léger. Le test est décrit avec précision, quatre séances d'habituation puis une phase de reconnaissance d'objets, et l'injection abdominale de scopolamine altère volontairement leur mémoire pendant environ cinq heures. Le projet ne vise aucune production de connaissances, il renouvelle l'autorisation d'un cours qui forme 24 étudiants par an, à raison de deux souris par binôme. Le porteur affirme que la formation aux gestes reste "essentielle" tant que l'expérimentation sur rongeurs sera autorisée, argument qui fait reposer la justification sur le maintien de la pratique elle-même.
Objectifs
Ce projet rentre dans le cadre des Travaux Pratiques d’un cours s’adressant à des étudiants anglophones. L’objectif du cours est de représenter un axe d’apprentissage important pour la compréhension par de futurs neurobiologistes du rôle des neuromédiateurs et en particulier celui du système cholinergique dans la mémoire et les processus cognitifs. Il s’agit d’un renouvellement d’autorisation pour un cours ayant fait ses preuves et dont le protocole est conçu de manière à pouvoir être géré selon les infrastructures disponibles et accessibles, tout en formant annuellement 24 étudiants.
Bénéfices attendus
Ce projet éducatif représente un axe d’apprentissage important pour la compréhension par de futurs neurobiologistes du rôle des neuromédiateurs dans les comportementaux et les tâches de mémoire. En Neurobiologie, les modèles animaux sont utilisés lorsqu’aucune alternative n’est disponible. Par exemple, des biopsies cérébrales ne peuvent pas être envisageables contrairement à d’autres tissus. Les modèles animaux permettent d’étudier un processus spontané ou induit, présentant un ou plusieurs aspects communs avec un phénomène équivalent chez l’humain. Ceci est de fait particulièrement utile en Neurobiologie et dans le cadre de maladies psychiatriques, dégénératives ou neurodéveloppementales. Il est donc important dans le cadre d’une formation d’étudiants au domaine des Neurosciences d’aborder ces aspects et de les initier aux expérimentations sur animaux. C’est aussi la possibilité de les sensibiliser directement aux aspects éthiques liés à l’expérimentation animale par un enseignement très adapté et très encadré.
Procédures
Les animaux sont soumis à un test comportemental de reconnaissance d’objet permettant à la souris de se mouvoir librement et d’explorer un nouvel environnement. Les animaux sont habitués à leur environnement pour éviter tout impact sur leur activité exploratoire. Cette phase d’habituation (H1-4) comporte 4 sessions, à un rythme de 2 sessions par jour (H1: souris groupées pendant 30 minutes ; H2-H3 : souris seules,10 minutes chacune ; H4 souris seules,10 minutes chacune, avec présentation objet). S’ensuit une phase d’exposition à des objets identiques de 3 sessions avec intervalle inter-session de 5 minutes puis une phase de test (T1 :souris individuelle, 5 minutes ; T2 souris individuelle, 5 minutes, 2 objets, ancien et nouveau) et enfin un test de reconnaissance de 5 minute, 10 minutes après la phase prcédente. La seconde intervention est une injection intrapéritonéale unique et de quelques secondes sur animal adulte vigile réalisée par l’enseignant.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus peuvent être une peur et un léger stress physique de très courte durée avec un léger dommage comportemental totalement réversible et temporaire (5 heures environ). Ce dommage comportemental réside dans les capacités naturelles de la souris à reconnaitre des objets et se définit par une légère capacité mnésique momentanément altérée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni adoptés car injectés avec de la scopolamine.
Remplacement
Dans le cadre du cours, l’analyse du système nerveux et de son implication dans des petites tâches comportementales très basiques est aussi réalisée à partir d’un modèle chez la drosophile. Toutefois les informations apportées ne peuvent être qu’un tout petit complément à celles obtenues chez le mammifère. En effet, le cerveau de la drosophile est petit pour uniquement 100000 neurones au total et son organisation est très particulière : les corps cellulaires des neurones sont massés à la périphérie, tandis que les projections axonales et dendritiques se regroupent au centre. Ce n’est pas du tout le cas du cerveau de la souris. La qualité des études comportementales et l’apprentissage ne peut donc être équivalent. Aucune méthode alternative ne pourra remplacer l’animal dans ce projet. Des enseignements par vidéos sont également utilisés lorsque possible mais sans altérer la qualité d’apprentissage. Tant que l’expérimentation sur rongeurs sera autorisée en recherche, la formation des étudiants aux gestes réalisés eux-mêmes est essentielle.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit à son minimum pour les 24 étudiants répartis en 12 binômes (26 animaux au total, 2 animaux par binôme et deux supplémentaires pour la démonstration par les enseignants). Ce projet pourrait utiliser des animaux surnuméraires d'une activité d'élevage sous la condition d’obtention des souris pour la date précise de l’enseignement.
Raffinement
Tous les efforts techniques sont mis en œuvre pour minimiser au maximum toute douleur et tout inconfort de l’animal. Le bien-être de l’animal sera évalué selon une grille mise en place par la structure du bien-être de l’animal. La qualité des études comportementales en dépend également. Des mesures spécifiques comprendront : une surveillance accrue des animaux, des phases répétées d’habituation en amont de l’expérience, une prise en charge de la surveillance et du déroulement des expériences par un enseignant expérimenté de longue date. Les phases d’habituation seront réalisées entre les souris d’une même cage pour permettre de conserver leur environnement familier. Il n’y a pas de souffrance attendue avec grille de points limites. En cas de problème comportemental inattendu, il sera immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
En Neurobiologie, les modèles animaux sont utilisés lorsqu’aucune alternative n’est disponible. Par exemple chez l’homme, des biopsies cérébrales ne peuvent pas être envisageables contrairement à d’autres tissus. Les modèles animaux permettent d’étudier un processus spontané ou induit, présentant un ou plusieurs aspects communs avec un phénomène équivalent chez l’humain. Ceci est de fait particulièrement utile en Neurobiologie et notamment dans le cadre de maladies dégénératives. Il est donc important dans le cadre d’une formation d’étudiants au domaine des Neurosciences d’aborder ces aspects et de les initier aux expérimentations sur animaux. C’est aussi la possibilité de les sensibiliser directement aux aspects éthiques liés à l’expérimentation animale par un enseignement très adapté. Le modèle murin est le plus adapté pour illustrer les concepts à enseigner. Les animaux sont utilisés adultes (12 semaines). Ce stade est justifié par la nécessité d’avoir un cerveau mature.
Rôle de la ligne mediane du thalamus dans la mémoire à long terme
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
402 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour analyse de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie cérébrale de deux heures trente sous anesthésie gazeuse, puis des tests que le porteur détaille, mesure de l'activité locomotrice pendant 24 heures en cage individuelle, test d'anxiété de dix minutes, et séances répétées de nage en labyrinthe aquatique à 21 degrés pour évaluer la mémoire à long terme. Le porteur reconnaît que l'isolement de 24 heures est une source de stress et que l'eau à 21 degrés provoque une sensation de froid. Il justifie le choix du rat par des capacités cognitives élaborées et un répertoire comportemental complexe, arguments qui décrivent aussi ce que ces individus ont à perdre.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier les structures cérébrales qui permettent aux souvenirs de persister dans le temps. Cette capacité est largement diminuée dans un grand nombre de pathologies cérébrales, telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie à Corps de Levy, le syndrome de Korsakoff mais également dans des troubles psychiatriques tels que la schizophrénie ou encore la dépression. Pour maintenir les souvenirs, une réorganisation progressive de l’information dans des structures cérébrales qui soutiennent la mémoire à long terme, telles que l’hippocampe et le cortex préfrontal médian est nécessaire. Cette réorganisation semble également engager un relais thalamique de la ligne médiane du cerveau. Nos expériences chez le Rat vont nous permettre de comprendre le rôle de ce relai thalamique, et à quel moment de la réorganisation du souvenir il est nécéssaire. Nous questionnerons nos animaux gràce à des taches de comportement qui testent le souvenir de leur environnement spatial.
Bénéfices attendus
En utilisant une espèce animale avec de bonnes capacités d'apprentissage et de mémoire , le Rat, ce projet va nous permettre de mieux comprendre les mecanismses cérébraux de persistence des souvenirs anciens. Cette fonction mnésique représente un des socles de la cognition animale et humaine. Notre compréhension de ces processus neurobiologiques de la mémoire alimente nos seulement des domaines appliqués tels que la modélisation, les théories de l’apprentissage, les sciences de l’éducation mais aussi ces études apporteront des bénéfices en santé humaine car elles ouvriront une piste de cible cérébrale nouvelle et précise pour comprendre les deficits de memoire chez l’Homme.
Procédures
Une chirurgie cérébrale sera réalisée sur tous les animaux de ce projet, sous anesthésie gazeuse contrôlée et continue pendant 2h30. Une analyse comportementale sera réalisée sur une cohorte de 120 animaux vigiles sur une période de 55-60 jours/animal. Ces analyses nous permettront d'étudier le phénotype locomoteur (1 seance de 24h dans un environnement où les mouvements sont quantifiés), l’anxieté (1 séance de 10 min), les capacités de flexibilité cognitive (6 séances, composées chacune de 4 x 1 min dans un environnement aquatique) ou de mémoire à long terme (9+1 séances composées chacunes de 4 x 1 min dans un environnement aquatique). Ces tests auront une durée de 1 à 9 jours consécutifs et seront séparés les uns des autres de 2 jours en moyenne. Une autre cohorte de 252 animaux vigiles participera à l'étude des différentes phases de la consolidation de la mémoire à long terme sur une période de 9 séances consécutives + 1 séance de rappel 5 ou 25 jours après (chaque séance est composée de 4 x 1 min dans un environnement aquatique).
Impact sur les animaux
Pour nos procédures, nous attendons un inconfort suite à la chirurgie intracérébrale. La douleur et l’inconfort pendant la chirurgie seront pris en charge par les anesthésiques, les antidouleurs locaux et la couverture anti-inflammatoire, prolongée après la chirurgie. Les animaux seront observés minutieusement et quotidiennement après la chirurgie par les expérimentateurs formés pour détecter des signes d’inconfort prolongé et les traiter. Suite aux expérience de comportement dans les labyrinthes aquatiques (21°) une sensation de froid peut être générée, mais seulement pour un temps court (1 min). Les animaux s’habituent et nagent très vite se qui raccourcit le temps dans l’eau pendant les phase d’apprentissage à moins de 20 sec. Ils sont ensuite séchés et réchauffés rapidement à la sortie de l’eau avant de retrouver leur cage habituelle et leurs congénères. Les rats seront isolés 24h dans des cages pour mesurer l'activité générale individuelle. Cette phase peut entrainer une nuisance d'isolement social, et peut conduire à un stress durant cette courte periode d'isolement. Pour limiter l'impact de cet isolement social les cages individuelles seront disposées de façon à maintenir le contact visuel, sonore et olfactif avec les congénères et un baton à ronger sera ajouté dans chaque cage.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements et analyses des tissus post-mortem.
Remplacement
Ce projet étudie une fonction cognitive telle que la réorganisation des souvenirs pour les maintenir à très long terme, il ne peut pas être réalisé à l’aide de modèles cellulaires, ni être modélisé par l’informatique et l’I.A. Notons que les modèles murins possèdent des fonctions cérébrales proches de l’Homme, et que les processus pathologiques impliquant la mémoire sont particulièrement étudiés chez ces animaux. Ces modèles récapitulent également des altérations fonctionnelles de l’Homme comme celles de la maladie d’Alzheimer ou même de la schizophrénie. Les études chez le rat représentent ainsi des opportunités uniques pour l'étude de fonctions cognitives essentielles et pour l’ouverture vers de nouvelles approches thérapeutiques et la réalisation de tests précliniques.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux pour permettre des analyses statistiques sur des groupes d’animaux expérimentaux avec leurs contrôles pertinents. L’impact de chaque traitement sera mesuré à l’aide de tests statistiques adaptés. Les calculs faits tiennent compte de la variabilité interindividuelle. Enfin, nous avons établi une progression dans les expériences qui nous permettra de ne pas réaliser les expériences suivantes si une cohorte d’animaux suffit à valider ou à invalider une de nos hypothèses de travail.
Raffinement
Afin de raffiner les conditions de vie des animaux, ils seront maintenus en groupe de 3 tout au long de ces procédures. Une exception pour le test d’activité locomotrice concernant 120 rats qui seront hébergés dans des cages individuelles pour 24h uniquement. Tous les rats bénéficieront de soins appropriés pour optimiser leur bienêtre et un élément (barre à ronger) est renouvelé dans les cages. Une observation soutenue du comportement spontanée dans la cage avec les congénères ou du comportement évoqué en interaction avec les expérimentateurs sera réalisé. Des points limites prédictifs sont mis en place pour limiter la souffrance si un problème devait survenir tout au long des procédures et particulièrement pendant ou après la chirurgie cérébrale. Les rats sont habitués à la manipulation par l’expérimentateur pour réduire le stress lié à la manipulation lors des expériences de comportement.
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle Rat car il possède des capacités cognitives élaborée et un répertoire comportemental complexe. La question cognitive posée requiert un modèle animal possédant une structure neuro-anatomique comparable à celle du cerveau humain, c'est le cas du Rat, mais pas des organismes plus simples tels que c elegans, drosophila, zebra fish. Les structures cérébrales impliquées dans la réorganisation et le maintien du souvenir sont aussi celles qui sont sujettes à des dysfonctionnements et des dégénérescences dans le cadre de pathologie cérébrale et mentale telles que la maladie d’Alzheimer, mais aussi le stress post-traumatique ou la dépression, qui ont en commun de présenter des déficits de la cognition et de la mémoire en particulier. Les animaux arriveront à l'age de 7 semaines pour etre en expérimentation entre 9 et 18 semaines, soit le stade jeune adulte.
Récupération locomotrice après des lésions médullaires chez le rat nouveau-né.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tous tués à l'issue, 231 rats subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère commencées dès les premiers jours de vie. 144 d'entre eux sont opérés de la moelle épinière pendant 45 minutes au maximum, ce qui leur fait perdre l'usage des membres postérieurs, puis reçoivent deux injections quotidiennes pendant cinq jours et une injection par jour d'expérimentation entre le cinquième et le vingt-et-unième jour. Le porteur indique que le stress lié à la paralysie est limité par le maternage et que la prise de poids se normalise après quatre jours. Les tests comportementaux annoncés parmi les moyens réunis pour le projet ne sont pas détaillés, et le porteur affirme qu'aucune approche in vitro ou in silico ne peut modéliser la complexité d'un "organisme entier".
Objectifs
L’objectif principal de ce projet que nous souhaitons atteindre au cours des 5 années à venir est d’établir s’il est possible, et optimiser, le développement de la locomotion à la suite d’une lésion de la moelle épinière survenant au stade néonatal chez le rat. Le choix de la mise en place du projet au laboratoire à cet instant est le fruit d'un travail préparatoire qui a consisté à réunir l'ensemble des moyens matériels (chirurgicaux, tests comportementaux etc.) et l'expertise nécessaire à sa réalisation. En regard de l'absence d'outils non invasifs permettant chez l'homme l'exploration des phénomènes physiopathologiques que nous souhaitons étudier, et du manque de connaissances nécessaires à l'établissement d'outils de modélisation des lésions de la moelle épinière, notre projet ne peut s'abstenir de l'utilisation du modèle animal. Le choix du rat est objectivé par des niveaux de récupérations post-lésionnelles proches de l'humain. Au cours des cinq années, nous utiliserons au maximum 231 rats, chaque groupe expérimental étant constitué de 12 animaux, chiffre qui prend en compte les contraintes statistiques et la nature des expériences/analyses réalisées. Chaque expérience sera lancée dans un premier temps sur un nombre restreint d'animaux afin d'évaluer la pertinence de poursuivre la série expérimentale. Par ailleurs, dans le souci de réduire au maximum le nombre d’animaux dans les projets à venir, nous enrichirons une banque de tissu à partir des animaux utilisés dans ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux appréhender les risques, durant la période périnatale, d’une lésion de la moelle épinière et de développer des protocoles expérimentaux permettant de réactiver les réseaux locomoteurs sous-lésionnels.
Procédures
Les animaux (n = 144) seront soumis à des lésions de la moelle épinière, la durée de l'intervention est au maximum de 45 minutes. Ils recevront également deux injections quotidiennes (un analgésique et un anti-inflammatoire) durant les 5 jours de suivi post-opératoire et une injection sous-cutanée le jour des expérimentations, qui seront quotidiennes entre le jour postnatal 5 et postnatal 21. Enfin tous les animaux recevront une injection d'un analgésique suivi 30 minutes plus tard par l'injection d'un anesthésique le jour de leur euthanasie.
Impact sur les animaux
Les lésions de moelle épinière vont induire une perte de mobilité des membres postérieurs chez les nouveau-nés dont les conséquences en terme de stress notamment physique seront limitées du fait du maternage de la mère et du traitement préventif post-opératoire. Les douleurs inhérantes à l'intervention chirurgicale seront prévenues par la mise en place d'un traitement post-opératoire analgésique et anti-inflammatoire. Les animaux nouveau-nés ayant subi une lésion auront également une prise de poids réduite durant les 4 premiers jours suivant la lésion entrainant un stress physique supplémentaire, cependant leur poids se normalisera les jours suivants, l'alimentation étant assuré par la mère la perte de mobilité n'entraine pas réellement de difficulté pour se nourrir à moyen terme et la récupération fonctionnelle spontanée permet aux animaux de récupérer un niveau de mobilité suffisant pour se nourrir seuls après le sevrage.
Devenir
Tous les animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés à la fin des expériences.
Remplacement
Il n’y a au jour d’aujourd’hui aucunes méthodes alternatives nous permettant d’aborder notre projet sans passer par l’étude de modèles animaux, que ce soit les approches in vitro, ou in silico, qui ne peuvent pas reproduire, ou modéliser la complexité d’un organisme entier.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser le nombre minimal de rats nécessaire pour obtenir des analyses statistiques fiables et cohérentes, nombre dépendant de la technique utilisée. En outre animaux mâles et femelles seront utilisés.
Raffinement
Nos animaux seront hébergées dans une animalerie conventionnelle, au sein de laquelle le bien-être et la santé des animaux sont suivis quotidiennement, permettant de détecter toute anomalie physique ou comportementale potentiellement révélatrice de signes cliniques. Les conditions de stabulations (température hygrométrie, cages, nourriture, litière, enrichissement) sont adaptées au modèle rat. Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Un soin particulier sera accordé à l’observation des animaux, de plus, des traitements appropriés (anesthésie, anti-douleur) sont utilisés pour pallier la douleur associée aux opérations chirurgicales. Pour identifier les dommages et contraintes subis par l’animal, nous avons définis une fiche de suivi du bien-être animal permettant d'établir des points limites adaptés à l'état de l'animal et permettant la mise en oeuvre de traitements rapides et adaptés. L’ensemble des procédures est encadré et mis en œuvre par du personnel dument formé et habilité aux méthodologies utilisées et au bien-être animal.
Choix des espèces
Le choix du rat comme modèle expérimental est motivé par: 1) l'absence de récupération spontanée d'une activité locomotrice en dessous d'une lésion complète de la moelle épinière observée chez le rat qui est extrêmement proche de la physiopathologie humaine; 2) le fait que le rat, notamment la souche non-consanguine Sprague-Dawley, est un animal docile, facile à manipuler, ayant une bonne qualité maternelle, et résistant aux infections d'une façon générale, ce qui est un plus certain pour la réalisation de projets tels que le notre qui incluent un volet chirurgical associé à un aspect développemental; 3) la possibilité de réaliser des lésions spinales chez le très jeune animal sans risque majeur d'augmenter les niveaux de mortalité, sans risque d'abandon de la mère (pré-conditionnée au cours de la gestation) au retour dans la portée à la suite d'une chirurgie. Les animaux seront utilisés des tous premiers stades néonataux à l'âge adulte. La raison principale est que notre projet propose d'étudier l'impact et les conséquences d'une lésion spinale en fonction du stade développemental au cours duquel elle survient. En effet le degré de plasticité, et probablement la nature des phénomènes plastiques, du système nerveux évolue au cours du temps, ce qui implique que les possibilités de récupération post-traumatique, et/ou les modalités en permettant l'émergence varient avec l'âge. Ainsi la récupération locomotrice après une lésion de la moelle épinière chez le jeune animal est supérieure à celle rapportée chez l'adulte.
Evaluation d’un apport de cannabidiol sur l’activité mitochondriale et le maintien de la masse musculaire dans un modèle de cancer de la tête et du cou
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Inoculées d'un cancer de la tête et du cou puis traitées par chimiothérapie au cisplatine, 60 souris mâles seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Le porteur attend une fonte musculaire massive, une perte de poids, de la léthargie, de l'isolement social et une agressivité accrue, et prévoit des jeûnes de seize heures ainsi qu'une contention en tube pour mesurer la composition corporelle. La mise à mort sert à prélever les muscles squelettiques et la totalité du sang. L'hypothèse testée, un effet protecteur du cannabidiol sur le muscle, repose sur des effets que le porteur décrit comme démontrés "principalement in vitro".
Objectifs
La cachexie est un syndrome caractérisé par une fonte musculaire massive, responsable de 25% des décès chez les patients atteints de cancer de la tête et du cou (CTC). Cette perte de masse musculaire est prédictive de l’incidence des complications, de l’efficacité des traitements anticancéreux, et de la survie des patients à long terme. La cachexie est également associée à une augmentation de la fatigue et de la fragilité, à une diminution de l'activité physique entraînant une perte d'autonomie et une dégradation de la qualité de vie. Dans ce contexte, le maintien de la masse musculaire chez les patients atteints de cancer est un défi majeur pour l'amélioration de la réponse aux thérapies et l'amélioration de leur qualité de vie.
Bénéfices attendus
D'après la littérature, l'utilisation du cannabidiol (CBD) semble moduler la respiration mitochondriale, ainsi que le développement et le métabolisme musculaire. Il est largement documenté que la cachexie est associée à un dysfonctionnement mitochondrial et à une atrophie musculaire. Enfin, les effets antinéoplasiques du CBD ont été démontrés dans de nombreux types de cancers, principalement in vitro. Par conséquent, nous postulons que dans notre modèle préclinique de CTC, le traitement au CBD limitera l’atrophie musculaire en favorisant le maintien d'une fonction mitochondriale optimale, et ralentira la croissance tumorale. A l’heure actuelle, les indications retenues par la Haute Autorité de Santé pour l'utilisation du CBD concernent des pathologies neurologiques infantiles et un vaste champ d’expérimentations dans la prise en charge des douleurs cancéreuses est en cours. Notre projet s’intéressera à l’utilisation de cette molécule comme adjuvant à la nutrition et aux molécules de chimiothérapie antinéoplasiques. Malheureusement, seule une partie des patients atteints d'un cancer avancé bénéficient de manière optimale de cette chimiothérapie en raison de la résistance tumorale et des effets toxiques (toxicité hématologique, toxicité du tractus gastro-intestinal, neurotoxicité). Dans le présent programme, nous souhaitons utiliser le CBD comme adjuvant dans le traitement des CTC afin d’améliorer la prise en charge des patients atteints de CTC. L’apport de CBD en plus des traitements anti-cancéreux pourrait ainsi favoriser le maintien de la masse musculaire au cours de ces traitements, ce qui améliorerait leur tolérance et ainsi leur efficacité, et impacterait positivement la qualité de vie des patients. L’utilisation de CBD s’est aujourd’hui démocratisée dans le grand public et son utilisation clinique commence à se mettre en place dans le cadre de l’expérimentation du cannabis à usage médical (pilotée par l’ANSM). Certains traitements comme l’Epidyolex (CBD médical) sont disponibles, et de nombreux effets positifs du CBD sont démontrés. Ainsi, l’utilisation clinique du CBD apparait comme une approche thérapeutique adjuvante intéressante et innovante pour la prise en charge des patients atteints de CTC. Cette utilisation pourrait être facile à mettre en œuvre. Seules manquent des résultats précliniques pour organiser rapidement des études cliniques pour démontrer ces effets positifs chez l’Homme.
Procédures
Les souris incluses dans ce projet seront inoculées avec un cancer par une injection unique de cellules cancéreuses. Deux semaines après cette injection tumorale, un traitement de chimiothérapie par injection de cisplatine (une fois par semaine pendant 2 semaines), et un traitement par injection de CBD (trois fois par semaine pendant deux semaines) seront effectués. Les animaux seront soumis à différents tests permettant d'évaluer leur force musculaire et leur capacité locomotrice. A la fin de ce protocole, les animaux recevront une injection unique de traceurs isotopiques stables pour mesurer la vitesse de synthèse des protéines musculaires. Les animaux seront également soumis à des mises à jeun (de 16h) et à une contention en tube pour l'analyse de leur composition corporelle par echo MRI (imagerie par résonance magnétique nucléaire qui permet de déterminer la masse grasse, la masse maigre, l’eau libre et l’eau corporelle totale d’un petit animal).
Impact sur les animaux
Le protocole expérimental consiste à induire un cancer chez l’animal. Il comprend l'injection de cellules tumorales pour induire un développement tumoral et des injections sous cutanées de cisplatine, cannabidiol et traceurs isotopiques stables. La tumorigenèse peut s'accompagner d'une perte de poids, de comportements anormaux, tels que l'isolement social, la léthargie, l'agressivité accrue ou des altérations de la locomotion. Les différentes mesures de fonctionnalité musculaire, et de composition corporelle réalisées ne seront quant à elles que très peu invasives.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir réaliser les analyses sur les différents tissus prélevés qui permettront de répondre aux objectifs du projet. En effet, le prélèvement des muscles squelettiques est nécessaire pour mesurer le niveau de synthèse protéique au sein de ce tissu. De même, l'ensemble du sang des animaux doit être prélevé pour pouvoir mesurer leur statut inflammatoire et réaliser leur bilan sanguin
Remplacement
L’utilisation d’animaux, dans ce projet est absolument nécessaire et ne peut être remplacée par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire à 2 voire 3 dimensions. En effet, le développement de la cachexie est la résultante d’altérations métaboliques systémiques impactant de nombreux tissus et organes (muscle squelettique, foie, tissu adipeux, système immunitaire…). La complexité tumorale (mélange de cellules tumorales et immunitaires), la complexité du dialogue tumoral avec les différents tissus et la complexité du dialogue entre ces tissus eux même, ainsi que les conséquence de la croissance tumorale sur la fonctionnalité musculaire la mobilité ne peuvent être complètement reproduits in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans en compromettre les objectifs. Le nombre de souris nécessaire à l’étude est calculé pour une variation attendue de 25% du volume tumoral entre les souris porteuses de tumeur traitées au cisplatine ou au CBD et les souris porteuses de la tumeur uniquement. Ainsi, le nombre de souris nécessaire par groupe est de 12 souris. Le nombre total de souris nécessaire à la réalisation de ce projet est donc de 60 souris.
Raffinement
Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Un enrichissement de l'environnement sera mis en place, correspondant en divers éléments (tubes en plexiglass, boules métalliques...). Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque souris, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Une grille d'évaluation définissant des points limites sera mise en place. Elle permettra d'identifier des points limites notables et des points limites graves. Si un animal présente 3 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum. L'atteinte d'un point limite grave entrainera la mise à mort de l'animal concerné . Les points limites et l’arbre de décision adapté à cette étude sont présentés en annexes.
Choix des espèces
Nous envisageons d'étudier l'impact d'une supplémentation en cannabidiol sur la mise en place de la cachexie en réponse au développement tumoral et à son traitement par chimiothérapie. Nous envisageons d'inoculer des cellules cancéreuse chez des souris pour induire un cancer qui sera ensuite traité par injection de cisplatine +/- cannabidiol. Les cellules cancéreuses utilisées dérivent de métastases pulmonaires produites chez la souris en réponse à l'implantation de carcinome épidermoïde de l'oropharynx. Le modèle de tumorigenèse est donc syngénique. Ce type d'expérimentation ne peut pas être menée chez l'Homme. De plus, ce protocole requière de nombreux prélèvements tissulaires dont certains sont très difficile à obtenir chez l'Homme (en particulier au niveau musculaire) et la recherche de métastases au niveau hépatique et pulmonaire. Pour réalisée ce protocole, nous utiliserons des souris mâles agées de 12 semaines. Des souris de cette âge sont couramment utilisées pour ce type d'inoculation de cancer. Nous avons choisi cet âge afin de valider que l'inoculation du cancer que nous décrivons est bien conforme à ce qui a été publié précédemment et pour faciliter la comparaison des résultats que nous obtiendrons avec ceux pré-cités.