Recherche fondamentale

Pour comprendre comment s'installe l'hypersensibilité mécanique, 306 souris reçoivent une injection sous-cutanée de la molécule testée ou d'un placebo, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées ensuite pour prélèvement de tissus. 114 subissent une incision de la peau de la patte au scalpel sous anesthésie et 114 autres l'injection d'un composé inflammatoire dans la patte. La sensibilité de la patte lésée est mesurée avec des filaments calibrés la veille et le lendemain, le porteur indiquant que ces lésions accroissent la sensibilité et peuvent entraîner une perte de poids. Il déclare viser à terme la prescription de la molécule comme antidouleur en clinique, et affirme que la douleur ne peut pas être dissociée du système physiologique global de l'animal.

Objectifs

Depuis 2013, notre équipe travaille sur une molécule nommée Tafa4. Cette molécule est présente naturellement en petite quantité dans notre organisme et celui des souris. Si on supprime cette molécule chez la souris, on transforme une douleur aigue en douleur chronique quel que soit le type de lésion. Nous avons aussi constaté que l'injection de Tafa4 permettait de réduire l'hypersensibilité mécanique suite à une lésion, c’est-à-dire qu’après une lésion, les souris sont moins en douleur. Cette molécule a donc une forte valeur thérapeuthique et notre équipe de recherche se propose d'étudier et de comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine de cet effet. Recemment, nous avons montrés que l'injection de Tafa4 avant une lésion post opératoire (type chirurgie) empêchait la mise en place de l'hypersensibilité mécanique, ou de la douleur chez la souris. Ainsi, ce projet possède un double objectif. D'une part de comprendre comment la preinjection de tafa4 empêche la mise en place de l'hypersensibilité mécanique, augmentant encore son potentiel thérapeuthique. D'autre part, cet effet préventif est le modèle parfait pour comprendre comment l'hypersensibilité mécanique se met en place, ce qui est une question biologique ouverte depuis des années et qui serait à même d'avoir une incidence sur la prise en charge de certaines douleurs.

Bénéfices attendus

Le but final est que TAFA4 soit prescrite comme une molécule antidouleur en clinique. De plus, comprendre comment l'hypersensibilité se met en place ouvrira un nouveau panel de solution pour la prise en charge de patients souffrant de douleurs chroniques.

Procédures

Afin d’étudier l’effet préventif de TAFA4, nous serons ammenés à injecter la molécule (ou un placebo) en sous-cutannée sur toutes les souris (306). 114 d’entre-elles seront opérées chirurgicalement sous anesthésie général. L’anesthésique sera administré par voie intra-péritonéale. La chirurgie consiste en une fine incision de la peau de la patte avec une lame de scalpel. Pour le modèle inflammatoire, nous injecterons un composé inflammatoire dans la patte de la souris sur 114 d’entre-elles. Ces interventions dureront moins de 20 minutes. Un jour avant et un jour après ces procédures, nous mesurerons la sensibilité au niveau de la patte des animaux grâce à des filaments exerçant une pression donnée.

Impact sur les animaux

Avec les differents modèles de lésions post-opératoires et inflammatoires, la sensibilité des souris au niveau de la patte lésée sera acrue. Ces lésions peuvent entrainer une perte de poids. Toutes ces procédures seront réalisées par un personnel qualifié et expérimenté et tout sera mis en oeuvre pour minimiser la nuisance provoquée. Il y aura une surveillance accrue les jours suivant les chirurgies.

Devenir

Les animaux seront mis à mort car nous devons prélever leurs tissus qui seront par la suite analysés. En effet, l’analyse est indispensable pour comprendre les mécanismes de la douleur et nottamment l’effet préventif de TAFA4.

Remplacement

La thématique principale de notre laboratoire étant de comprendre la physiologie de la douleur, notre projet nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes non-animales. En effet, la douleur ne peut être dissociée du système physiologique global de l’animal. L’étude comportementale, constituant le point de départ de notre étude, est le résultat d’une intégration complexe de l’information sensorielle de la périphérie vers des zones spécialisées du cerveau. Ainsi, l’expérimentation animale sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet. .

Réduction

Des stratégies seront mises en place afin d’éviter ou de limiter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions liées à l'étude. Ainsi, l’élaboration précise des protocoles de comportement et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. De plus nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues en réalisant toute une série de tests comportementaux non-invasifs sur le même animal, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Par ailleurs, l’utilisation d’outils statistiques permet d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaire. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables. Les procédures décrites sont appliquées depuis plusieurs années au sein de notre équipe et sont maitrisées par les expérimentateurs. Nous avons donc l'expérience nécessaire concernant la réalisation des procédures et l’évaluation de l'impact sanitaire sur les animaux. La qualité de notre plan expérimental ainsi que l’étude détaillée du nombre d’animaux nécessaires à l’obtention d’un résultat scientifique statistiquement valable nous permettent d’optimiser le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, dans un environnement enrichi (coton et/ou dôme) pour optimiser les conditions d’hébergement et favoriser un comportement normal afin de diminuer au maximum le stress des animaux. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé et 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages. De ce fait, l’état sanitaire et environnemental des animaux sont contrôlés tous les jours. Nous avons recours à l'anesthésie/analgésie lors du procédé chirurgical et des soins pré-, per- et post-opératoires adéquats sont administrés. Les procédures expérimentales seront planifiées (disponibilité des locaux d'expérimentation, du matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation), ce qui permettra de diminuer le stress des animaux et de favoriser la validité des expériences. Enfin, des points limites les plus précoces possibles seront établis en fonction des tests de comportements utilisés. Un examen clinique sera effectué quotidiennement afin de vérifier la cicatrisation et l’état général de l’animal. Toutes ces stratégies d’optimisation seront mises en place dans le but de réduire voire supprimer la souffrance chez l’animal.

Choix des espèces

Chez la souris, les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires à celles décrites chez l’homme. De plus, differents tissus impliqués dans l'intégration nociceptives (peau, neurones sensoriels et moèlle epinière) sont parfaitement décrit chez la souris. La recherche sur la douleur est menée sur les rongeurs mâles depuis des décennies. Pourtant, plusieurs études ont montré que les femmes ont des seuils de douleur aiguë plus bas que les hommes et qu’elles sont prépondérantes parmi les patients souffrant de douleurs chroniques, ce qui suggère fortement des mécanismes sexuellement dimorphiques impliqués dans la perception, la modulation et le traitement de la douleur. Nos travaux seront donc réalisés sur des souris mâles et femelles. Lorsque les phénotypes étudiés sont comparables entre mâles et femelles, les données seront regroupées. Cela aura alors un impact considérable sur le nombre total de souris utilisées

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes reçoivent une injection intraveineuse de vecteur viral sous anesthésie, 980 sont soumises à un régime hypercalorique pendant douze ou vingt-quatre semaines et 500 à des prises de sang, rétro-orbitales pour partie, tous les quinze jours. Le porteur affirme que la maladie du foie gras induite "reste indolore" et ramène les atteintes à un manque d'appétence initial, tout en signalant que l'un des régimes provoque un diabète de type 2 et une polyurie. Il conclut que seuls les modèles in vivo reproduisent le caractère multifactoriel de cette pathologie.

Objectifs

Au cours de la maladie du foie gras (ou NASH), la mort des cellules principales du foie (hépatocyte) alimente l’état inflammatoire au sein de l’organe, participe à la chronicité et à l’aggravation de la maladie. Des travaux ont évalué indépendamment les 3 principales voies de mort cellulaire programmée (apoptose, nécroptose et pyroptose), suggérant que chacune d’elle pourrait contribuer à la mort des hépatocytes. En parallèle, des interconnexions entre ces différentes voies de mort cellulaire programmée ont été découvertes. Ces interconnexions peuvent conduire à un basculement d’une voie de mort cellulaire à une autre si l’une d’elle est inhibée. Une thérapie basée sur l’inhibition de la mort des hépatocytes devra donc cibler les différentes voies impliquées. Pour preuve, un inhibiteur de l’apoptose aggrave la NASH chez l’Homme probablement en favorisant une voie de mort pro-inflammatoire (nécroptose et/ou pyroptose). L’objectif de notre projet vise à évaluer la pertinence d’un ciblage multiple des principales voies de mort cellulaire programmée. Pour cela des lignées de souris génétiquement modifiées pour rendre les hépatocytes résistants à l’apoptose ou/et à la nécroptose ou/et à la pyroptose seront soumises à un protocole expérimental induisant une NASH. Nous comparerons alors la susceptibilité des différentes lignées à développer la maladie afin de déterminer quelle(s) combinaison(s) pourraient permettre de les protéger de la NASH.

Bénéfices attendus

Lors de la maladie du foie gras (NASH), la mort des cellules principales du foie, l’hépatocyte, alimente l’état inflammatoire du foie et contribue à la chronicité de l’hépatite et donc à son aggravation. Ce projet a pour but d’évaluer l’intérêt thérapeutique d’inhiber individuellement ou en combinaison les 3 principales voies de mort cellulaire programmée (apoptose, pyroptose et nécroptose) qui pourraient être activées au sein de l’hépatocyte au cours de la NASH. Ce projet permettra d’évaluer l’éventuelle nécessité d’un ciblage multiple de 2 ou des 3 types de mort cellulaire programmée. En effet, non seulement, différentes voies de mort cellulaire programmée pourraient être induites dans des hépatocytes distincts mais l’existence d’interconnexions entre elles pourrait permettre un basculement vers une voie de mort cellulaire programmée alternative lorsque celle initialement activée est inhibée. Evaluer l’intérêt d’un ciblage multiple sur les différentes voies de mort cellulaire programmée est donc un préalable pour envisager une thérapie visant à prévenir la mort des hépatocytes lors de la NASH.

Procédures

Différents protocoles expérimentaux seront appliqués sur des périodes de temps différentes s’étalant sur 2 semaines au minimum ou sur 25 semaines maximum. La totalité des animaux (1080) recevront une injection intraveineuse sous anesthésie générale pour inoculer soit un vecteur viral contrôle qui n’induit aucune réaction, soit un vecteur viral capable d’induire une recombinaison génétique ciblée. La procédure incluant la mise sous anesthésie, l'injection et le début du réveil dure moins de 5 min. Pour induire une NASH, des groupes de souris (980) seront soumis à un régime hypercalorique, sur une période de 12 ou 24 semaines selon le type de régime, capable d’induire la maladie du foie gras qui reste indolore. Pour suivre l’évolution de la maladie au cours du temps et permettre de réduire le nombre d’animaux à intégrer à l’étude, un prélèvement sanguin (inférieur à 150 µL) sera effectué tous les 15 jours sur toute la période de mise sous régime hypercalorique, sur une partie des animaux (500). Cette procédure de prélèvement intermédaire s'effectueant sous anesthésie durera moins de 5 min.

Impact sur les animaux

La maladie induite (NASH) est une pathologie indolore. Au cours du protocole expérimental, le seul léger désagrément transitoire ressenti par l’animal sera lié au manque d’appétence initiale pour les régimes alimentaires hypercaloriques. Par ailleurs, l'un de ces régimes induit après plusieurs semaines un diabète de type 2 pouvant résulter en une polyurie nécessitant un suivi régulier de l’état hygrométrique de la litière. Ce régime induit également une prise de poids plus importante qu’un régime standard.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour permettre le prélèvement de plusieurs organes nécessaires à l’analyse de différents paramètres cliniques indispensables à l’évaluation du stade d’avancement de la maladie.

Remplacement

Le développement des pathologies du foie comme la stéatose et la stéatohépatite (maladie du foie gras) dépendent étroitement de la communication entre les organes (foie, tissus adipeux, intestins et pancréas notamment) mais aussi de la communication entre les différents types cellulaires qui constituent le foie. Par conséquent, compte tenu de la nature multifactorielle de la physiopathologie de la NASH, de la composition hétérogène du microenvironnement cellulaire et de la contribution du microbiote intrahépatique, seuls les modèles précliniques in vivo permettent jusqu’à présent de reproduire les diverses caractéristiques d’un organisme multicellulaire atteint par cette pathologie.

Réduction

La stratégie expérimentale a été définie de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en vue de l’obtention de résultats statistiquement significatifs tout en évitant des réplicas inutiles. En se basant sur les données de la littérature scientifique utilisant des modèles murins de maladie du foie gras induits par un régime alimentaire hypercalorique, un test statistique de calcul d’effectif minimal a été réalisé. Ainsi, un effectif de 10 animaux par groupe permettra de déceler de faibles variations quantitatives entre les groupes expérimentaux tout en prenant en compte la variabilité inter-individuelle et en conservant une sécurité en cas de perte accidentelle d’un individu lié au hasard. Par ailleurs, la conception du projet en étapes successives permet de limiter l’effectif nécessaire à la réalisation de l’étude. Ainsi, un arbre décisionnel d’intégration des lignées dans les étapes successives a été établi. La première étape sert à valider les vecteurs viraux sur un nombre limité de souris avant d’engager les étapes suivantes impliquant un plus grand nombre d’animaux. Alors que les 7 lignées de souris seront intégrées à l’étape suivante, seules celles présentant un phénotype spécifique de protection ou d’aggravation seront incluses aux étapes ultérieures. Enfin, un suivi longitudinal de l’évolution de la maladie par prises de sang régulières évite la constitution de groupes de souris supplémentaires pour des points de cinétique intermédiaires additionnels.

Raffinement

Les études seront conduites dans des installations modernes et agréées pour assurer un confort maximal aux animaux. Un suivi régulier de l’état des animaux sera mis en œuvre, a minima de façon hebdomadaire lors des pesées ou plus régulièrement si nécessaire. Par ailleurs, un grand nombre de mesures sur les échantillons prélevés sont envisagées pour récolter un maximum d’informations. Les manipulations sur les animaux seront réalisées sur des temps courts par un personnel expérimenté, dans une pièce d’expérimentation dédiée distincte de la pièce d’hébergement où résident leurs congénères. Toutes les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’au moins une semaine avant d’intégrer un protocole expérimental. Pour conserver une sociabilisation, les animaux d’une même fratrie seront hébergés à plusieurs au sein des cages. En cas de nécessité d’hébergement individuel lié à de l’agressivité de dominance, les cages disposeront d’un enrichissement approprié. Une anesthésie générale sera effectuée pour les injections ou les prélèvements retro-orbitaux et un anesthésique locorégional sera appliqué pour diminuer l’inconfort induit.

Choix des espèces

Cette espèce (souris) permet de modéliser la pathologie humaine sur des temps raccourcis à l’échelle de vie de cet animal. Par ailleurs, ce modèle murin permet de tester in vivo les conséquences de l’absence d’expression au sein de l’hépatocyte d’une ou plusieurs protéines potentiellement impliquées dans la pathologie. D’ailleurs, des animaux génétiquement modifiés sont déjà disponibles auprès de la communauté scientifique pour cibler spécifiquement les protéines d’intérêts identifiées pour ce projet. Les souris seront incluses aux protocoles expérimentaux au stade d’adultes (8 semaines). En effet, la pathologie du foie gras (NASH) se développe essentiellement chez les adultes. L’âge est d’ailleurs un facteur de risque majeur dans le développement de la NASH.

Toutes tuées à l'issue, y compris les reproducteurs transgéniques tués à six mois puis remplacés, 8 132 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré pour tester des vecteurs de thérapie génique contre la surdité. Elles subissent cinq à six tests auditifs sous anesthésie, des injections intrapéritonéales de tamoxifène et une chirurgie intracochléaire de vingt minutes. Le porteur reconnaît que cette chirurgie peut léser l'oreille injectée et faire perdre l'audition, tout en indiquant qu'il ne s'attend à aucun signe de souffrance ni d'inconfort, la surdité provoquée restant unilatérale. Il affirme qu'aucune alternative n'existe, faute de pouvoir mettre en culture les systèmes auditifs périphérique et central.

Objectifs

Entendre, c’est pouvoir identifier et localiser les sources sonores dans l’espace, de jour comme de nuit ; l’audition contribue ainsi à la sécurité des individus. L’audition est devenue chez l’homme le sens prépondérant sur lequel repose la communication inter-individuelle. Or, l’importance de l’audition continue d’être fortement sous-estimée : le risque que la perte de l’audition fait peser sur les individus, risque qui inclut le déclin des fonctions cognitives, n’est ni compris, ni anticipé et les campagnes d’information et de prévention ont été jusqu’ici peu fructueuses. Par leur ampleur et leurs conséquences, les atteintes de l’audition constitueront, avant 2030, la 7ème cause la plus importante d’invalidité au quotidien, selon l’organisation mondiale de la santé. La thérapie génique est une approche thérapeutique de choix pour le traitement de maladies héréditaires. Elle représente une piste de plus en plus explorée pour le traitement des déficits auditifs précoces et profonds. Il a récemment été montré que plusieurs cas surdité liée à l’âge sont des troubles génétiques potentiellement traitables par thérapie génique. Le présent projet vise à établir la preuve de concept d’efficacité thérapeutique de vecteurs de thérapie génique que nous développons pour traiter/stopper la progression de surdités génétiques. La thérapie génique pourra être réalisée à tout moment, en fonction du modèle expérimental de surdité humaine auquel on s’adresse, précoce ou à développement tardif.

Bénéfices attendus

La thérapie génique est une approche thérapeutique de choix pour le traitement de maladies héréditaires ; elle représente une piste de plus en plus explorée pour le traitement des déficits auditifs précoces et profonds mais pas pour les déficits auditifs postnatales dont la presbyacousie. Cependant, il a récemment été montré que plusieurs cas surdité liée à l’âge sont des troubles génétiques potentiellement traitable par thérapie génique. De plus, il a récemment été mis en évidence l’existence de forme génétique de presbyacousie. Le présent projet vise à établir la preuve de concept d’efficacité thérapeutique de certains vecteurs de thérapie génique que nous développons pour traiter/stopper la progression des surdités. La thérapie génique pourra être réalisée à tout moment, en fonction du modèle expérimental de surdité humaine auquel on s’adresse, précoce ou à développement tardif. Si les résultats sont probants, ce projet pourrait poser les bases d’un développement clinique.

Procédures

Les animaux des modèles de surdité seront soumis à des tests auditifs, au nombre de 5 à 6 maximum, avec un intervalle minimal d’au moins un mois entre chaque tests. Le test complet correspond à une anesthésie fixe puis une mesure des amplitudes de la réponse auditive du tronc cérébral et suivie d’une mesure des produits de distorsion des otoémissions acoustiques. L’ensemble de la procédure prend entre 30 et 45 minutes. Les tests auditifs seront réalisés au plus tôt à P16. Des animaux seront soumis à des injections avec une dose unique ou fragmentée (3 fois maximum sur une même semaine) par voie intrapéritonéale avec 100µL d'une solution de tamoxifène (une injection prendra quelques secondes Les animaux seront soumis à des injections de vecteur de thérapie génique qui seront réalisées par voie intra cochléaire une seule fois sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane. L’ensemble de la chirurgie ne durera pas plus de 20 minutes.

Impact sur les animaux

Pour ce projet, les nuisances et effet indésirables attendus sur les animaux sont l’induction de la surdité (surdité congénitale ou acquise, profonde ou modérée, selon le modèle) et les suites de la chirurgie nécessaire à l’administration des vecteurs viraux dans la cochlée. Concernant l’induction de la surdité chez l’animal, nous ne nous attendons pas à ce que les animaux développent des signes souffrance ou d’inconfort. Nous ne nous attendons pas à ce que l’injection du tamoxifène puisse engendrer des effets secondaires. Nous nous attendons à ce que la chirurgie de la cochlée puisse entrainer des lésions et donc une baisse/perte d’audition de l’oreille injectée. La surdité potentielle étant unilatérale, nous ne nous attendons pas à ce que les animaux développent des signes souffrance ou d’inconfort. Concernant les suites chirurgicales, l’état général des souris sera régulièrement suivi après l’injection des vecteurs AAV afin de détecter les signes potentiels de souffrance ou d’inconfort (infection ou problème de cicatrisation du site d’injection, souriceau cyanosé ou délaissé par la mère, cachexie, expression faciale de souffrance (yeux plissés, oreilles couchées vers l’arrière), prostration, immobilité, poil non toiletté).

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort. Animaux pour élevage : Les anciens reproducteurs sont des animaux transgéniques ne pouvant être adoptés, ils seront mis à mort au bout de 6 mois et renouvelés Animaux utilisés pour les expériences : Pour réaliser nos analyses histologiques sur les oreilles internes, les animaux seront mis à mort. Post mortem nous prélèverons donc les cochlées pour évaluer infra cliniquement performances de nos stratégies de vectorisation.

Remplacement

Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central de rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. Aujourd’hui, il n’existe aucune alternative à l’expérimentation animale, car nous avons besoin d’étudier le système auditif dans son ensemble (de l’oreille interne au cortex auditif). Il n’est pas possible aujourd’hui de mettre en culture les systèmes auditifs périphériques et centraux. De plus, aucun modèle informatique n’existe pour simuler le fonctionnement du système auditif dans son ensemble.

Réduction

Les groupes sont constitués afin de garantir une puissance statistique de 80% pour des différences de 10%. Nous utilisons classiquement les tests de student, de Mann-Whitney, test du Xhi2, et ANOVA pour tester la significativité de nos résultats. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et génotypons les animaux afin de ne pas maintenir inutilement les animaux qui ne portent pas les modifications génétiques d’intérêt pour ce projet. Nous avons établi des tests de criblage de capsides in vitro pour réduire le nombre de vecteurs candidats à tester in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisé à son strict nécessaire. De plus nous nous appuyons sur les données obtenues dans nos précédentes expériences pour le nombre de vecteurs candidats à tester in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisé à son strict nécessaire.

Raffinement

Les animaux du projet seront suivis quotidiennement. Ce projet ne concerne que des procédures dont la mise en œuvre ne devrait se traduire ni par une dégradation de l’état de santé de l’animal ni par des douleurs importantes. Si nous observions un comportement anormal en termes de santé (perte de poids, du pelage, etc.) dès l’initiation de l’intégration dans un groupe expérimental, l’animal serait immédiatement mis à mort. Un bâtonnet de coton sera ajouté dans les cages d’hébergement pour faciliter la nidification, ainsi qu’un igloo pour les femelles avec portée. L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies de souris adultes. Nous utiliserons un matériel miniaturisé pour l’anesthésie gazeuse des animaux entre 0 et 21 jours après la naissance. Les animaux anesthésiés seront gardés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans une cage propre et pourvue d’une coupelle de gel nutritif hydratant. Les animaux opérés seront surveillés tous les jours pendant une semaine après chirurgie puis deux fois par semaine minimum la semaine suivante pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort tels que décrits dans notre grille d’évaluation de référence.

Choix des espèces

Nous souhaitons recourir aux souris de laboratoire dont le système auditif est similaire à celui de l’homme. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. L’audition se met en place chez la souris autour de 10 jours après la naissance ; avant 8 jours après la naissance, le système auditif est immature, à 16 jours après la naissance le système auditif est fonctionnel, et à 30 jours après la naissance et au-delà, le système auditif est mature. En fonction des modèles de déficits auditifs (congénital ou induit), les animaux seront utilisés dès la naissance ou à l’âge adulte.

1 144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 992 reçoivent une injection intramammaire de cellules tumorales sous anesthésie, suivie de trois à quatre semaines de croissance tumorale, d'une à deux vaccinations intramusculaires et de deux à quatre injections intrapéritonéales. Le porteur précise que même les souris dont la tumeur a disparu sont tuées, leur système immunitaire modifié empêchant selon lui toute réutilisation, replacement ou adoption. Il affirme qu'aucun système cellulaire in vitro ne peut remplacer la recherche vaccinale et que la réponse anti-tumorale doit s'observer dans un "organisme entier".

Objectifs

Les cancers sont caractérisés par la prolifération incontrôlée de cellules qui subissent une transformation maligne. Le système immunitaire a un rôle majeur dans le contrôle de cette prolifération et plus particulièrement les lymphocytes T cytotoxiques, capables de détruire les cellules tumorales de façon spécifique. L’utilisation d’une vaccination thérapeutique basée sur des vecteurs lentiviraux ayant pour cible des antigènes tumoraux pertinents dans le cancer du sein, pourrait être particulièrement efficace pour permettre l’activation des lymphocytes T spécifiques de ces antigènes et le contrôle immunitaire de la prolifération tumorale. L’objectif du projet est d’établir la preuve de concept de cette immunothérapie contre le cancer du sein et d’étudier les mécanismes du contrôle immunitaire mis en place dans l’organisme par une immuno-thérapie basée sur des vecteurs lentiviraux. Ultimement, les vaccins candidats ayant une activité anti-tumorale notable seront développés en vue d’un essai clinique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme sont la preuve du concept d'utilisation des vecteurs lentiviraux dans la vaccination contre le cancer du sein. Les vecteurs lentiviraux codant pour des antigènes pertinents se sont révélés sûrs et efficaces comme des candidats vaccins contre des flavivirus (ZIKA et Dengue), le SARS-CoV-2, Mycobacterium tuberculosis, d'autres agents pathologiques, ainsi que des tumeurs induites par des «Human Papilloma Virus» (HPV). Le dernier est en cours d’obtention de l’approbation de la FDA pour entrer en phase clinique I/IIa de traitement des cancers du col de l’utérus ou oro-pharyngés résultant des infections par HPV aux USA en 2024. Avec le projet actuel du cancer du sein, nous espérons prouver que les vaccins à base de vecteurs lentiviraux pourront être plus efficaces que les vaccins à base de peptides ou protéines adjuvantés ou d'ARN messager dans le cancer du sein. Les avantages à long terme seront l'utilisation de ces vaccins en clinique contre le cancer du sein.

Procédures

Dans une procédure de sévérité légère, environ 72 souris au maximum seront immunisées avec un candidat vaccin (quelques secondes), et mises à mort au bout de 30 jours afin d'analyser leur réponse immunitaire. Les autres procédures de sévérité moyenne, et à appliquer à un maximum de 992 souris, comprennent dans un premier temps l'injection intra-mammaires de cellules tumorales (quelques secondes) sous anesthésie gazeuse puis la surveillance de la croissance tumorale pendant 3 à 4 semaines. La vaccination sera ensuite réalisée en intramusculaire via 1 à 2 injections espacées de 3 semaines (quelques secondes). Dans le cadre de la dernière procédure, les souris subiront également 2 à 4 injections en intrapéritonéale (quelques secondes) sous deux semaines.

Impact sur les animaux

Les souris ressentiront une légère douleur au moment de l'injection mammaire du petit volume de suspension cellulaire. L'injection de cellules tumorales sera effectuée sous anesthésie générale. Normalement, la croissance de la tumeur est bien tolérée par les souris, mais peut dans certains cas s’associer à une perte d'activité normale, en particulier si la tumeur atteint la taille limite. La période maximale de nuisance sera de 1 à 2 jours.

Devenir

Les souris présentant des tumeurs seront mises à mort pour des raisons éthiques (pour éviter les souffrances). Si les souris ne présentent plus de tumeur grâce aux différents traitements, elles seront suivies pendant deux mois. Même les souris sans tumeur ne peuvent être réutilisées car leur système immunitaire a été modifié par la vaccination. Par conséquent, tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.

Remplacement

L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité de candidats vaccins destinés à l’humain. Ce type d’étude implique nécessairement une phase d’expérimentation animale du fait de la complexité de la réponse vaccinale et anti-tumorale au niveau d’un organisme entier. Cette étape constitue une preuve de concept requise par les agences réglementaires de santé en vue d’une application chez l’humain, en complément des études réalisées in vitro. Actuellement, aucun système cellulaire in vitro ne peut être utilisé pour remplacer la recherche vaccinale et immuno-thérapeutique sur les animaux.

Réduction

Sur les conseils d’un biostatisticien, les groupes seront constitués de 5 à 10 animaux, en fonction de la nature de l’expérience, et du fait de la variabilité de la croissance tumorale de façon à obtenir des différences statistiquement significatives entre les groupes, pourra être réduit si la variabilité observée est moins élevée que celle actuellement estimée. Des études précédentes ont permis d’optimiser le protocole de vaccination avec des vecteurs lentiviraux et de définir la cinétique de vaccination permettant de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les vecteurs lentiviraux seront préalablement validés par des études d’immunogénicité chez la souris afin de s’assurer qu’ils permettent la mise en place de réponses cellulaires T spécifiques des tumeurs chez la souris. Avant chaque procédure, le résultat des procédures précédentes sera pris en considération. Si un candidat vaccin n'a pas d’effet significatif sur la croissance de la tumeur, les procédures suivantes, qui devraient permettre de comprendre le mécanisme d'action d'un vaccin, ne seront pas réalisées.

Raffinement

Selon notre expérience antérieure, l’injection de vecteurs lentiviraux n’induit aucun signe clinique chez les souris. L’implantation de tumeurs mammaires peut induire une gêne modérée, qui sera contrôlée au cours des expériences. Les tumeurs seront implantées seulement au niveau des 4èmes glandes mammaires (gauche ou droite) où, par rapport aux glandes mammaires situées plus haut, il y a plus d’espace pour la croissance tumorale et par conséquent sans gêner la mobilité des souris afin de limiter à minima la gêne occasionnée par la tumeur. Les animaux seront observés pour détecter tout signe d’inconfort ou de souffrance, si un point limite (nécrose ou la taille de tumeur) est atteint. La souffrance des animaux sera abrégée par leur mise à mort. Si les signes cliniques de souffrance sont légers, mais néanmoins présents, comme des poils hérissés, inactivité, plusieurs mesures seront prises, incluant l’ajout de gel hydrique, réhydratation sous cutanée, chauffage des cages ou bien l’amélioration de l’enrichissement qui consistera à ajouter la litière à base de cellulose quand les tumeurs seront palpables pour éviter l’irritation par les coupons de bois.

Choix des espèces

Le système immunitaire de la souris est proche du système immunitaire humain. Il existe de nombreux modèles de tumeurs qui peuvent être utilisés chez la souris pour tester nos candidats vaccins. De plus, des études précédentes montrent que les vecteurs lentiviraux sont immunogéniques chez la souris et de nombreux outils sont disponibles pour étudier les réponses immunitaires chez cette espèce. Les expériences envisagées requièrent des animaux avec un système immunitaire fonctionnel. Elles seront donc menées sur les souris adultes âgées de 6 semaines au minimum.

840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique de quatre-vingt-dix minutes, une privation alimentaire maintenue à 90 % de leur poids pendant environ huit semaines et treize semaines de régimes lipidiques modifiés, puis un conditionnement opérant où il faut appuyer sur un levier pour obtenir de la nourriture. 720 sont tuées pour analyse histologique et les 120 géniteurs à sept ou huit mois, à la fin de leur période de reproduction. Le porteur qualifie les effets de la privation alimentaire de "très limités" et justifie le recours aux souris par des dimensions comportementales qu'il déclare non modélisables in vitro ou in silico.

Objectifs

Le but de ce projet est de déterminer quelles sont les types de neurons qui sont vulnérables à une déficience en acides gras polyinsaturés (AGPI) de type n-3. Pour cela, nous utiliserons une approche transgénique qui permettra de restaurer les taux d'AGPI dans des populations spécifiques de neurones en situation de carence générale en AGPI n-3. Nous testerons les processus de prise de décision par des tâches comportementales de conditionnement opérant où l'animal doit appuyer sur un levier pour obtenir une récompense alimentaire. Nous mesurerons l'activité neuronale par des approches d'imagerie in vivo chez l'animal se comportant.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de comprendre comment le statut cérébral en AGPI - qui est perturbé dans plusieurs pathologies psychiatriques- influence les processus de prise de décision.

Procédures

Les procédures de conditionnement opérant nécessitent une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum) durant environ 8 semaines - 1 chirurgie stéréotaxique d'environ 90 minutes- Exposition chronique à des régimes modifiés en lipides pendant environ 13 semaines

Impact sur les animaux

Une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum) a des effets très limités pour l'animal. Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération. L'exposition chronique à des régimes modifiés en lipides n'a pas d'impact évident pour l'animal.

Devenir

Tous les animaux expérimentaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour procéder à des analyses histologiques (720). Les géniteurs (120) seront mis à mort à l'âge de 7-8 mois, à la fin de la période de reproduction.

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. En particulier, nous utiliserons une stratégie de croisements génétiques qui permettra l'utilisation de tous les animaux de la descendance et comparerons les mâles et les femelles. Du fait de cette stratégie, tous les animaux (génotypes et sexes) issus de nos croisements seront utilisés. Le nombre d'animaux nécessaires est basé sur des expériences précédemment effectuées au laboratoire permettant de révéler des différences statistiques entre groupes.

Raffinement

Tous les efforts seront faits pour réduire la souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en cages collectives et environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). Du fait de la déprivation alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille et seront consignés sur une fiche de scorage. Si un score élevé persiste pendant plus de 48h les animaux seront mis à mort. Dans tous les cas, si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera mis à mort dans les 48h.

Choix des espèces

Ce projet nécessite l'utilisation de modèles transgéniques disponibles uniquement dans des modèles souris. Les animaux expérimentaux seront utilisés à l'âge adulte (>8 semaines) puisque le projet vise à évaluer les conséquences fonctionnelles des manipulations en AGPI sur le cerveau mature.