Recherche fondamentale

32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse de leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une séquence d'ultrasons destinée à ouvrir temporairement la barrière qui protège le cerveau, une injection intraveineuse par cathéter posé dans la veine de la queue, et des séances d'imagerie sous anesthésie de deux heures répétées jusqu'à deux fois par semaine. Le porteur indique que l'ouverture de cette barrière provoque de légers dommages cérébraux dans moins de 10 % des cas, avec des douleurs transitoires possibles. Il présente les ultrasons comme un "espoir majeur" pour des maladies génétiques cérébrales sans traitement, alors que le projet se limite à évaluer le passage de particules virales et l'état du cerveau après traitement.

Objectifs

La principale limite à l'efficacité des thérapies dans le cerveau est leur accès restreint en raison de la barrière protégeant le cerveau de tout élément pouvant être toxique, mais limitant aussi le passage de la majorité des médicaments. Récemment, une technique utilisant des ultrasons a attiré l'attention en tant que moyen non invasif pour perturber temporairement cette barrière. Les ultrasons permettent de perturber cette barrière à travers le crâne et donc sans opération chirurgicale nécessaire. Dans cette étude, nous évaluerons chez la souris le potentiel thérapeutique de cette approche. En plus des données que nous obtiendrons avec des séances d'imagerie médicale, reflétant le caractère réversible ou non de l’ouverture de la barrière, nous évaluerons la durée d'efficacité du traitement. Enfin, nous étudierons les modifications provoquées dans le cerveau après avoir reçu une onde ultrasonore afin d’en évaluer l'intégrité après traitement.

Bénéfices attendus

Les ultrasons représentent un espoir majeur de traitement de nombreuses pathologies cérébrales tel que les maladies génétiques. Des essais cliniques utilisant cette technique chez l'homme sont en cours. Nous souhaitons ici évaluer des approches plus performantes que les traitements habituels et profiter d'une délivrance par ultrasons. Avec le développement en cours des ultrasons chez l'homme, les méthodes que nous proposons pourraient bénéficier d'un transfert rapide vers l'homme. Dans le cas de maladies génétiques, nous souhaitons évaluer le potentiel des ultrasons pour administrer un traitement efficace et durable dans le cerveau. Cette approche pourrait permettre de corriger, au niveau génétique, des anomalies au niveau cérébral, ce qui représente un espoir conséquent pour les personnes atteintes de ce type de maladie, qui ne disposent à ce jour d'aucun traitement efficace, à l'exception de traitements de leurs symptômes.

Procédures

Tous les animaux seront exposés à une séance d'imagerie médicale anatomique pour une durée maximale de 2h, anesthésie incluse. Pour les besoins de l'imagerie médicale effectuée dans ce projet, une partie des animaux recevront une injection permettant d'améliorer la qualité de l'image. Tous les animaux recevront une séquence ultrasonore ainsi qu'une injection intraveineuse de notre traitement. Tous les animaux seront également exposés à des séances d'imageries servant à évaluer l'efficacité du traitement et nécessitant une injection dans l'abdomen, ces séances pouvant être répétées jusqu'à 2 fois par semaine.

Impact sur les animaux

De possibles douleurs transitoires pourraient apparaître suite à l’apparition de légers dommages dans le cerveau provoqués par l'ouverture de la barrière le protégeant, visualisables par imagerie médicale (fréquence observée inférieure à 10%). Notre protocole nécessite une pose de cathéter dans la veine de la queue, ainsi que des injections dans l'abdomen qui seront réalisées sous anesthésie générale, présentant des contraintes de classe légère pour les animaux et n’engendre pas de souffrance ou de stress. Le transport entre les laboratoires du projet peut également générer un léger stress ou inconfort chez l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin d'en analyser les tissus.

Remplacement

Le projet portant sur l’étude de la réponse du cerveau, et plus particulièrement la barrière le protégeant, il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. De plus, il n'existe pas à ce jour de méthodes alternatives, n'impliquant pas d'animaux vivants, qui permettent l'étude du passage de particules virales à travers cette barrière grâce aux ultrasons. L’étude qui en découle comporte des analyses du cerveau afin d'évaluer l’impact cellulaire des ultrasons qui ne sauraient être remplacées par un modèle informatique ou cellulaire.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé avec l’aide d’un logiciel permettant d’évaluer le nombre d’animaux minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives sur les paramètres à mesurer. Ce nombre tient compte des risques de mort et d’exclusion d’un animal lors des différentes procédures. Le nombre d’animaux nécessaires à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats. Le suivi de l'efficacité du traitement se faisant sur plusieurs semaines pour chaque animal, notre étude nécessite très peu de groupes de souris.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l'hébergement des animaux de l'Annexe II du premier février 2013 de l'arrêté fixant les conditions d'agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l'environnement. Toutes les mesures seront prises pour réduire la souffrance des animaux. L’ensemble des expérimentations seront réalisées sous anesthésie adaptée, les animaux seront maintenus en température et un suivi de la fréquence cardiaque et respiratoire sera effectué lors des séances d'imagerie médiale et de traitement par ultrasons. L'imagerie médicale nous permettra également de visualiser l'apparition d'éventuel dommage au cerveau avant le réveil de l'animal, permettant une administration préventive d'un analgésique dans ce cas. Une échelle de cotation de douleur basée sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d'évaluer l'état général de chaque animal et de définir des points limites, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l'animal. De plus, dans le cas où certains signes de douleurs seraient observés, sans dépassement des points limites, un traitement sous-cutané avec un analgésique sera mis en place.

Choix des espèces

L’ensemble des animaux utilisés seront des souris à l'âge adulte, soit à partir de 6 semaines. Nous avons optimisé les protocoles pour des animaux de ce calibre, ce qui nous permettra un transfert sans difficulté pour ces expérimentations.

Pour étudier le rôle de l'acide rétinoïque dans la production des spermatozoïdes, 1 050 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées entre l'âge de quinze et vingt-neuf jours par perfusion d'un fixateur sous anesthésie létale. Les souriceaux subissent une biopsie de queue dès le premier jour de vie, puis des injections de rétinoïdes, d'inhibiteurs de kinases et d'un traceur cellulaire. Trois mâles sur quatre n'ont pas le génotype recherché et sont tués sans qu'aucun prélèvement soit fait sur eux, et le porteur ajoute 25 % d'animaux pour couvrir un risque qu'il qualifie d'"élevé" d'abandon ou de cannibalisme par la mère, provoqué par la manipulation précoce des nouveau-nés. Il conclut que le remplacement par un système in vitro est "impossible".

Objectifs

La spermatogenèse est le processus de formation des gamètes mâles - les spermatozoïdes, à partir des cellules souches appelées spermatogonies. Ce processus se déroule dans les tubes séminifères du testicule. Une étape cruciale de la spermatogenèse est la méiose, qui permet des échanges entre les gènes, contribuant ainsi à la diversité génétique. Selon la littérature, l'acide rétinoïque, le métabolite actif de la vitamine A, est une molécule essentielle qui régule différentes phases de la méiose. L'inactivation d'un ou plusieurs acteurs de la voie de signalisation de l'acide rétinoïque conduit à un blocage de la spermatogenèse, entraînant par conséquent l'infertilité. L’acide rétinoïque peut exercer des effets génomiques, en se liant à ses récepteurs dans le noyau de la cellule, mais il peut également induire des effets non génomiques, en régulant des protéines kinases présentes dans le cytoplasme de la cellule. Dans ce projet nous utilisons des souris mutantes (pour les voies de synthèse de l’acide rétinoïque) présentant un arrêt de la spermatogénèse. Chez ces souris mutantes, on note également une sur-activation de certaines protéines kinases dans le testicule. En employant une approche pharmacologique, nous déclenchons de manière contrôlée et simultanée la différenciation de toutes les spermatogonies puis nous administrons différentes substances activatrices de la voie de signalisation de l’acide rétinoïque ou inhibitrices de tyrosine kinases, afin d'étudier leur implication dans le processus de la méiose. Les testicules des animaux traités servent à réaliser les analyses qui doivent permettre de comprendre le rôle de ces différentes voies dans la méiose.

Bénéfices attendus

Des études pharmacologiques montrent un blocage de différenciation des spermatogonies chez l’Homme, lorsque la synthèse de l’acide rétinoïque est bloquée. En comprenant comment les voies de signalisation de l'acide rétinoïque et des tyrosines kinases (potentiellement contrôlées par l'acide rétinoïque) agissent sur les spermatogonies et la méiose chez la souris, nous obtiendrons des pistes pour évaluer si des cas d'infertilité Humaine, qui sont en augmentation constante dans le monde, sont liés à des altérations du fonctionnement de ces voies de signalisation. La possibilité de perturber temporairement la signalisation de l'acide rétinoïque représente également une stratégie pour développer de nouveaux contraceptifs masculins non chirurgicaux.

Procédures

Toutes les interventions décrites ci-dessous nécessitent d’immobiliser les souris avec la main (contention non traumatisante de 20 à 30 secondes). - Biopsie de queue (entre le 1e et le 3e jour) sur animaux vigiles pour génotyper les animaux. Réalisée 1 fois dans leur vie. - Administration d’un médicament à l’âge de 4 jours pour rétablir et synchroniser la différentiation des spermatogonies. Réalisée 1 fois dans leur vie. - Administration d’un médicament à l’âge entre 10 et 12 jours (1 injection pour les rétinoïdes, 3 injections pour les inhibiteurs des kinases) pour sauver les cellules méiotiques de la mort. - Administration d’une molécule traceuse de cellules à l’âge de 10 jours pour suivre l’évolution d’une cellule. Réalisée 1 fois dans leur vie. - Administration d’anesthésique/analgésique en dose létale pour perfuser un fixateur histologique. Etape finale de mise à mort réalisée entre l’âge de 15 jours et 29 jours. Les souris sous anesthésie générale profonde en moins de 5 minutes. La perfusion (10 minutes) résulte en la mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Nous générons des souris porteuses d’une mutation restreinte à deux types cellulaires du testicule et aucun phénotype dommageable n’est attendu ; le phénotype attendu se limitant à une stérilité non obstructive chez les mâles. Une biopsie de la queue est réalisée pour le génotypage. La taille de l’échantillon de queue ne dépasse pas 0.5mm pour limiter la nuisance engendrée par cette biopsie. L’administration de substances (rétinoïdes, inhibiteurs de kinases, traceur cellulaire, anesthésique ou analgésique) entraîne une douleur équivalente à celle de l’introduction d’une aiguille sous la peau.

Devenir

Après la réalisation du génotypage, les mâles ne présentant pas le génotype d'intérêt seront exclus de la procédure et euthanasiés sans prélèvement (3/4 des mâles). Tous les animaux mutants sont euthanasiés en fin de procédure pour prélever les testicules.

Remplacement

La production de spermatozoïdes, appelée spermatogenèse, est un processus complexe qui implique différentes cellules dans les testicules. Les interactions entre ces cellules sont cruciales pour assurer une production constante de spermatozoïdes. Notre étude vise à examiner le rôle de l'acide rétinoïque – métabolite actif de la vitamine A, et des protéines de type tyrosine kinases, qui sont potentiellement régulées par l’acide rétinoïque, dans un contexte physiologique naturel préservant ces interactions cellulaires. Il est donc indispensable qu’une approche expérimentale avec des animaux soit employée pour répondre à ces questions. Le remplacement par un système in vitro (1er R de la règle des 3R) est impossible.

Réduction

Notre étude se concentre sur la production des spermatozoïdes, donc seulement les mâles (environ la moitié des naissances) participent aux expériences. On identifie et prélève un petit échantillon de queue le plus tôt possible afin de déterminer le type génétique et sélectionner les mâles mutants. La suite de la procédure n’est réalisée que pour les mâles mutants sélectionnés. Ils représentent un quart des mâles produits avec les croisements mis en place, et la proportion ne peut pas être augmentée. Il sera donc nécessaire de quadrupler l’effectif (quadruple). Le risque d'abandon par la mère ou de cannibalisme au cours de la procédure expérimentale est élevé dû à la manipulation précoce des nouveau-nés. Afin de prendre en considération ces risques, nous prévoyons d’augmenter l’effectif des animaux de 25%. Cependant, dès que le nombre de mâles requis pour un traitement donné sera atteint, les prélèvements pour le lot correspondant seront arrêtés, 25% représentant une valeur limite maximale. Par ailleurs, au cours de notre étude, nous serons à même d’estimer plus finement le pourcentage de risque lié à la manipulation des nouveau-nés, ce qui permettra d’ajuster les effectifs et de réduire au maximum l’utilisation des animaux dans les futurs projets. Nous comparons et analysons des groupes de mâles mutants traités de différentes manières (7 conditions au total). Nous analysons l’évolution de la méiose - processus de combinaison des gènes maternels et paternels assurant la formation d’une nouvelle cellule qui va se maturer en spermatozoïde. Nous étudions 2 points clé de la méiose et nous analysons aussi son produit final à un stade plus tardif (3 stades). Nous avons besoin de 10 mâles pour chaque groupe expérimental : 5 pour des analyses de tissu et 5 pour des analyses moléculaires. Nous utilisons le deuxième testicule de chaque mâle pour évaluer l'efficacité des traitements. Les deux testicules sont fixés différemment et utilisés pour deux voire trois types d’analyses, ce qui répond parfaitement à une réduction du nombre d’animaux en accord avec le 2e R de la règle des 3R.

Raffinement

Dans le souci du bien-être des animaux, une surveillance de leur état de santé et des soins appropriés (analgésie) est assurée si nécessaire. En cas de souffrance ou d’altération du comportement des animaux, des mesures correctives nécessaires sont prises rapidement en concertation avec les responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) et le vétérinaire. Les animaux étudiés présentent des mutations dans les cellules de Sertoli et les cellules germinales du testicule (Ser-/- ; Germ-/-), ce qui n’induit aucune souffrance car le phénotype attendu se limite à la stérilité des mâles. Ce génotype d’intérêt concerne un quart des mâles produits avec les croisements mis en place, et la proportion ne peut pas être augmentée. Les procédures expérimentales commencent par l’identification des mâles suivie de la biopsie de queue en vue du génotypage. Ces procédures sont conduites au stade P0-3, précédant l'administration du Médicament1 afin de permettre une sélection ciblée visant à traiter exclusivement les animaux mutants d’intérêt. Les procédures expérimentales sont conduites de façon à diminuer le stress de l’animal. Ainsi, dans le cadre de la Procédure 1, les injections des molécules destinées à être administrées le même jour (rétinoïdes et traceur) sont espacées d’un intervalle de 8 heures. Pour assurer le bien-être des nouveaux-nés, des nids sont aménagés dans les cages, offrant ainsi un environnement chaleureux et sécurisé pour les souriceaux. Afin de garantir leur confort, les animaux sont maintenus en groupe avec leur mère jusqu'au moment de l'euthanasie. Ainsi, l'intégration totale du raffinement, conformément au principe du 3e "R" de la règle des 3R, est une caractéristique fondamentale de notre approche expérimentale.

Choix des espèces

La petite taille de la souris, ses nombreuses ressemblances génétiques avec l'Homme, et les facilités de modification de son génome, font d’elle un modèle animal de choix pour appréhender la physiopathologie des maladies humaines. Nous avons choisi une approche de génomique fonctionnelle pour laquelle la souris est particulièrement bien adaptée (possibilité de réaliser des mutations dans le génome : temps de génération court, génome connu, outils moléculaires). Par ailleurs, la souris partage 99% d'identité génétique avec l'homme, et les mécanismes de la spermatogenèse sont conservés chez les deux espèces. Nous induisons la différenciation de toutes les spermatogonies en utilisant une méthode pharmacologique (Médicament1 : acide rétinoïque) à l’âge de 4 jours (P4). Cet âge a été sélectionné afin de correspondre au mieux à la période habituelle de différenciation des spermatogonies chez les souris sauvages, permettant ainsi une comparaison pertinente. Cependant, chez les mutants synchronisés, la méiose ne se finalise pas et les cellules meurent de par l’absence d’acide rétinoïque ou d’une dérégulation des voies qu’il contrôle en aval. Le traitement avec le Médicament2 vise à préserver les cellules méiotiques de la mort. Pour les rétinoïdes, nous envisageons une seule injection à P10 (Médicament1+6 jours). Cet âge a été choisi en raison de l'émergence des premières cellules méiotiques productrices d'acide rétinoïque chez les souris synchronisées, correspondant ainsi à la période propice. En revanche, pour les inhibiteurs des kinases, nous prévoyons une injection quotidienne entre P10 et P12 (Médicament1 + 6 à 8 jours). Cette fréquence de traitement a été délibérément choisie pour garantir une inhibition constante des kinases juste après la période de production d’acide rétinoïque. La méiose dure environ 15 jours chez la souris. Nous analysons l'évolution de la méiose à deux points clé (à P15 et à P19) et nous analysons aussi son produit final (à P29).

Pour étudier des combinaisons de radiothérapie, d'immunothérapie et d'un modulateur de la matrice tumorale, 2 696 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales dans la veine de la queue ou dans le gras mammaire, des mesures de tumeur au pied à coulisse, des séances d'imagerie sous anesthésie et, pour certaines, une ouverture du thorax suivie de trois heures et demie d'imagerie sans réveil. Le porteur indique que la croissance tumorale dégrade la condition physique, provoque des douleurs et peut entraîner la mort, et que l'anesthésie prolongée peut causer une détresse respiratoire jusqu'à l'arrêt cardio-respiratoire. Il reconnaît que le remplacement est "la notion la plus limitante" du projet, tout en concluant que l'utilisation d'animaux non-humains est "nécessaire".

Objectifs

Notre programme de travail repose sur l’observation fondamentale que deux populations du système immunitaire, sont impliquées dans le développement tumoral et la résistance aux thérapies anti-cancéreuses. L'étude de l'impact des thérapies conventionnelles ainsi que les nouvelles immunothérapies sur ces populations immunitaires sont nécessaires pour comprendre comment elles interviennent dans les résistances à ces thérapies et donc à la rechute tumorale. Les objectifs du projet sont ici de caractériser les effets combinatoires de la radiothérapie avec une immunothérapie qui stimule l'activité d’une de ces deux populations ou une pharmacothérapie qui perturbe la structure de soutien entourant les cellules tumorale pour faciliter l'activité anti-tumorale qui est, dans la plupart des cas, empêchée par l'interaction entre les deux populations immunitaires.

Bénéfices attendus

Les thérapie anti-cancéreuses (radiothérapie, chimiothérapie) sont utilisées depuis les débuts de l'identification de la pathologie cancéreuse. Elles ont considérablement augmenté en qualité, plus précises, plus variées et l'émergence des immunothérapies a suscité un nouvel espoir pour les cancers incurables. Cependant dans encore trop de cas, ces thérapies ne font que prolonger la durée de vie et entrainent des effets secondaires très lourds. En effet les cancers répondent très rapidement à ces thérapies et développent des résistances. Ce projet de recherche vise à mettre en lumière les mécanismes par lesquels les cellules du système immunitaire participent à la croissance tumorale et la résistance aux thérapies anti-cancéreuses. Cette compréhension permettra dans un premier temps de tester efficacement des nouvelles combinaisons de thérapies anti-cancéreuses afin d'améliorer leur efficacité mais aussi de réduire les effets secondaires chez le patient. Nous pensons également qu'il permettra d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de ces cancers.

Procédures

Dans le cadre de notre étude, nous effectuons plusieurs procédures pour évaluer la croissance tumorale et les effets des traitements. Tout d’abord, nous réalisons des biopsies de tissus pour l’identification génétique, en utilisant une méthode rapide et peu invasive. Ces biopsies sont issues de l’extrémité de la queue de l’animal ou d’une goutte de sang prélevée par poinçon à la joue. Le processus dure environ une minute sur animal vigile. Ensuite, nous procédons aux injections de lignées tumorales. Pour cela, nous avons deux options : une injection au niveau de la veine caudale sur l’animal vigile, ou une injection dans le gras mammaire sur animal anesthésié. Cette étape prend environ deux minutes. Pour surveiller la croissance tumorale, nous utilisons une technique d’imagerie sur animal anesthésié (environ dix minutes) ou mesurons directement la masse tumorale à l’aide d’un pied à coulisse sur animal vigile (cinq minutes pour cinq souris). Nous administrons également des traitements cellulaires par injection, avec deux injections par animal sur deux jours consécutifs, chacune prenant environ une minute. Enfin, nous réalisons des procédures chirurgicales sous anesthésie générale pendant quatre heures accompagnée d'un traitement analgésique par injection (1min) pour l’imagerie, impliquant une chirurgie de trente minutes suivie d’une imagerie de trois heures et demie. Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure pour procéder aux prélèvements des tissus et analyses. Ces étapes sont essentielles pour notre recherche sur les tumeurs et les thérapies associées.

Impact sur les animaux

Dans un premier temps, les animaux subiront très tôt une biopsie de l’extrémité de la queue et/ou un prélèvement de sang (une goutte) pour identification génétique. Ces gestes peuvent engendrer des douleurs de courte durée et un stress chez l’animal. Les effets indésirables les plus lourds pouvant survenir chez les animaux sont majoritairement dus à la croissance tumorale. Les animaux vont alors subir le développement d'une ou plusieurs tumeurs entraînant une dégradation de la condition physique, des douleurs et pouvant provoquer la mort. Aussi, la procédure d’imagerie peut engendrer des effets indésirables de par l’utilisation prolongée d’anesthésique pouvant provoquer un stress thermique ainsi qu’une détresse respiratoire pouvant conduire à un arrêt cardio-respiratoire. La thoracotomie est également une chirurgie lourde même si celle-ci sera sans réveil. Dans une moindre mesure, les anesthésies répétées des animaux pour le suivi de croissance tumorale par imagerie ou pour la radiothérapie ainsi que les injections de solutions contenant les traitements peuvent également être une source de stress pour l'animal et provoquer des douleurs de courte durée.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue de chaque procédure. Dans la majorité des cas il n'est pas attendu de rejet tumoral complet ainsi les animaux seront euthanasiés suivant les points limites à l'issu de la récidive tumorale ou suivant les besoins de l'étude. De plus, des prélèvements pour analyses post-mortem sont nécessaires dans le cadre du projet et implique donc l’euthanasie des animaux.

Remplacement

Le sujet reposant essentiellement sur des réponses aux traitements anti-tumoraux par le système immunitaire, l'utilisation d'animaux est nécessaire. La notion de remplacement est la plus limitante dans le cadre de ce projet, cependant nous avons mis au point des expériences de cocultures in vitro des cellules tumorales avec des lignées de macrophages permettant d'analyser les interactions avec les cellules tumorales. De plus, nous complémentons nos études sur des échantillons humains ce qui nous permet de focaliser sur des cibles ayant un minimum de relevance déjà établie chez l'homme.

Réduction

Notre approche la plus efficace dans la réduction des animaux repose sur l'utilisation de techniques moderne d'analyse à haute dimension permettant d'avoir un jeu de données le plus large d'un seul coup sur les mêmes animaux. La deuxième approche est de réaliser les expériences sur l’ensemble des groupes d’étude en même temps afin de comparer les différents groupes par rapport au même groupe contrôle. Nous mettons aussi en place une stratégie d’optimisation des animaux euthanasiés. Nos études in vivo portent sur l’analyse de différents organes. Ainsi pour chaque animal euthanasié nous prélèverons le maximum d’organes afin de collecter et conserver les données pour l’ensemble des tissus. Enfin mâles et femelles sont utilisés indépendamment dès que possible. Bien que l'uniformisation du sexe puisse améliorer l'homogénéité des lots, l'utilisation des deux sexes permet de réduire la génération d'animaux qui ne seraient jamais utilisés. Selon notre expérience, cela représente une option majeure de Reduction des animaux. Le nombre total d’animaux utilisés dans ce projet s’élève à 2696 sur 5 ans. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance, il sera donc nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans les conditions de notre établissement avec température et hygrométrie contrôlée, cycle jour,nuit 12-12, avec au maximum 5 animaux par cages. La génération de ces modèles tumoraux est sans risque infectieux. Chaque cage contient au moins un élément d'enrichissement : nid en carton, tunnel ou maisonnette. La surveillance quotidienne est prise en charge par un personnel dédié au soin et à l’expérimentation et un suivi complémentaire (points limites : mesure de la charge tumorale, mesure de poids, détection de signes clinique) fréquent allant de tous les 5 jours en début de procédure (avant les risques d'apparition de signe de souffrance) à 3 x/semaine en milieu de procédure (lorsque le risque d'apparition de signes d'inconforts peut survenir). Cette surveillance permet de réduire la souffrance animale. Dans la plus grande majorité des cas nos approches de raffinement reposent sur l'utilisation d'anesthésiant/analgésiant pendant les procédures. Pour diminuer le stress, les conditions globales d'hébergement des animaux ne changent pas outre des conditions de raffinement supplémentaires dans certains cas.

Choix des espèces

Nous étudions la mobilisation d'un grand nombre de cellules immunitaires à travers les tissus et l'impact de traitements anti-tumoraux sur l'organisme entier. Les modèles de souris utilisés sont l'unique moyen d'obtenir les outils permettant de suivre les cellules d'intérêts par des techniques d'imagerie. Le projet utilise différentes lignées de souris qui combinent un certain nombre de gènes d’intérêts ainsi que des cellules tumorales murines justifiant le choix de cette espèce. On distingue les modifications génétiques qui apportent une fluorescence sur les cellules ne générant pas de caractéristiques génétiques néfastes, à l’exception du modèle développant des tumeurs mammaires spontanées. Ce modèle représentatif des tumeurs humaines pour lequel, malgré l’apparition de la tumeur, aucune souffrance animale n’est observée tant que la tumeur est contrôlée. Les animaux sont utilisés entre 10 et 14 semaines d’âge (maturité immunitaire) sauf pour le modèle de tumeur spontanée du sein dont la progression est lente qui seront utilisés entre 6 et 12 mois d’âge (à l'apparition de tumeur palpable).

Toutes tuées à l'issue parce qu'elles ne sont plus "naïves" et ne peuvent servir à d'autres projets, 720 souris subissent des douleurs inflammatoires et neuropathiques provoquées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Un agent inflammatoire est injecté dans leur queue, une chirurgie de vingt minutes lèse la patte d'un autre groupe, puis viennent jusqu'à dix-sept tests de douleur thermique et huit tests de douleur mécanique, avec sept injections quotidiennes du composé testé. Le porteur indique attendre un abaissement du seuil douloureux, des œdèmes, des infections et des troubles de la locomotion. Il affirme que la nociception ne s'évalue que sur "l'animal entier et vigile" et présente la souris comme un modèle "incontournable" en neurosciences.

Objectifs

La douleur chronique est un problème de santé publique majeur. Elle diminue la qualité de vie des patients et son traitement a un impact économique considérable. Bien que des progrès importants aient été réalisés dans la compréhension des mécanismes de la douleur, peu de progrès ont été faits dans le développement de nouveaux analgésiques. Dans le cadre d’une douleur modérée à sévère, les opiacés restent à ce jour le moyen le plus efficace de traiter ces douleurs malgré leurs nombreux effets indésirables. Des résultats récents indiquent que les récepteurs à neuropeptides RFamide, et notamment le récepteur GPR103, sont impliqués dans ces effets indésirables. Ce projet est un projet de recherche préclinique qui vise à développer de nouvelles voies thérapeutiques analgésiques et anti-hyperalgésiques sur cette cible peu ou pas caractérisée jusqu'à présent le récepteur GPR103. Pour ce faire, nous avons récemment identifié deux composés capables de bloquer sélectivement ce récepteur RFamide. L’évaluation de l’activité de ces molécules dans différents modèles de douleur (inflammatoire et neuropathique), et parfois en co-administration avec la morphine, chez la souris nous permettra notamment de mieux comprendre l’implication de ce récepteur dans la modulation du signal nociceptif. Nous espérons que ces nouveaux traitements permettront seuls de soulager la douleur chronique et/ou de diminuer les effets secondaires de la morphine lorsqu’ils sont donnés en co-administration avec cette dernière. Ce projet est un projet complémentaire d’un autre projet déjà autorisé.

Bénéfices attendus

Dans l’ensemble, les résultats de ce projet permettront d’affiner le rôle du récepteur GPR103 dans la modulation de la nociception et le développement de la tolérance induite par un traitement chronique par les opiacés. Ils pourraient permettre à terme d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de la douleur notamment en combinant l’utilisation de morphine à l’un de ces 2 composés afin de réduire les effets indésirables de cette dernière.

Procédures

Un lot d’animaux subira une injection d’agent inflammatoire dans la queue sous anesthésie générale (10 secondes) puis 3 jours après ils auront au total 7 injections sous-cutanées de composé (sur animal vigile) espacées de 24 heures ainsi que 17 tests nociceptifs thermique d’une durée de 30 secondes espacés de 1h minimum. Un second lot d’animaux subira une injection d’agent inflammatoire dans la queue sous anesthésie générale (10 secondes) puis 3 jours après 1 test nociceptif thermique d’une durée de 30 secondes puis une injection sous-cutanée de composé (sur animal vigile). 30 min après cette injection sous-cutanée, ils subiront 7 prélèvements sanguins de 5 µL, à la queue, sous anesthésie locale, espacés d’au minimum 30 min. Un troisième lot d’animaux subira des tests nociceptifs mécaniques pendant une semaine (20 min environ, espacés de 24h minimum) puis une chirurgie sous anesthésie générale au niveau de la patte d’une durée de 20 minutes environ. Puis 10 jours après ils auront au total 7 injections sous-cutanées de composé (sur animal vigile) espacées de 24 heures ainsi que 8 tests nociceptifs mécaniques d’une durée de 20 min environ, espacés de 24h. Un quatrième lot d’animaux subira 2 injections par jour (10 secondes) espacées de 4h pendant 3 jours.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pouvant apparaitre après application de nos procédures, sont l’abaissement du seuil douloureux, l’apparition d’inflammation / œdème / infection au niveau des points d’injection ou des sutures chirurgicales, comportements anormaux, problème de locomotion, d’alimentation. Nous pouvons aussi nous attendre à une amélioration du niveau de douleur pour les molécules qui s’avéreront efficaces.

Devenir

A l’issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort car ce sont des animaux non naïfs qui ne peuvent être réutilisés dans des projets ultérieurs.

Remplacement

Les 2 molécules testées in vivo sont au préalable sélectionnées sur la base d’évaluations in vitro afin de déterminer leur affinité et leur activité sur le récepteur d'intérêt ainsi que leurs caractéristiques physicochimiques. Ces expériences permettent de limiter fortement le nombre de molécules à tester sur l'animal. Cependant l'évaluation de leurs effets sur la nociception n’est réalisable que sur l’animal entier et vigile ; il n’existe, à ce jour, pas de modèles in vitro permettant de réaliser ce travail. Nous avons choisi la souris pour pouvoir comparer les résultats obtenus avec le phénotype des souris knockout pour le récepteur RFamide GPR103 disponible au laboratoire collaborateur de ce projet dans les mêmes modèles de douleur.

Réduction

En raison de la variabilité dans les différentes expériences prévues et de nos résultats antérieurs, nous avons pu estimer par une analyse statistique que 12 animaux sont requis pour obtenir une analyse statistiquement robuste au vu du pourcentage de variation attendu. L’évaluation préalable in vitro de nos molécules permet de réduire grandement le nombre de molécules à évaluer in vivo et par conséquent réduit également fortement le nombre d’animaux nécessaires pour leur évaluation. Les expériences seront menées sur les mâles et les femelles.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Une acclimatation et une habituation à l’expérimentateur (handling) et aux tests comportementaux de 2 semaines sont systématiquement réalisés. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies des méthodes d’anesthésie et d'analgésie sont systématiquement utilisées, un gel ophtalmique sera appliqué et un tapis chauffant servira à réduire l’hypothermie des animaux. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Une analgésie sera mise en place pour les prélèvements sanguins. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la SBEA de l’institut pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Les objectifs du projet consistent à étudier les effets de ligands du récepteur RFamide GPR103 la tolérance induite par les opiacées ou associée aux douleurs persistantes. Pour ce faire, il nous est indispensable de travailler sur un modèle entier et complexe prenant en compte les cascades de réactions, les voies de signalisation, la communication entre les organes afin d’être dans des conditions au plus proche de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences et notamment dans la compréhension des mécanismes de la douleur. En plus de sa proximité physiologique avec l’Homme, la souris possède également une forte homologie génétique faisant d’elle un bon modèle d’étude de la douleur. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés (arrivée des animaux à 8 semaines lorsqu’ils sont jeunes adultes puis début des procédures à partir de 10 semaines).

Pour ouvrir par ultrasons la barrière qui protège le cerveau, 32 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyser leurs tissus. Elles passent des séances d'imagerie sous anesthésie allant jusqu'à deux heures, répétées jusqu'à deux fois par semaine, avec pose d'un cathéter dans la veine de la queue et injections dans l'abdomen. Le porteur indique que l'ouverture de la barrière provoque de légers dommages cérébraux chez moins de 10 % des animaux, pouvant entraîner des douleurs transitoires, et qualifie par ailleurs ces gestes de contraintes légères n'engendrant "pas de souffrance ou de stress". Il présente les ultrasons comme un "espoir majeur" contre les maladies génétiques du cerveau, en s'appuyant sur des essais cliniques déjà en cours chez l'humain.

Objectifs

La principale limite à l'efficacité des thérapies dans le cerveau est leur accès restreint en raison de la barrière protégeant le cerveau de tout élément pouvant être toxique, mais limitant aussi le passage de la majorité des médicaments. Récemment, une technique utilisant des ultrasons a attiré l'attention en tant que moyen non invasif pour perturber temporairement cette barrière. Les ultrasons permettent de perturber cette barrière à travers le crâne et donc sans opération chirurgicale nécessaire. Dans cette étude, nous évaluerons chez la souris le potentiel thérapeutique de cette approche. En plus des données que nous obtiendrons avec des séances d'imagerie médicale, reflétant le caractère réversible ou non de l’ouverture de la barrière, nous évaluerons la durée d'efficacité du traitement. Enfin, nous étudierons les modifications provoquées dans le cerveau après avoir reçu une onde ultrasonore afin d’en évaluer l'intégrité après traitement.

Bénéfices attendus

Les ultrasons représentent un espoir majeur de traitement de nombreuses pathologies cérébrales tel que les maladies génétiques. Des essais cliniques utilisant cette technique chez l'homme sont en cours. Nous souhaitons ici évaluer des approches plus performantes que les traitements habituels et profiter d'une délivrance par ultrasons. Avec le développement en cours des ultrasons chez l'homme, les méthodes que nous proposons pourraient bénéficier d'un transfert rapide vers l'homme. Dans le cas de maladies génétiques, nous souhaitons évaluer le potentiel des ultrasons pour administrer un traitement efficace et durable dans le cerveau. Cette approche pourrait permettre de corriger, au niveau génétique, des anomalies au niveau cérébral, ce qui représente un espoir conséquent pour les personnes atteintes de ce type de maladie, qui ne disposent à ce jour d'aucun traitement efficace, à l'exception de traitements de leurs symptômes.

Procédures

Tous les animaux seront exposés à une séance d'imagerie médicale anatomique pour une durée maximale de 2h, anesthésie incluse. Pour les besoins de l'imagerie médicale effectuée dans ce projet, une partie des animaux recevront une injection permettant d'améliorer la qualité de l'image. Tous les animaux recevront une séquence ultrasonore ainsi qu'une injection intraveineuse de notre traitement. Tous les animaux seront également exposés à des séances d'imageries servant à évaluer l'efficacité du traitement et nécessitant une injection dans l'abdomen, ces séances pouvant être répétées jusqu'à 2 fois par semaine.

Impact sur les animaux

De possibles douleurs transitoires pourraient apparaître suite à l’apparition de légers dommages dans le cerveau provoqués par l'ouverture de la barrière le protégeant, visualisables par imagerie médicale (fréquence observée inférieure à 10%). Notre protocole nécessite une pose de cathéter dans la veine de la queue, ainsi que des injections dans l'abdomen qui seront réalisées sous anesthésie générale, présentant des contraintes de classe légère pour les animaux et n’engendre pas de souffrance ou de stress. Le transport entre les laboratoires du projet peut également générer un léger stress ou inconfort chez l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin d'en analyser les tissus.

Remplacement

Le projet portant sur l’étude de la réponse du cerveau, et plus particulièrement la barrière le protégeant, il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. De plus, il n'existe pas à ce jour de méthodes alternatives, n'impliquant pas d'animaux vivants, qui permettent l'étude du passage de particules virales à travers cette barrière grâce aux ultrasons. L’étude qui en découle comporte des analyses du cerveau afin d'évaluer l’impact cellulaire des ultrasons qui ne sauraient être remplacées par un modèle informatique ou cellulaire.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé avec l’aide d’un logiciel permettant d’évaluer le nombre d’animaux minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives sur les paramètres à mesurer. Ce nombre tient compte des risques de mort et d’exclusion d’un animal lors des différentes procédures. Le nombre d’animaux nécessaires à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats. Le suivi de l'efficacité du traitement se faisant sur plusieurs semaines pour chaque animal, notre étude nécessite très peu de groupes de souris.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l'hébergement des animaux de l'Annexe II du premier février 2013 de l'arrêté fixant les conditions d'agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l'environnement. Toutes les mesures seront prises pour réduire la souffrance des animaux. L’ensemble des expérimentations seront réalisées sous anesthésie adaptée, les animaux seront maintenus en température et un suivi de la fréquence cardiaque et respiratoire sera effectué lors des séances d'imagerie médiale et de traitement par ultrasons. L'imagerie médicale nous permettra également de visualiser l'apparition d'éventuel dommage au cerveau avant le réveil de l'animal, permettant une administration préventive d'un analgésique dans ce cas. Une échelle de cotation de douleur basée sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d'évaluer l'état général de chaque animal et de définir des points limites, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l'animal. De plus, dans le cas où certains signes de douleurs seraient observés, sans dépassement des points limites, un traitement sous-cutané avec un analgésique sera mis en place.

Choix des espèces

L’ensemble des animaux utilisés seront des souris à l'âge adulte, soit à partir de 6 semaines. Nous avons optimisé les protocoles pour des animaux de ce calibre, ce qui nous permettra un transfert sans difficulté pour ces expérimentations.