Recherche fondamentale

Pour tester des nanoparticules poreuses censées porter des gaz et des médicaments jusqu'aux tumeurs, 1 692 souris et 504 rats sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous mis à mort pour prélever leurs organes. Une partie reçoit une implantation de cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie, puis trois séances d'irradiation de 4 Gy et des injections intraveineuses trois jours de suite. Le porteur s'attend à une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux porteurs d'une tumeur cérébrale, ainsi qu'à une dégradation de l'état général jusqu'à une semaine après l'irradiation du crâne, avec pelades sur la tête et sécrétions au museau. Il justifie le projet par le "besoin d'améliorer" des thérapies dont il constate le manque d'efficacité, et présente le nombre annoncé comme un maximum susceptible d'être réduit si les seuils statistiques sont atteints plus tôt.

Objectifs

Ce projet a pour but de caractériser l’intérêt de nanoparticules (NPs) poreuses comme vecteur de thérapies (gazeuses et médicamenteuses) pour les tumeurs hypoxiques, décrites dans la littérature comme résistantes aux traitements actuels. En effet, un meilleur ciblage de la tumeur par ces NPs permettrait d’améliorer l’efficacité des traitements actuels tels que la radiothérapie (RT), les chimiothérapies (CT) ou encore les immunothérapies (IT). Devant le manque d’efficacité des thérapies standards, ce projet se justifie par le besoin d’améliorer, par des approches innovantes, les thérapies actuelles.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est une amélioration des stratégies thérapeutiques actuelles en utilisant comme vecteur des NPs qui ont montré, par nos études précédentes, leur capacité à s’accumuler dans la tumeur tout en préservant le tissu sain environnant .

Procédures

Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale) : 30 minutes maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal. - Injection intraveineuse de cellules tumorales (animal vigile) : 1 fois à l’injection des cellules ; 5 minutes maximum par animal. - Injection sous-cutanée de cellules tumorales (animal vigile) : 1 fois à l’injection des cellules ; 5 minutes maximum par animal. - Injection intraveineuse des NPs (animal vigile) : 3 fois sur 3 jours consécutifs ; 5 minutes maximum par animal. - Injection intraveineuse des CT ou IT (animal vigile) : 3 fois sur 3 jours consécutifs ; 5 minutes maximum par animal. - Irradiation (sous anesthésie générale) : 3 séances de 4 Gy sur 3 jours consécutifs : 10 minutes maximum par animal. - Injection sous-cutanée de buprénorphine (animal vigile) : 1 fois avant la mise à mort pour tous les animaux et 3 fois pour les animaux avec des tumeurs cérébrales qui auront deux injections supplémentaires en péri-opératoire ; 2 minutes maximum par animal.

Impact sur les animaux

Parmi les procédures expérimentales, les injections intraveineuses (cellules tumorales, NP, CT ou IT) ou les injections sous-cutanées effectuées sur un animal vigile peuvent causer un stress à l'animal lors de l'intervention, ce qui peut être considéré comme une nuisance légère. De plus, au regard de l’expérience du laboratoire concernant les différentes procédures expérimentales, nous nous attendons à avoir des effets indésirable modérés avec une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de tumeur cérébrale. Également, sur ces modèles de tumeur cérébrale, nous nous attendons à une fatigue et une dégradation de l’état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, pelades sur la tête) induit par l'irradiation cérébrale jusqu’à une semaine après l’irradiation.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organes.

Remplacement

Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la cellule tumorale. L’utilisation de modèles in vivo complets permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et à la réponses aux différents traitements. Ce projet intervient après plusieurs étapes de validation in vitro ayant permis de retenir les meilleures NPs (taille, aspect de toxicité, oxygénation) mais ne peut pas s’effectuer intégralement sur des modèles de remplacement in vitro ou in silico.

Réduction

L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasive et des modèles de tumeur sous-cutanés se conforment à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité d’euthanasier plusieurs animaux à chacun des temps. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Toutefois, dans tous les protocoles d’imagerie, d’irradiation, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane, non sans risque pour l’animal. Afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques, nous estimons qu’au minimum, 12 animaux par groupe au départ sont nécessaires afin de réaliser des tests statistiques puissants, et ainsi comparer les effets des différents traitements et ce, en fonction du temps. Ces 12 animaux sont calculés sur la base d’un test de puissance connaissant la variabilité intrinsèque des modèles tumoraux basés sur nos travaux antérieurs. Il est important de noter ici que le nombre d’animaux calculés est un nombre maximal. En effet, les expériences seront réalisées par plusieurs lots et si les seuils statistiques sont atteints alors le protocole sera stoppé.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux (4 souris par cage et 3 à 2 rats par cage) dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation de 7 jours minimum avant toutes expérimentations et bénéficierons également d’enrichissement (roue d’activité, tunnel en carton, stimulation sensorielle par différents objets). Les animaux seront surveillés de leur arrivée à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée quotidiennement pendant les phases critiques (implantation, irradiation) et 3 fois par semaine par la suite. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents. Pour les animaux immunodéprimé, la procédure est identique à l’exception de l’hébergement. En effet, les animaux sont placés dans des cages ventilées individuellement par des portoirs spécifiques, ces deniers étant eux-mêmes dans une zone spécifique et dédiée à la manipulation des animaux immunodéprimés pour la recherche en cancérologie.

Choix des espèces

La souris et le rat immunodéprimés sont des espèces de choix pour évaluer l’évolution du volume tumoral dans le temps dès lors que les cellules tumorales utilisées sont d’origine humaine. Notre expertise des différents modèles de tumeurs cérébrales, nous a permis d’établir que suivant le type cellulaire, nous obtenons des tumeurs plus ou moins hypoxiques et plus ou moins vascularisés (Corroyer-Dulmont et al., Biol Chem. 2013). Ces deux composantes, influençant la croissance tumorale et l’efficacité des traitements actuels, il est nécessaire de travailler avec ces différents modèles in vivo, afin de se rapprocher de la situation clinique. Lorsque les cellules tumorales (cérébrales et pulmonaires) sont d’origine murine (issues de souris C57Bl/6) alors nous pouvons utiliser des animaux immuno-compétents de même souche (souris C57Bl/6) dans ce projet afin de prendre en compte l’ensemble du système immunitaire et le contexte inflammatoire du micro-environnement étudié et connus pour participer à la réponse aux traitements. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes, mâles et femelles, âgés de 8 à 12 semaines en début de protocole. Cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. De plus, à ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps longs. Cet âge leur confère également une résistance aux protocoles expérimentaux utilisés.

Toutes tuées à l'issue pour prélever les tissus autour de l'implant, 190 souris subissent une chirurgie sous la peau du dos puis neuf séances d'imagerie sous anesthésie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. L'objet du projet reste étroit : mesurer la diffusion d'une molécule fluorescente hors d'un hydrogel implanté, dans une étude que le porteur qualifie lui-même de pilote. Il indique que l'incision dorsale et l'implantation peuvent provoquer douleurs et démangeaisons, et que les expositions répétées aux rayons X pourraient induire une légère perte de poids. Il affirme qu'"aucune méthode alternative" ne peut remplacer le recours aux souris, tout en présentant cette étape comme un préalable à des modèles "plus compliqués" avant toute application dentaire humaine.

Objectifs

A l’intérieur d’une dent se trouve un tissu nommé pulpe dentaire. A la base de la dent se trouve un orifice. C’est à travers cet orifice que les vaisseaux sanguins et les nerfs de la pulpe dentaire passent pour rejoindre les systèmes nerveux et sanguins dits systémiques. Lors d’une infection carieuse non traitée, la pulpe dentaire est attaquée, puis nécrose. On observe l’apparition d’un abcès à la base de la dent suite au passage de l’infection à travers l’apex pouvant conduire à des infections systémiques graves. Le traitement actuel consiste à remplacer la pulpe par un dérivé inerte de caoutchouc, et présente des limites en augmentant le risque de fracture de la dent ou de réinfection. Au risque de réinfection s’ajoute un risque de sélection de souches bactériennes résistantes ou multirésistantes. Des stratégies visant à régénérer la pulpe dentaire à partir d’hydrogels sont donc actuellement envisagées. Pour ce faire, il est nécessaire de concevoir des hydrogels bioactifs, associés à des molécules aux propriétés antibactériennes, capables de désinfecter à la fois l’intérieur de la dent et l'orifice. L’efficacité des hydrogels repose donc sur l’évaluation et le contrôle du relargage de l’agent antibactérien à travers l'orifice. L’objectif de ce projet est d’évaluer les variations de relargage à l'orifice et de maintien dans l’hydrogel d’une molécule fluorescente lorsque des éléments anatomiques et physicochimiques sont modifiés.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux connaître les cinétiques de relargage à partir d’hydrogels. Ces cinétiques sont très peu documentées, et plus particlièrement dans le cadre d’hydrogels pour la dent. L’objectif est de mieux comprendre et appréhender le comportement des hydrogels “in vivo”, afin de développer notre maitrise des cinétiques de relargage avant de proposer des études plus complexes sur la dent de souris à partir d’hydrogels formulés en conséquence. A long terme, ces travaux permettront la conception d’hydrogels antibactériens pour l'intérieur de la dent humaine. Il sera possible d’anticiper la libération des molécules antibiotiques, et donc de fournir aux patients un produit connu, maitrisé et par conséquent sécurisé. Ces produits permettront la désinfection à la fois de l'orifice et de l'interieur de la dent, et par conséquent la réduction du risque de d'infection du corps entier associé aux infections non traitées.

Procédures

Les animaux seront soumis à une opération de chirurgie sous cutanée sous anesthésie, puis à 9 procédures d'imagerie sous anesthésie également (imagerie en fluorescence ou en rayons X).

Impact sur les animaux

De précédentes études d’implantation d’hydrogel et de nanoparticules en sous-cutanée ne montrent pas signe de souffrance significative de l’animal. Toutefois, une attention particulière sera apportée concernant l’implantation des nanoparticules d’or. Il existe un risque de douleurs liées à l’incision dans le dos et à l’implantation d’un objet de grade chirurgical en sous cutanée. Les animaux pourraient souffrir de démangeaisons et douleurs dans le dos au niveau du lieu d’implantation. Par ailleurs, les animaux pourraient également souffrir de stress en raison de leur manipulation notamment pour l’imagerie quotidienne . Enfin, l’analyse au rayons X provoque une exposition à de faibles doses de rayons ionisants. Il n'y a pas d’effets secondaires dans la littérature. Cependant, ces expositions répétées pourraient induire une perte légère de poids et des démangeaisons pour lesquelles nous serons vigilants.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, afin de rendre possible le prélevement de tissus sur environ 5mm autour de l'apex du modèle endodontique, et l'analyse des signes d'inflammation liés aux hydrogels.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne peut se substituer à l'utilisation des animaux. Des tests “in vitro” ont au préalable été réalisés afin de limiter le nombre de conditions expérimentales (concentration en hydrogel, diamètres des apex…). Ce projet est une étape indispensable pour mimer un environnement associé à un système physiologique avant d’envisager des modèles plus compliqués à mettre en oeuvre et un passage vers la clinique. La souris, par sa petite taille, est un modèle adapté à l’imagerie corps entier, nécessaire ici pour suivre et quantifier la libération des molécules à partir des hydrogels.

Réduction

Le nombre d’animaux maximum nécessaire au total sur toutes procédures ,est de 190 sur 5 ans. Ce nombre, validé par une statisticienne , a été déterminé dans le but d’utiliser un nombre minimum d'animaux sans compromettre l’analyse statistique des résultats. L’utilisation de la tomographie par fluorescence permet de suivre la biodistribution sans mise à mort des animaux, limitant ainsi le nombre d’animaux nécessaire à cette étude.

Raffinement

Toutes les analyses d’imagerie ont lieu sous anesthésie afin de limiter l’angoisse des animaux, tout en conservant un temps de réveil court après endormissement. Lors de la chirurgie sous cutanée, les animaux seront anesthésiés et un traitement analgésique sera mis en place. L'apparence physique, le comportement (socialisation, nettoyage) seront observés 7/7 jours. et leur poids sera mesuré 2/7 jours.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris permet, par sa petite taille, l’imagerie en corps entier. Par ailleurs, de précédent travaux mené sur la souris donne un meilleur recul et de plus grande chances de répétabilité. Les souris seront âgés de 8 semaines à leur réception. Le début des manipulations aura lieu lorsqu’elles auront 9 semaines (après une semaine d’acclimatation) et la mise à mort aura lieu à 10 semaines. A ce stade (jeune adulte, entre et 8 et 10 semaines) , la croissance est terminée, les souris sont pleinement formées, et le vieillissement n’a pas commencé. Cela permet de travailler avec un minimum d’interférences liées à la croissance physiologique de la souris, et donc de réduire la variabilité statistique. Plus cette variabilité est basse, moins le nombre d’animaux nécessaires est grand.

Pour étudier la vulnérabilité à l'addiction à la cocaïne, 652 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélèvement d'échantillons. La plupart subissent une chirurgie cérébrale de deux heures puis la pose d'un cathéter veineux, avant trente séances d'autoadministration de cocaïne sur plusieurs semaines. Le porteur écrit que le rat "s'autoadministre à son gré et librement", une formulation qui gomme le dispositif expérimental imposant l'accès à la drogue. L'étude relève de la recherche fondamentale, ses applications thérapeutiques restant évoquées de façon générale.

Objectifs

L’addiction à la cocaïne est un enjeu de santé publique. Aucun traitement n’est actuellement approuvé pour cette addiction qui se développe chez environ 20% des usagers dits vulnérables. Au moyen d’un modèle validé chez le rat, qui permet d’identifier 20% de sujets à risque de développer un comportement de type addiction à la cocaïne, nous cherchons à comprendre les différences biologiques entre sujets vulnérables et résilients afin d’identifier des mécanismes pathologiques et des cibles thérapeutiques. Précisément, nous cherchons à identifier dans le comportement des animaux vis-à-vis de récompenses naturelles palatables des facteurs prédictifs de cette vulnérabilité à l’addiction à la cocaïne. Nous cherchons à comprendre les mécanismes cérébraux d’un comportement adapté vis-à-vis des récompenses naturelles et vis-à-vis de la cocaïne, et à établir comment sujets vulnérables et résilients à l’addiction diffèrent pour ces mécanismes.

Bénéfices attendus

La consommation de cocaïne est en forte expansion en Europe et un enjeu de santé publique mondial. Ce projet participe à la compréhension des mécanismes biologiques et comportementaux qui sous-tendent la vulnérabilité à cette addiction. Cette compréhension doit permettre de guider les approches thérapeutiques, y compris psycho-comportementales.

Procédures

380 animaux seront soumis à une chirurgie cérébrale (durée moyenne : 120 min) puis 20 à 30 jours plus tard à une chirurgie intraveineuse pour l'implantation d'un cathéter intraveineux (durée moyenne : 30 min) suivie de 30 sessions d'autoadministration de cocaïne (2h par jour, 5 jour par semaine). 192 animaux seront soumis à 30 sessions d'autoadministration orale d'une solution palatable (2h par jour, 5 jour par semaine) suivies d'une chirurgie intraveineuse pour l'implantation d'un cathéter intraveineux (durée moyenne : 30 min) suivie de 30 sessions d'autoadministration de cocaïne (2h par jour, 5 jour par semaine). 80 animaux seront soumis à une chirurgie cérébrale (durée moyenne : 120 min) suivi de 35 sessions d'autoadministration orale d'une solution palatable (2h par jour, 5 jour par semaine). Toutes les chirurgies sont effectuées sous anesthésie générale, en conditions aseptiques, sur couverture chauffante.

Impact sur les animaux

Les procédures appliquées dans ce projet sont toutes de gravité modérée. Les nuisances attendues sont celles associées à une chirurgie vasculaire ou cérébrale, dans des conditions où toutes les mesures sont prises pour réduire douleur et risque d’infections (aseptie, anesthésie générale, analgésie/anti-inflammatoire pré- et post-opératoire sur plusieurs jours). Les nuisances attendues sont celles associées à l'autoadministration de cocaïne dans des conditions où toutes les mesures sont prises pour minimiser les risques cardiovasculaires connus liés à l'usage de cette drogue (limite de la quantité prise par jour, alternance d'accès et de non accès à la drogue, traitement anti-thrombose). L'autoadministration est un comportement opérant ; le rat émet une réponse comportementale qui lui donne accès à la récompense (cocaïne ou solution palatable). Il s'autoadministre à son gré et librement.

Devenir

Au terme des trois procédures, les animaux seront mis à mort selon une méthode réglementaire, pour prélèvement d’échantillons.

Remplacement

Seul le modèle animal permet d’interroger les mécanismes neurobiologiques difficilement accessibles chez l’homme. De plus, l’étude du comportement addictif ne peut se réduire à la simple étude de l’effet de la drogue. Ce comportement met en jeu des mécanismes psychopharmacologiques complexes qui ne peuvent pas être appréhendés par des modèles ex vivo.

Réduction

L'utilisation d'un trop grand nombre d'animaux est contraire à l'éthique, mais si trop peu d'animaux sont utilisés, l'expérience peut manquer de puissance statistique. Nous procédons à des analyses statistiques afin de déterminer le nombre minimum de sujets nécessaires pour obtenir un résultat fiable. Notre grande maîtrise des chirurgies et des procédures comportementales que nous mettons en œuvre nous permet de ne pas dépasser ce nombre minimum.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en cycle inversé (obscurité : 7h-19h). Les expériences se déroulent dans la phase active de ces animaux nocturnes, respectant leur sommeil. Ils sont hébergés individuellement pour éviter des blessures ou dégâts aux implants entre congénères. Les cages transparentes sont disposées pour que chacun ait un contact visuel, auditif et olfactif avec deux de ses congénères. Pour enrichissement, des lanières de papier kraft sont placées dans la cage et renouvelés systématiquement lors du change. Les paramètres environnementaux sont contrôlés en permanence. Hors études comportementales, les animaux sont manipulés deux fois et pesés une fois par semaine. Dès le début des études comportementales, les animaux sont pris en main deux fois par jour (sauf week-end où ils sont observés). Une à deux semaines avant leur application, les animaux sont habitués à toutes les manipulations, jusqu’à ce que chaque animal, si c’était le cas, n’exprime plus d’inconfort. Un anti-inflammatoire/analgésique est administré en pré-opératoire. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse ou anesthésie/analgésie chimique. Des mesures strictes d’asepsie sont appliquées. Les chirurgies sont réalisées sur couverture chauffante. Les périodes post-opératoires font l’objet d’un suivi spécifique pendant trois jours incluant une pesée quotidienne et un traitement antalgique/anti-inflammatoire. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été définis qui conduisent à décider d’une euthanasie en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Compte tenu des questions que nous posons, il est nécessaire d’utiliser une espèce mammifère dont le développement des réseaux neuronaux permet l’expression d’un comportement aussi complexe que la prise de drogue. Or il a été montré un continuum entre les mécanismes psychologiques et biologiques des processus de récompense entre le rat et l’homme, et ces processus sont à la base de l’addiction, étudiée dans ce projet. Nous utilisons des rats âgés de 8 à 10 semaines à leur arrivée au laboratoire (250-275 / 270-300g) correspondant au stade jeunes adultes, ce qui garantit, compte tenu des périodes d’habituation appliquée, d’étudier l’addiction de façon stable à l’âge adulte.

Toutes tuées pour prélèvement du foie, du coeur et des tissus gras, 84 souris rendues obèses par un régime hyperlipidique sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections sous-cutanées tous les deux à cinq jours pendant quatre semaines, puis une imagerie de composition corporelle sous anesthésie. Le projet teste les doses d'une molécule censée réduire la prise alimentaire, en préparation d'un essai clinique. Le porteur note que l'efficacité de cette molécule a "déjà été validée" par ses collaborateurs américains, ce qui interroge la nécessité de cette série supplémentaire.

Objectifs

L'obésité morbide est un problème de santé publique majeur et croissant qui est fréquemment associé à des complications métaboliques telles que le diabète de type 2, l'hypertension, des concentrations élevées en lipides dans le sang et les maladies hépatiques. Le développement de nouvelles molécules susceptibles de réguler la prise alimentaire est actuellement en plein essor. L’objectif de ce projet est de tester différentes doses et différentes fréquences d’administration d’une nouvelle molécule pharmaceutique d’intérêt.

Bénéfices attendus

Notre étude, en améliorant la connaissance sur les effets et le mode d’administration de nouvelles molécules affectant la prise alimentaire nous permettra de préparer la mise en place d’une étude clinique de phase 1 et à terme une meilleure prise en charge des patients obèses.

Procédures

Les souris vigiles recevront une injection sous cutanée tous les 2 ou 5 jours pendant 4 semaines. Les souris seront pesées chaque jour pendant 28 jours. A jour 28, une acquisition d’images d'une durée de 30 à 40 minutes sera réalisée sur animaux anesthésiés pour déterminer le pourcentage corporel en masse grasse et masse maigre.

Impact sur les animaux

Le protocole est modéré, il comporte des injections sous cutanées tous les 2 ou 5 jours, des prises de poids et une analyse non invasive terminale de mesure de composition corporelle. Nous n’attendons pas d’effets indésirables majeurs néanmoins une surveillance appuyée des sites d'injections sera réalisé pour s'assurer de la bonne tolérance de la molécule.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à la fin de l'expérimentation afin de récolter le foie, le coeur et les tissus adipeux gonadaux et sous cutanées.

Remplacement

Le métabolisme énergétique et le développement de l'obésité est un processus physiologique complexe, impliquant l’action combinée d’une multitude d’organes et de diverses voies métaboliques. Il est donc actuellement impossible d’étudier ce paramètre d’une façon intégrale ex vivo ou in vitro et nous sommes malheureusement contraints d’utiliser les modèles animaux. il est à noter que l'efficacité de la molécule a déja été validée par nos collaborateurs américains via une étude pilote réalisée in vitro et in vivo.

Réduction

Ce projet a été construit avec la volonté de mettre en place et de respecter « la règle des 3 R ». Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en oeuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation a été défini en fonction de notre expérience passée. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Le calcul d’effectif a été défini à l'aide d'un logiciel dédié.

Raffinement

Enfin, les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations. Les animaux seront hébergés 4 par cage dans un environnement sain. Les cages seront enrichies par des frisottis et un dôme en carton. Afin de limiter les souffrances expérimentales, une surveillance attentive et quotidienne des animaux sera réalisée au cours de la procédure. Des signes cliniques définissant les points limites ont été fixés au-delà desquels l’expérimentation serait arrêtée et l’animal euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé depuis longue date pour caractériser de manière intégrée les mécanismes de régulation de l'homéostasie énergétique. Nous utiliserons des souris à l’âge adulte, le début du protocole se fera sur des souris âgées de 8 semaines. Nous maitrisons un modèle de souris sauvages rendues obèses par un régime hyperlipidique.

Enduites de crème Aldara provoquant une dermatite proche du psoriasis, 936 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvements de tissus. Elles reçoivent en plus des injections intrapéritonéales quotidiennes, une semaine sur deux pendant neuf semaines, et présentent stress et grattage. Le projet cherche le rôle de certaines enzymes dans l'inflammation cutanée, en vue de futures cibles thérapeutiques. Le porteur affirme avoir limité le nombre d'animaux par des travaux in vitro préalables, mais juge l'étape animale "indispensable".

Objectifs

Notre laboratoire étudie le rôle des médiateurs de l’inflammation au cours des pathologies inflammatoires chroniques de la peau telles que le psoriasis. La description de l’activité de ces médiateurs proinflammatoires permet d’identifier celles qui jouent un rôle primordial dans la physiopathologie de la maladie et de les cibler en thérapie. Bien que quelques médiateurs proinflammatoires constituent des cibles thérapeutiques validées en clinique, des mécanismes d’échappement sont toujours observés, nécessitant l’identification de nouvelles cibles originales. Dans le cadre d’une collaboration scientifique nationale, nous étudions le rôle de certaines enzymes du microenvironement inflammatoire. Les rôles respectivement pro-inflammatoires et anti-inflammatoires de ces molécules sont décrits dans un contexte tumorale et des outils de blocages de ces enzymes sont en cours de validation chez l’animal. Néanmoins, leurs expressions par les cellules résidentes cutanées (kératinocytes, fibroblastes) ou par les cellules immunitaires et leurs activités biologiques sont peu caractérisées dans les maladies inflammatoires chroniques cutanées. Des résultats préliminaires montrent que l’expression de ces enzymes est modifiée dans les lésions psoriasiques humaines et que les kératinocytes, les fibroblastes et les cellules immunes peuvent produire ces enzymes in vitro dans un contexte inflammatoire. Le but de notre projet est de démontrer les roles régulateurs de ces enzymes dans la dermatite psoriasiforme chez la souris en utilisant des animaux génétiquement modifiés n’exprimant pas ces enzymes et des inhibiteurs originaux spécifiques de ces enzymes.

Bénéfices attendus

Ces résultats nous permettront de mieux comprendre le rôle joué par certaines enzymes dans la régulation de l’inflammation cutanée. A terme, le développement des inhibiteurs testés dans notre projet pourrait améliorer la prise en charge des patients présentant des lésions chroniques en ciblant l'inflammation induite par ces enzymes.

Procédures

-Injection intrapéritonéale tous les jours pendant 5 jours, sur animal vigile (n=72 souris). -Anesthésie générale par injection intra-péritonéale (n=936 animaux). -Application quotidienne en vigile de crème Aldara ou de vaseline sur l’oreille et sur le dos de l’animal une semaine sur 2 pendant 9 semaines (n=936 animaux). -Injection quotidienne par voie intrapéritonéale une semaine sur 2 pendant 9 semaines (uniquement pour les animaux traités, n=468 animaux). -Administration une fois par semaine des inhibiteurs enzymatiques ou des excipients par application sur l’oreille et le dos, ou par injection intrapéritonéale pendant 9 semaines. (n=468 animaux).

Impact sur les animaux

-injections intrapéritonéales: douleur et stress légère et transitoire -Anesthésie fixe : incomfort léger et transitoire au réveil -Application de crème sur le dos et l’oreille : stress léger et transitoire. Phénomènes de grattage.

Devenir

Mise à mort pour prélèvements tissulaires et analyses histologiques et moléculaires

Remplacement

Nous avons limité le nombre d’animaux utilisés dans notre projet en réalisant en amont des expériences sur des modèles in vitro de kératinocytes, fibroblastes, monocytes et leucocytes. Ces données nous ont permis de cibler ces 4 types cellulaires et d’analyser les expressions et fonctions de ceraines enzymes dans l’inflammation. L’intégration de ces types cellulaires dans le tissu cutané in vivo est maintenant indispensable pour vérifier les profils d’expression et les fonctions identifiées in vitro. L’utilisation d’animaux génétiquement modifiés n’exprimant pas ces enzymes dans les types cellulaires cités est indispensable pour démontrer le rôle clé de ces molécules dans l’inflammation. De même, le blocage d’activité par des inhibiteurs originaux seront testés en amont sur des cultures in vitro. Seuls les outils validés in vitro et sans toxicité seront testés sur les souris. A ce jour, il n'existe pas de modèle in silico permettant de réaliser ce projet. La modélisation in vitro ou in silico n’est pas envisageable au vu de la complexité de la réponse inflammatoire cutanée étudiée.

Réduction

L’expérience du laboratoire sur ce modèle d’inflammation chronique et la variabilité mesurée des différents paramêtres de l’inflammation nous ont permis d’utiliser un test de puissance et de calculer un effectif pour avoir des données interprétables statistiquement et robustes. Afin de limiter le nombre d'animaux, une analyse intermédiaire sera effectuée. Si aucune différence n’est observée entre les lots, l’expérience sera stoppée. Si une différence est observée nous procéderons à la réalisation des expériences sur le dernier groupe d’animaux. De même, le test des inhibiteurs enzymatiques ne sera effectué que si un phénotype est observé chez les souris génétiquement modifiées.

Raffinement

Afin de limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse des animaux, ceux-ci seront anesthésiés lors des phases d’expérimentation les plus longues avec contrôle de la température par tapis chauffant. Afin de satisfaire les besoins comportementaux des souris, celles-ci seront maintenues en groupe de 3 individus par cage ventilée. Leur milieu sera enrichi de structures adaptées leur permettant de se cacher (nid, tunnel, matériel à ronger). Dans certains modèles d’inflammation, une perte de poids temporaire, liée à une déshydratation de l’animal, peut être observée. Afin de compenser cette déshydratation une réhydration sera effectuée de façon préventive, un gel hydraté mis à disposition dans les cages et le poids des animaux mesuré quotidiennement pendant le traitement. Des points limites gradés précis et adaptés sont proposés et feront l’objet d’une surveillance quotidienne. Une prise en charge par un traitement antalgique sera mise en oeuvre précocemment en cas de besoin.

Choix des espèces

Le système immunitaire de la souris décrit et étudié depuis des décennies, autorise des comparaisons avec le système immunitaire humain. Les modèles murins, bien que pouvant présenter certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier l’inflammation cutanée et évitent d’avoir recours à des espèces animales supérieures. De plus, le projet de recherche inclut des expériences utilisant des modèles animaux modifiés génétiquement disponibles uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 à 14 semaines lorsque leur système immunitaire est bien développé.