Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
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Consolidation du protocole de marquage par fluorochrome chez l’anguille européenne (Anguilla anguilla) pour la détection externe des marques sur individus vivants en vue d’applications opérationnelles
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Relâchées dans le milieu naturel à l'issue de l'expérience, 900 civelles sont capturées en estuaire, marquées par immersion dans un colorant fluorescent puis maintenues 180 jours en aquarium et en bassin, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. 300 d'entre elles sont anesthésiées, mesurées et passées au lecteur portatif à 60 et 180 jours. Le porteur indique que la mise à mort restera "anecdotique", limitée aux cas d'atteinte des points limites, et compte sur une mortalité en captivité pouvant atteindre 40 à 50 %. L'objectif déclaré est de valider une détection externe des marques, ce qui éviterait à l'avenir de tuer les civelles pour lire leurs otolithes.
Objectifs
Face au déclin des population d’anguilles européennes, des mesures sont mises en œuvre pour reconstituer les stocks et sauvegarder l’espèce, dans le cadre du plan national de gestion de l’anguille. Des opérations de repeuplement sont réalisées chaque année : des jeunes anguilles (civelles) sont capturées en estuaire et relâchées dans les zones amont des cours d’eau côtiers. Afin d’évaluer le succès de cette pratique de repeuplement, il est nécessaire de pouvoir différencier les individus introduits ; pour cette raison, les civelles capturées sont marquées par immersion dans un colorant avant d’être relâchées. Ce colorant génère une marque fluorescente fixée durablement dans les structures osseuses des jeunes anguilles, et en particulier dans des concrétions de l’oreille interne (otolithes). L’observation de ces structures nécessite toutefois la mise à mort des individus. La possibilité d’une détection externe des marques a été récemment démontrée sur des civelles et des tests réalisés en 2022 puis 2023 ont confirmé la présence de marques dans la mâchoire et les nageoires des civelles, détectable après 180 jours à l’aide d’un dispositif portatif. L’objectif de la présente étude est de rendre opérationnel le protocole de marquage en réduisant les quantités de colorant utilisé et en validant la procédure de détection sur des individus vivants après 6 mois.
Bénéfices attendus
La lecture externe des marques sur individus vivants permettrait en premier lieu la préservation des civelles analysées (pas de mise à mort), une simplification du protocole de détection, la réduction du temps de lecture des marques et l’augmentation de la taille de l’échantillon analysé dans un soucis de représentativité statistique.
Procédures
Les animaux seront soumis au marquage par immersion dans une solution de marqueur fluorescent, selon 4 traitements et un contrôle. La durée des interventions sera de 13.5 minutes (balnéations "flash"). Puis 60 individus seront prélevés, anesthésiés, mesurés, pesés et leur fluorescence observée à l’aide du lecteur portatif. La durée totale de l’intervention hors d’eau sera de 1 minute.
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables potentiels sur les animaux concernent le transport après capture, le marquage, le maintien en captivité et l’anesthésie avant lecture de fluorescence. Toutefois, ces effets peuvent être considérés comme légers au vu de l’expérience des opérateurs dans le transport et le marquage des civelles, qui sont communément réalisés dans le cadre du programme de repeuplement.
Devenir
900 civelles seront capturées, transportées, marquées puis stabulées pendant 180 jours en aquarium puis en bassins (mésocosmes). A 60 et 180 jours, 150 individus seront anesthésiés, mesurés, analysés (mesure de fluorescence), puis remis en liberté. Tous les autres individus seront remis en liberté en fin d’expérience. La mise à mort restera anecdotique, uniquement en cas d’atteinte des points limites.
Remplacement
La civelle est l’objet d’étude et ne peut pas être remplacée pour cette expérience de recherche de fluorescence externe. Les résultats obtenus sur une autre espèce de poisson ne pourraient être transposés à la civelle, du fait de sa singularité morphologique (poisson serpentiforme), anatomique (épiderme translucide) et comportementale (activité nocturne).
Réduction
L’effectif de 900 individus (3 lots de 50 individus pour chacun des 5 traitements + 1 lot contrôle de 150 individus) tient compte de la mortalité attendue en milieu contrôlé au stade civelle (maximum 40-50%, en fonction de la qualité des civelles récupérées chez le mareyeur, variables selon la période de pêche). A 2 occasions au cours du suivi (60 et 180 jours), un effectif de 30 individus par traitement sera analysé. Ainsi, au total 300 individus seront anesthésiés et analysés, afin de prendre en compte la variabilité inter-individuelle du niveau de fluorescence, potentiellement importante si l’on se réfère aux résultats des études réalisées en 2022. Tous les individus (analysés ou non) seront relâchés dans le milieu naturel sur les sites de repeuplement (au maximum 900 individus).
Raffinement
Lors du transport, les civelles seront réparties dans deux sacs de transport gonflés à l’O2 et contenant un volume d’eau adapté. La densité de civelles sera très faible comparé aux densités de stockage observées chez les mareyeurs et lors des opérations standards de marquages effectuées depuis 2011 pour les repeuplements. La durée de transport est limitée au minimum et estimée à environ 1 heure, ce qui permet de garantir le maintien d’un niveau d’oxygénation très élevé dans les sacs (très faible consommation par les civelles). Pour le marquage, l’oxygénation des solutions sera maintenue à 100% à l’aide de diffuseurs d’oxygène, point essentiel en raison des fortes densités d’individus. Les aquariums seront enrichis à l’aide caches constituées de tubes PVC puis des flottangs seront utilisés dans les mésocosmes, dispositifs permettant aux civelles de s’abriter. Des daphnies seront ensemencées pour leur alimentation. La concentration en déchets du métabolisme azoté sera contrôlée chaque semaine, la concentration en oxygène et la température seront également contrôlées quotidiennement. Des changements d’eau seront réalisés si nécessaire, notamment en période de fort réchauffement estival. Lors des contrôles de fluorescence (à 60 et 180 jours), les civelles seront anesthésiées individuellement puis au moment de la lecture de fluorescence, leur tête sera protégée des rayonnements laser à l’aide d’un cache opaque. La durée totale de la manipulation hors d’eau n’excèdera pas 1 minute.
Choix des espèces
L’anguille est une espèce menacée au niveau européen, qui fait l’objet d’un plan de conservation à l’échelle nationale. L’évaluation des pratiques de repeuplement par une méthode de détection externe non létale représente un fort enjeu pour la gestion future. Les animaux seront utilisés au stade civelle car c'est le stade utilisé en France pour réaliser les opérations de repeuplement d'anguille.
Le rôle des plaquettes dans la formation des anévrysmes intracrâniens 2/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Ligature de la carotide et de l'artère rénale, injection d'une molécule dans le cerveau, pose d'un dispositif augmentant la pression artérielle : 1 179 souris subissent ces interventions dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Le porteur attend environ 10 % de mortalité pour chacune des deux chirurgies, et décrit des douleurs post-opératoires, des pertes de poids, et pour les souris dont l'anévrysme se rompt une hémorragie et des symptômes neurologiques. Cinq prélèvements sanguins et dix jours de sessions de mesure de pression sur animal maintenu immobile s'ajoutent aux chirurgies. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun dispositif ne reproduit tous les paramètres de la maladie et conclut qu'il est "nécessaire" d'utiliser des animaux vivants.
Objectifs
Ce projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs. Les anévrysmes intracrâniens (AI) sont des déformations des vaisseaux sanguins présentes dans le cerveau chez environ 4% de la population avec une majorité de femmes atteintes. La rupture d'un anévvrysme entraine des saignements dans le cerveau, ce qui provoque le plus souvent la mort du patient. L’unique traitement des AI, rompus ou non, consiste en une intervention chirurgicale risquée permettant de retirer l'anévrysme du cerveau. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, moins lourdes, pour améliorer la prise en charge des patients. Il est aujourd’hui admis qu'un flux sanguin anormal et une inflammation de la paroi vasculaire sont à l'origine de l'anévrysme car ils fragilisent la paroi, ce qui permet la déformation du vaisseau. Cette déformation du vaisseau qu'est l'AI évoluera ou non jusqu’à sa rupture. Il apparait que les plaquettes, petites cellules sanguines responsables, entre autre, de la cicatrisation lorsqu'on se coupe et de la coagulation, pourraient être impliquées dans les processus pathologiques de formation d'AI. Ces cellules sont en effet les garantes de la bonne santé de la paroi des vaisseaux. Ce projet a pour but de caractériser la contribution des plaquettes et leur mécanismes de réponses lors des stades précoces de la pathologie anévrysmale. Pour cela, nous allons appliquer un modèle d’induction d’anévrysme bien connu et documenté chez la souris. Ce modèle permet d’obtenir en 23 jours chez la souris la formation d'AI. Pour étudier dans la pathologie anévrysmale le rôle de différentes molécules plaquettaires nous disposons de lignées murines génétiquement modifiées ayant des plaquettes déplétées pour ces différentes molécules plaquettaires que nous voulons tester. Nous utiliserons aussi différents médicaments ciblant tous différentes propriétés plaquettaires.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre dans un premier temps d'identifier des molécules plaquettaires impliquées dans la formation des anévrysmes et leur croissance. Il permettra par la suite de tester des médicaments antiplaquettaires déjà utilisés chez l'Homme (comme par exemple l'Aspirine qui empêche les plaquettes de remplir leur rôle dans la coagulation)ainsi que de nouvelles molécules antiplaquettaires en développement. Si nous validons des médicaments empêchant la formation ou la croissance des anévrysmes, le bénéfice pour les êtres humains pourrait être conséquent. De plus, comme les médicaments que nous allons tester sont pour la plupart déjà administrés à l’Homme il n'y aura pas à attendre pour obtenir toutes les autorisations nécessaires à l'utilisation d'une nouvelle molécule chez l'Homme. Finalement, ce projet pourrait permettre de remplacer un traitement chirurgical compliqué et dangereux par un traitement médicamenteux simple et beaucoup moins dangereux.
Procédures
Tous les gestes techniques à l’exception de la mesure de la pression artérielle sont réalisés sur animaux anesthésiés à l’aide d’une anesthésie gazeuse. Tous les animaux prévus dans ce projet seront soumis à une procédure permettant de créer des anévrysmes intracrâniens. Avant l'intervention chirurgicale : un prélèvement sanguin (1 minute) est prévu ainsi qu'une session de rasage des zones opérées (5 minutes). 4 autres prélèvements sanguins (1minute) sont prévus afin de pouvoir étudier les propriétés du sang des souris tout le long du modèle. la première procédure chirurgicale de 50 min consiste en la ligature de la carotide commune gauche, la ligature de l’artère rénale droite (30 min de procédure pour ces deux ligatures) + 20 min de suture du muscle abdominal et de la peau. Les ligatures consistent à faire un noeud autour des artères avec un fil, ce qui permet de couper la circulation sanguine et la suture permet de remettre les bords de l'incision faite au niveau du ventre de la souris ensemble ce qui permettra la cicatrisation. Cette procédure s’effectue sur animaux analgésiés. Une autre procédure chirurgicale de 50 min est prévue durant laquelle l’animal reçoit une injection d'une molécule dans le cerveau (40min) et la pose d'un dispositif en sous cutanée au niveau du dos permettant de diffuser une molécule augmentant la pression artérielle(10min). Cette procédure s’effectue sur animaux analgésiés. La pression artérielle des souris sera mesurée sur souris vigile lors de session de 15 minutes de mesure. Chaque souris aura 4 jours de session constituant des séances d’habituation à la machine et 6 jours de mesure de pression. Toutes les procédures décrites ci dessus s'effectueront dans l'établissement utillisateur EU1. L'évolution de leur pathologie sera surveillée par des méthodes d'imagerie: 3 séances d’échographie doppler (15min par séance) + 2 séances d’IRM (30 min par séance). Cette partie surveillance par imagerie s'effectura dans l'établissement utilisateur EU2.
Impact sur les animaux
Une certaine mortalité est attendue lors de la chirugie de ligature des artères (obstruction d'artère permettant de modifier le flux sanguin dans le cerveau de l'animal), estimée être de l’ordre de 10%. Il en est de même pour la chirurgie d’injection de molécule dans le cerveau, il existe une mortalité de 10%. Les effets indésirables prévus sur les animaux sont : douleur post-opératoire (modérée grâce à l'utilisation d'antidouleur, pendant environ 24h) après chaque chirurgie; perte de poids postopératoire. Pendant la mesure de leur pression artérielle, les animaux peuvent ressentir du stress car ils sont maintenus immobiles (de façon non douloureuse pour l'animal). Si les animaux souffrent d'une rupture d’anévrisme : brusque perte de poids ; Apparition de symptomes neurologiques, hémorragie.
Devenir
Dès lors qu'une rupture d'anévrysme est identifiée, les animaux sont euthanasiés. Les animaux arrivant jusqu'à la fin de la procédure sans avoir eu de rupture d'anévrysme sont aussi euthanasiés. Nous effectuons des euthanasies afin de pouvoir analyser le cerveau des souris et les anévrysmes qui s'y sont développés. Nous étudions aussi leur sang pour analyser les caractéristiques de leur plaquettes.
Remplacement
La maladie que nous cherchons à étudier est une maladie complexe qui fait intervenir beaucoup de paramètres (inflammation, remodelage de la paroi des vaisseaux sanguins, flux sanguin, pression artérielle...). Il n'existe pas de dispositif aujourd'hui permettant de mimer tous les paramètres nécessaires à la maladie. Il est nécessaire d'utiliser des animaux vivants pour provoquer une maladie qui se rapproche de celle des Humains
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grace aux données disponibles dans la litératture scientifique du domaine. Des tests statistiques pour connaitre le nombre de souris minimum nécessaire ont aussi été réalisés.
Raffinement
Une grille de score a été mise en place, nous permettant d'agir sur la souffrance des animaux avec euthanasie lorsque des points limites sont atteints. La douleur post-opératoire est évaluée chez nos animaux, et est traitée préventivement grâce à l’administration d'un antidouleur. Après les chirurgies, les souris sont gardées en observation car il peut arriver qu’une hémorragie (due au passage de la micropipette dans un vaisseau par exemple) survienne. Ceci s’exprime par l’apparition de symptome neurologique et la souris est alors euthanasiée. Après cette chirurgie, les souris peuvent aussi être gênées dans leurs mouvements pendant 1 à 2 jours. De la nourriture humide est donc placée au sol dans leur cage, plus facile d’accès. L'apparition de symptôme neurologique, l'apparence général des animaux ainsi que leur poids sont contrôlés tous les jours. Enfin, du coton est placé dans leur cage ce qui permet aux animaux de faire des nids. Le transport entre les 2 EU dure 5 minutes à pied. Les souris sont déplacées dans leur cage qui sont placées dans un sac de transport recouvert d'un tissus pour les cacher de la vue du public.
Choix des espèces
La souris présente un système vasculaire, c'est à dire une organisation des vaisseaux sanguins proche de l'Homme. De même son système immunitaire impliqué dans les inflammations ressemble aussi à celui de l'Homme, permettant une transition des résultats trouvés chez la souris à l'Hommme plus facile. De plus, il existe un grand nombre de souris ayant différentes protéines de plaquette absentes, nous permettant d'en tester un grand nombre. Sa large utilisation dans le domaine scientifique a conduit au développement de nombreux modèles d’anévrysme intracranien dont celui sur lequel se base le projet, qui permet de mimer certaines caractéristiques de la pathologie humaine. Age adulte (entre 8 et 12 semaines). Notre étude porte sur le rôle des plaquettes dans une pathologie touchant principalement des individus adultes.
Étude de la dysfonction coronaire microvasculaire et de sa prévention par échographie chez le petit animal (2/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses immunohistochimiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Porteuses d'une mutation qui les rend diabétiques et obèses, elles reçoivent un gavage quotidien six jours sur sept pendant douze semaines, quatre échographies cardiaques sous anesthésie avec épilation de la zone examinée, et deux prélèvements de sang à la queue sur animal vigile. Le porteur justifie la mise à mort par la "nécessité" d'objectiver la dysfonction des microvaisseaux coronaires par des analyses post-mortem. Le projet teste un médicament contre l'insuffisance cardiaque déjà commercialisé, l'Entresto, dont il indique que les effets coronaires restent inconnus.
Objectifs
Les maladies des artères coronaires sont responsables d’une augmentation de la mortalité cardiovasculaire. L’objectif de cette étude est d’étudier la possibilité de la prévention de ces maladies en utilisant un traitement contre l’insuffisance cardiaque (Entresto) dont les effets coronaires sont inconnus à ce jour, dans un modèle de souris obèse diabétique.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra l’évaluation de la capacité de l’Entresto à prévenir la dysfonction coronarienne microvasculaire.
Procédures
Les animaux prendront part à plusieurs imageries échographiques cardiaques réalisées à 8, 12, 16 et 20 semaines d’âge. Elles se feront sous anesthésie volatile et dureront 30 min maximum pour chaque souris. Durant les acquisitions les souris seront épilées au niveau de la zone d’intérêt avec une crème épilatoire pour peaux sensibles, elles seront sur un lit thermostaté pour compenser la chute de température corporelle liée à l’anesthésie et recevront un gel ophtalmique pour prévenir toute sécheresse oculaire. Les échographies auront lieu dans un autre établissement utilisateur que l’hébergement, Le transport des animaux vigiles prendra environ 10 min et se fera par voie pédestre dans des conditions de raffinement maîtrisées en utilisant des cages isolées des stimuli extérieurs. A partir de l’âge de 8 semaines et immédiatement après la 1ère échographie, une solution d’Entresto dilué dans du liquide physiologique sera administrée quotidiennement par gavage aux animaux du groupe traité jusqu’au terme du protocole, c’est-à-dire pendant 12 semaines, soit jusqu’à 20 semaines d’âge. Le volume administré quotidiennement per os sera de l’ordre de 500 µL. Les animaux des groupes diabétiques et contrôles non traités se verront administrer un volume similaire de liquide physiologique. Une trêve dominicale sera observée pour tous les animaux (traitement 6 jours / 7 pendant 12 semaines), compatible avec la pharmacocinétique de l’entresto décrite chez le rongeur. Un prélèvement sanguin caudal sera effectué sur les animaux vigiles à 8 et 20 semaines pour dosage plasmatique d'un marqueur d’efficacité du traitement.
Impact sur les animaux
L’imagerie échographique cardiaque implique l’administration intrapéritonéale d’un agent vasodilatateur qui sera réalisée sous anesthésie volatile afin de limiter le stress aux animaux. Le transport et le changement d’animalerie peuvent aussi induire un stress léger lié au balancement des cages et au changement de température. La cage sera transportée avec soin et isolée des stimuli extérieurs ainsi que thermiquement. Le transport, pédestre, sera également inférieur à 10 min. Le réveil d’anesthésie ainsi que les deux prélèvements caudaux peuvent également causer un stress léger. En revanche, aucun effet indésirable n’est attendu comme conséquence de l’administration de l’Entresto, qui est largement utilisé en clinique.
Devenir
La mise à mort des animaux à l’issue de la procédure expérimentale est justifiée par la nécessité d’objectiver la dysfonction coronaire microvasculaire par des études immunohistochimiqes post-mortem.
Remplacement
Les atteintes des microvaisseaux coronaires sont la conséquence de désordres métaboliques et physiologiques qui sont à l'heure actuelle impossible à reproduire in vitro et qui nécessitent l’utilisation d’un modèle animal. De plus, l’évaluation de l’effet de l’Entresto sur la microcirculation coronaire doit être effectuée in vivo pour que l’on puisse envisager une extrapolation des résultats à la situation clinique.
Réduction
L’utilisation de 24 animaux au total se répartissant en 8 animaux / groupe est un minimum pour l’analyse fiable des résultats. Nous fondons ce dimensionnement sur une étude préalable ayant mis en évidence une dysfonction coronaire microvasculaire par réduction significative de la réserve coronaire in vivo chez des rats obèses avec des effectifs similaires. Nous comptons également sur l’absence de mortalité observée précédemment au décours de ce protocole expérimental pour limiter au maximum la taille initiale des groupes expérimentaux.
Raffinement
Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux avec enrichissement du milieu de vie, un hébergement par groupe et un suivi de leur bien-être sera effectué quotidiennement. Des points limites stricts et spécifiques au modèle animal et aux actes réalisés sont mis en place, via une grille de scoring, afin d’évaluer une potentielle souffrance. Une surveillance accrue de la consommation d’eau de boisson en raison de la polydipsie des animaux diabétiques sera réalisée et la fréquence de change des cages sera augmentée si nécessaire. Les sessions d’imagerie échographique cardiaque se dérouleront sous anesthésie volatile, avec une anesthésie d’environ 30min. Les animaux seront placés sur un lit thermostaté le temps de l’imagerie et les fréquences respiratoire et cardiaque seront monitorées en continu afin de contrôler le degré d’anesthésie et de le moduler si nécessaire. Le protocole d’imagerie échographique cardiaque n’entrainera pas de douleur, souffrance ou angoisse.
Choix des espèces
La lignée de souris choisie possède une mutation génétique qui la rend diabétique. Le modèle est très largement utilisé pour l’étude de maladies métaboliques car il reflète bien la maladie humaine , tout en étant moins sévère que d’autres modèles. Ce modèle constitue donc un outil largement utilisé pour l’étude de la maladie coronaire microvasculaire et de sa prévention. Les animaux seront accueillis à 7 semaines d’âge, à un stade de développement précoce de la maladie diabétique entraînée par la mutation dont ils sont porteurs. Le choix de ce stade précoce est guidé par la volonté d’étudier le potentiel de l’Entresto à prévenir la maladie coronaire microvasculaire.
Caractérisation des effets de la diminution de DNM2 ou de l’augmentation de BIN1 sur la fonction musculaire dans un modèle murin reproduisant une forme récessive de myopathie centronucléaire causée par des mutations dans le gène Ryr1
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Soumises chaque semaine à des tests d'activité locomotrice, de force et de posture, puis à des mesures de force sous anesthésie, 280 souris sont toutes tuées après prélèvement d'organes, 240 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 40 d'un niveau sévère. Ces 40 souris portent la mutation étudiée, qui provoque une perte de poids dès quinze jours, une scoliose, une cyphose, une atrophie et une faiblesse musculaires, et une survie qui dépasse rarement huit semaines. Toutes reçoivent une biopsie de l'oreille pour identification et sont isolées temporairement, jusqu'à 48 heures pour l'enregistrement de l'activité spontanée. Le porteur qualifie ces tests de "peu invasifs" et affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'évaluer la contractilité musculaire sur l'organisme entier.
Objectifs
Les myopathies congénitales sont des maladies génétiques rares qui affectent notamment la fonction des muscles squelettiques. A ce jour aucun traitement n’est disponible pour les patients atteints de ces maladies qui impactent grandement leur survie ou qui sont handicapantes au quotidien et qui affectent considérablement leur qualité de vie. Le but de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique de la modulation du niveau de protéines impliquées dans la maladie pour le traitement de myopathies congénitales.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de fournir des informations relatives aux effets de la modulation du niveau de protéines impliquées dans la maladie pour le traitement de myopathies congénitales. Ce projet permettra de proposer un traitement pour ces maladies graves.
Procédures
Des tests de comportement peu invasifs qui permettront d’évaluer les performances et capacités motrices de l’animal (activité locomotrice, force, posture) seront réalisés une fois par semaine chez l’animal vivant à partir de 3 semaines pendant 5 semaines (i.e. jusqu’à l’âge de 8 semaines), puis une fois par mois de deux mois jusqu’à un an. Chaque test sera réalisé 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 minutes entre chaque essai. Chaque essai durera entre 10 secondes et 5 minutes selon le test comportemental. L’activité locomotrice spontanée et la posture debout de l’animal seront acquises pendant 48h au maximum, période au cours de laquelle les animaux seront hébergés individuellement. La production de force sera mesurée sur une durée maximale de 30 minutes chez l’animal anesthésié par inhalation d’un mélange gazeux ou par injection intrapéritonéale d’un anesthésique et d’un anti-douleur dont l’administration ne durera pas plus de 5 secondes.
Impact sur les animaux
Une partie des animaux (40/280) sont porteurs de la mutation qui entraine une perte de poids à partir de 14 jours après la naissance, une scoliose et une cyphose, une atrophie musculaire, une faiblesse musculaire et une durée de vie réduite par rapport à des animaux contrôles (les animaux ne survivent pas plus de 8 semaines). Pour ces animaux, les mâles et les femelles sont affectés. Tous les animaux seront identifiés et génotypés à partir d’une biopsie auriculaire prélevée à partir de 14 jours suivant la naissance. Tous les animaux seront isolés temporairement. Tous les animaux seront mis sous anesthésie générale profonde en fin de procédure.
Devenir
Les animaux utilisés pour les tests seront euthanasiés après prélèvement des organes nécessaires pour les analyses au niveau cellulaire et moléculaire.
Remplacement
Dans ce projet qui consiste à évaluer les effets de la modulation du niveau de protéines sur la fonction du muscle, le modèle murin est privilégié car l’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer la contractilité du muscle. D’autre part, il n’existe pas de méthode alternative qui permette d’évaluer sur l’organisme entier et dans des conditions in vivo les effets de ce type de modulation. L’évaluation in vivo des effets de potentiels traitements est un prérequis indispensable avant toute application clinique.
Réduction
Pour la production des animaux expérimentaux, le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle et en faisant plusieurs portées par femelle. Pour la partie expérimentale, les tests comportementaux peu invasifs offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. Ce point est essentiel car il permet de réduire de manière drastique le nombre d’animaux.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, la couleur de la peau, la présence d'une poche de lait seront évalués chez le nouveau-né tous les 2 à 3 jours. A partir du sevrage, les animaux seront hébergés en groupe. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 à 3 fois par semaine. Dès lors qu’une perte de poids sera notée, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. Les tests comportementaux seront peu invasifs et permettront un suivi longitudinal. Afin de diminuer le stress lié à ces tests, une session de familiarisation sera effectuée. Pour les tests nécessitant une anesthésie générale de l’animal, la respiration sera contrôlée visuellement, la température de l’animal sera régulée et maintenue à sa valeur basale à l’aide d’une lampe chauffante et un gel ophtalmique sera appliquée sur les yeux de l’animal afin de limiter l´assèchement des cornées. La phase de réveil s’effectuera sous une lampe chauffante dans une cage où l’animal sera seul, puis l’animal sera replacé dans sa cage avec ses congénères.
Choix des espèces
Le modèle murin utilisé reproduit la pathologie humaine. Une partie des animaux générés développe un phénotype dommageable (symptômes de myopathie dès 14 jours après la naissance). La durée de vie maximale de ces animaux étant de 8 semaines avec une majorité des animaux mourant avant l’âge de 8 semaines, ces animaux seront utilisés entre 5 et 7 semaines. Si la modulation génique améliore le phénotype, les autres animaux générés ne développeront pas de phénotype dommageable. Les tests de la fonction musculaire seront réalisés une fois par semaine sur les animaux âgés de 3 semaines (i.e. à partir du sevrage) sur une période de 5 semaines puis une fois par mois à partir de 2 mois jusqu’à un an, chez les animaux sans phénotype dommageable.
Rôle spécifique des composants d’une voie de réponse à l’infection dans l’immunodépression suite à une infection chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour comprendre l'immunodépression qui suit une infection sévère, 7 648 souris sont utilisées, toutes tuées pour prélever des organes vitaux, 6 880 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 768 d'un niveau sévère. Une partie subit une péritonite provoquée par perforation du tube digestif sous anesthésie, une autre reçoit l'injection d'un composant bactérien sur animal vigile, puis des injections d'inhibiteurs chaque jour pendant six jours jusqu'à la mise à mort. Le porteur indique que la péritonite peut provoquer douleurs, perte de poids et réduction de la mobilité, et prévoit une mise à mort anticipée en cas d'inconfort trop important. Il juge l'étude sur "animal entier" indispensable et rappelle que des médicaments inhibant cette voie sont déjà utilisés en clinique dans d'autres indications, ce qui rend selon lui la perspective thérapeutique "très concrète".
Objectifs
Chez les patients de réanimation présentant une infection sévère, des altérations de la réponse immunitaire se développent, responsables de la majorité des décès. Les mécanismes à l’origine de ces dysfonctionnements des cellules du système immunitaire restent mal connus. L’activation d’une voie particulière de l’inflammation pourrait participer à ce phénomène. Les souris présentant une infection sévère ont une activation de cette voie, en association avec des altérations du système immunitaire. Au cours de ce projet, nous allons étudier plus précisément le rôle respectif des différents composants de cette voie en utilisant d’une part des souris génétiquement modifiées capables ou non d’activer cette voie de l’inflammation et d’autre part des inhibiteurs de cette voie. Nous utiliserons un modèle murin d’infection sévère par péritonite ou par injection d’un composant bactérien. Nous étudierons les altérations immunitaires présentées par ces souris dans différents organes (rate, moelle osseuse, sang, péritoine, poumon).
Bénéfices attendus
Les infection sévères sont des pathologies fréquentes qui peuvent causer de nombreuses maladies et décès. Le pronostic des patients développant ces infections sévères est principalement grevé par le développement d’altérations de la réponse immunitaire à l’origine à moyen terme d’infections secondaires contractées à l’hôpital et à long terme du développement de maladies cardiovasculaires et de cancers. Une meilleure compréhension des mécanismes de ces altérations est jugée nécessaire par l’Organisation Mondiale de la Santé pour progresser dans la prise en charge de cette pathologie. En focalisant les efforts sur une voie majeure de réponse à l’infection et en particulier sur ses différents composants, cela permettra de générer des pistes pour de nouvelles approches thérapeutiques susceptibles d’améliorer le devenir de ces patients. L’existence de médicaments capables d’inhiber cette voie utilisés en pratique clinique et bien tolérés dans d’autres indications rend cette perspective très concrète. Ces stratégies thérapeutiques innovantes auraient un effet préventif des conséquences à moyen et long terme de ces infections sévères.
Procédures
L’étude des modifications génétiques des souris sera réalisée grâce à une biopsie de l’oreille. Le projet s’appuie sur 2 modèles d’infections chez la souris. Le premier modèle est une infection au niveau abdominal (péritonite) créée par perforation du tube digestif (durée de la procédure : 5 minutes) sous anesthésie générale. Cette intervention est réalisée une seule fois en début de procédure, à J0. Le deuxième modèle consiste en l’injection d’un composant bactérien (injection sur 10 secondes) sur animal vigile. Cette injection est réalisée une seule fois en début de procédure à J0. L’injection des différents inhibiteurs d’une voie de réponse à l’infection sera réalisée au maximum une seule fois par jour pendant 6 jours, jusqu’à mise à mort de l’animal (De J1 à J6 injection sur 10 secondes) sur animal vigile. Les prélèvements sanguins seront réalisés exclusivement sous anesthésie générale le jour de la mise à mort (10 secondes) et les différents autres prélèvements en post-mortem.
Impact sur les animaux
La péritonite peut être à l’origine de douleurs, d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité. Il existe également une douleur au point d’injection lors de l’injection d’anesthésique. L’injection du composant bactérien est à l’origine d’une perte de poids, d’une douleur au point d’injection lors de l’injection et d’une réduction de l’activité et de la mobilité. L’injection d’inhibiteurs de cette voie de l’inflammation génère une douleur au point d’injection lors de l’injection. L’étude des modifications génétiques des souris sera réalisée grâce à une biopsie de l’oreille. Cette biopsie est à l’origine d’une douleur légère de courte durée.
Devenir
Une mise à mort sera réalisée à l’issue des procédures du fait du prélèvement nécessaire d’organes vitaux (poumon par exemple) ne permettant pas d’envisager une autre issue.
Remplacement
Un modèle utilisant uniquement des cellules isolées ou l’utilisation d’outils informatiques ne pourraient refléter toute la complexité de la réponse du système immunitaire contre les infections sévères et les relations entre les cellules de l’immunité. L’étude sur un animal entier est donc indispensable et nous utiliserons 2 modèles d’infection bien validés dans d’autres études et qui reproduisent la réponse anti-infectieuse décrite chez l’homme.
Réduction
Le calcul du nombre d’animaux par groupe a été réalisé afin de pouvoir mettre en évidence des différences significatives entre les groupes. Au cours de chaque expérience, de multiples analyses utilisant des techniques différentes seront réalisées sur les différents prélèvements afin de minimiser le nombre de souris utilisé.
Raffinement
Afin de limiter la souffrance des animaux et d'assurer leur bien-être, une prise en charge de la douleur (anesthésie générale lors de l'intervention, administration d’antalgiques) et une prise en charge de la déshydratation seront réalisées. A l'issue de la chirurgie, les souris seront replacées dans leurs cages avec un aménagement spécifique pour garantir leur confort. La cage sera placée dans une armoire chauffante. Une surveillance quotidienne avec pesée des souris et grille d’évaluation spécifique sera effectuée jusqu'à mise à mort. En cas de douleur ou d’inconfort trop important, une mise à mort anticipée des souris sera réalisée.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux les plus utilisés en immunologie avec un large choix de solutions techniques dédiées disponibles commercialement et des modèles génétiquement modifiés sont d’ores et déjà disponibles. Il s'agit de jeunes adultes (8-12 semaines) dont le système immunitaire est à maturité.
Etude du développement de la spécialisation hémisphérique du langage chez le babouin (EU2/2)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Maintenus en vie et replacés dans leurs groupes sociaux, 76 babouins sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour 38 d'entre eux et léger pour 38 autres, avec une réutilisation possible dans d'autres projets. Trente-huit sujets suivis depuis la naissance subissent chacun six IRM, chaque séance impliquant une capture, deux heures de transport en camion, une anesthésie de deux à trois heures et 48 heures d'isolement, les nouveau-nés étant séparés de leur mère pendant l'examen. Huit femelles reçoivent en plus un dispositif d'imagerie optique fixé sur le crâne et dans le dos, posé et retiré sous anesthésie. Le porteur affirme qu'aucune de ces interventions n'est douloureuse ou invasive, tout en listant comme nuisances le stress des captures, le transport, l'anesthésie, l'isolement et le port du dispositif, et présente le babouin comme un "modèle incontournable" pour étudier l'origine du langage.
Objectifs
Ce projet explore la piste des origines gestuelles de la parole. Et si la communication gestuelle était centrale dans l'origine et l’organisation cérébrale du langage dominé par l’hémisphère gauche ? Cette hypothèse gagne du terrain à la lumière des liens étroits mis en évidence non seulement entre les gestes et le langage dans l'espèce humaine mais aussi entre les gestes de nos cousins les primates et certaines propriétés du langage. Au regard de leur proximité phylogénétique, seule une perspective comparative entre primates humains et non humains peut nous aider à déterminer les continuités entre la latéralisation des gestes des primates et celle du langage humain. A la croisée de l’éthologie, de la psychologie comparée et des neurosciences non invasives, ces recherches continuront d’être menées sur les babouins hébergés en captivité en groupes sociaux et porteront (1) sur le développement longitudinal de gestes communicatifs (et signaux vocaux) au sein du groupe social de babouins olives Papio anubis, leurs asymétries et leur spécialisation hémisphérique anatomique (via IRM anatomique et de diffusion) auprès de 38 babouins depuis la naissance jusqu’à l’âge adulte; (2) sur leurs liens avec la specialisation hémisphérique associée à leurs relations sociales, incluant ainsi l’étude de celle de leurs congérères, impliquant près de 38 indidus supplémentaires ; (3) sur les asymétries cérébrales fonctionnelles des gestes et des vocalisations mesurées par imagerie optique auprès de 8 sujets entrainées Papio anubis. Tous les sujets, dont la taille optimale d'échantillon a été évaluée, sont observés dans leur groupe social respectif et ne sont mobilisés que temporairement au cours du projet sur 5 ans lors de la pose du serre-tête de l'appareil d'imagerie optique ou lors d'acquisitions d’images IRM, et ce, sous anesthésie monitorée dans les standards de sécurité et de bien-être animal avant d'être remis dans leur groupe social après le réveil.
Bénéfices attendus
L’étude de l’ontogénèse de la communication gestuelle du babouin et de sa spécialisation hémisphérique cérébrale associées à des zones homologues du langage revêt une importance cruciale pour comprendre les précurseurs phylogénétiques de l’organisation de notre système de communication, des précurseurs qui auraient été hérités à partir de notre ancêtre commun. Les recherches longitudinales sur des babouins en développement, de la naissance jusqu’à l’âge adulte, constituent une opportunité unique d'explorer les déterminants neurobiologiques potentiels du développement de la communication gestuelle. Une telle approche longitudinale étant peu réalisable sur primates humains, elle renforce l’intérêt de ses recherches, avec le babouin comme modèle incontournable, pour comprendre l’ontogénèse de la spécialisation hémisphérique associée au langage dans l’espèce humaine. De surcroît, les conclusions tirées de ces recherches peuvent avoir des implications uniques pour la compréhension du développement précoce du langage chez l'humain et enrichir notre connaissance en neurosciences cognitives, particulièrement en ce qui concerne la communication gestuelle, ses bases cérébrales et son évolution.
Procédures
Les 38 animaux adultes seront soumis à une anesthésie de 2 à 3h pour une acquisition IRM associée à une capture, un tranport en camion (2h environ aller/retour) et un isolement de 48h. Les 38 sujets suivis longitudinalement seront soumis à 6 IRM chacun. Chaque IRM impliquera également une capture, un tranport en camion et un isolement de 48h et une anesthésie de 2 à 3h pour chaque session. Un sous groupe de 8 femelles sera également utilisé pour des acquisitions d'imagerie optique (3 à 6 par animal) qui nécessitent l'installation d'un dispositif amovible sur le crâne et dans le dos. Pour chaque session, l'animal aura deux anesthésies (1 de 1h pour placer le dispositif, 1 de 20 minutes pour le retirer), 2 captures et un isolement inférieur à 24h. Aucune de ces interventions n'est douloureuse ou invasive.
Impact sur les animaux
Stress lors des captures. Transport. Anesthésie. Isolement 48h. Port du dispositif.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les sujets seront maintenus en vie car les acquisitions ne sont ni invasives ni douloureuses, il seront donc replacés dans leurs groupes sociaux respectifs. Ils pourront potentiellement être réutilisés dans d'autres projets en prenant en compte l'effet cumulatif.
Remplacement
Dans une problématique qui porte sur les origines, au regard de la proximité phylogénétique des primates humains et non humains, seule l'étude du modèle primate peut nous aider à détecter les précurseurs éventuels de certaines propriétés du langage et de leurs bases cérébrales chez notre ancêtre commun. Il nous est donc impossible de remplacer l’animal par un autre sujet ou une autre méthode alternative.
Réduction
Au regard de la variabilité interindividuelle anatomique des cerveaux, étudier les corrélats neuroanatomiques des comportements gestuels des babouins nécessite généralement de larges cohortes de sujets pour la collection d'images IRM. Cette étude étant pionnière sur l’approche longitudinale du développement des asymétries cérébrales de primates non-humains et leurs corrélats comportementaux, il n’existe pas d’"effect size" connu à ce jour sur ce modèle, ne permettant pas d’estimer avec exactitude le nombre de sujets idéal pour la constitution de cette base de données. Néanmoins, en fonction de résultats publiés sur les asymétries cérébrales de babouins de tout âge (n=96), un effort de réduction à 38 sujets a été estimé pertinent au regard de l’aspect répété (x6) des mesures au cours du développement. - Dans l'étude d'imagerie optique fonctionnelle, le nombre de sujets critique a été estimé en fonction des résultats publiés de travaux en imagerie cérébrale fonctionnelle menées sur primates de l’ancien monde (macaques).
Raffinement
Les animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires...), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises...). Ce programme est supervisé par le responsable du bien-être animal et validé par la structure en charge du bien-être animal. La capture est toujours réalisée en privilégiant une méthode sans contention (ni chimique, ni physique). Les animaux sont maintenus dans le noir (effet calmant) par un cache sur la cage de transport et le compartiment du véhicule agrée est chauffé. L’IRM est une méthode non-invasive, ne causant aucune souffrance ou risque pour l’animal et ni de douleur importante apparente et est réalisée sous anesthésie générale. Pour le T0, les sujets étant des nouveaux-nés ils sont capturés avec leurs mères et sont transportées avec celles-ci. Le nouveau-né est alors temporairement séparé de samère pour l’IRM (3h max). Le temps d’anesthésie est compris entre 2 et 3h. Pendant toute l’anesthésie les individus seront surveillés et monitorés et des mesures de réchauffement sont mises en place (matelas air chaud pulsé et couverture de survie). De retour à la station, les sujets sont réintroduits dans leur groupe social et surveillés quotidiennement. Les nouveaux-nés seront suivis avec une grille de scoring spécifique pendant 3 jours. Pour la partie portant sur l'imagerie optique, les animaux seront préalablement entraînés à des tâches manuelles et ne pourront commencer qu'une fois l'entraînement terminé et répétable. Des séances de désensibilisation sans anesthésie (approche, renforcement à se laisser toucher la tête) sont mises en place en amont afin de diminuer le stress. Le dispositif sera placé sous anesthésie. Les premières sessions seront consacrées à la phase d'habituation du dispositif (de 1 à 3 sessions par sujet) et se feront donc avec un dispositif factice jusqu’au succès du processus d’habituation avant de réaliser les sessions expérimentales (3 sessions répétées) avec l'appareil d'imagerie. Les sessions seront limitées à 60 minutes (30 minutes d’anesthésie et 10-30 minutes de tâches). Les individus sont hébergés pendant toute la durée du projet en groupes sociaux. Ils seront seulement séparés de leurs groupes au moment des IRM (48h) ou pour les sessions d'imagerie optique (moins de 24h).
Choix des espèces
Dans une problématique qui porte sur les origines, au regard de la proximité phylogénétique des primates humains et non humains, seule l'étude du modèle primate non-humain comme le babouin peut nous aider à détecter les précurseurs éventuels de certaines propriétés du langage et de leurs bases cérébrales chez notre ancêtre commun. Le babouin est un modèle incontournable pour étudier l’ontogénèse de la communication et de la spécialisation hémisphérique cérébrale du langage, au regard de leur taille de cerveau (deux fois plus gros que celui du macaque par exemple), leur latéralité manuelle et gestuelle déjà documentée et associée à des latéralisations cérébrales équivalentes à celles décrites dans l’espèce humaine, et un repertoire de signaux gestuels intentionnelles uniques parmi les singes de l’ancien monde. C’est la seule espèce chez qui nous pouvons poursuivre nos recherches longitudinales initiées au cours d’un précédent projet à partir d’une cohorte de bébés en développement. Pour 38 individus, notre échantillonnage inclut 6 stades de développement de la naissance jusqu’à l’âge adulte, en passant par le stade de fin de myélinisation et de sevrage maternel : - T0 : de 6 à 15 jours : le plus tôt possible après la naissance - T1 : de 8 à 10 mois : sevrage naturel de la mère - T2 : 24 mois : stade juvénile avec une vie sociale intégrée au groupe. - T3 : de 48 à 60 mois : maturité sexuelle - T4 : à 7 ans : Adulte (plafond volume cérébrale) - T5 : à 9-10 ans : Adulte avancé Les 8 mères des nouveaux nés seront utilisées à l’âge adulte. Enfin, 30 congénères adultes (âgés entre 7 et 25 ans) seront également scannés à l’IRM. Les 8 femelles impliquées dans le projet d'imagerie optique seront d’un âge supérieur à T1 (i.e., après le sevrage) et font partie du lot du suivi longitudinal.
Etude de la dégénérescence des cellules oligodendrocytaires et étude des effets de la stimulation magnétique répétitive transpinale dans le développement de la SLA chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
360 souris vont être utilisées, toutes tuées au plus tard à 110 jours pour prélever la moelle épinière, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Toutes subissent une biopsie de la queue vers six jours, et 260 d'entre elles portent une mutation qui provoque une paralysie progressive, avec des tests moteurs hebdomadaires que le porteur n'énumère pas. Quatre-vingts souris reçoivent en plus une stimulation magnétique de la moelle sous anesthésie générale pendant quatorze jours. Le porteur fixe le point limite à une paralysie modérée qu'il décrit comme ayant "peu d'impact sur la vie de l'animal", et prévoit croquettes mouillées et biberons à longue tétine pour que les souris n'aient pas à se redresser.
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique est une maladie neurodégénérative touchant les neurones moteurs (appelés aussi motoneurones). Elle se déclare à l’âge adulte, il n’existe à ce jour aucun traitement curatif et l'issue de la maladie est fatale. De plus, les mécanismes conduisant à la dégénérescence des motoneurones restent mal connus à ce jour. En outre, une dégénérescence des précurseurs d'oligodendrocytes et des oligodendrocytes matures a été observée, cette dégénérescence étant considérée comme une conséquence de celle des motoneurones. Cependant, des études récentes suggèrent que la dégénérescence des précurseurs d'oligodendrocytes et des oligodendrocytes matures pourrait précéder, voire contribuer, à celle des neurones moteurs. Le premier objectif de ce projet sera donc d'étudier la dégénérescence des précurseurs d'oligodendrocytes et des oligodendrocytes matures au cours de l'évolution de la maladie chez des souris transgéniques qui reproduisent la sclérose latérale amyotrophique. Le second objectif sera d’étudier l’efficacité thérapeutique d’un traitement non-invasif dans le développement de la maladie. En effet, il a été démontré que la stimulation magnétique répétitive permet d'augmenter la survie des neurones et de réduire la démyélinisation après une lésion traumatique de la moelle épinière. Par conséquent, nous étudierons les effets de la stimulation magnétique répétitive sur la dégénérescence des précurseurs d'oligodendrocytes et des oligodendrocytes matures. Pour cela, afin de pouvoir étudier spécifiquement les oligodendrocytes et les oligodendrocytes matures dans le cadre de la sclérose latérale amyotrophique, des souris permettant de suivre spécifiquement ces cellules seront croisées avec des souris développant la sclérose latérale amyotrophique au cours du temps ; ces deux lignées de souris étant présentes au sein de notre animalerie.
Bénéfices attendus
Ce projet s’intéresse aux mécanismes qui concourent à la dégénérescence des motoneurones et donc au développement de la sclérose latérale amyotrophique dans un modèle de souris qui reproduit la maladie décrite chez l’Homme. Il permettra donc le cas écheant de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de cette maladie. Cette étude nous permettra également d’avoir une meilleure connaissance sur les bénéfices d’une méthode non invasive (stimulation magnétique répétitive) dans ce contexte pathologique. Cela permettrait, sur un plus long terme, d’envisager de proposer ce traitement dans le cadre de la prise en charge des patients qui développent la sclérose latérale amyotrophique.
Procédures
L'ensemble des animaux, soit 360 souris, subiront une biopsie de queue vers 6 jours afin de réaliser le génotypage de ces animaux. Pour une première série d’expérimentations ; 100 souris controles (50 males et 50 femelles) seront utilisées afin de réaliser des expériences d’histologie. De la même facon, 100 souris exprimant les symptomes de la sclérose latérale amyotrophique (50 males et 50 femelles) seront utilisées afin de réaliser des expériences d’histologie. Pour une seconde série d’expérimentations 160 souris exprimant les symptomes de la sclérose latérale amyotrophique (80 males et 80 femelles) seront utilisées afin de réaliser des expériences de comportements et d’histologie. Les tests de comportements seront réalisés à partir de l’âge P50 et seront effectués toutes les semaines. La moitié de ces souris, soit 80 souris, bénéficiera d’un traiment par stimulation magnétique qui durera 14 jours. Ce traitement se fera sous anesthésie générale pendant 10 minutes (10hz pendant 10 secondes suivies de 20 secondes sans stimulation avec une intensité de 0.4T). Les animaux seront stimulés soit de J50 à J64 soit de J80 à J94. Enfin l’ensemble des animaux sera euthanasié, à un age de P110 au maximum afin de récupérer la moelle épinière.
Impact sur les animaux
Nous avons bien conscience que dans notre étude certains animaux mimant la maladie humaine vont développer certains signes de paralysie progressive et que l’aggravation de leur état conduira à un arrêt de toute procédure pour ces animaux. Ce projet impose également une douleur de courte durée à la suite du prélévement de queue (biopsie) afin de réaliser le génotypage
Devenir
L’ensemble des animaux (360 souris) sera euthanasié à l’issue des expérimentations (à P110 maximum) afin de procéder au prélévement de la moelle.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, la sclérose latérale amyotrophique résulte d'interactions pathogènes complexes entre les neurones moteurs et les autres constituants cellulaires de la moelle épinière, en particulier les cellules microgliales, les astrocytes et également les oligodendrocytes. L’étude de l’implication de ces différentes populations cellulaires dans le développpement de la maladie ne peut donc se faire que via l’utilisation d’animaux entiers vivants.
Réduction
Le nombre d’animaux a été évalué à partir d’études précédentes, à savoir que les expériences histologiques nécessitent un minimum de 6 à 10 animaux et les expériences fonctionnelles nécessitent un minimum de 10 animaux. Des tests statistiques seront utilisés afin de comparer les groupes d’animaux entre eux, nous savons que ces tests permettent de mettre en évidence une différence entre deux groupes d’étude avec une bonne sensibilité dès n=6 par groupe. L'utilisation de 10 animaux pour certaines expériences se justifie par la variation pouvant être observée notamment lors des tests fonctionnels.
Raffinement
Les expériences sont concues pour apporter le moins d’inconfort possible aux animaux. Les animaux seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification). Nous avons défini un point limite ; score de 2 sur une échelle de 4 où la paralysie est modérée et a peu d'impact sur la vie de l'animal. Toutefois, par souci de précaution, afin de leur permettre aisèment d’avoir accès à la nourriture et à l’eau de boisson ; des croquettes mouillées seront mises dans la cage. De plus, des biberons avec une tétine longue seront utilisés de manière à ce que les souris n’aient pas à se redresser. Enfin, l'eau et la nourriture seront mises à disposition ad libitum.
Choix des espèces
La découverte d’un lien génétique chez certains patients a permis de développer des modèles murins de la sclérose latérale amyotrphique ou SLA. Nous utiliserons ici l'un de ces modèles de souris qui mime la maladie. Ces souris présentent une mort progressive des neurones permettant le controle moteur, reproduisant ainsi les caractéristiques de cette maladie. Cette souris est donc un modèle de choix pour étudier les mécanismes physiopathologiques de la SLA et l'effet de thérapies potentielles. Afin d’étudier la dégénérescence des cellules qui produisent la myéline, ces souris seront croisées avec un second modèle de souris de manière à pouvoir suivre ces cellules spécifiquement durant le développement de la maladie. Les animaux utilisés seront agées entre 15 et 110 jours. En effet, nous voulons étudier la dégénérescence des cellules myélinisantes et des neurones au cours du développement de la SLA chez la souris. Les premiers temps expérimentaux correspondent aux stade pécoces pré-symptomatiques (P15 et P30) de la maladie, puis à P50, P80 et P110 ; périodes qui correspondent respectivement à l’apparition des premiers signes notamment des symptomes locomoteurs et à l’apparition de la paralysie.
Modèle murin de maltraitance physique infantile : syndrome du bébé secoué
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Secoués sous anesthésie générale à l'âge de sept jours pour reproduire le syndrome du bébé secoué, 909 souriceaux sont tous tués aux stades étudiés pour prélever leur cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Le porteur liste les atteintes attendues : douleurs cérébrales liées aux lésions, difficulté à s'alimenter, retard du développement psychomoteur, rigidité corporelle, mouvements de convulsion, respiration anormale et anomalies du comportement. Une partie des souriceaux subit en plus une craniotomie d'une heure sous anesthésie, sans réveil. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative parfaite" à un organisme vivant pour étudier les conséquences du secouement, et présente ce modèle comme une préparation d'interventions de prévention chez les enfants.
Objectifs
Les violences faites aux enfants et adolescents sont un fléau sanitaire et sociétal mondial. Un quart des adultes déclarent en avoir été victime mais une minorité d’entre eux est repérée suffisamment précocement pour éviter les conséquences « vie entière » somatiques et neuropsychiatrique de ces violences et leur impact socio-économique majeur. Les violences faites aux enfants et adolescents sont définies par l’OMS comme toutes les formes de mauvais traitements physique et/ou affectifs, de sévices sexuels, de négligences ou d’exploitation, entraînant un préjudice réel ou potentiel pour la santé de l’enfant, sa survie, son développement ou sa dignité, dans le contexte d’une relation de responsabilité, de confiance ou de pouvoir. Dans les pays à économie développée, les estimations de fréquence usuellement acceptées indiquent que 4 à 16% des mineurs seraient victimes de maltraitance physique. Pour les enfants survivants aux violences physiques du syndrome du bébé secoué, les conséquences à long terme sont majeurs sur le plan neurologique et développemental (périmètre crânien diminué, épilepsie, déficiences motrices visuelles intellectuelles, trouble du langages, et anomalies comportementales). Enfin, la pandémie de COVID-19 a augmenté la fréquence et la gravité des violences. Le syndrome du bébé secoué a vu son incidence doubler en 2021 et la mortalité décupler par rapport à la période de prépandémie. Dans ce projet, nous modéliserons chez le souriceau le syndrome du bébé secoué (traumatisme crânien). Plusieurs analyses seront réalisées à des temps spécifiques de la maturation du cerveau : enfance, adolescence et adultes. Nous établirons un profil comportemental individuel sur plusieurs composantes (motrice, sociale, cognitive). Les effets au niveau moléculaires de ces maltraitances seront également étudiés afin de permettre un futur transfert vers la clinique chez l’humain. Les analyses seront ciblées sur les marqueurs moléculaires de deux axes identifiés chez l’humain comme étant tout particulièrement perturbés après exposition à des maltraitance dans l’enfance : la neuroinflammation et la production d’hormones. Les études de la génétique et des protéines sont réalisés sur le sang et le cerveau des animaux juvéniles, adolescents et adultes. Enfin des approches thérapeutiques telles que la thérapie comportementale et des tests de médicaments ciblant les régulateurs clés seront entreprises.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier les mécanismes et l'évolution du traumatisme crânien du syndrome du bébé secoué à l’échelle cellulaire comme comportementale pour mieux définir la période la plus propice pour les futures études thérapeutiques chez les enfants et adolescents. Il permettra de préparer des interventions de prévention secondaires adaptées et correctrices.
Procédures
Les souriceaux subiront un traumatisme crânien par secouement sous anesthésie générale. Après le traumatisme, des groupes d’animaux de différents âges seront anesthésiés, et une perfusion intra-cardiaque sera réalisée post- mortem pour éliminer le sang des vaisseaux du cerveau qui sera étudié. La perfusion est réalisée sous anesthésie générale et avec analgésie. Certains animaux subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale pour réaliser des mesures d’imagerie du cerveau (durée 1 heure). Cette chirurgie consiste en une craniotomie afin de permettre le passage du signal. Cette procédure est sans réveil, les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérimentation. Cette procédure sera réalisée exclusivement par des expérimentateurs aguerris, maîtrisant parfaitement toutes les techniques requises.
Impact sur les animaux
Tout d'abord le jour du traumatisme crânien par secouement : - Séparation d’avec la mère lors de l’anesthésie par inhalation - Une hypothermie causée par l’isolement d’avec la mère - Le secouement horizontale. Ensuite, suite au traumatisme du secouement : - Douleurs cérébrales suite aux lésions occasionnées par le secouement - Difficulté à s’alimenter engendrant un petit poids - Retard dans le développement psychomoteur - Hypertonique, ou rigidité corporel, mouvements anormaux de convulsions, - Respiration anormale - Anomalie du comportement
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés aux stades d’intérêt. Les cerveaux seront prélevés post-mortem pour les différentes analyses qui permettront d’étudier de manière approfondie le tissus cérébral après le traumatisme, ainsi que l’inflammation cérébrale.
Remplacement
Il n’y a pas d’alternative parfaite à un modèle sur un organisme vivant pour étudier les conséquences du secouement sur le cerveau et les anomalies du développement qui en découle. Plusieurs analyses de notre projet ne peuvent être modélisée hors de l’organisme vivant, ni par des méthodes utilisant des modèles informatiques de théories de toxicité. Ce modèle, de bébé secoué, réalisé sur organisme vivant nous permet de s’intéresser à des caractéristiques du cerveau en activité, entier et fonctionnel.
Réduction
Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d’animaux utilisés. Nos analyses sont réalisées régulièrement dans notre laboratoire, ainsi nous savons combien d’animaux sont nécessaires afin d’obtenir un résultat. En conséquence, le nombre d’animaux pour ce projet sera au maximum de 909 animaux afin d’obtenir des résultats analysables par les tests statistiques. Le cerveau des animaux issus de l’analyse de la connectivité neuronale et ceux issus des analyses du comportement seront prélevés pour les analyses du tissus cérébral ce qui a réduit le nombre d’animaux dans notre projet. Il est prévu de mettre en place le modèle avec 48 animaux, mais si la fréquence d’agitation est déterminée sur moins d’animaux nous en utiliserons moins ce qui réduira le nombre total d’animaux.
Raffinement
Nous procéderons à l’enrichissement de l’hébergement avec du papier doux absorbant pour la fabrication du nid comme cela est fait dans leur milieu naturel. Les animaux seront réchauffés à l’aide d’une lampe au moment de la procédure du secouement. On surveillera l’état général des animaux dans le nid à l’aide d’un document appelé « arbre décisionnel ». Il permet d’observer les souriceaux dans la portée sans les déranger à nouveau car les soins apportés par la mère sont importants. Dès qu’un animal ne va pas bien il est vite repéré car il est blanchâtre et/ou immobile, donc il attire l’œil. Pendant les protocoles nécessaires pour la mise en place des appareils d'imagerie, les animaux seront anesthésiés et surveillés : si l'animal présente une difficulté respiratoire, une variation importante de sa fréquence cardiaque ou une hypothermie importante, la procédure sera interrompue et l'animal euthanasié. Les animaux seront euthanasiés après administration d’un analgésique et d’un anesthésique. C’est quand la mort sera vérifiée (plus de réflexes) que nous procéderons alors aux prélèvements post-mortem.
Choix des espèces
Le choix de la souris est pertinent d’un point de vue scientifique en termes de reproductibilité, des connaissances biologiques de l’espèce et du temps de reproduction. Le modèle de secouement sera fait à 7 jours de vie, ceci correspond à la petite enfance chez l’humain. Nous étudierons les interactions entre les cellules du cerveau en développement sur un modèle de bébé secoué, pour cela il est nécessaire d’utiliser une espèce animale qui présente un système nerveux central proche de celui de l’homme. La souris remplit très bien cette condition. Notre objectif étant d’étudier l’effet du secouement sur le cerveau en développement, nous nous intéresserons à 3 temps de vie : 8 à 21 jours (petite et moyenne enfance), 45 jours (adolescence), et 6 mois de vie (adulte), afin d’étudier l‘évolution du traumatisme cérébrale et les effets à long terme.
Identification du rôle de l’additif alimentaire nanoparticulaire phosphate tricalcique dans la survenue de l’allergie à l’œuf chez un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour savoir si un additif alimentaire nanoparticulaire déclenche l'allergie à l'œuf, 360 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever les tissus. Chacune subit quatre prises de sang et quatre prélèvements de selles, et 240 d'entre elles reçoivent trois injections intrapéritonéales de sensibilisation avant un gavage destiné à déclencher la réaction allergique. Le porteur indique que des symptômes d'anaphylaxie peuvent apparaître dans la demi-heure suivant le gavage et persister une trentaine de minutes, avec chute de la température corporelle mesurée par voie rectale. Il compare la forme en aiguilles des particules de phosphate tricalcique aux fibres d'amiante dans les poumons, tout en rappelant que cet additif entre dans les préparations infantiles.
Objectifs
L’augmentation de la prévalence des allergies alimentaires observée depuis une vingtaine d’année coïncide avec l’augmentation de la consommation d’aliments ultra-transformés. Parmi les aliments ultra-transformés, on trouve ceux contenant des additifs alimentaires, dont le risque de déclencher des réactions allergiques commence à être évoqué pour ceux contenant des nanoparticules. L’un de ces additifs, le phosphate de calcium, contient 100% de nanoparticules et se présente sous la forme d’hydroxyapatite. Il a servi pendant plusieurs années de support à des vaccins comme adjuvant pour amplifier la réponse immune et est actuellement employé dans les préparations infantiles pour augmenter l’apport en calcium. Le projet vise à identifier comment cet additif alimentaire, reconnu comme un nanomatériau et incorporé dans les formulations alimentaires pour équilibrer l’apport en phosphate et calcium, peut conduire à des désordres immunitaires via sa capacité à stimuler le système immunitaire et/ou son affinité pour des protéines identifiées comme allergène (ici le lysozyme).
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif d’apporter des connaissances sur le mécanisme d’action d’un additif alimentaire, le phosphate tricalcique dans l’allergie à l’œuf (via le lysozyme). Par la comparaison des différents paramètres mesurés, le protocole répondra aux hypothèses mécanistiques formulées suivant la bibliographie, à savoir : 1) Le phosphate tricalcique (E341) participe à la sensibilisation et au déclenchement de l’allergie alimentaire en favorisant l’exposition des épitopes et/ou limitant la dégradabilité des protéines dans le tractus gastro-intestinal. Ce mécanisme est basé sur les grandes capacités d’adsorption du phosphate tricalcique pour les protéines dont les allergènes. 2) Les particules de phosphate tricalcique (E341), de par leur forme en aiguilles pointues, irritent mécaniquement la barrière intestinale (à la manière des fibres d’amiante dans les poumons), la rendant perméable et facilitant le passage d’allergènes dans l’organisme, auquel le système immunitaire réagit en produisant des anticorps.
Procédures
Lors de ce protocole, toutes les souris subiront 4 prélèvements de selles et 4 prises de sang espacées d’une semaine au minimum, une juste après l’acclimatation, une avant la sensibilisation 1 = S1, une avant la sensibilisation 2 =S2 et une avant la sensibilisation 3 =S3. Les groupes sensibilisés soit 120 souris par sexe subiront 3 Injections intrapéritonéales à 1 semaine d’intervalle (S1, S2, S3), puis toutes les souris, soit 360, subiront 1 gavage oral.
Impact sur les animaux
La sensibilisation par voie intrapéritonéale et la phase de déclenchement de l’allergie alimentaire peuvent contribuer à des nuisances. Lors de l’injection intrapéritonéale une légère douleur passagère peut être ressentie au point d'injection. Une baisse de la température corporelle des animaux est également observée quand l’animal déclenche une réaction allergique. Les souris pourraient ressentir des douleurs stomacales liées à l’administration de l’allergène par gavage. La prise de température par voie rectale peut aussi entrainer un inconfort pour les souris. Aussi, des symptômes caractéristiques de l’anaphylaxie peuvent être observés. Généralement, les effets surviennent entre 0 et 30 minutes après le gavage pour déclencher la réaction allergique et peuvent persister pendant une trentaine de minutes. Lors de la prise de sang à la queue une irritation passagère à la queue peut être ressentie.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de récupérer les différents tissus nécessaires à l’étude immunologique et de la fonction gastro-intestinale.
Remplacement
Dans le cas de l’allergie alimentaire, les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire efficacement les phénomènes intervenant à la fois sur le système immunitaire et la physiologie. Pour étudier le mécanisme de la réponse allergique, le modèle in vivo est donc actuellement le seul adapté.
Réduction
Sur la base d’une étude menée récemment au laboratoire, le nombre minimum d’animaux pour obtenir des résultats statistiquement exploitables sur les immunoglobines IgG conduit à utiliser des groupes de 30 souris chacun.
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l’expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi des signes généraux et le suivi des points limites sont effectués au quotidien afin de minimiser l’inconfort et la douleur. L’eau et la nourriture seront mises à volonté dans les cages.
Choix des espèces
Au cours de cette étude seront utilisées des souris mâles et femelles. Le modèle murin est reconnu dans le cadre des études du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de cette espèce. De plus, nos modèles d’allergie ont été établis sur cette espèce. Des analyses phénotypiques des populations lymphocytaires seront réalisées. L’utilisation de ces souris nous donne accès à de nombreux outils immunologiques, notamment les anticorps nécessaires aux marquages. Les souris utilisées auront 3 semaines de vie à réception, 5 semaines de vie au début du protocole d’exposition, puis 7 semaines à la première sensibilisation, 10 semaines au moment du gavage oral et de la mise à mort.
Etude des approches d’inhibition de la GPVI plaquettaire dans un modèle murin immunocompétent de greffe d’adénocarcinome canalaire pancréatique (ACCP)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Toutes tuées pour analyse histologique, 150 souris subissent une greffe de cellules tumorales dans le pancréas par chirurgie ou une injection intraveineuse de ces cellules, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Le porteur indique que les tumeurs pancréatiques entraînent une perte de poids et que des métastases apparaissent rapidement dans les poumons, avec des difficultés respiratoires, ainsi que dans le foie, la rate et les ganglions. Le projet teste l'effet de médicaments inhibant une protéine plaquettaire, seuls ou combinés à la chimiothérapie standard. Le porteur décrit ses propres modèles cellulaires en trois dimensions comme capables de remplacer "une partie" des études sur souris, et retient le recours aux animaux non-humains pour les échanges cellulaires que ces modèles ne reproduisent pas.
Objectifs
Les carcinomes canalaires pancréatiques sont classés comme des tumeurs très agressives par l'Organisation mondiale de la santé. Ils se caractérisent par une invasion étendue du pancréas et des organes distants, principalement en raison de mécanismes de résistance aux traitements anticancéreux. La prise en charge thérapeutique de ces tumeurs repose généralement sur une chimiothérapie et/ou radiothérapie. Lorsque cela est possible, l'ablation partielle ou totale de la tumeur améliore la survie des patients. Cependant, malgré ces traitements lourds, la survie des patients est actuellement estimée à environ 6 à 12 mois. L'objectif de ce projet est d'étudier, dans un premier temps, l'effet de médicaments sur le développement de ces tumeurs en combinaison ou pas avec la chimiothérapie standard. Dans un deuxième temps, nous étudierons l'effet de ces inhibiteurs sur la dissémination métastatique des tumeurs.
Bénéfices attendus
A ce jour, les cancers du pancréas représentent des cancers très agressifs et réfractaires à tous types de traitement. Ainsi, la mise en évidence de nouveaux traitements ou de nouvelles combinaisons de traitements représenterait une avancée majeure dans la prise en charge thérapeutique de ces patients et un espoir thérapeutique fort pour d’autres types de tumeurs agressives et réfractaires. Notre étude s’attache à mieux comprendre, modéliser, et cibler la croissance tumorale et la dissémination métastatique afin de contrecarrer la résistance aux traitements et les mécanismes d’échappement.
Procédures
Des souris subiront une chirurgie lors de la greffe intra-pancréatique des cellules tumorales. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie adaptée et analgésie (1 fois, durée : 10min). D'autres souris auront une greffe cellulaires en intraveineux sous anesthésie (1 fois, durée 1min). Des animaux subiront des traitements par injections intraveineuses (durée : 1min) (nombre : 3 fois, espacés de 3 jours ou 5 jours).
Impact sur les animaux
La chirurgie pourrait entrainer une hémorragie chirurgicale ou une infection générale sont des complications exceptionnelles de la procédure (jamais rencontrées). Ces animaux développeront des tumeurs pancréatiques, qui peuvent entrainer la perte de poids. L'injection intraveineuse de cellules pourrait entrainer une irritation. Ce projet est bien caractérisé et des tumeurs métastatiques apparaissent rapidement dans les poumons (principalement), ceci pourrait entrainer des difficultés respiratoires. Des tumeurs métastatiques peuvent aussi être retrouvées dans d’autres organes tels que le foie, la rate et les ganglions. Lors des traitements : un stress peut être engendré par des contentions multiples, une irritation au point d'injection pourrait apparaitre.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyses histologiques détaillant des effets thérapeutiques observés.
Remplacement
Notre laboratoire développe des modèles cellulaires en 3 dimensions permettant de remplacer une partie des études précliniques chez la souris en testant sur des cellules l’efficacité des drogues. Seules les drogues ayant montré un effet significatif sur l’inhibition de l’agressivité des cellules tumorales seront testées chez la souris. Ces systèmes cellulaires comportent des limites et ne récapitulent pas toute la complexité de l’organe ce qui explique le recours à des animaux pour étudier les échanges cellulaires et moléculaires qui prennent place dans la progression tumorale et la dissémination métastatique.
Réduction
Nous allons diviser les études en deux groupes : une étude de la progression de la tumeur qui durera 30 jours et une étude de la dissémination métastatique des cellules cancéreuses qui durera 15 jours. Un nombre croissant d’études révèlent la présence d’un dimorphisme sexuel pouvant conduire à une mauvaise interprétation des résultats. Des tests statistiques ont été utilisés afin de déterminer le nombre d’animaux nécessaires par groupe qui permettent à la fois de réduire le nombre total d’animaux nécessaires tout en préservant la significativité des résultats et leur robustesse. Cela nous permettra d’obtenir des conclusions pertinentes et d’éviter toutes répétitions expérimentales.
Raffinement
Les animaux seront hébergés ensemble dans un environnement confortable pour éviter qu'ils ne soient stressés. Les personnes en charge des animaux et de l'expérience surveilleront leur comportement tous les jours pour détecter toute douleur ou souffrance. Les expériences et les procédures seront effectuées de manière à minimiser le stress et à garantir le bien-être animal. Les souris seront suivies régulièrement pour détecter tout signe de souffrance, et si nécessaire, elles seront euthanasiées. Avant toute intervention chirurgicale, les souris recevront des anti-douleurs et seront surveillées de près pendant 48 heures après l'opération. Pendant l'anesthésie, les yeux des souris seront protégés pour éviter qu'ils ne se dessèchent, et les souris seront maintenues au chaud sur un tapis chauffant pour les garder à une température corporelle confortable.
Choix des espèces
Nous avons choisi d'utiliser des souris car la souris est génétiquement très proche de l'Homme. Les expériences sur les souris permettent d'avoir des analyses statistiques plus étendues comparées à des animaux de plus grande taille. Le modèle permettra de bien comprendre les mécanismes immunologiques émis par le microenvironnement tumoral pendant la progression tumorale et la dissémination métastatique et lors des réponses aux traitements. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines pour toutes les études. A ces âges, les animaux présentent des caractéristiques adultes et sont réceptifs à la prise des greffes.
Compréhension des mécanismes de l’oncogenèse mammaire grâce à des études orthotopiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 860 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses mammaires, des traitements répétés jusqu'à une fois par jour pendant deux à quatre semaines, et jusqu'à deux ponctions de sang par semaine dans la veine mandibulaire. Le porteur affirme que des expériences antérieures n'ont montré "aucune souffrance" liée aux tumeurs parce qu'elles sont sous-cutanées, une affirmation difficile à concilier avec la gravité sévère déclarée pour l'ensemble des 1 860 souris. Une partie de ces souris est utilisée pour constituer une biobanque de tumeurs destinée à son laboratoire et à des équipes partenaires.
Objectifs
Le cancer du sein dit triple-négatif (aussi appelé TNBC, pour "Triple-Negative Breast Cancer" en anglais), est un sous-type très agressif de cancer du sein pour lequel très peu de stratégies thérapeutiques sont envisageables à l'heure actuelle par manque de compréhension de cette maladie complexe. Nous pensons que des traitements combinatoires ciblant les cellules cancéreuses et les cellules immunitaires seront efficaces, contrairement aux traitements individuels qui n'ont que des effets limités. Mais l’évaluation de l'efficacité de ces traitements dans les études précliniques est assez limitée en raison du manque de modèles d'étude appropriés. Nous travaillons avec des souris qui développent des tumeurs dans la glande mammaire et qui modélisent fidèlement les caractéristiques des tumeurs retrouvées chez les patientes atteintes de TNBC. Ce projet de recherche a pour objectif de comprendre comment les cellules cancéreuses et les cellules immunitaires "dialoguent" entre elles au début de la formation des tumeurs mais aussi lorsque la tumeur régresse suite à un traitement anticancéreux. Nous souhaitons aussi évaluer l'efficacité de traitements combinant des candidats-médicaments ciblant les cellules cancéreuses et les cellules immunitaires (immunothérapie). Pour cela, nous envisageons de greffer des cellules cancéreuses (provenant du modèle souris TNBC) dans des souris dites receveuses, qui elles-mêmes développeront des tumeurs mammaires; ceci afin d'obtenir suffisamment d'échantillons biologiques permettant de nombreuses analyses (création d'une biobanque). Ces greffes de cellules cancéreuses serviront également à évaluer l'efficacité d'agents anti-cancéreux (candidats-médicaments) administrés seuls ou en combinaison avec de l'immunothérapie. Enfin, afin de se rapprocher de la clinique, la pertinence des traitements qui s'avèreront efficaces sur les cellules cancéreuses de souris seront ensuite testées sur des cellules humaines. Pour cela, des cellules cancéreuses humaines (cellules provenant de patientes atteintes de TNBC) seront greffées dans la glande mammaire de souris dont le système immunitaire est défaillant, permettant ainsi la prise de la greffe. Les tumeurs résultantes seront alors soumises aux traitements qui se seront avérés être efficaces sur les tumeurs d'origine souris.
Bénéfices attendus
1) Le modèle de souris qui sera utilisé est un modèle unique puisqu'il génère exclusivement des tumeurs mammaires de type TNBC. Ce modèle préclinique est par conséquent très précieux pour la communauté scientifique. La création d'une biobanque de tumeurs de souris de type TNBC est donc importante afin de générer suffisamment de matériel biologique pour des études réalisées soit dans notre laboratoire, soit en collaboration avec d'autres équipes. 2) L'évaluation préclinique de traitements combinatoires ciblant les cellules cancéreuses et/ou les cellules immunitaires est un prérequis pour des études cliniques. Ce projet nous permettra d'apporter des connaissances sur les signaux qui confèrent la sensibilité ou la résistance de certains sous-types de TNBC à des traitements spécifiques. A plus long terme, ces données pourront alors être traduites en clinique afin d'envisager une stratification des patients atteints de TNBC et ainsi prédire une réponse aux traitements.
Procédures
Les souris anesthésiées subiront 1 seule greffe de cellules. La durée de la greffe sera très courte (inférieure à 30 secondes). Certaines de ces souris seront traitées avec des candidats-médicaments anti-cancéreux et/ou de l'immunothérapie qui seront administrés selon les recommandations fournies pour chaque composé. La durée de l'administration sera très courte ((inférieure à 20 secondes). Après administration, les souris seront placées en observation dans une cage. La fréquence des injections dépendra du type de traitement (variant de 1/jour à 1/semaine, pour une durée variant de 2 à 4 semaines). Pour certaines cohortes de souris, l'évolution des tumeurs sera évaluée par mesure directe avec un pied à coulisse ou de manière indirecte, par imagerie non-invasive, réalisée 1x/15jours (5mn/séance). Les animaux seront examinés régulièrement de façon à détecter d'éventuels signes pouvant traduire un stress ou une souffrance. Un échantillon de sang sera également prélevé (2x/semaine, au maximum) par ponction dans la veine mandibulaire. Chaque prélèvement durera moins de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les nuisances / effets indésirables potentiels sont : 1) des insuffisances respiratoires ou cardiaques survenant au cours de l'anesthésie et 2) un réveil douloureux suite à l'anesthésie. Mais puisque nous réaliserons une anesthésie volatile, ce risque est minimisé. 3) Une douleur possible lors de l'administration des agents pharmacologiques qui seront administrés selon un mode opératoire, une fréquence et dose tolérés par les souris, sur la base d'études publiées. Les nuisances dues au mode d'administration ne seront que temporaires (au cours de l'administration). Aucun effet indésirable, dû à l'administration, n'est attendu chez les animaux. 4) Une douleur possible lors de l'injection de luciférine, composé nécessaire aux analyses par bioluminescence (imagerie non invasive). 5) Une souffrance éventuelle liée à la formation des tumeurs. Cependant, des expériences précédentes n'ont montré aucune soufrance chez les souris car il s'agit de tumeurs sous-cutanées. 6) Un stress généré par les manipulations fréquentes des animaux (pesées, mesure des tumeurs). Les souris seront régulièrement suivies par les expérimentateurs. Des paramètres définis permettront d'évaluer la souffrance des animaux. Des stratégies d’optimisation seront mises en place au cours du projet afin de réduire, voire de supprimer, la souffrance chez l’animal (enrichissement des cages, acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation).
Devenir
En fin d'expérimentation, toutes les souris seront euthanasiées. Les tumeurs seront prélevées pour réaliser les analyses nécessaires au projet. Toutefois, en cas de souffrance avérée (définie selon des critères bien établis) au cours de la procédure, les souris seront euthanasiées.
Remplacement
Nous avons établi des lignées de cellules TNBC (provenant des tumeurs mammaires du modèle de souris) et sommes actuellement en train de générer des cultures d'organoïdes (également dérivés des tumeurs mammaires). Bien que des études supplémentaires soient nécessaires, ces modèles in vitro nous ont déjà permis d'identifier des signaux vulnérables et de tester l'efficacité de certains agents anti-cancéreux. Ces résultats nous permettent de limiter les études in vivo, en se focalisant sur les agents/signaux les plus pertinents, afin d'établir leur pertinence dans un contexte physiologique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé par un test d'effectifs couramment utilisé en recherche. Cet outil nous permet d’estimer le nombre d’animaux nécessaires pour avoir une différence significative entre le groupe contrôle et le groupe d'animaux traités, en tenant compte de la variabilité des réponses. En outre, nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues sur chaque animal en réalisant des analyses biologiques, biochimiques et histologiques sur le même animal. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux et du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats obtenus et de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables.
Raffinement
L'état de santé des souris sera régulièrement surveillé en fonction de l'évolution des expériences, de la formation des tumeurs. L'évaluation sera réalisée en suivant différents critères : poids, apparence du pelage, comportement animal dans la cage qui traduirait une éventuelle souffrance ou angoisse. Des stratégies d’optimisation seront mises en place au cours du projet afin de réduire, voire de supprimer, la souffrance chez l’animal (ex : acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation). De plus, les cages seront enrichies avec des objets comme un dôme, un rouleau de carton, des petits rouleaux de papier ou de la paille que les souris désintègrent pour se constituer un nid. La formation et l'évolution des tumeurs sera suivie de manière longitudinale par mesure directe avec un pied à coulisse et/ou par imagerie non invasive (bioluminescence/fluorescence). Les anesthésies pratiquées seront des anesthésies gazeuses et seront effectuées par du personnel compétent et expérimenté.
Choix des espèces
Nos études nécessitent l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement puisque la thématique principale de notre laboratoire est de comprendre les mécanismes impliqués dans des étapes du développement du cancer. Les modèles animaux que nous utiliserons représentent des alternatives prometteuses pour obtenir des résultats plus pertinents en ce qui concerne la compréhension du cancer chez l'Homme. En particulier, les approches utilisées dans notre équipe, combinant des études in vitro avec des analyses in vivo réalisées chez la souris, permettent de mettre en évidence de nouveaux mécanismes de signalisation impliqués dans les cancers ainsi que de potentiel traitements, comme nous l'avons déjà démontré. Les modèles de greffes chez la souris utilisés dans ce projet, permettront de tester dans le cas du TNBC, pour lequel aucune thérapie n'est efficace à l'heure actuelle, de nouveaux candidats-médicaments et d'évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques combinants des agents qui visent les cellules cancéreuses et des immunothérapies (qui affectent les cellules immunitaires). Les souris seront utilisées au stade adulte (environ 2 mois). Cet âge permet de minimiser les variations intrinsèques liées au fait que les greffes seront réalisées dans des tissus d'individus jeunes, plus réceptifs, par rapport à des tissus âgés. De plus, l'âge prédéfini des souris immunocompéténtes permettra de minimiser les variations du système immunitaire suite aux greffes. L'ensemble de ces critères permet de minimiser les variations et donc de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour atteindre des résultats statistiquement significatifs (règle des 3R).
Activité des formes génétiques naturelles d’un facteur cancéreux dans la dissémination des tumeurs mammaires vers les sites osseux et pulmonaires, dans un modèle métastatique murin de cancer du sein.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Pour savoir si deux variantes génétiques d'un facteur cancéreux favorisent les métastases osseuses, 108 souris femelles sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère pour 48 d'entre elles et modéré pour 60, toutes tuées sous anesthésie pour prélever leurs tissus. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses humaines dans l'artère de la queue, puis un suivi par radiographie et bioluminescence sous anesthésie pendant 7 ou 28 jours. Le porteur reconnaît que ces tumeurs induisent chez l'humain de fortes douleurs et une gêne à la mobilité, et affirme qu'arrêter les expériences à 28 jours permettra d'obtenir les données "sans occasionner de complication ni de douleur", ce qui cadre mal avec la gravité sévère déclarée pour près de la moitié des souris. Il revendique des expériences "indispensables" parce qu'elles portent sur un "animal entier".
Objectifs
Le cancer du sein est une tumeur maligne qui peut se propager dans tout l'organisme : on dit alors que la tumeur a métastasé vers des sites secondaires. Les métastases localisées dans l’os sont les complications les plus fréquentes du cancer du sein, responsables d’une destruction massive de l’os. Les métastases osseuses génèrent chez les patientes de grandes douleurs, des fractures pathologiques et peuvent engager le pronostic vital. Il est donc urgent d’identifier les facteurs qui prédisposent et conduisent les cellules cancéreuses du sein à se disséminer dans l’organisme et à coloniser l’os. Nous cherchons à mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à la dissémination des cancers du sein à l’os, et ceci afin d’améliorer les thérapeutiques préexistantes et d’entrevoir de nouvelles thérapies ciblées. Nous avons identifié un facteur biologique cancéreux qui favorise le développement des métastases osseuses dans le cancer du sein. Notre projet vise à comprendre si certaines formes génétiques naturelles de ce facteur peuvent également contribuer à la formation des métastases osseuses dans le cancer du sein. Les deux formes génétiques que nous étudions sont les seules connues à ce jour comme ayant un impact sur la séquence de la protéine du facteur cancéreux étudié, c’est-à-dire que ces deux formes génétques peuvent affecter la fonction biologique du facteur cancéreux étudié. Les résultats attendus permettront de savoir si le facteur biologique cancéreux étudié ou si également les formes génétiques naturelles de ce facteur représentent des cibles thérapeutiques potentielles dans le traitement des rechutes métastatiques et en particulier des métastases osseuses dans le cancer du sein.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des informations indispensables pour limiter la rechute métastatique à l’os des cancers du sein et améliorer la survie des patients. A court terme, ce projet permettra l’apport de nouvelles connaissances afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à la dissémination des cancers du sein à l’os. Ainsi, le projet permettra de comprendre le rôle des formes génétiques naturelles du facteur biologique cancéreux étudié dans la dissémination des cellules de cancer du sein vers la moelle osseuse et dans le développement des métastases dégradant l’os. Trouver une solution thérapeutique afin de prévenir le développement de métastases osseuses dans le cancer du sein est un problème majeur de santé publique. A terme, ce projet permettra également d’envisager des solutions thérapeutiques candidates, car il indiquera s’il est pertinent de cibler uniquement le facteur biologique cancéreux étudié ou si les formes génétiques naturelles de ce facteur représentent également une cible thérapeutique potentielle. A l’avenir, le projet bénéficiera à d’autres cancers propices à développer des métastases osseuses (cancer du poumon et cancer de la prostate), et dans lesquels le facteur biologique cancéreux étudié joue également un rôle.
Procédures
Les souris recevront une injection de cellules cancéreuses dans l’artère de la queue (moins d’une minute) et un suivi quotidien d’observation des animaux sera mis en place pendant 7 jours ou 28 jours. Les animaux suivis jusqu'à 28 jours seront anesthésiés une fois par semaine pour une imagerie non invasive en radiographie (1 minute) et en bioluminescence (5 minutes). En fin d'expérience, toutes les souris sont mises à mort sous anesthésie générale afin de réaliser des prélèvements de tissus pour analyse.
Impact sur les animaux
Le développement des tumeurs a pour caractéristique chez l’homme d’induire de fortes douleurs et une gêne à la mobilité. Dans le but de réduire la douleur et la gêne à la mobilité des animaux, la procédure sera limitée dans le temps et la quantification de la dégradation osseuses et de la croissance tumorale sera suivie de facon hebdomadaire par radiographie et bioluminescence afin d’anticiper le moment d’apparition d’un des points limites.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort sous anesthésie générale. Les analyses seront réalisées post-mortem.
Remplacement
Nos expériences chez l’animal sont indispensables pour répondre à nos deux questions scientifiques. En effet, elles miment un contexte se rapprochant le plus possible de la situation clinique du cancer du sein métastatique chez la patiente, car utilisant un animal entier. Notre équipe dispose déjà de résultats expérimentaux in vitro justifiant de passer dans le modèle in vivo. En effet, nous avons montré que les formes génétiques naturelles du facteur cancéreux étudié confèrent in vitro un phénotype agressif qui apparait supérieur à celui de la forme sauvage du facteur cancéreux étudié. Toutefois, l’activité biologique et l’influence que peuvent présenter les formes génétiques naturelles étudiées sur des phénomènes tumoraux (tels que la migration in vivo, la colonisation et l’ancrage osseux lors de la formation des métastases osseuses) ne peuvent pas être appréciées par des tests in vitro, et nécessitent exclusivement une approche sur animal entier. L’approche in vivo est donc entièrement justifiée et sera complémentaire des résultats in vitro déjà obtenus. L’utilisation des lignées cellulaires d’origine humaine que nous avons préalablement testées in vitro pour leur capacité à être invasives nous permettra de reproduire chez la souris le plus fidèlement possible la situation pathologique du cancer du sein chez la femme.
Réduction
La taille des groupes a été déterminée à l’aide d’une analyse de puissance réalisée avec le logiciel BiostaTGV. La taille des groupes correpond au nombre minimal de souris permettant de mettre en évidence une différence statistiquement significative pour l’effet observé. La réduction des effectifs à 12 souris par groupe permet une réduction au nombre de souris strictement nécéssaire pour obtenir la robustesse statistique nécessaire, tout en ayant pris en compte les éventuelles pertes d’animaux, par exemple si retirés de l’étude.
Raffinement
Les souris seront réceptionnées dans un environnement permettant leur acclimatation et cohabiteront dans des conditions d’hébergement adaptées pour garantir leur bien-être. Les animaux seront également sous surveillance journalière et manipulés systématiquement dans des conditions limitant leur stress. La douleur des animaux sera prise en compte et réduite en réalisant les injections des cellules humaines dans des souris sous anesthésie générale, et ce afin d’améliorer le confort de l’animal. L’état de bien être des souris sera évalué quotidiennement par l’observation des principaux signes physiologiques, comportementaux et de l’apparence de l’animal. Les animaux seront pris en charge au premier signe d’inconfort, et retirés de l’ étude si nécessaire. Les expériences seront arrêtées au plus tard 28 jours après l'injection de cellules cancéreuses ce qui permettra d'obtenir les données escomptées sans occasionner de complication ni de douleur ou incidence sur la qualité de vie des animaux.
Choix des espèces
Les souris prévues pour nos expériences sont couramment utilisées en oncologie. Ces souris présentant une déficience de leur système immunitaire et peuvent donc recevoir des cellules tumorales humaines sans rejet. Nous utiliserons des souris femelles car nous travaillons sur le cancer du sein, principalement diagnostiqué chez la femme. Le cancer du sein chez l’homme est très rare et représente moins de 1% des cancers du sein diagnostiqués. Les expériences seront réalisées avec des souris âgées de 6 semaines (à cet âge, l’ensemble des fonctions sont matures). Pour les injections intra-artérielles de cellules du cancer du sein, les souris doivent en effet être agées entre 4 et 6 semaines, car la prise métastatique est fortement réduite avec des souris plus agées.