Recherche fondamentale

Toutes tuées à l'issue des procédures pour analyser l'effet des molécules testées, 551 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris, qui ont reçu des cellules immunitaires humaines, subissent une injection intraveineuse puis des injections intrapéritonéales tous les trois à quatre jours pendant trois semaines, et une partie d'entre elles une prise de sang hebdomadaire sous anesthésie pendant quatre semaines. Les molécules testées sont censées détruire les seuls lymphocytes B producteurs d'auto-anticorps de la polyarthrite rhumatoïde. Le porteur qualifie ces souris d'"indispensables" et de "modèles les plus pertinents", tout en écrivant qu'une douleur "modérée à sévère" peut être attendue lors de la réaction du greffon contre l'hôte.

Objectifs

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie autoimmune caractérisée par une inflammation des articulations qui évolue par poussées, espacées par des périodes de rémission, aboutissant en quelques années à une invalidité aux conséquences socio-économiques lourdes. Notre équipe de recherche développe depuis plus de 20 ans des nouvelles approches d’immunothérapie dans la PR pour cibler les cellules pathogènes et particulièrement les lymphocytes B qui sécrètent les auto-anticorps. Le diagnostic de la PR repose sur la présence de ces auto-anticorps dont les cibles de ces auto-anticorps ont été parfaitement identifiées et plus particulièrement certains peptides citrulliné. Nous allons tester de nouvelles molécules thérapeutiques ciblant les cellules exprimant les auto-anticorps. De précédentes études nous ont déjà permis d’évaluer les propriétés de ces nouvelles molécules thérapeutiques. Les résultats obtenus étant très encourageants, nous souhaitons poursuivre le développement de l’utilisation de ces molécules. Ce projet nous permettra de valider le potentiel de ces molécules pour cibler les cellules sécrétant les auto-anticorps dans des modèles expérimentaux plus pertinents et plus proches de la situation en clinique, pour envisager de nouvelles approches thérapeutiques dans la PR.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra d’évaluer l’efficacité thérapeutique d’une biothérapie innovante basée sur des molécules permettant de détruire les cellules exprimant/sécrétant les autoanticorps. Le bénéfice de notre nouvelle approche thérapeutique est la destruction spécifique des cellules B pathogènes sans détruire les cellules B non pathogènes. Les traitements actuels ciblant toutes les cellules B entrainent une immunosuppréssion globale qui peut entrainer des effets secondaires graves tels que le développement de cancer ou le défaut de réponse immunitaire des patients à des agents pathogènes. En ciblant spécifiquement les lymphocytes B pathogènes, notre stratégie permettra de proposer de nouveaux traitements pour la PR et pourrait être étendue à d’autres maladies auto-immunes dans lesquelles il y a également une production d’auto-anticorps pathogènes.

Procédures

Les animaux seront soumis à 1 injection intra-veineuse (30 secondes) et plusieurs injections intra-péritonéales (

Impact sur les animaux

Douleur légère dûe aux injections intrapéritonéales ou intraveineuses. Une douleur modérée peut être attendue lors de la croissance des cellules cibles exprimant/sécrétant les auto-anticorps. Une douleur modérée à sévère peut être également attendue lors de la réaction du greffon contre l’hôte.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures pour analyser l’impact des molécules testées sur les cellules exprimant/sécrétant les auto-anticorps.

Remplacement

Les molécules utilisées dans ce projet ont toutes été validées in vitro dans un premier temps afin d’optimiser chacun des paramètres et seules les molécules efficaces in vitro seront évaluées in vivo chez des souris immunodéficientes. Les souris immunodéficientes, injectées avec des cellules immunitaires humaines, permettent d’évaluer l’impact de la molécule à tester sur la réponse immunitaire humaine et vice-versa l’impact de la réponse immunitaire sur la molécule à tester. L’utilisation de souris immunodéficientes est donc indispensable pour évaluer les propriétés des molécules thérapeutiques dans les conditions qui seront utilisées en clinique. Elles constituent aujourd’hui les modèles les plus pertinents pour décrypter les effets des molécules et sont aujourd’hui bien plus adaptées que les souris immunocompétentes ou les modèles expérimentaux ex-vivo. Elles sont indispensables pour définir les propriétés des nouvelles molécules thérapeutiques avant application chez l’Homme.

Réduction

Le suivi longitudinal que nous avons choisi pour ce projet permet d’utiliser les mêmes souris sans avoir à les euthanasier à différents temps pour évaluer l’efficacité des molécules à tester. Pour estimer le nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment dans des publications utilisant des modèles expérimentaux similaires et avons calculé, avec un logiciel spécialisé, le nombre nécessaire et suffisant d’animaux pour obtenir des données interprétables au niveau statistique Les souris immunodéficientes sont généralement irradiées avant greffe avec des cellules humaines pour permettre une meilleure prise de greffe mais cette irradiation favorise également la maladie du greffon contre l’hôte, limitant la survie des souris greffées. Afin de limiter le nombre de souris, nous n’envisageons pas, dans ce projet, d’irradier les souris.

Raffinement

Toutes les mesures seront prises pour réduire la souffrance et le stress des animaux. Les animaux seront observés quotidiennement pour rechercher tout signe de douleur et de stress grâce à une grille de score qui prend en compte de nombreux paramètres comportementaux et la perte de poids des souris sera évaluée 2 fois par semaine. Un enrichissement des cages sera réalisé en utilisant des copeaux de litière et des igloos, mais surtout de la nourriture humidifiée dans la cage en cas d’observation de perte de poids. Les souris seront suivies sur une période de 4 semaines post-injection et euthanasiées. Les animaux immunodéprimés peuvent présenter un phénotype dommageable selon les conditions d’hébergement. Les souris seront réceptionnées à l’âge de 5-6 semaines et seront incluses dans les protocoles expérimentaux après 8 à 10 jours d’acclimatation. Les souris seront hébergées et manipulées dans des conditions préservant leur statut immunologique. Elles seront changées avec du matériel autoclavé et de préference en premier, dans une hotte change cage, de façon à éviter toute contamination. Les souris ne seront pas gardées plus de 1,5 mois en zone d’hébergement et ne devraient pas montrer de phénotype particulier dû à leur déficit immunitaire. Enfin, pour éviter l’apparition de la réaction du greffon contre l’hôte, nous évaluerons également la possibilité d’utiliser d’autres cellules ne provoquant pas ce type de réaction immunitaire.

Choix des espèces

Les souris immunodéprimées sélectionnées pour ce projet ont une caractéristique essentielle de ne pas avoir de cellules immunitaires permettant ainsi l’injection de cellules humaines, qui ne sont pas détruites par la souris. Les souris injectées avec les cellules immunitaires humaines permettent de tester de nouvelles approches thérapeutiques. Elles permettent d’évaluer l’impact de la molécule à tester sur la réponse immunitaire humaine et vice-versa, l’impact de la réponse immunitaire sur la molécule à tester. Elles constituent aujourd’hui les modèles les plus pertinents pour décrypter les effets des molécules et sont aujourd’hui bien plus adaptées que les souris immunocompétentes ou les modèles expérimentaux ex-vivo. Dans la littérature, ces souris sont injectées avec les cellules humaines à l’âge adulte (6-7 semaines). Elles seront donc réceptionnées à l’âge de 5-6 semaines et seront incluses dans les protocoles expérimentaux après 8 à 10 jours d’acclimatation.

Immunisées avec des protéines du parasite du paludisme mêlées à l'adjuvant de Freund, ou avec des candidats vaccins à ARNm, 1 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prises de sang et des injections, puis, en fin d'expérience, une ponction cardiaque sous anesthésie qui les vide de leur sang, pour produire des anticorps de laboratoire et trier des candidats vaccins. Le porteur évoque aussi des souris "préalablement infectées par du Plasmodium berghei" pour valider les préparations vaccinales, sans décrire cette infection parmi les actes prévus. Il écrit que les souris au taux d'anticorps insuffisant seront mises à mort à la fin de chaque procédure, puis qu'elles "peuvent être réutilisées dans d'autre projets dans la mesure du possible".

Objectifs

Le paludisme est un problème de santé publique, majeur qui sévit dans plus de 100 pays et fait plus de 627 000 morts par an surtout chez les jeunes enfants. Chez les femmes enceintes, l’infection par Plasmodium peut causer leur mort et celle de leur enfant ainsi qu’un poids de naissance inférieur à la normale entraînant une mortalité très fréquente après la naissance. Depuis 2021, un vaccin est disponible sur le marché. La prise d’antipaludiques et l’utilisation de moustiquaires imprégnées augmentent la résistance du parasite aux antipaludiques. La maladie est causée par le parasite du genre Plasmodium, un protozoaire appartenant au phylum des Apicomplexes. Parmi les 5 espèces qui infectent l’Homme, deux sont les plus répandues : Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax. Le cycle de vie du parasite, entre un hôte mammifère et un moustique du genre Anopheles, est complexe. La partie la mieux connue de ce cycle est la phase érythrocytaire se déroulant chez le mammifère, durant laquelle les parasites se multiplient dans les érythrocytes de l’hôte. Notre laboratoire étudie les mécanismes d’invasion des globules rouges humains par Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax. Nous nous intéressons, en particulier, au stade sanguin du cycle du parasite. Nous étudions les mécanismes mis en jeu par le parasite pour s’attacher au globule rouge, y pénétrer et s’y développer. Cette phase érythrocytaire, pour Plasmodium falciparum, peut être reproduite in vitro dans des systèmes de culture de globules rouges humains. Nous avons identifié plusieurs protéines d’intérêt exprimées par le parasite lors de son cycle de vie dans le globule rouge. Afin de les étudier, nous allons produire, chez la souris, des anticorps polyclonaux (AcP) dirigés contre ces protéines. Ces anticorps nous permettrons d’inhiber ces protéines à la surface du mérozoïte (forme du parasite permettant d’infecter un nouveau globule rouge) ainsi que de déterminer la réponse immunitaire des candidats vaccins contre Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax.

Bénéfices attendus

Notre compréhension du paludisme est limitée par des outils de recherche tels que les anticorps. Il existe en effet peu d’anticorps spécifiques contre les différentes espèces de Plasmodium disponibles. Ce projet a pour but de produire un outil qui sera indispensable dans la lutte contre cette maladie. Les anticorps sont essentiels pour faire progresser notre connaissance sur le fonctionnement du parasite. Nous pouvons étudier l’expression de ces molécules dans les différents stades du parasite en utilisant les techniques suivantes : ELISA, Western Blot, l’inhibition de la croissance parasitaire, les procédures d’immunoprécipitation, l’immunofluoromicroscopie. Avec des anticorps spécifiques nous sommes en mesure de mieux comprendre l’implication des protéines responsables de l’invasion chez P. falciparum, P. vivax et P. knowlesi. De plus, les infections de souris par des candidats vaccins permettront un criblage des préparations vaccinales.

Procédures

1) Une prise de sang (une minute). 2) Une injection (une minute). 3) L'exsanguination par ponction intra-cardiaque (5 minutes) à la fin de l’expérience, préalablement anesthésiées par injection par voie intrapéritonéale (une minute).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont liés à l’injection des protéines avec adjuvant et des candidats vaccins. Dans des très rares cas les souris peuvent mal supporter les protéines recombinantes et les candidats vaccins à ARNm. Elles peuvent montrer une réaction inflammatoire. Les souris recevront les protéines recombinantes en présence d’adjuvant Complet de Freund (CFA) pour la première injection et l'adjuvant Incomplète de Freund (IFA) pour les autres injections. L’utilisation de l’adjuvant CFA par voie sous-cutanée peut induire des effets indésirables. Les injections des candidats vaccins à ARNm se feront par la voie intra-musculaire sans adjuvant. Les souris peuvent montrer des signes cliniques et comportementaux de souffrance et ou d’angoisse.

Devenir

Toutes les souris ayant un titre d’anticorps satisfaisant seront mises à mort afin d’obtenir une quantité de sérum suffisant pour l’études des protéines d’invasion ou déterminer les candidats vaccins permettant la meilleure immunisation possible contre P. falciparum, P. vivax ou P. knowlesi. Toutes les souris n’ayant de titre d’anticorps satisfaisant lors de prélèvements intermédiaires seront mis à mort à la fin de chaque procédure, car elles ont reçu au moins une injection de protéines recombinantes ou une dose de candidats vaccins à ARNm. Elles ne peuvent donc pas être réutilisés dans notre projet. Cependant, elles peuvent être réutilisées dans d’autre projets dans la mesure du possible.

Remplacement

L’alternative possible à l’emploi de sérums serait d’employer les sérums prélevés chez des personnes vivant en zone d’endémie, porteuses d’anticorps contre les antigènes d’intérêt et d’immuno-purifier les immunoglobulines spécifiques par affinité sur les antigènes recombinants. Les expériences d’autre groupes de recherche ont montré que les anticorps ainsi obtenus sont de faible affinité pour des protéines spécifiques, avec un titre très faible et ne fonctionnent pas pour les protéines intracellulaires qui ne sont pas exposée à la réponse immunitaire de l'hôte. Il existe aujourd'hui des alternatives non animales pour produire les anticorps telles que les anticorps recombinants et les aptamères (courts fragments d'ADN ou d'ARN qui peuvent se lier à des cibles telles que des protéines). Cependant, une bibliothèque de gènes d'anticorps de Plasmodium n'a pas encore été constituée, ce qui rend cette technique hors de portée pour le moment. Le recours à l’animal est nécessaire car ces anticorps ne peuvent être obtenus qu’après immunisation d’une espèce animale. Cependant, pour chaque protéine identifiée avec certitude dans l’invasion du globule rouge par P. falciparum, P. vivax ou P. knowlesi, nous ferons des hybridomes permettant d’obtenir des anticorps monoclonaux. Ce qui nous permettra de bénéficier d’une banque d’anticorps pour l’étude des mécanismes d’invasion du globule rouge par les Plasmodium. De plus, l’utilisation de souris préalablement infectées par du Plasmodium berghei permet de valider les préparations vaccinales avant d’envisager de futur développement de ces vaccins.

Réduction

Le nombre de souris pour chaque expérimentation a été calculé au plus juste pour permettre un nombre minimum des animaux. Cette estimation a été réalisée en concertation avec un biostatisticien. Ainsi, nous avons choisi des groupes de 5 souris dont les sérums seront poolés afin d’avoir une quantité de sérums suffisante pour une étude approfondie et répétée.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse de nos souris, nous mettrons en œuvre un enrichissement de l’environnement avec par exemple des abris et des bâtons de coton pour la nidification. Si les souris montrent des signes de détresse ou de souffrance pendant les prélèvements nous pouvons utiliser une anesthésie gazeuse sous isoflurane. Une surveillance accrue pendant 3 jours suivant les injections et puis 2 fois par semaine entre les injections et les prélèvements ainsi que des soins post manipulation (injections et prélèvements) seront pratiqués.

Choix des espèces

Nous avons choisi de produire nos anticorps chez la souris car nous savons par des expériences antérieures que les protéines recombinantes de Plasmodium sont très immunogènes chez la souris. De plus il est indispensable de tester des candidats vaccins sur des souris avant de continuer leur développement. Les souris utilisées pour les immunisations seront âgées de 6 semaines, âge auquel on obtient une bonne réponse immune et une préhension correcte pour l’immunisation et le prélèvement sanguin.

528 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux dépourvus de microbiote sont colonisés par des bactéries, séparés de leur mère à répétition et soumis à 28 tests neurologiques et 8 tests comportementaux entre 6 et 45 jours de vie, les mères étant gavées une fois. Le projet étudie l'effet de dérivés du tryptophane produits par le microbiote sur le développement du cerveau. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro assez complexe n'existe pour cet objectif.

Objectifs

La période néonatale est critique pour le développement du cerveau. Or les facteurs qui influencent ce développement sont encore mal connus. Parmi les facteurs candidats figurent les molécules produites par le microbiote intestinal. En effet, la période néonatale est aussi celle de la colonisation microbienne intestinale, caractérisée par une évolution progressive des populations bactériennes résidentes et de leurs capacités métaboliques. A cet égard, le profil des molécules produites par le microbiote intestinal et présentes dans le cerveau de jeunes souris évolue entre la naissance et le sevrage. Cette évolution concerne notamment le profil des métabolites microbiens du tryptophane, un acide aminé essentiel, à structure indolique, . Ces données rejoignent des observations chez l’être humain montrant que, chez des nouveau-nés à terme, le microbiote de ceux nés par césarienne a un potentiel métabolique altéré. En effet, chez les nouveau-nés par césarienne, il n'y a pas de transmission du microbiote vaginal et fécal de la mère, comme c'est le cas lors d'un accouchement par voie basse. En raison de la fréquence accrue de troubles cognitifs chez les personnes nées par césarienne et des effets neuronaux des substances dérivées du tryptophane produites par le microbiote chez les rongeurs, nous supposons qu'une perturbation de la colonisation microbienne intestinale pourrait influencer le développement cérébral. Pour tester cette hypothèse, nous allons simuler, chez des souris initialement dépourvues de microbiote intestinal, une altération de la production de ces substances en les colonisant avec des bactéries produisant ou non les dérivés en question. Ces souris seront soumises de l’âge de 6 jours à l’âge de 45 jours (jeunes adultes) à des tests comportementaux. Leur cerveau sera analysé pour différents paramètres caractérisant l’état du neurodéveloppement.

Bénéfices attendus

En examinant comment les substances issues du tryptophane produit par les microbes intestinaux peuvent agir comme messagers entre le microbiote intestinal et le système nerveux central pendant la période néonatale, nous aiderons à comprendre comment ces mécanismes et ces voies de communication fonctionnent à un moment crucial qui influence la vie d'un individu.

Procédures

Les femelles reproductrices (animaux vigiles, n=96) seront gavées 1 fois à l’aide d’une sonde de gavage souple (durée 1 à 2 minutes). Elles subiront 1 prélèvement de fèces émis spontanément, d’une durée de quelques minutes. Les souriceaux (animaux vigiles, n=128) subiront à J42 1 prélèvement de fèces émis spontanément, d’une durée de quelques minutes. Les souriceaux (animaux vigiles, n=128) dans la périodes entre J6 et J44 subiront en tout 28 tests neurologiques de développement en 4 sessions de 5 à 15 mn, et 8 tests comportementaux en 8 sessions de 6 à 15 mn.

Impact sur les animaux

Pour effectuer les évaluations neurologiques, les portées seront séparées temporairement de leur mère ce qui va générer du stress. Lors des prélèvements fécaux les souris seront isolées quelques minutes dans des pots individuels. Le gavage des mères sera effectué par des personnes entraînées, qui les pratiquent en routine, mais un accident pourrait se produire pouvant entrainer une douleur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements d'échantillons biologiques.

Remplacement

Ce projet vise à déterminer l’effet de l’inoculation de 2 souches bactériennes produisant ou non les dérivés métaboliques d’intérêts sur le développement du cerveau de jeunes souris. Ces bactéries sont capables de générer des métabolites pouvant agir sur les structures cérébrales par voie nerveuse ou circulatoire. L’utilisation d’animaux est donc obligatoire, car il n’y a aucun modèle in vitro ou in silico suffisamment complexe qui existe et puisse être utilisé dans cet objectif.

Réduction

Le nombre d’animaux a été fixé au strict nécessaire. Le facteur limitant est l’étude biochimique des cerveaux. En effet, l’étude comporte la détermination de plusieurs marqueurs cérébraux qui ne peuvent pas être mesurés simultanément sur les mêmes cerveaux. Nous avons évalué à 8 souris femelles et 8 souris mâles par type de marqueurs. Pour les tests neurologiques et comportementaux, et les analyses dans les autres échantillons biologiques, le nombre sera de 16 souris femelles et 16 souris mâles.

Raffinement

Chaque cage comporte un tunnel en plastique transparent, des bâtons à ronger et du matériel de nidification en guise d'enrichissement. Les souriceaux seront conservés avec leur mère pendant la durée de la lactation. Lors des évaluations neurologiques et comportementales avant le sevrage, les souriceaux seront isolés par portée entière dans une cage contenant de la litière de la cage d’origine, et du papier absorbant déchiqueté par la mère. La durée de chaque évaluation sera courte et les souriceaux seront immédiatement replacés dans la portée. Pour éviter le rejet de la portée, le nid n'est pas déplacé pendant le change, la litière est enlevée et replacée autour du nid sans le déranger. Les animaux sont surveillés quotidiennement et pesés une fois par semaine et les points limites préalablement définis sont contrôlés.

Choix des espèces

Seuls les rongeurs permettent la mise au point de modèles d’animaux à microbiote intestinal particulier en isolateur adaptés à notre étude. La souris a été préférée au rat car, en isolateur, où l'espace est restreint, cette espèce permet de tester simultanément un nombre d’animaux plus important, et d’utiliser des dispositifs expérimentaux de plus petite taille, donc plus nombreux et plus variés. Par ailleurs, puisque la majorité des études publiées au cours des dernières années sur les relations entre le microbiote intestinal et le système nerveux central de l’hôte ont été réalisées chez la souris, les études menées avec cette espèce permettent une meilleure comparaison des résultats avec ceux de la littérature. Les souris sont utilisées de la naissance à la fin de l’adolescence, car nous voulons déterminer l’impact de produits bactériens sur le développement cérébral.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues démyélinisées par une alimentation spéciale pendant douze semaines, elles reçoivent des injections intramusculaires d'une molécule puis passent des examens d'imagerie par résonance magnétique de deux à quatre heures sous anesthésie, transportées entre deux établissements. Le projet suit la régénération de la myéline dans un modèle de sclérose en plaques. Le porteur affirme que la remyélinisation ne peut être reproduite in vitro et impose le test dans un "organisme entier".

Objectifs

Dans le système nerveux central, le prolongement majeur des neurones que l’on appelle l’axone est entouré d’une gaine de lipides, ou myéline, qui permet d’optimiser la réponse du neurone et participe au fonctionnement correct des différents tissus et organes du corps humain. Les maladies qui détruisent la myéline dans le système nerveux central sont dites démyélinisantes. La plus commune est la sclérose en plaques (SEP) qui atteint une majorité d'adultes jeunes entre 20 et 40 ans. Les troubles neurologiques associés touchent diverses fonctions comme la motricité, la sensibilité, la vision. Une régénération spontanée de la myéline détruite existe au cours des premières étapes de la maladie, mais le processus finit par s’épuiser conduisant donc à des handicaps irréversibles. Les traitements actuellement disponibles permettent de réduire l'inflammation déclenchée par le système de défense de l’organisme contre les agressions extérieures, mais aucun ne favorise la régénération de la myéline indispensable pour éviter une maladie très invalidante. Nous avons précédemment mis en évidence des propriétés remyélinisantes (régénération de la myéline) intéressantes pour une molécule dans des modèles de démyélinisation (perte de myéline) focale. L’objectif de ce projet est la mise en place d’une étude longitudinale destinée à visualiser par imagerie par résonance magnétique (IRM) la régénération de la myéline induite par cette molécule en utilisant un modèle chronique de démyélinisation chez la souris, classiquement utilisé pour refléter plusieurs caractéristiques des phases tardives de la SEP. La présente demande concerne donc un projet multi-sites (2 établissements utilisateurs). La première partie (établissement utilisateur 1/2) a été préalablement autorisé par le ministère. La deuxième partie est réalisée dans un deuxième établissement utilisateur car elle nécessite une expertise et un équipement spécifiques indisponibles dans le premier établissement utilisateur (l'imagerie par résonance magnétique chez la souris). Aucun animal supplémentaire n'est donc ajouté par rapport au projet initial autorisé dans le premier établissement utilisateur.

Bénéfices attendus

Du point de vue scientifique, ce projet pourrait permettre d’identifier une molécule remyélinisante qui comblerait le vide thérapeutique actuel dans le domaine de la sclérose en plaques. Cette molécule pourrait permettre d’éviter les handicaps neurologiques irréversibles qui finissent par apparaître au cours du temps chez les malades.   

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur (EU 1/2) : les souris traitées auront reçu un traitement dans leur nourriture pendant 12 semaines afin de mettre le modèle de la maladie en place. Tous les animaux (traités et contrôles) seront transportés de leur établissement utilisateur d’origine vers un deuxième établissement utilisateur (EU 2/2). Dans le second établissement utilisateur (EU 2/2) : les souris traitées recevront la molécule à tester ou son contrôle, vigiles, tous les 4 jours pendant 21 jours (6 injections au total par animal), par voie intramusculaire après une anesthésie locale (le temps d’une injection dure environ 30 secondes). Trois examens IRM seront réalisées sur une partie de ces souris traitées sous anesthésie gazeuse à 0, 3 et 6 semaines après le début du traitement. Les autres souris traitées seront imagées si besoin pour obtenir nos effectifs statistiques si nous rencontrons un problème. Les souris contrôles seront quant à elles soumises à un unique examen IRM sous anesthésie gazeuse. La procédure IRM dure 4h maximum par animal, 2h30 en moyenne (de l’induction de l’anesthésie au réveil de l’animal).

Impact sur les animaux

Avant leur arrivée dans notre établissement les animaux (32 souris) auront ingéré une nourriture en poudre supplémentée par une molécule entraînant une perte de myéline (gaine de lipide présente autour des prolongement des neurones) mais cette perte est restreinte au cerveau sans atteinte de la moelle épinière et n’entraîne donc pas de troubles moteurs. A l’issue du transport entre l’établissement d’origine et d’accueil, la période d’acclimatation sera inférieure à 7 jours pour 16 animaux, pouvant causer du stress. La période d’acclimatation est réduite pour ces animaux, car il est nécessaire de pouvoir établir le niveau de démyélinisation basal le plus rapidement possible après la préparation du modèle, avant de commencer le traitement par la molécule ou le véhicule. La molécule à évaluer dans ce projet, tout comme le véhicule contrôle, sera administré par voie intramusculaire (I.M.), car les connaissances pharmacocinétiques actuelles ne permettent pas d’utiliser une autre voie. Il est possible que cela provoque une gêne et une légère douleur au niveau du site d’injection se traduisant par un léger boitillement des animaux à la suite de l’injection. Aucun effet indésirable n’est attendu par la molécule elle-même, car il s’agit d’une molécule déjà testée à la même dose chez d’autres modèles rongeurs, dans le cadre d’autres applications thérapeutiques, sans reporter de toxicité. Les animaux subiront une anesthésie générale unique (8 souris) ou à jusqu’à 3 reprises lors des sessions d’IRM (20 minmum à 32 maximum) pouvant causer un stress thermique (hypothermie), des difficultés cardio-respiratoires et une non récupération de la vigilance suite à l'anesthésie.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux (40 souris) seront euthanasiés au sein du deuxième établissement utilisateur. Ce projet est réalisé sur deux établissements utilisateurs et n'ajoute aucun animal supplémentaire. Pour les animaux ayant effectué au moins un examen par imagerie par résonance magnétique (IRM) (au minimum 28 animaux, au maximum 40 animaux), le cerveau sera prélevé pour réaliser des analyses histologiques dans le cadre de l’évaluation de l’efficacité de notre molécule d’intérêt.

Remplacement

Le processus de remyélinisation (regénération de la myéline) met en jeu plusieurs types cellulaires en dehors des cellules qui synthétisent la myéline, en particulier des cellules inflammatoires. L’évaluation sur culture de ces cellules a permis de déterminer l’effet pro-myélinisant in vitro de la molécule. Mais le processus de remyélinisation qui a lieu dans un organisme à l’issue d’un processus de démyélinisation (perte de myéline) se fait au sein d’un environnement inflammatoire mettant en jeu d’autres types de cellules et des neurones qui sont tous impliqués de manière complexe dans la remyélinisation, ce que l’on ne peut pas reproduire in vitro. Aussi le test de la molécule dans un organisme entier est nécessaire.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisés est de 40 souris, dont 8 souris contrôles non traitées (4 mâles et 4 femelles) et 4 groupes de 8 animaux traités avec une molécule permettant d’établir notre modèle pathologique, puis par un véhicule ou la molécule d’intérêt à tester. L’étude longitudinale nous permet de réduire le nombre d’animaux tout en examinant 3 temps successifs. Notre expertise dans le domaine nous permet de dire que 5 animaux par groupe seront suffisants pour visualiser l’effet remyélinisant (regénération de la myéline) si l’on considère les valeurs moyennes dans les conditions 'tests' et 'contrôles' classiquement observées dans nos analyses histologiques. Nous traiterons 8 animaux par groupe pour créer notre modèle, étant donné la durée de l’expérience (18 semaines) et la nécessité de 3 anesthésies générales successives, espacées de 3 semaines, qui pourraient conduire à la perte prématurée de certains animaux. Les 3 animaux supplémentaires viendront en remplacement des éventuels animaux perdus. Nous pourrons ainsi maintenir un effectif suffisant pour notre interprétation statistique. Pour les animaux contrôles, 4 animaux de chaque sexe nous permettent de mesurer un niveau basal de myélinisation pour les comparer par la suite avec les animaux traités.

Raffinement

Dans l'établissement utilisateur 1 sur 2: Les injections intramusculaires (I.M.) sont effectuées par du personnel maîtrisant ce geste, après anesthésie locale avec un système de contention adapté. La molécule injectée a déjà été testée chez des modèles rongeurs à la même dose, sans reporter d’effet toxique. Les 4 dernières semaines de traitement, les animaux seront habitués au système de contention (1 fois par semaine). Dans l'établissement utilisateur 2 sur 2: Le jour du transfert tous les animaux repassent à la nourriture classique avec de la nourriture pulvérisée non supplémentée pour assurer la transition. Le transport est réalisé par un transporteur agréé au calme dans une boîte de transport (trajet inférieur à 30 min) avec leurs congénères, de quoi boire et s’alimenter ainsi que de l’enrichissement. Les animaux seront observés à leur arrivée et transférés en zone d’hébergement avec les mêmes congénères et de l’enrichissement dans des cages ventilées et dans des conditions contrôlées de température, hygrométrie, éclairage afin de garantir le respect des normes sanitaires. Avant l’imagerie, les souris sont laissées 30 min dans la pièce de préparation puis observés pour vérifier leur état. Lors de l’imagerie (sous anesthésie générale), l’animal est positionné dans un système de contention dédié au système d’imagerie. Un anesthésique local est appliqué au niveau des points d'appui pour éviter toute douleur, un gel ophtalmique est appliqué pour éviter la déshydratation oculaire. La température de l'animal est maintenue à température physiologique grâce à un tapis chauffant placé sous la cage d’induction puis avec un système de circulation d'eau chaude intégré au berceau IRM. Un contrôle des paramètres physiologiques est réalisé avec une sonde rectale et un capteur de pression respiratoire. De la vaseline sera appliquée avant d’introduire la sonde de température. La profondeur de narcose est contrôlée pendant l’examen (4h maximum) via le rythme cardio-respiratoire. La procédure sera immédiatement arrêtée et l’animal sorti pour vérification en cas d’atteinte de points limites établis (respiration trop lente ou rapide, température corporelle anormale). Pour le réveil l’animal sera placé dans une chambre thermostatée à 37 degrés, sous surveillance et stimulation régulière. La remise en zone d’hébergement sera faite avec des animaux ayant repris une activité normale dans leur cage.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les principales espèces utilisées sur notre plateforme d’imagerie, leur taille permet de les utiliser dans ce type de scanner par imagerie par résonance magnétique (IRM) pour acquérir des images 2D, 3D ou 4D (dimension temporelle) capables de donner des détails anatomiques et fonctionnels qui contribuent à répondre aux questions scientifiques posées. Nous disposons d’un modèle souris de démyélinisation (perte de myéline) classiquement utilisé pour refléter plusieurs caractéristiques des phases tardives de la sclérose en plaques (SEP) chez lequel nous souhaitons tester un traitement via l’injection intramusculaire d’une molécule pour ses capacités remyélinisantes (regénération de la myéline). Les souris (mâles et femelles) seront âgées entre 20-21 semaines (correspondant à l'âge du début du traitement par la molécule et au pic de démyélinisation) à 26-27 semaines (soit à 6,5 mois, 3 semaines après la fin du traitement par la molécule d'intérêt pour étudier les effets à long termes après l'arrêt du traitement).

345 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris immunodéficientes reçoivent des greffes de cellules cancéreuses dans la queue, la glande mammaire ou le foie, suivies de séances d'imagerie répétées sous anesthésie pendant que se forment des micrométastases. Le projet cherche à comprendre comment des vésicules libérées par des cellules agressives augmentent le pouvoir métastatique de cellules moins invasives. Le porteur affirme que la complexité de la tumeur intégrée impose le recours au modèle animal après les tests in vitro.

Objectifs

Les métastases sont responsables de 90% des causes de décès lié au cancer selon l’OMS, et représente un problème majeur de santé publique. En effet, le mécanisme de formation des métastases est très complexe et il n’existe actuellement aucun traitement. La compréhension du mécanisme de formation des métastases constitue donc un enjeu majeur pour identifier de nouvelles cibles et axes thérapeutiques. L’objectif de ce projet vise à comprendre l’impact de vésicules extracellulaires produites par des cellules agressives métastatiques sur la capacité à former des métastases de cellules moins invasives (qui potentialiseraient le pouvoir métastatique des cellules moins invasives). Ce projet implique l’injection de cellules cancéreuses chez la souris afin de pouvoir suivre la formation de micrométastases en réponse à la stimulation aux vésicules extracellulaires ou non. Nous avons montré un effet significatif de ces vésicules extracellulaires sur l’augmentation des capacités invasives in vitro. La présence de ces vésicules dans un modèle in vitro 3D a également été confirmée. Les expériences in vivo nous permettrons de tenir compte de l’environnement complexe de la tumeur intégrée dans un organisme entier. Seules les expériences in vivo nous permettront de valider notre hypothèse.

Bénéfices attendus

A la fin du projet, ces résultats nous permettront de valider que ces vésicules sont impliquées dans la formation de métastases. A des fins thérapeutiques, ces vésicules pourront par la suite être ciblées par des traitements visant à réduire la formation de métastases aujourd’hui largement responsable de la gravité des cancers et des rechutes. Grâce à cette étude, nous pourrons apporter des bénéfices sur la meilleure compréhension des cellules à former des métastases mais aussi une nouvelle cible thérapeutique pour espérer mieux soigner les patients à terme.

Procédures

Greffe par voie caudale sur animaux vigiles (une fois par procédure, moins de 5 minutes). Greffe dans la glande mammaire sur animaux anesthésiés (une fois par procédure- durée : 5min/animal). Greffe dans le foie sur animaux anesthésiés (une fois par procédure- durée : 10min/animal). Imagerie par bioluminescence ( 1 à 2 fois par semaine ou tous les 15 jours en fonction de la procédure et en fonction du développement tumoral obtenu soit au plus 20 fois -durée de la séance d'imagerie : environ 20 minutes sur animaux anesthésiés)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un stress dû à la contention/préhension des animaux. 2/ des douleurs durant et après les injections orthotopiques 3/ Un inconfort au niveau des sutures dans les heures suivant les injections orthotopiques. 4/ Un stress lors des phases d’induction de l’anesthésie (animal placé dans une boîte à induction lors des imageries) et de réveil. 5/ le développement de micro- métastases.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser l'analyse post-mortem des différents organes qui présenteront des micrométastases.

Remplacement

Tous les tests cellulaires in vitro réalisés en amont de cette étude montrent le rôle important de ces vésicules dans la tumorigénicité des cellules de cancer du sein et notamment dans le potentiel métastatique. Cependant, les tumeurs sont des modèles intégrés qui font intervenir un grand nombre de mécanismes physiologiques et de tissus avoisinants qui ne peuvent être modélisés in vitro. Nous devons donc avoir recours à un modèle physiologique complet et fonctionnel pour cette dernière étape : le modèle animal.

Réduction

Une expérience pilote nous permettra de déterminer le nombre nécessaire et suffisant à la greffe tumorale. Nous combinerons nos lots témoins dans le but de restreindre le nombre d'animaux. La croissance tumorale sera suivie de manière longitudinale tout au long de l'expérience notamment grâce l’expression de la luciférase dans nos cellules, système très sensible qui nous permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux nécessaires par lot pour détecter 50% de différence inter lots avec 50% d’écart type intra lot est de 10, les expériences seront réalisées en duplicat et des tests statistiques seront effectués.

Raffinement

Le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort, les animaux seront hébergés en groupe et l'enrichissement de leur milieu de vie sera systématique. Les animaux recevront une surveillance quotidienne et des soins adaptés (administration d’analgésiques et anesthésiques en pré et/ou postopératoire, mesure hebdomadaire du poids des souris et du volume tumoral, définition de points limites suffisamment précoces et mise en place de critères d’arrêt). Les cellules greffées exprimeront la luciférase ce qui permettra de détecter l’apparition de cellules tumorales très précocement permettant ainsi d’améliorer le bien-être animal par une prise en charge plus rapide.

Choix des espèces

Nous avons choisi de réaliser nos expériences sur des souris immunodéficientes qui permettent la greffe de cellules humaines Les souris seront utilisées à l'âge adulte de 8 semaines à 12 semaines de vie. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l´inoculation de cellules.

462 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit l'implantation de cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie et une infusion intracrânienne du traitement, avec perte de poids, de motricité et de sensibilité attendues à mesure que la tumeur se développe. Le projet teste des nanoémulsions de fénofibrate associées à des oxydes de fer contre le glioblastome. Le porteur affirme qu'un modèle in vivo complet est "indispensable" pour intégrer le microenvironnement de la tumeur.

Objectifs

Le glioblastome (GBM) est une tumeur cérébrale maligne et agressive dont la médiane de survie est faible. La résistance aux traitements est due notamment au microenvironnement tumoral constitué de trois composantes : l’hypoxie, la barrière hémato-encéphalique ainsi que la composante inflammatoire. Ce projet a pour but de développer une nouvelle stratégie thérapeutique du glioblastome basée sur la formulation de nanoémulsions de fénofibrate (NEF) associées à des nanoparticules d’oxydes de fer (SPIONs). En effet, nous avons développé une formulation de fénofibrate dans des nanoémulsions permettant d’améliorer sa solubilisation et le rendre ainsi compatible avec une utilisation sur des modèles cellulaires et animaux. Afin de cibler la composante inflammatoire, le fer contenu dans les SPIONs est utilisé pour stimuler la réponse inflammatoire. Ces SPIONs pourraient également améliorer la stabilité des NEF.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’étudier le potentiel thérapeutique des nanoémulsions de fénofibrate associées à des SPIONs. Il vise à démontrer l’intérêt d’outils innovants pour le traitement du glioblastome. Cette stratégie est également basée sur l’utilisation d’un principe actif, développé initialement pour une pathologie différente, associée à un autre agent de thérapie et de diagnostic (les SPIONs) ciblant la composante inflammatoire du glioblastome, autre facteur limitant de l’efficacité des traitements. De façon totalement originale, il s’agit de valoriser un nouvel outil nanotechnologique pour lequel les avantages en terme d’incorporation de principe actif et d’augmentation de leur solubilisation a déjà été établi. L’approche de thérapie combinée ciblant plusieurs composantes du glioblastome est d’emblée intégrée à ce projet pour optimiser les chances de réussite du traitement. De plus, le choix de plusieurs modèles expérimentaux a pour objectif de favoriser la translation des résultats.

Procédures

Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale et infusion intracrânienne du traitement) : 30 minutes maximum par animal, réalisée au maximum deux fois sur chaque animal, les 462 animaux sont concernés.

Impact sur les animaux

Suivant l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous nous attendons à avoir une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de GBM. Pour remédier à la perte de poids, les souris disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de la cage ainsi que du complément alimentaire (DietGel Recovery). Le poids de chaque animal sera mesuré avant, pendant et après les procédures d’implantation tumorale et d’injection du traitement. Si une perte de poids supérieure à 15% est observée, la procédure sera arrêtée. Les séances d’imagerie (IRM) n’induisent pas en elles-mêmes de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal, un autre point de vigilance est ainsi défini pendant l’acquisition IRM par une diminution de la fréquence respiratoire en dessous de 30 respirations / min. S’il est atteint, le pourcentage d’isoflurane sera légèrement diminué et si la fréquence n’augmente pas à nouveau, la procédure sera arrêtée. Les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil et ensuite replacés dans leur cage et rentrés à l’animalerie tous les soirs. Ils sont ensuite surveillés quotidiennement. La procédure chirurgicale pour l’établissement du modèle de tumeur cérébrale et l’injection du traitement peut induire des douleurs. Pour limiter ces douleurs, les souris reçoivent une injection de buprénorphine (sous-cutanée ; 0,05 mg/kg) 15min avant la chirurgie. L’induction de l’anesthésie des souris est ensuite réalisée avec 5% d’isoflurane (apporté dans un mélange gazeux contenant 70% N2O/30 % O2) pour l’induction puis les animaux sont maintenus anesthésiés à 2,5% d’isoflurane pendant la chirurgie. Les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil et ensuite replacés dans leur cage et rentrés à l’animalerie tous les soirs. Ils sont ensuite surveillés quotidiennement.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort dans le but de récupérer les cerveaux pour analyses post-mortem.

Remplacement

Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la cellule tumorale. L’utilisation de modèles in vivo complets permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux différents traitements. Ce projet a été initié sur des cultures de lignées de GBM afin de déterminer des doses efficaces pour les trois lignées de GBM utilisées ainsi que la maitrise de la formulation des nanoémulsions mais ne peut pas s’effectuer intégralement sur ces modèles de remplacement in vitro ou in silico.

Réduction

L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasive se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques, nous avons réalisé des simulations statistiques à l’aide des données précédemment acquises au sein de l’équipe pour les groupes A, B et C. Ces simulations ont été réalisées à l’aide de l’outil BiostaTGV disponible sur le site internet https://biostatgv.sentiweb.fr/?module=etudes/sujets#. Ces simulations ont permis de mettre en évidence pour le Groupe A (modèle GL261) un nombre minimum de 10 animaux par sous-groupe. De même, pour les Groupes B (modèle U-251-MG) et C (modèle U-87-MG) un nombre minimum de 30 animaux et 20 animaux respectivement par sous-groupe de traitement est nécessaire. Ce nombre d’animaux est cependant un nombre maximum et pourra être revu à la baisse durant l’étude.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux (5 souris par cage) dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation et bénéficieront également d’enrichissement (roue d’activité, cartons). L'hébergement des animaux immunodéprimés se fera en cage ventilée individuelle permettrant le maintien d'un statut sanitaire exempt d'organismes opportunistes et pathogènes. Les animaux seront surveillés dès leur arrivée jusqu’à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique, respiration) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée 3 fois par semaine. Les animaux disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de la cage ainsi que de complément alimentaire afin de limiter la perte de poids due aux procédures expérimentales. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents.

Choix des espèces

Les modèles tumoraux in vivo sont nécessaires afin d’évaluer l’effet du traitement sur les cellules tumorales tout en prenant en compte toutes les composantes du microenvironnement tumoral qui peuvent modifier l’effet thérapeutique du traitement. Nous utiliserons donc des souris immunocompétentes C57Bl/6 car ces souris présentent la composante inflammatoire et notamment macrophagique, cible de notre traitement. Le modèle de tumeur cérébrale utilisé repose sur l’implantation de cellules de gliome GL261, cellules issues de souris C57Bl/6 qui permet alors d’éviter toute inflammation aberrante due au rejet de « greffe » par la souris souche utilisée. Nous utiliserons également des souris immunodéficientes Nude, sans lymphocytes T, mais présentant des lymphocytes B, des cellules tueuses naturelles (NK) et des cellules myéloïdes (macrophages). Ce modèle nous permettra d’étudier l’effet du traitement sur un modèle de tumeur cérébrale reposant sur l’implantation de cellules de glioblastome d’origine humaine ; permettant une plus grande représentativité de la réalité clinique. Cette étude va également inclure un nombre égal de souris mâles et femelles pour l’ensemble des procédures, en lien avec les recommandations actuelles. En effet, le GBM est un cancer touchant aussi bien les hommes que les femmes. Le sexe sera pris en compte comme variable lors des différentes analyses. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes, âgés de 8 à 10 semaines en début de protocole. Cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. De plus, à ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps longs.