Recherche fondamentale

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent la flunarizine par gavage quotidien pendant 14 jours, subissent des tests moteurs et un test d'anxiété, un électromyogramme sous anesthésie et une biopsie de l'oreille pour génotypage. Le projet cherche à savoir si cette molécule déjà commercialisée pourrait ralentir une forme de sclérose latérale amyotrophique liée au gène FUS, maladie sans traitement. Le porteur pose ce repositionnement comme une hypothèse et affirme que seul un modèle souris reproduit la complexité comportementale et nerveuse recherchée.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est la forme principale de maladie du motoneurone adulte (neurones localisés dans la moelle épinière et impliqués dans la transmission du signal moteur). La maladie du motoneurone principale chez l’enfant est l’amyotrophie spinale. Il existe des points communs au niveau génétique et fonctionnel entre ces deux maladies. Ces deux maladies entrainent une mort inévitable des patients et aucun traitement n’est actuellement disponible pour la SLA liée à la mutation du gène FUS. Des travaux récents ici d'une collaboration ont identifié une nouvelle molécule, la flunarizine, comme une molécule ayant un effet protecteur dans le contexte de l’amyotrophie spinale. La SLA et l’amyotrophie spinale partageant un certain nombre de points communs, y compris dans les mécanismes impliqués dans le développement de la maladie, il est raisonnable de faire l’hypothèse que la flunarizine puisse aussi exercer une action protectrice dans la SLA-FUS. C’est ce que nous voulons tester dans ce projet. La flunarizine possède une autorisation de mise sur le marché et est utilisée essentiellement pour des traitements de courte durée mais peut entrainer à forte dose des effets néfastes. Nos objectifs sont donc : (i) de déterminer la dose de flunarizine ayant un effet bénéfique (expression de gènes cibles) mais sans effet secondaire chez des souris sauvages (ii) de caractériser l’effet de la flunarizine sur les défauts moteurs établis dans un modèle murin de SLA-FUS.

Bénéfices attendus

La SLA FUS est une maladie fatale, sans traitement à l’heure actuelle. La flunarizine est une molécule disposant d’une autorisation de mise sur le marché qui a fait ses preuves dans un modèle murin modélisant une maladie ayant des similitudes avec la SLA. Notre projet pourrait amener les arguments expérimentaux pour repositionner la flunarizine pour le traitement de la SLA-FUS.

Procédures

Les animaux recevront un traitement (administration par gavage sur animal vigil afin de limiter les risques de fausse route) durant 14 jours, à raison de 1 fois par jour. La durée du gavage est d’environ 20 secondes. Nous réaliserons un suivi mensuel des capacités motrices (force musculaire). Ce test se passe en 3 session de 3 minutes maximum chacune, entrecoupées de phases de repos de 5 minutes. Les animaux seront toujours remis en groupe. Nous réaliserons un test d’anxiété 2 fois au cours de la vie de l’animal (avant le début du traitement et un mois après). Ce test se déroule sur une session unique de 5 minutes. L’examen du fonctionnement des muscles (EMG) durera environ 20 minutes et sera réalisée en fin de procédure, sur les souris anesthésiées afin d’éviter toute souffrance. Nous réaliserons un prélèvement d’un petit bout d’oreille (1mm de diamètre) lorsque les souris auront entre 7 et 10 jours ce qui entrainera une douleur légère et de courte durée.

Impact sur les animaux

Nous pourrions observer chez les souris traitées des fausses routes liées à l’administration du traitement, raison pour laquelle nous avons développé une grille spécifique de scorage afin de suivre chacune des souris dès le début du traitement. La molécule utilisée peut entrainer des problèmes musculaires lorsqu’elle est administrée à forte dose. Nous avons développé une seconde grille d’évaluation afin de nous assurer que les doses choisies ne sont pas néfastes. Nous pourrions également observer un stress causé par la passation du test moteur et du test d’anxiété. Un temps de repos sera systématiquement appliqué pour le test moteur qui nécessitent plusieurs passages successifs. Si nous remarquons que les souris sont fatiguées, nous espacerons les différentes sessions. La procédure d’électro myo gramme qui permet d’observer la présence ou non d'atteinte des muscles sera réalisée sous anesthésie, les souris ne ressentiront donc aucune douleur. Le prélèvement d’un morceau d’oreille pour définir le génotype de nos souris entrainera une douleur légère et brève.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour réaliser les prélèvements et analyses.

Remplacement

Ce projet a pour but de déterminer s’il est possible d’utiliser la flunarizine pour contre carrer, ou du moins ralentir, le développement des troubles moteurs observés dans la SLA. Pour étudier cela, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit à la fois la complexité comportementale (avec l’apparition possible des troubles de l’anxiété et des troubles moteurs) mais aussi une complexité structurelle du système nerveux, notamment avec les différents intervenants cellulaires retrouvés dans le système nerveux central chez l’Homme. La souris nous offre la possibilité de travailler avec ces deux niveaux de complexité.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires à la bonne réalisation de ce projet a été calculé, d’après nos travaux préliminaires, de manière à obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Par ailleurs, pour limiter le nombre total d’animaux générés, nous proposons ici de réaliser les analyses histologiques et moléculaires sur les mêmes animaux que ceux chez qui auront réalisé le suivi longitudinal. Pour limiter le nombre total d’animaux générés et améliorer nos connaissances de la maladie, nous proposons d’utiliser les mâles et les femelles. Par ailleurs, nous avons décidé de réaliser une première étude pour 1. vérifier que la flunarizine soit utilisable dans nos conditions d’expérimentations, 2. déterminer la dose de flunarizine que nous utiliserons ensuite et 3. diminuer le nombre de souris impliquées dans l’étude longitudinale (nous n’étudierons plus qu’une dose de flunarizine au lieu de trois si nous ne faisions pas cette première étude).

Raffinement

L’enrichissement de l’environnement des animaux (bâtonnets à ronger, coton compressé pour faire des nids, maisons de carton blanc), le maintien des interactions sociales (les souris sont gardées à plusieurs par cage tout au long de leur vie) et la surveillance quotidienne des animaux permettront d’assurer de leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Nous avons établi des points-limites clairs afin de pouvoir soustraire l’animal à la souffrance si nécessaire. Nous pourrons ainsi facilement déceler un éventuel comportement anormal. Toutes les approches expérimentales que nous souhaitons utiliser dans ce projet sont couramment réalisées dans notre laboratoire, ce qui limite fortement les risques de perte de tissus pour des raisons purement techniques. Par ailleurs, la procédure d’étude du muscle sera réalisée sous anesthésie gazeuse afin de réduire toute souffrance de l’animal et de réduire le stress lié à la manipulation.

Choix des espèces

Les modèles de souris transgéniques sont les plus appropriés à notre étude car ils présentent le niveau de complexité structurelle du cerveau et de la moelle épinière adéquat, une séquence de notre gène d’intérêt (Fus) bien concernée d’un point de vue phylogénétique et des capacités cognitives et motrices qui nous permettent d’évaluer des troubles retrouvés chez les patients. Les études seront réalisées sur des souris adultes (4 mois) car les patients souffrant de SLA liée à FUS présentent très rarement des formes juvéniles.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour accepter des cellules humaines, elles reçoivent une chimiothérapie puis une greffe de cellules souches sanguines humaines corrigées, avec des prélèvements sanguins mensuels, avant d'être tuées pour analyser leur moelle osseuse et leur rate. Le porteur indique que la modification génétique affaiblit leur système immunitaire et que la greffe et les prélèvements sont sources de stress. Il affirme que la capacité de greffe et la reconstitution du système sanguin ne peuvent être reproduites en laboratoire, rendant selon lui l'usage d'un modèle murin "requis".

Objectifs

La drépanocytose, maladie génétique du sang la plus répandue, altère la structure des globules rouges, posant un problème de santé mondial avec près de 300 000 nouveaux cas diagnostiqués annuellement. Une mutation génétique affectant la production d'hémoglobine, composant essentiel des globules rouges, provoque leur déformation, entraînant coagulation, obstruction vasculaire et dommages multi-organiques, réduisant sévèrement l'espérance de vie. Les traitements actuels, tels que les transfusions sanguines ou les greffes de cellules souches hématopoïétiques, ne sont accessibles que pour une fraction des patients et présentent des résultats insatisfaisants, se concentrant sur la gestion des symptômes. Ce projet permettrait d'apporter aux patients un traitement curatif afin de supprimer leurs symptômes tout en réduisant le coût de la prise en charge de leur maladie. En effet, grâce à une greffe unique de cellules souches hématopoïétiques modifiées, prélevées directement chez la personne atteinte de la maladie pour éviter les risques de rejet associés aux greffes issues de donneurs, les globules rouges seront, in fine, capables de remplir leur fonction de véhiculer l’oxygène vers tous les organes, le tout sans risque de rejet. Notre laboratoire travaille sur une nouvelle approche thérapeutique axée sur la récupération et la correction des cellules affectées chez les patients souffrant de drépanocytose. Cette méthode vise à corriger de manière permanente le défaut génétique dans les cellules souches sanguines afin d'obtenir une hémoglobine fonctionnelle. Ces dernières se trouvent dans la moelle osseuse et sont capables de générer toutes les cellules nécessaires aux fonctions sanguines. En utilisant une technique basée sur des outils et des ciseaux moléculaires, nous avons réussi à corriger l’erreur génétique responsable de la drépanocytose. Notre stratégie a été développée, en laboratoire, sur des cellules souches hématopoïétiques humaines. Ce projet a donc pour but d’évaluer les caractéristiques fonctionnelles des cellules modifiées après transplantation. Ainsi, une fois les cellules souches hématopoïétiques corrigées par notre traitement, il sera nécessaire de vérifier leur capacité à se greffer dans la moelle osseuse dans un organisme entier et à re-fabriquer ensuite différents types de cellules. Pour ces raisons, le recours à un modèle murin permettant la greffe de cellules souches humaines est désormais nécessaire pour valider ces protocoles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les effets bénéfiques du traitement chez la souris devraient permettre aux cellules humaines de retrouver une hémoglobine fonctionnelle, tout en s’assurant que notre traitement permet une greffe stable et efficace au cours du temps. Le projet s’effectuant directement sur des cellules humaines (et non murines), l’efficacité de notre traitement reflètera directement l’applicabilité aux patients. Seules la dose de chimiothérapie et le nombre total de cellules à transplanter seront à adapter. Ce projet permettrait d'apporter aux patients drépanocytaires un traitement curatif permettant de supprimer définitivement leurs symptômes tout en réduisant significativement le coût total de la prise en charge de leur maladie tout au long de leur vie. En effet, grâce à une autogreffe de cellules souches hématopoïétiques modifiées (permettant d’éviter les rejets observés lors des greffes issues de donneurs), leurs globules rouges seront, in fine, capables de remplir leur fonction de véhiculer l’oxygène vers tous les organes, le tout sans risque de rejet.

Procédures

Les souris recevront une injection de traitement chimiothérapeutique pour les préparer à recevoir des cellules souches sanguines humaines. Après la transplantation de ces cellules, un prélèvement sanguin sera réalisé chaque mois pour surveiller la réussite de la greffe. Enfin, une injection d'un médicament favorisant la production de globules rouges sera administrée.

Impact sur les animaux

Les animaux possèdent une modification génétique, afin de faciliter la transplantation de cellules souches humaines, ce qui affaiblit leur système immunitaire. Pour prévenir les infections, les souris seront logées dans des cages dotées d'une ventilation, contribuant ainsi à réduire la présence de pathogènes dans leur environnement. Pendant ces procédures, deux actes peuvent causer du stress: l'injection de cellules modifiées et le prélèvement de sang.

Devenir

Les animaux seront mis à mort. En effet, il sera nécessaire de récolter notamment les informations suivantes dans les organes suivants : - Le sang des souris sera récupéré, afin d’analyser la quantité et la qualité de ces globules rouges humains. - La moelle osseuse et la rate seront récupérées. Ces organes, cruciaux pour le fonctionnement du système sanguin, seront analysés afin d'évaluer la prise de greffe et leur capacité à produire toutes les cellules présentes dans le système sanguin.

Remplacement

Le projet consiste à évaluer notre stratégie thérapeutique sur un organisme entier car il n’est pas réalisable de reproduire en laboratoire, la complexité d’un organe comme la moelle osseuse, ainsi que la complexité du système sanguin, notamment en termes de prolifération et de différenciation en différents types de cellules sanguines.

Réduction

Dans le but de limiter l'utilisation d'animaux dans ce projet, nous avons évalué diverses stratégies visant à corriger ce défaut génétique sur des cellules souches sanguines humaines en laboratoire. Les quatre meilleures stratégies ont été retenues pour leur efficacité et seront testées sur modèle animal. Afin de minimiser le nombre de souris utilisées, nous avons estimé le nombre minimal d'animaux permettant de tester et de conclure sur l'efficacité de nos stratégies. Cette démarche s'appuie sur les taux de réussite de la prise de greffe issus d'une référence établie. Notre objectif est d'atteindre une prise de greffe similaire à ce modèle mentionné. Afin de viser ces résultats, les calculs statistiques conduisent à estimer que 8 souris par groupe sont nécessaires. Ainsi, notre plan prévoit l'utilisation de 8 souris par groupe, totalisant 400 souris sur 5 ans, tout en visant des résultats scientifiquement robustes.

Raffinement

Les souris, présentant un système immunitaire affaibli, seront placées dans un environnement exempt de pathogènes. Après le traitement chimiothérapeutique et la greffe des cellules, l'état général des souris (apparence, posture, comportement...) ainsi que leur poids seront surveillés tous les deux jours pendant 20 jours. Les procédures expérimentales potentiellement inconfortables (greffe des cellules corrigées et prélèvement sanguin pour suivre la prise de greffe) seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de minimiser le stress et l'inconfort des animaux. En cas d’inconfort trop important, les procédures seront interrompues.

Choix des espèces

Pour évaluer l’efficacité de nos stratégies, nous sommes obligés de réaliser des études sur l’animal, car la capacité de greffe ainsi que la reconstitution et la différenciation complète du système sanguin en différentes cellules sanguines ne peuvent pas être reproduites par des modèles cellulaires en laboratoire. De plus, seule l’utilisation d’animaux peut nous permettre d’observer les éventuels effets secondaires sur le long terme de notre traitement au niveau de l’ensemble des organes. Pour ce faire, l’utilisation d’un modèle murin permettant la greffe de cellules humaines est requis. Les animaux seront greffés à l’âge adulte, de plus de 8 semaines. L'âge des animaux receveurs pour obtenir et conclure sur une efficacité optimale de la greffe des cellules souches sanguines dans la moelle osseuse se situe à 16 semaines.

90 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ablation des ovaires pour reproduire la ménopause et la pose d'une pompe délivrant une substance provoquant une hypertension, avec un suivi par échographie et IRM, pour étudier l'insuffisance cardiaque de la femme âgée. Le porteur estime que moins de 10 % des souris risquent une souffrance en fin de protocole, avec perte de poids rapide ou congestion pulmonaire liée à l'insuffisance cardiaque. Il décrit des études in vitro prévues en parallèle mais affirme le recours aux animaux "nécessaire" faute de modèle in vitro d'insuffisance cardiaque.

Objectifs

L'objectif est d'analyser les mécanismes qui contribuent au dysfonctionnement cardiaque développant chez des femmes âgées. Nous allons évaluer le rôle de l'inflammation et du réseau lymphatique dans le développement de la dysfonction cardiaque dites 'diastolique', caractérisé par une rigidification des parois cardiaques induit par le vieillissement et l'hypertension artérielle et la ménopause, modélisé par ovariectomie chez la souris. Des traitements anti-inflammatoires, ciblant des cytokines proinflammatoires, seront administrés afin d'atténuer la dysfonction cardiaque. Nous espérons identifier des nouveaux traitements permettant de prévenir ou traiter l'insuffisance cardiaque, notamment chez des femmes âgées.

Bénéfices attendus

Nous espérons identifier les mécanismes immunitaires altérés dans le vieillissement, accentué par l'hypertension et la ménopause chez la femelle. Dans un deuxième temps, notre étude permettra d'identifier des nouvelles traitement antiinflammatoires (bloquant des cytokines proinflammatoires) qui permet de limiter la dysfonction cardiaque et ainsi améliorer la qualité de vie des patients atteints d'insuffisance cardiaque. Ce protocole expérimental permettra, nous l'espérons, de guider des essais cliniques chez des sous-groupes de patients avec insuffisance cardiaque avec des traitement immunomodulateurs ciblant des cytokines.

Procédures

Des procédures chirurgicales minimalement invasif (ovariectomie, implantation d'un mini pompe osmotique en sous-cutanée). Chaque intervention chirurgicale à une durée de moins de 10 minutes par animale. Les prélèvements sanguins seront réalisés sur des animaux anesthésiés. Les interventions d'imagerie (echocardiographie ou IRM) à une durée de 10-20 minutes par animale. Tandis que l'echocardiographie sera réalisé 3 fois pendant l'etude (a 3, 6 et 8 semaines apres l'inclusion), l'IRM n'est realisé qu'un seul fois en fin d'etude.

Impact sur les animaux

Vers la fin du protocole, les animaux seront à risque de souffrance legere-moderé (potentiellement atteints des points limites) associé au développement aigue de l'insuffisance cardiaque, tel que perte de poids rapide ou congestion pulmonaire. Nous estimons que ce risque concerne moins que 10% des animaux, et que notre suivi individuel des animaux nous permettra d’identifier ces individus bien en amont de souffrance importante. Nous espérons que les traitements avec des anticorps ciblant des cytokines proinflammatoires permettra de limiter la dysfonction cardiaque et de prévenir le développement de l'insuffisance cardiaque, améliorant l'état de santé des animaux insuffisant cardiaques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude afin d'étudier les organes (cœur, poumon, rein) par des analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Dans l’objectif de remplacer l’expérimentation animale, nous mettrons en place des études in vitro (prolifération de cellules, interactions cellules-cellules). Cependant l’utilisation des animaux est rendue nécessaire car il n’existe pas, à ce jour de modèles d'insuffisance cardiaque in vitro.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude nous réaliserons séquentiellement des mesures non-invasives de la fonction cardiaque (échographie, IRM) puis des mesures invasives (hémodynamique). Nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex vivo au moment de la mise à mort. De plus, nous avons réalisé des tests statistiques appropriés pour calculer le nombre de souris nécessaire afin de détecter une différence de 15%. Nos expériences préalables dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=15 sont nécessaires pour des évaluations fonctionnelles tel que l’échocardiographie. Un bon suivi post-opératoire permet également de limiter le nombre d'animaux par groupe. Nous nous appuierons sur nos données historiques dès que cela sera possible pour tendre, là encore, à limiter le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Pour raffiner, nous allons dans ce projet utiliser des souris femelles ovariectomisés, afin de modéliser la ménopause. Ceci diminuera les variations dans les réponses immunitaires chez des sujets âgés, et permettra une meilleure comparaison entre nos groupes expérimentales. L’ajout d’angiotensine II couplé à 1% NaCl dans l’eau de boisson permet de déclencher l’hypertension artérielle chronique de facon homogène. Les animaux seront manipulés régulièrement par les mêmes expérimentateurs pour tendre à une habituation, et nous appliqueront une grille d’évaluation du bien-être animal séparément pour chaque individu. Tout au long de l’étude, les animaux seront nourris ad libitum et hébergé dans des portoirs ventilés au nombre maximum de 5 animaux par cages avec de l’enrichissement. Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des souris sera maintenue avant tout début de protocole. Une couverture analgésique sera proposée avant, pendant et après l’induction avec une évaluation quotidienne la première semaine post-chirurgicale de la douleur basée sur la 'grimace scale de Langford'. Couplé à un suivi de poids, cela permettra de statuer sur l’atteinte d’un point limite en période post-opératoire.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par l’expérience du laboratoire avec des modèles de cardiomyopathies chez la souris. La souris a également l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des outils biologiques, comme certains anticorps monoclonaux qui ne sont parfois pas accessibles pour le rat. De plus, dans notre laboratoire, nous avons depuis de nombreuses années une excellente expérience des évaluations fonctionnelles et structurelles cardiaques in vivo ainsi que ex vivo chez la souris. Nous allons utiliser des souris jeunes adultes (3 mois) mais principalement des souris âgés (18 mois) afin d’étudier les effets de vieillissement sur le cœur. L’ovariectomie (ovx) est rendue nécessaire car des souris âgées n’entrent pas la ménopause. De même façon, les souris âgés ne sont pas spontanément hypertensives, nécessitant une implantation d’un mini pompe délivrant de l’angiotensine II couplé a 1% NaCl dans l'eau de boisson. Nos comparaisons seront : 1) souris jeunes versus souris ‘contrôles’ vielles ovx mais sans hypertension afin d’identifier les différences liés au vieillissement ; 2) souris contrôles vielles versus souris avec insuffisance cardiaque fraction d’éjection préservé (ICFEp) (induit par vieillissement et ovx accompagné d’hypertension) afin d’identifier les effets délétères sur la fonction cardiaque ; et 3) souris ICFEp traités avec des anticorps contrôles versus des anticorps anti-IL1beta et/ou anti-IL6.

208 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des tests de tolérance au glucose avec prélèvements sanguins répétés, des tests d'effort où des chocs électriques sont appliqués, des injections de vecteurs viraux dans le sinus de l'œil sous anesthésie et un tatouage, pour étudier le rôle d'une enzyme sur la masse musculaire et l'obésité. Le porteur indique qu'un régime gras peut créer une obésité et une résistance à l'insuline sources d'inconfort, et qu'une souris est retirée du test d'effort au-delà de vingt chocs électriques. Il décrit des essais préalables sur cellules musculaires mais juge l'animal entier "indispensable" pour relier les taux de lipides à la fonction musculaire.

Objectifs

Les sphingolipides constituent une vaste famille de lipides complexes impliqués dans de nombreux mécanismes physiopathologiques. Les céramides, à la base de leur métabolisme, sont connus pour influencer la sensibilité à l’insuline dans plusieurs tissus, y compris le muscle squelettique. Plus récemment, plusieurs travaux ont démontré que l’inhibition de la synthèse de novo des céramides chez la souris permet de prévenir le déclin de la masse musculaire et de la performance physique dans plusieurs contextes pathologiques et notamment au cours du vieillissement. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’effet de la réduction des concentrations intramusculaires de ces espèces de céramides sur la masse musculaire, la performance physique et l’homéostasie glucidique et ce, chez des animaux adultes jeunes, mais également au cours du vieillissement et dans le contexte de l’obésité et de la thermoneutralité, qui sont des contextes favorisant le développement de la résistance à l’insuline.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait nous apporter de nouvelles connaissances théoriques sur la physiologie des muscles squelettiques et plus précisément sur l'importance de certains lipides sur la dégradation de certaines fonctions musculaires notamment lors de l'obésité et/ou du vieillissement.

Procédures

A l'issue de leur réception, après 15 jours d'acclimatation et durant ce projet, les animaux seront soumis à trois tests permettant d'évaluer leur métabolisme glucidique. Ceux-ci durent moins de 3 heures et nécessitent le prélèvement de 3 à 5 µL de sang via la veine caudale à 9 reprises durant un test. Une mesure de la composition corporelle, entraînant un isolement et une contention dans un tube en plexiglas, causera un inconfort à l'animal qui n'excèdera pas 2 minutes. Cette manipulation sera répétée une fois en fin de protocole pour les jeunes mâles et de manière mensuelle pour les mâles âgés. Les tests d'exploration des capacités musculaires, d'une durée maximale de 5 minutes, vont générer soit de l'inconfort soit du stress. Ce dernier sera diminué par la présence de personnel formé et attentif, par l'entraînement des animaux et par la diminution de l’intensité des chocs électriques, lors du test d'endurance, à la valeur seuil minimale de détection. Les animaux recevront des vecteurs viraux par voie rétro-orbitaire, ceci sera réalisé une seule fois sur animaux anesthésiés ce qui diminuera grandement la douleur, d'autant qu'un collyre anesthésiant sera appliqué en per opératoire. Cette partie des procédures expérimentales n'excède pas 10 minutes entre l'endormissement et le réveil de l'animal. De même, l'identification par tatouage sera faîte sur animaux anesthésiés et une fois en début de protocole, acte rapide (15 secondes environ) et peu invasif.

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables pourraient être observés. Un stress lié à l'isolement, même s'il est de courte durée, pourrait être constaté lors des expériences de mesure de la composition corporelle, de la force musculaire ou lors du test d'endurance. Un stress lié à la contention et aux injections par voie intrapéritonéale pourrait survenir lors des tests in vivo de tolérance au glucose et de sensibilité à l'insuline. Un inconfort pourrait être constaté au réveil des animaux anesthésiés pour l'injection des vecteurs viraux via le sinus rétro-orbitaire ou pour leur identification par tatouage. La mise en régime enrichi en lipides en créant une obésité associée éventuellement à une insulino-résistance voire à un diabète pourrait engendrer un grand inconfort à l'animal.

Devenir

A l'issue des procédures, tous les animaux seront nécropsiés, des tissus et organes collectés pour des analyses histologiques, d'expressions génique et/ou protéique.

Remplacement

Des expériences préliminaires sur des cultures cellulaires issues de muscles squelettiques ont déjà été réalisées et ont montré l'importance de l'intérêt porté aux lipides intramusculaires. Cependant, pour faire le lien entre les quantités de certaines espèces lipidiques, ici les céramides, et la masse musculaire, les perfomances physiques ainsi que l'homéostasie glucide, l'animal en tant que modèle intégré est indispensable.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en oeuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en oeuvre seront des tests non paramétriques utilisés soit pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, ou pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, et encore pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche du centre.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans le Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés dans les cages, quantité qui sera augmentée au moment de l'administration des vecteurs viraux. Après l'identification par tatouage, si une inflammation locale ou systémique (encore plus rare que la précédente) survenait, les souris seraient traitées par un mélange antibiotique/anti-inflammatoire. Si cette médication ne suffisait pas elles seraient alors mises à mort. Un suivi quotidien sera réalisé soit par le personnel de la zootechnie soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permettra une habituation à l'Homme ce qui devrait diminuer le stress des animaux et indirectement la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées; elle permettra également de vérifier l'absence de perte de poids qui, si elle excède 20% du poids corporel, entraînerait une mise à mort de l'animal concerné. Le réveil de l'animal, après anesthésie par un mélange isoflurane-oxygène, pour l'injection des vecteurs viraux, se fera dans une cage posée sur un tapis chauffant; du collyre sera appliqué sur l'oeil de l'animal qui aura été injecté. Enfin, la mesure du test d'exercice en endurance ne sera réalisée qu'une fois en toute fin des procédures, donc avec des animaux habitués à la manipulation et après deux tests à blanc de courte durée. Malgré toutes ces précautions, un animal sera sorti du protocole si le nombre de chocs devient supérieur à 20.

Choix des espèces

L'espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d'Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux adultes jeunes (3 mois lors de leur arrivée dans le service de zootechnie et 7-8 mois en fin de protocole) ou âgés (15 mois lors de leur arrivée dans le service de zootechnie et 21-22 mois en fin de protocole) seront utilisés. En effet, nous souhaitons analyser divers paramètres et facteurs (cf description du projet et procédures) sur des animaux jeunes contrôles et les comparer soit à des animaux rendus obèses par un régime nutrionnel approprié ou par modification de leur température d'hébergement ou âgés, pour lesquels une obésité associée à une insulino-résistance peut s'installer et se développer.