Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Étude du rôle des neutrophiles dans l’accident vasculaire cérébral ischémique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie sous anesthésie pour provoquer un accident vasculaire cérébral par occlusion d'une artère cérébrale, reçoit des injections puis est tuée pour prélever son sang et ses tissus, afin d'étudier le rôle des cellules sanguines dans le défaut de recirculation. Le porteur indique que le modèle induit une douleur et une perte sensorimotrice, avec perte de poids et déshydratation possibles. Il justifie le recours aux souris par la durée de vie très courte des cellules sanguines et affirme que le projet ne peut s'envisager que dans un "organisme entier".
Objectifs
Chaque année, les accidents vasculaires cérébraux touchent plus de 13,7 millions de personnes, ce qui représente la deuxième cause de décès et la première cause d'invalidité dans le monde. Ceux-ci sont dans 80% des cas liés à l’occlusion d’une artère cérébrale par un caillot sanguin. La recirculation sanguine peut être réalisée par le retrait du caillot lors d’une intervention chirurgicale ou par sa dégradation grâce à l’injection intraveineuse d’un traitement médicamenteux. Cependant, même après la dégradation du caillot par ce traitement, la circulation sanguine reste insuffisante chez plus de 50 % des patients ce qui est à l’origine d’une évolution défavorable voire de leur décès. De nombreuses études cliniques et précliniques semblent indiquer que la principale cause de l'absence de flux sanguin est l’obstruction des capillaires par des cellules sanguines. L’objectif de la présente étude est de déterminer les mécanismes par lesquels les cellules sanguines bloquent les capillaires cérébraux. Notre hypothèse est que leur propriété de déformation et d’élasticité est diminuée après un accident vasculaire cérébral. Il a été récemment démontré qu’une enzyme modifie la forme des cellules sanguines et que l’inhibition de celle-ci améliore la circulation de ces cellules. L’inhibiteur n’a pas été testé dans un contexte d’accident vasculaire cérébral, mais pourrait être un outil intéressant pour réduire l’obstruction des vaisseaux cérébraux. Pour étudier cela, nous souhaitons réaliser des mesures d’élasticité des cellules sanguines de souris ayant subi un accident vasculaire cérébral traitées ou non par l’inhibiteur, afin de comprendre les mécanismes responsables de l’obstruction des capillaires. Cette étude pourrait permettrait d’améliorer la recirculation sanguine chez les patients victimes d’un accident vasculaire cérébral. La demande de ce projet d’expérimentation animale est justifiée par le fait que le modèle d’accident vasculaire cérébral chez la souris ne peut pas être remplacé par une approche in vitro.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer si l’obstruction des capillaires cérébraux par les cellules sanguines à la suite d’un accident vasculaire cérébral est due à une modification de leur élasticité ; à terme cela pourrait permettre d’identifier des cibles thérapeutiques afin de rétablir cette élasticité et d’augmenter la recirculation sanguine après un accident vasculaire cérébral et ainsi d’améliorer le pronostic des patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs types d’interventions : Les quatre traitements analgésiques seront réalisés par injection en sous cutanée. Chaque injection sera réalisée sur les souris vigiles et aura une durée d’environ 30 secondes. Une chirurgie sera réalisée sous anesthésie générales (avec une analgésie préalable) avec une durée d’anesthésie / chirurgie d’environ 45 minutes. Deux traitements par voie intraveineuse seront réalisés 30 minutes après le début de l’ischémie sur souris anesthésiées et seront d’environ 1 minute pour l’injection de l’inhibiteur ou de son solvant et de 30 minutes pour l’injection de l'activateur tissulaire recombinant du plasminogène; en effet, dans ce cas, 10% de la dose sont injectés en environ une minute, le reste (90%) est injecté pendant les 29 minutes suivantes à l’aide d’un pousse seringue. Une anesthésie générale profonde, avec aussi une analgésie préalable, d’environ 10 minutes sera réalisée lors de la fin de l’étude pour le prélèvement sanguin. Deux injections de solution physiologique pour la réhydratation post opératoire seront réalisées sur souris vigile en sous cutanée. Chaque injection sera d’une durée d’environ 30 secondes.
Impact sur les animaux
Le modèle d’accident vasculaire cérébrale induit une douleur peropératoire et une perte sensorimotrice. Une perte de poids et une déshydratation peuvent également être attendues. Un stress lié à l’anesthésie et des douleurs associées aux injections peuvent être présents lors des manipulations.
Devenir
La mise à mort est nécessaire pour récupérer le sang et des tissus
Remplacement
Le projet a pour but d’étudier le rôle des cellules sanguines dans la mauvaise recirculation sanguine survenant après un accident vasculaire cérébral. Les cellules sanguines ont une durée de vie très courtes (quelques heures) et il est nécessaire d’utiliser des cellules fraichement isolées de souris pour étudier leur comportement et maintenir leurs propriétés afin de mieux comprendre leur implication dans les vaisseaux sanguins après l’accident vasculaire cérébral. Ce projet ne peut s'envisager que dans un organisme entier.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés. De plus, le nombre de cellules sanguines isolées à partir d’une souris est élevé, ce qui permet de réduire le nombre de souris nécessaires.
Raffinement
Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement analgésique en pré- et post-opératoire. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée sur la zone de chirurgie. La chirurgie est par ailleurs réalisée au cours d’une anesthésie générale. En post-chirurgie une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil. Après leur réveil, quelques croquettes pulvérisées au pilon humidifiées seront placée dans la cage, pour faciliter l’alimentation. De l’eau sous forme d’hydrogel sera également proposée. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge selon le score. En cas de réouverture de la plaie chirurgicale lors du suivi post opératoire, elle sera nettoyée et un point de suture sera réalisé sous anesthésie générale ; pour permettre à l’animal de récupérer dans un environnement calme, il sera isolé dans une autre cage pendant le reste de l’expérience (inférieur à 24h). Les souris seront gardées 24 heures après l’accident vasculaire cérébral et le prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie profonde et traitement analgésique.
Choix des espèces
Des études précédentes ont montré la pertinence de la souris pour étudier les maladies cardiovasculaires. Le modèle d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne réalisé chez la souris est lui-même reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’accident vasculaire cérébral, et permettre de mieux comprendre le phénomène chez l’humain. L’ischémie cérébrale étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte, le modèle sera réalisé sur des souris adultes d’au moins 2 mois.
Implication de l’hypothalamus dans l’altération de l’homéostasie glucidique induite par l’action centrale des triglycérides inter-estérifiés.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
820 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 720 d'entre elles. Elles reçoivent des injections d'huile de palme inter-estérifiée dans la carotide, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec prélèvements sanguins répétés, et pour certaines des chirurgies dans le cerveau suivies de perfusions et d'un isolement de un à deux mois. Le porteur indique que ces chirurgies peuvent entraîner perte de poids, prostration ou agressivité, et vise à préciser les conditions de sécurité alimentaire de ces graisses utilisées par l'industrie agroalimentaire. Il décrit des études sur cultures cellulaires menées en parallèle mais juge l'usage de la souris "encore nécessaire" faute de pouvoir reproduire in vitro les échanges entre organes.
Objectifs
La consommation d’aliments ultra-transformés riches en huile végétale hydrogénée est néfaste pour la santé des individus puisqu’elle contribue à l’obésité et au diabète de type 2 (DT2). Afin de remplacer les huiles végétales hydrogénées, l’industrie agroalimentaire commence à utiliser l’inter-estérification des graisses végétales. Des études récentes suggèrent que la consommation de ces graisses inter-estérifiés peuvent altérer l’homéostasie glucidique et donc favoriser le DT2. Il est donc important de comprendre les effets moléculaires de ces graisses inter-estérifiées sur la régulation de l'homéostasie glucidique. Des résultats préliminaires suggèrent que la consommation d’un régime contenant des graisses inter-estérifiées conduit à l’accumulation dans le foie, le tissu adipeux et l’hypothalamus de dérivés lipidiques comme les céramides. les céramides sont connus pour induire une résistance à l’insuline qui favorise l'installation d'un DT2. L'objectif de ce projet sera de déterminer l’implication du métabolisme des céramides dans la dérégulation de l’homéostasie glucidique induite par la consommation de graisses inter-estérifiées. Pour cela, la synthèse des céramides sera inhibée chez des souris (pharmacologiquement ou génétiquement) qui seront soumises à un régime contenant de l’huile de palme inter-estérifiées. Les taux de céramides seront analysés par une approche lipidomique. La régulation de l'homéostasie glucidique sera étudiée chez ces souris soumises à un régime contenant de l’huile de palme inter-estérifiées. Une analyse transcriptomique des tissus sera réalisée afin d’identifier les gènes dérégulés par les graisses inter-estérifiées. Cette analyses permettra également de caractériser les cibles moléculaires des céramides dans la dérégulation de l'homéostasie glucidique induite par les graisses inter-estérifiées. Ce projet devrait permettre de mieux comprendre l'implication des graisses inter-estérifiées dans le développement du DT2 et ainsi d’affiner les conditions de sécurité alimentaire nécessaire à leur utilisation par l’industrie agro-alimentaire.
Bénéfices attendus
Ce projet identifiera l’implication des graisses inter-estérifiées dans le développement du diabète de type 2 et permettra d’affiner les conditions de sécurité alimentaire nécessaire à leur utilisation par l’industrie agro-alimentaire.
Procédures
Les souris de la procédure 1 recevront des injections aigues intra-carotidienne d’huile de palme inter-estérifié pendant 30sec. Les souris de la procédure 2 recevront des injections aigues intra-carotidienne d’huile de palme inter-estérifié pendant 30sec. La moitié des souris de la procédure 2 subiront un test de tolérance au glucose (IP-GTT) (120min/souris) à la fin de l’expérimentation, avant le sacrifice. Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d'une goutte de sang afin de mesurer la glycémie et aux temps 0, 15, 30 et 120 min : prélèvements à la queue de sang afin de mesurer l'insulinémie. L’autre moitié des souris de la procédure 2 subiront un test de tolérance à l’insuline (ITT) (120min/souris) à la fin de l’expérimentation, avant le sacrifice. Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d'une goutte de sang afin de mesurer la glycémie. Les souris de la procédure 3 subiront des chirurgies d'injections stéréotaxiques intracérébroventriculaires (30min/souris) afin d'injecter des adénovirus dans le troisième ventricule. Pour les souris de la procédure 3, il s'en suivra, 28 jours plus tard d'une deuxième chirurgie pour poser un système de pompe et de canule pour réaliser des perfusions intracérébroventriculaires pendant 28 jours d'émulsions contenant les lipides inter-estérifiés d’intérêt. Les souris de la procédure 4 subiront des chirurgies d'injections stéréotaxiques intracérébroventriculaires (30min/souris) afin d'injecter des adénovirus dans le troisième ventricule. Pour les procédures 3 et 4, à la fin des expérimentations nous réalisons un test de tolérance à l’insuline (ITT) (120min/souris). Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d'une goutte de sang afin de mesurer la glycémie. 3 jours plus tard nous réalisons un test de tolérance au glucose (IP-GTT) (120min/souris) à la fin de l’expérimentation, avant le sacrifice. Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d'une goutte de sang afin de mesurer la glycémie et aux temps 0, 15, 30 et 120 min : prélèvements à la queue de sang afin de mesurer l'insulinémie. S'ajoutent aux nuisances expérimentales, l'isolement des souris des procédures 3 (28 jours pour 360 souris) et 4 (2 mois pour 360 souris).
Impact sur les animaux
Les procédures font intervenir des injections stéréotaxiques dans le troisième ventricule et des perfusions dans le ventricule latéral, chirurgies qui peuvent entrainer des effets indésirables sur les animaux tels qu'une perte de poids, des troubles alimentaires, un manque de toilettage, de la prostration, une agressivité lors de la manipulation, des douleurs ou gêne au niveau du crane.
Devenir
A l'issue de la procédure 1, les souris seront mises à mort afin d'évaluer l'incorporation des triglycérides inter-estérifiés depuis la périphérie vers le cerveau. A l'issue des procédures 2, 3 et 4, les souris seront mises à mort afin de collecter les tissus pour réaliser des RTqPCR, des immunohistochomies et des analyses lipidomiques.
Remplacement
Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôles les flux d'énergie en fonction des besoins. Il est très difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux vivants est encore nécessaire. De plus, nous allons effectuer en parallèle de nos études in vivo des études in vitro sur des cultures cellulaires pour disséquer les effets de l'huile de palme interérifiée et identifier les mécanismes moléculaires les relayant.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons commencé des études in vitro sur des cultures cellulaires pour tester les concentrations d'huile de palme que nous pourrons utiliser in vivo. Nous avons aussi réalisé une étude in vivo pour tester les concentrations d'huile de palme inter-estérifiée à utiliser pendant les expériences. Ainsi nous utiliserons le nombre minimum de souris nécessaire à générer des données interprétables. Les échantillons prélevés sur chaque animal permettront de générer un grand nombre d'informations sur des marqueurs moléculaires (métabolites, transcripts, protéines inflammatoires). De plus, grâce aux données de la littérature et aux nombreux résultats obtenus lors de projets précédents (nous travaillons depuis plus de 20 ans sur des modèles murins d'obésité), nous avons estimé la taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace. En effet les groupes de souris sont générallement très homogènes en terme de tolérance au glucose, données physiologiques ou biochimiques.
Raffinement
Les souris des procédures 3 (360 souris, pendant 28j) et 4 (360 souris, pendant 2 mois) seront exceptionnellement maintenus en cage individuelle afin de contrôler individuellement la prise alimentaire et le poids corporel de chaque individu. Ils seront maintenus dans des milieux enrichis (nid, batons de bois, cotons) ce qui améliorera leur bien-être. Pour les procédures chirurgicales que nous utiliserons, nous avons instauré une médication et un suivi post-opératoire approprié permettant de réduire les possibles douleurs à leur minimum. Nous avons également mis en place une grille d'évaluation permettant au chercheur de suivre les signes de souffrance des animaux.
Choix des espèces
Les modèles précliniques de souris obèses et insulino-résistantes partagent avec l'humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contôle de l'homéostasie glucidique et de l'adiposité. Le laboratoire travaille depuis de nombreuses années sur la souris en régime gras et a accumulé un grand nombre d'informations physiologiques et moléculaires qui seront utilisées pour interpréter les résultats obtenus. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines au début des procédures, âge à partir duquel toutes les structures cérébrales sont matures.
Compréhension des mécanismes de l’oncogenèse du foie grâce à la technique d’injection hydrodynamique dans la veine de la queue de souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de plasmides dans la veine de la queue pour déclencher des tumeurs du foie, certaines recevant aussi des molécules anticancéreuses, avec un suivi par imagerie tous les quinze jours. Le porteur affirme que la nuisance de la manipulation reste temporaire et qu'aucun signe de souffrance n'apparaît au stade précoce, tout en reconnaissant que la formation des tumeurs peut provoquer des souffrances. Il décrit des tests in vitro sur cellules et organoïdes de foie mais conclut que la validation chez la souris est "indispensable" pour confirmer l'implication des gènes candidats.
Objectifs
Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est une pathologie complexe, en raison de ses caractéristiques qui influencent son évolution et la résistance au traitement. L'identification de gènes impliqués dans le déclenchement du processus de cancérisation est difficile en raison de la présence de plusieurs altérations qui n'ont pas d'impact fonctionnel. Nous avons généré un modèle murin qui récapitule le programme du développement du CHC. L'utilisation de ce modèle à des stades précoces (avant l'apparition des tumeurs) permet de tester l'implication fonctionnelle de gènes qui coopèrent pour induire la formation de tumeurs. Nous avons conçu un programme de recherche interdisciplinaire pour identifier les gènes fonctionnellement impliqués dans l'initiation des tumeurs hépatiques et leur évolution en CHC, ainsi que leur mode de coopération. Pour cela, nous envisageons d'injecter par voie intraveineuse des plasmides, qui s'intégreront dans les hépatocytes (cellules du foie). Ce projet nous permettra de tester l’implication fonctionnelle de nouveaux gènes (seuls ou en combinaison) agissant comme régulateur du processus de cancérisation dans le foie sain. Cette stratégie nous permettra de tester directement l’implication de gènes candidats dans la formation des tumeurs dans un foie sain.
Bénéfices attendus
Ces études nous permettront d'identifier les gènes fonctionnellement impliqués dans la formation et l'évolution de tumeurs hépatiques ainsi que leur mode de coopération entre gènes. L'analyse par imagerie non-invasive permettra de suivre de manière longitudinale la formation, l'évolution et la régression des tumeurs.
Procédures
Les souris subiront 1 seule injection de plasmides dans la veine de la queue pour une durée inférieure à 5 secondes. Certaines de ces souris seront traitées avec des drogues anti-cancéreuses, administrées, selon les recommandations fournies pour chaque drogue. Après administration, la souris est placée en observation dans sa cage. La fréquence des injections dépend du type de traitement (variant de 1/jour à 1/semaine, pour une durée variant de 2 à 4 semaines). Les analyses par imagerie non-invasive seront effectuées 1x tous les 15 jours. Chaque séance d'imagerie durera environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Cette technique est couramment utilisée dans plusieurs laboratoires situés dans le monde entier. La nuisance globale de l'ensemble de la manipulation n'est que temporaire (
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées afin d'analyser les tumeurs d'un point de vue moléculaire et histologique.
Remplacement
Concernant les objectifs de ce projet, nous testerons certains gènes dans des modèles in vitro (culture d'hépatocytes immortalisés établis au laboratoire, lignées cellulaires, organoïdes de cellules de foie). Ces systèmes in vitro nous permettront de limiter nos études in vivo, en se focalisant sur les gènes candidats les plus pertinents, notamment ceux rapportés comme étant altérés chez les patients. Cette étape de validation in vivo, chez la souris, est indispensable pour valider dans un contexte physiologique l'implication des gènes candidats dans les processus de tumorigenèse et notamment dans des cas cliniques où leur altération a été décrite. En outre, l'analyse dans ce contexte in vivo est une étape obligatoire pour comprendre comment ces gènes influencent également l'environnement tumoral, notamment les cellules immunitaires.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs (p
Raffinement
L'état de santé des souris sera régulièrement surveillé en fonction de l'évolution des expériences, de la formation des tumeurs. L'évaluation sera réalisée en suivant différents critères : poids, apparence du pelage, comportement animal dans la cage qui traduirait une éventuelle souffrance ou angoisse. Des stratégies d’optimisation seront mises en place au cours du projet afin de réduire, voire de supprimer, la souffrance chez l’animal (enrichissement des cages, acclimatation des animaux aux pièces d’hébergement). La formation et l'évolution des tumeurs sera suivie de manière longitudinale par imagerie non invasive ("photon counting micro computed tomography" et/ou bioluminescence/fluorescence). En cas de souffrance de l’animal, des analgésiques seront administrés.
Choix des espèces
Nos études nécessitent l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement puisque la thématique principale de notre laboratoire est de comprendre les mécanismes impliqués dans des étapes d'initiation et d'évolution du cancer. Les modèles animaux que nous utiliserons représentent des alternatives prometteuses pour obtenir des résultats plus pertinents en ce qui concerne la compréhension du cancer chez l'Homme. En particulier, les approches uitilisées dans notre équipe, combinant des études in vitro avec des analyses in vivo réalisées chez la souris, permettent d'identifier de nouveaux gènes, leur implication dans le développement de tumeurs hépatiques, et de mettre en évidence des nouveaux mécanismes de coopération entre gènes, comme nous l'avons déjà démontré. Les souris seront utilisées au stade adulte (2-8 mois). Cet âge permet d'évaluer l'initiation et l'évolution tumorale dans des individus adultes, comme la majorité des CHC.
Rôle des tissus adipeux bruns/beiges dans le maintien de l’homéostasie redox systémique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des prélèvements de sang répétés, des chirurgies d'ablation ou de greffe de tissu adipeux, des expositions au froid à 4°C ou à 30°C et des tests de comportement, pour étudier le rôle des tissus adipeux bruns dans le vieillissement. Le porteur signale comme nuisances la douleur post-chirurgicale, le stress des températures d'hébergement et de l'isolement, et fixe une mise à mort à 20 % de perte de poids. Il décrit le recours à l'animal comme "indispensable" pour une étude à l'échelle de l'"organisme entier".
Objectifs
Avec l'augmentation de l'espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes afin qu'elles puissent être autonomes le plus longtemps possible représente un enjeu majeur de santé publique. L'objectif actuel est de promouvoir le vieillissement en bonne santé en déterminant des paramètres biologiques permettant de mesurer et de prédire son évolution. Le métabolisme énergétique est un régulateur clé de la longévité et de l’allongement de la vie en bonne santé. Les tissus adipeux (TA) jouent un rôle très important dans le maintien de l’homéostasie énergétique de l’organisme et leur dysfonctionnement pourrait contribuer à l’altération des fonctions de l’organisme au cours de l’âge. Alors que les TA blancs sont spécialisés dans le stockage et la libération de l’énergie, les TA bruns et beiges (ces derniers résultant de la transformation de certains dépôts de TA blancs en TA de type brun lors de différents stress comme l’exposition au froid) dissipent l’énergie sous forme de chaleur. Alors que leur activité est associée à la santé cardio-métabolique chez l’homme, les mécanismes par lesquels les TA bruns et beiges protègent l’organisme des désordres métaboliques associés au vieillissement restent encore mal compris. Le métabolisme redox correspond à l’ensemble des réactions de transfert d’électrons et constitue ainsi le socle du métabolisme énergétique. Plusieurs travaux ont montré que les adipocytes bruns et beiges sont activés suite à une l'altération de l'état redox cellulaire. Nous posons l’hypothèse selon laquelle les TA bruns et beiges permettraient de gérer des stress redox à l’échelle systémique et ainsi de protéger l’organisme contre les désordres métaboliques associés au vieillissement. Nous utiliserons le modèle murin chez lequel les TA bruns et beiges ont été très étudiés. Nous mesurerons la réponse des souris présentant des TA bruns et beiges activés ou inactivés à des stress redox systémiques en mesurant l’état redox plasmatique en cinétique au cours du stress. Les stress redox seront induits par des injections de métabolites ayant un impact fort sur l’équilibre redox (lactate, pyruvate et glucose). Par ailleurs, le rôle des TA bruns et beiges sur la trajectoire de vieillissement des animaux sera étudié. Le syndrome de fragilité et la perte de fonctions cognitives, indicateurs cliniques d’un vieillissement en mauvaise santé, seront étudiés à l’aide de tests comportementaux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’étudier le rôle des TA bruns/beiges dans le maintien de l’homéostasie redox systémique au cours de l’âge. Ces données permettront de mieux comprendre les processus médiés par les TA bruns/beiges qui contribuent à la perte de l’homéostasie énergétique de l’organisme au cours de l’âge et de mettre en évidence des biomarqueurs et/ou des cibles thérapeutiques d’intérêt pour restaurer l’homéostasie énergétique.
Procédures
Dans certaines procédures, des prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles, au maximum 10 prélèvements pendant une heure, juste avant la mise à mort. Dans certaines procédures, une injection sera réalisée sur souris vigiles : soit une seule injection (≤15 secondes par souris), soit une injection par jour pendant 5 jours consécutifs suivi d’une dernière injection 7 jours après. Dans certaines procédures, des procédures chirurgicales (ablation ou greffe de tissu adipeux) seront réalisées sous anesthésie générale, avec deux injections (≤15 secondes par souris) le jour de la chirurgie (analgésique avant et anti-inflammatoire après la chirurgie), puis une injection (≤15 secondes par souris) par jour pendant les deux jours suivant la chirurgie d’un anti-inflammatoire. Dans certaines procédures, les souris seront soumises à des tests comportementaux. Les tests pourront durer de quelques minutes à 45 minutes, la durée dépendra des capacités de l’animal ou sera de 5 à 8 minutes selon les tests.
Impact sur les animaux
Certaines nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : - le stress des animaux au moment de leur réception, - des problèmes liés à l’anesthésie, - une perte de poids et une douleur à court terme suite à la chirurgie (ablation de tissu adipeux et transplantation), - le stress lié à l’isolement et à l’individualisation des animaux en cas d’agressivité, - le stress lié aux températures d’hébergement de 30°C ou de 4°C - le stress lié à la contention nécessaire pour les injections dans la cavité intra-péritonéale. Les souris invalidées génétiquement ne présentent pas de phénotype dommageable dans les conditions standard ainsi que dans les conditions d’hébergement utilisées dans cette étude.
Devenir
Au terme de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer le sang et les organes d'intéret pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Notre projet consiste à étudier la régulation du métabolisme redox systémique par les tissus adipeux bruns et beiges. Bien que des modèles d’organoïdes de différents tissus soient actuellement développés, étudier les interactions métaboliques in vitro entre différents organoïdes présente encore beaucoup de limites. La réalisation de notre projet nécessite un modèle intégré permettant une étude à l’échelle de l’organisme entier, impliquant des échanges entre différents tissus ayant des spécificités bien distinctes. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche.
Réduction
Au regard de la bibliographie, compte tenu de la variabilité interindividuelle observée dans le contexte de vieillissement et de la variabilité de certaines mesures que nous effectuerons, des groupes de 10 souris par condition seront formés afin de mettre en évidence des différences statistiques. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit au minimum pour obtenir dans chaque groupe étudié un nombre d’individus suffisant pour réaliser les tests statistiques et avoir des données fiables. Mettre moins d’animaux dans chaque groupe serait prendre le risque de devoir refaire ces expériences pour pouvoir obtenir des différences significatives entre les différents groupes. Pour comparer deux groupes, des tests paramétriques ou non paramétriques en séries non-appariées seront réalisés ; pour des comparaisons multiples, des tests appropriés avec post-tests seront utilisés. Les tissus et organes prélevés seront utilisés non seulement pour les analyses métaboliques (par spectrométrie de masse et résonnance magnétique nucléaire) mais aussi pour des analyses transcriptomiques, protéomiques et biochimiques (mesures d’activités enzymatiques par exemple). Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus (lyophilisation et pulvérisation) qui nous permettront, à partir de la même poudre, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet. Par ailleurs, chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience et de partager les prélèvements le cas échéant.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront placés en zone d’acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils seront pris en charge par le personnel compétent de la zootechnie qui vérifie leur état et place de l’enrichissement dans les cages pour diminuer le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d’hébergement. Le caractère grégaire des souris sera respecté puisqu’elles ne seront jamais seules en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause d’agressivité et de bagarres). Les souris seront surveillées quotidiennement par le personnel de la zootechnie pour repérer des problèmes éventuels (comportement anormal, blessure, maigreur, problème de dentition, …), ainsi que surveillées et pesées une fois par semaine par une personne impliquée dans le projet. De plus, toutes les procédures engendrant de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale et un analgésique sera utilisé en parallèle pour minimiser toute douleur. Les chirurgies seront réalisées par le personnel compétent et un suivi post-opératoire sera réalisé une à deux fois par jour. Les points limites sont : perte de poids (20% par rapport au poids initial), prostration, poil hirsute, dos rond, ou tout autre signe clinique jugé par le zootechnicien expérimenté comme indiquant un état de souffrance. Une grille de score comprenant les différents points limites a été établie et dès lors que le score atteindra une valeur de 9 sur 12, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Nous avons décidé de travailler sur la souris puisque cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et du vieillissement et dans lequel la biologie des tissus adipeux bruns et beiges a été particulièrement bien étudiée. De plus, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées présentant des tissus adipeux bruns et beiges déficients et des défauts d’utilisation de certains métabolites dans les tissus adipeux. Enfin, la cinétique du vieillissement est bien décrite chez la souris, et cette espèce permet de réduire le temps d'expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (2 à 3 ans) que celle du rat (2 à 3.5 ans) ou encore du cobaye (4 à 8 ans). Pour cette étude, nous utiliserons des souris contrôles et présentant des tissus adipeux bruns et beiges déficients à différents âges (2, 5, 12 et 24 mois) afin de caractériser le rôle des tissus adipeux bruns et beiges dans le métabolisme et dans la mise en place de la fragilité et du déclin cognitif au cours de l’âge. Ces âges ont été sélectionnés grâce à des données qui montrent des changements progressifs et spécifiques à chacun de ces temps dans différents organes. La réponse des souris présentant des défauts d’utilisation de certains métabolites sera évaluée chez des souris jeunes âgées de 2 mois. L’exposition à 30°C sera réalisée chez des souris de 2 mois, soit pendant 2 mois (temps efficace pour inactiver les tissus adipeux bruns et beiges), soit pendant 16 mois (pour étudier les conséquences à long terme sur la fragilité et le déclin cognitif des animaux). L’exposition à 4°C sera réalisée chez des souris âgées de 4 ou 18 mois, afin de déterminer si l’âge impacte la capacité de réponse des animaux au froid. L’ablation du tissu adipeux brun sera réalisée chez des souris âgées de 2 mois tandis que la greffe de tissu adipeux brun sera réalisée chez des souris âgées de 18 mois (du tissu adipeux brun de souris âgées de 2 mois sera greffé).
Effets de bactéries anti-inflammatoires dans un modèle murin d’inflammation de la muqueuse intestinale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
448 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Pendant onze jours, elles reçoivent des gavages quotidiens et une injection d'un agent anticancéreux qui enflamme la muqueuse intestinale, avec pesées et prélèvements répétés, pour tester des bactéries probiotiques contre cette mucosite. Le porteur décrit une perte de poids, des diarrhées, un pelage hérissé et une apathie comme dommages attendus, et tue les souris en fin de procédure pour prélever leurs organes. Il affirme que l'animal reste "le seul moyen" de reconstituer les interactions entre le microbiote et le système immunitaire.
Objectifs
La mucosite est une inflammation et/ou une ulcération de la muqueuse du tractus digestif, en particulier buccale et intestinale. Elle est un problème majeur rapporté chez 50 à 80 % des patients subissant une chimiothérapie, affectant significativement leur qualité de vie. Cette inflammation peut être provoquée par l´agent anti-cancéreux utilisé. Plusieurs études ont montré qu’elle était associée à une modification du microbiote sain et induisant une aggravation des effets de la chimiothérapie (diarrhée, saignement dans les selles, douleurs abdominales, perte de poids). Dans ce contexte, il est nécessaire de trouver des traitements qui restaurent un microbiote intestinal sain. De nombreuses bactéries probiotiques ont été décrites comme des outils prometteurs pour le traitement et la prévention des inflammations intestinales. Ceci a été démontré dans de nombreux modèles précliniques. Le but de ce travail est d'étudier les effets anti-inflammatoires d’une famille de bactéries probiotiques, sur la mucosite murine expérimentale induite par un agent anticancéreux particulier. L’emploi de ces bactéries comme agent préventif et thérapeutique contre la mucosite constitue une piste sérieuse pour la réduction de la sévérité de l’inflammation intestinale chez les patients sous traitement par l´agent anti-cancéreux. Dans ce modèle, l’agent anticancéreux induit une inflammation des tissus semblable à celle retrouvée chez des patients présentant des effets secondaires. La réponse immunitaire développée suite au traitement peut être étudiée en détail. Le projet sera réalisé en 2 étapes : • Validation du modèle de mucosite dans nos conditions expérimentales • Evaluation des effets préventifs et thérapeuthiques des bactéries ou de composés qui en dérivent sur l’inflammation intestinale ; Analyser l'effet de ces administrations sur la composition du microbiote intestinal avant, pendant et après mucosite ; Evaluer l'action des bactéries ou composés dans l'amélioration des signes cliniques en cas de mucosite due à l´agent anti-cancéreux. Ces bactéries ainsi que leurs composés ont été testées précédemment lors d’essais in vitro et in vivo sur un modèle d’inflammation aigüe reproduisant les symptômes des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Suite à des résultats positifs concernant leur effet anti-inflammatoire sur une inflammation aigüe, nous souhaiterions évaluer leur efficacité sur une inflammation due à l’agent anti-cancéreux.
Bénéfices attendus
Actuellement, une grande majorité des patients cancéreux traités par cet agent anti-cancéreux développe des effets secondaires au niveau intestinal tels qu’une inflammation de la muqueuse appelée mucosite, due principalement à la réponse inflammatoire. Ceci induit des modifications tissulaires et favorise l’altération du microbiote et de l’équilibre intestinal. L’ensemble de ces modifications participe au développement de diarrhée et d’hémorragies intestinales. Ces effets, en plus des contraintes liées au traitement et à la maladie, contribuent très souvent à une baisse de moral des patients combinée à une importante perte de poids. De plus, à l'exception des traitements palliatifs (anesthésiques ou antibiotiques dans les cas graves), il n'existe aucune option thérapeutique connue pour prévenir la mucosite intestinale induite par la chimiothérapie. Il est donc important de développer d’autres approches complémentaires qui préservent les effets thérapeutiques de cette chimiothérapie mais qui protègent contre ses effets secondaires au niveau intestinal. Parmi ces nouveaux traitements se trouvent les probiotiques, qui sont des micro-organismes (bactéries ou levures) vivants ayant des effets bénéfiques sur l’organisme. Beaucoup de bactéries déjà utilisées comme probiotiques, sont des candidates potentielles car leurs effets anti-inflammatoires au niveau intestinal ont déjà été prouvés sur d’autres pathologies, sans effet secondaire. Des bénéfices en termes de connaissances sur l’interaction hôte - microorganisme, plus particulièrement microbiote intestinal - santé intestinale pourront être obtenus au cours de ce projet. Il s’agit pour notre équipe de l’intérêt principal. Nous aimerions savoir si les bactéries testées sont capables d'améliorer les signes cliniques de la mucosite et quels changements induisent-elles au niveau de la réponse immunitaire et histologiques pour y parvenir. Pour les nouveaux microorganismes n’étant actuellement pas commercialisés, leur mise à disposition sur le marché sera plus longue mais constitue un objectif d’amélioration du bien-être (réduction des effets secondaires au niveau intestinal du traitement et amélioration de la qualité de vie des patients sous traitement).
Procédures
- Pesée quotidienne pendant 11 jours, une pesée dure environ 5-10 secondes, animal vigile, 448 animaux. - Gavage intra gastrique quotidien de 10 secondes maximum pendant 11 jours, animal vigile, 448 animaux. - Isolement des souris pendant 10 minutes maximum dans des pots transparents pour prélever des crottes fraiches. 3 fois pendant les 11 jours , animal vigile, 448 animaux. - Injection intrapéritonéale unique de 10 secondes d’un agent anti-cancéreux (ou de son solvant pour contrôle), animal vigile, 448 animaux. - Isolement quotidien des souris pendant 10 minutes maximum pour réaliser le score clinique. 4 fois pendant les 11 jours (2 de ces isolements seront communs à ceux réalisés pour la collecte de feces). Animal vigile, 448 animaux - injection unique pour l’anesthésie de 10 secondes pendant le 11 jours (avant le prélèvement de sang). Animal vigile, 448 animaux - Prélèvement de sang de 30 secondes après l´administration d’un traceur fluorescent (par gavage) une fois pendant le 11 jours. Animal anesthésié, 448 animaux.
Impact sur les animaux
Les nuisances de ce protocole viennent du traitement par l´agent anti-cancéreux qui provoque une inflammation des muqueuses. Les dommages principaux liés au traitement peuvent se manifester par une perte de poids, une diarrhée légère (crotte molle) ou une déshydratation due à la diarrhée. Des signes cliniques peuvent également être relevés : pelage hérissé, posture voutée, yeux clos ou mi-clos, apathie. Lors du prélèvement de crottes et lors de la réalisation du score clinique, les animaux seront isolés pendant 10 minutes maximum, cela peut induire un stress le temps de l’isolement. Les animaux conservent cependant un contact visuel, sonore et olfactif avec les autres animaux. Aussi, les gavages des bactéries et des composés bactériens ainsi que l’injection intrapéritonéale et le prélèvement de sang peuvent entrainer un stress et/ou une douleur le temps de la manipulation.
Devenir
A l’issue de chaque prodédure, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements d’organes pour de futures analyses.
Remplacement
Le présent projet vise à étudier l’effet du microbiote intestinal, plus particulièrement d´une espèce bactérienne en particulier, sur la réponse immunitaire des animaux, principalement son effet anti-inflammatoire lors d’une inflammation due à un agent anti-cancéreux précis (et déjà employé en médecine humaine). A l’heure actuelle, l’utilisation des animaux reste le seul moyen qui permet de reconstituer l’environnement et les interactions complexes que l’on retrouve entre le microbiote et le système immunitaire d’un être vivant.
Réduction
Nous utilisons toujours une approche statistique pour déterminer la taille de nos groupes en fonction de l’intensité des effets que nous souhaitons mettre en évidence et des données déjà disponibles. Dans notre cas, des données issues de la littérature et acquises les années précédentes sur des modèles similaires comparables ont permis de calculer les tailles de groupes. Le nombre obtenu correspond au maximum d’animaux qui peuvent être utilisés par groupe. Au total, nous utiliserons 448 animaux.
Raffinement
Tout au long des procédures expérimentales, les animaux sont observés et pesés quotidiennement. A partir du moment où nous injectons l’agent anti-cancéreux aux animaux, un score clinique individuel est établi chaque jour. Les critères observés seront l’aspect des fécès (diarrhée), l’aspect du pelage, la posture, la réponse face au stimulus, la locomotion et la déshydratation de chaque animal. Des points limites adaptés sont définis afin de réduire au maximum la douleur ressentie par les animaux. Des traitements seront mis en place si les animaux présentent des signes de douleur ou stress. Toutes ces mesures représentent une surveillance accrue nécessaire à cette phase. Par ailleurs, les animaux seront hébergés à plusieurs (4 ou 5) afin de ne pas les exposer à un stress lié à l’isolement. Les quelques fois où les animaux sont séparés ne représentent qu’un temps très court (10 minutes maximum). Nous incluons des enrichissements dans les cages : cellulose à déchiqueter et permettant la nidification, bâtons à ronger, maisonnettes en carton ou en polycarbonate. Les sondes de gavages sont en plastique souple et fin (diamètre externe voisin du millimètre), à bords arrondis et de taille adaptée pour empêcher les blessures et réduire l’inconfort. La surveillance, les injections, prélèvements et manipulations seront réalisés par des expérimentateurs formés et maitrisant ces gestes afin de réduire au maximum le temps de manipulation et donc le stress des animaux.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence en nutrition, toxicologie, cancérologie et immunologie. Elle est le modèle d’étude dans le cadre de l’étude de pathologies inflammatoires intestinales, car leur développement intestinal est relativement similaire à celui de l'intestin humain et elles possèdent un grand nombre de réponses immunitaires, de microbiomes et de gènes identiques aux l´homme. Il est possible d’induire une mucosite chez la souris avec différents produits chimiques. Les réponses cliniques, tissulaires et immunitaires générées sont comparables à celles observées chez l’humain. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 7 semaines. Les souris adultes possèdent un système immunitaire mature, ce qui est essentiel pour étudier les effets anti-inflammatoires de nos produits bactériens sur une mucosite induite. De plus, cet âge constitue donc un point d’ancrage pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos propres données.
Elevage d’animaux avec un phénotype dommageable.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
4 910 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour l'élevage de lignées au "phénotype dommageable", surtout des souris immunodéficientes ou issues de croisements transgéniques. Elles subissent une biopsie de l'oreille pour le génotypage et un hébergement stérile strict, une rupture de stérilité pouvant, selon le porteur, les contaminer jusqu'au décès du fait de leur immunodéficience. Les souris dont le génotype n'a pas d'intérêt sont tuées, les autres gardées pour la reproduction ou pour entrer dans d'autres procédures. Le porteur décrit ces lignées transgéniques comme des modèles "unanimement validés" et affirme qu'aucun modèle in vitro ne recrée la complexité du système immunitaire.
Objectifs
L’objectif du projet est d’élever des animaux au sein d’une plateforme animalière agrée, en particulier des souris, avec des phénotypes dommageables. Ces animaux sont, pour la majorité, des souris immunodéficientes qui sont utilisées dans nos projets de recherche. Ces souris sont dépourvues totalement ou partiellement de système immunitaire adaptatif. Ces animaux ayant un phénotype dommageable peuvent être aussi des souris issues du croisement de deux souches de Souris transgéniques. La surveillance du bien-être des lignées au cours de l’élevage exigera des contrôles quotidiens et une évaluation appropriée de tous les aspects du bien-être des animaux. Ces animaux issus du croisement de deux souches de souris transgéniques seront utilisés dans des modèles communs : les modèles d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, d’arthrite, de maladies chroniques de l’intestin, d’inflammation cutanée et pulmonaire. Enfin, les modèles expérimentaux de cancérogénèse sont des modèles de greffe de tumeurs murines ou humaines comme les leucémies, différentes lignées de cancer du côlon ou du pancréas. Ces différents modèles permettent d’adresser un mécanisme d’action, ou des approches thérapeutiques avec des produits biologiques humains. Aujourd’hui, il n’y a pas de données scientifiques publiées sur ces croisements. Les données obtenues avec des nouvelles lignées permettront d’enrichir les données scientifiques dans les modèles étudiés. Nous n’attendons aucun phénotype dommageable au cours de la génération de ces lignées transgéniques dans nos conditions d’hébergement. Ce n’est que lors de nos expérimentations suite à l’injection de tamoxifène qu’un caractère dommageable sera observable ou non. Si un phénotype dommageable apparait, nous définirons des points limites et une intention particulière sera porté au bien-être animal.
Bénéfices attendus
L’elevage de ces animaux au sein de notre animalerie est bénéfiques pour les animaux et donc nos expérimentations. Les animaux, lorsqu’ils seront utilisés dans nos expériences, seront déjà habitués aux conditions environnementales de l’animalerie, ainsi qu’aux soigneurs et aux expérimentateurs Ce qui pourra limiter très fortement le stress de ceux-ci.
Procédures
L’animal présentant un phénotype dommageable suite au croisement des 2 souches de souris transgéniques pourra ressentir, du fait de son statut génétique, une douleur, une souffrance, une angoisse ou un risque d’infection . La surveillance du bien-être de chaque animal au cours de l'expérience exigera des contrôles quotidiens de routine et une évaluation appropriée de tous les aspects du bien-être des animaux. Des conditions d’hébergement pour ces élevages seront strictes dans des portoirs ventilés avec de la litière autoclavée ainsi que des poches d’eau stérile. Tout ceci est mis en place afin de maintenir les animaux en bonne santé et de veiller au bien-être des animaux. Hormis le change des animaux, l’autre intervention sur ces animaux sera une biopsie d’oreille servant à vérifier le génotype des animaux et servant également à l’identification des animaux pour un bon suivi de l’élevage.
Impact sur les animaux
Concernant les animaux immunodéficients, les conditions d’hébergement strictes permettent de maintenir les animaux en bonne santé. Dans le cas où une rupture de la stérilité aurait lieu, les animaux pourraient être contaminés par des micro-organismes opportunistes qui seraient pathogènes pour ces animaux. Du fait de leur immunodéficience, ces animaux subiraient de graves effets indésirables qui se manifesteraient par une inactivité, une perte de poids pouvant aller jusqu’au décès. Pour les modèles CreLox inductible, les phénotypes dommageables des souris obtenus sont difficile à prévoir à l’avance Le bien-être animal sera évalué selon les principes suivants : Des données seront recueillies durant au moins 2 cycles de reproduction après la génération considérant la lignée stable (après 2 générations) avec un nombre d’animaux scientifiquement et statistiquement justifiés (jamais moins de 14 animaux issus d’au moins 2 portées/pontes différentes) en prenant en compte le sexe sur le phénotype : à défaut 7 mâles et 7 femelles. Les observations seront faites à un âge représentatif et un génotype pertinent. Les animaux contrôles seront de même fond génétique que les lignées générées.
Devenir
Les animaux dont le génotypage n’est pas d’intérêt, seront euthanasiés. A l’inverse, les animaux ayant un génotypage d’intérêt seront conservés, soit pour continuer les élevages, soit pour rentrer dans une procédure d’expérimentation.
Remplacement
Un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs des réponses immunes lors de greffes ou de thérapies anti-cancéreuses. En plus des éléments apportés par les expériences réalisées à l’aide de modèles de culture cellulaire, le modèle vivant est essentiel à la preuve d’efficacité des thérapeutiques développées dans ce projet. Il n’est pas possible de créer in vitro la complexité du système immunitaire avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé au plus juste. L’élevage des animaux est réalisé à la demande des expérimentateurs. En fonction de la procédure concernée, le nombre d’animaux par groupe est défini de façon à obtenir une différence statistique (Tests paramétriques et non-paramétriques) en fin d’expérience en ayant pris en compte les animaux nécessaires (couples parents et portées non utilisées) et la toxicité associée à chaque modèle. A cause des variabilités inter‐animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et donc la nécessité de répéter inutilement l’expérience. Si un phénotype dommageable est observé avec ces souches, le nombre d’animaux utilisé dans nos expériences sera adapté en conséquence (dimunition du nombre d’animaux par groupe).
Raffinement
L’élevage des animaux au sein de l’animalerie est réalisé dans des conditions strictes de stérilité et de suivi. Les Souris sont hébergées dans des cages en portoirs ventilés, ce qui assure une non contamination par des pathogènes pouvant être présents dans l’air ambiant des pièces d’hébergement. Les cages contenant la litière sont autoclavées préalablement au change. L’eau de boisson est distribuée via des poches d’eau stériles à usage unique. Le change des animaux est réalisé sous hotte de change, le transfert des animaux de la cage sale à la nouvelle est réalisé à l’aide d’une paire de pince trempée dans l’alcool permettant au maximum de limiter les risques de contamination entre les cages. Entre chaque cage le soigneur désinfecte ses gants. Les animaux sont suivis quotidiennement par les soigneurs afin de prendre en charge les animaux pouvant montrer des signes de mal être et ainsi protéger ces congénères. Ce suivi accru limite aussi le risque de propagation potentielle de pathogènes.
Choix des espèces
La Souris présente un système immuno-physiologique très proche de celui de l’Homme, idéal pour l’évaluation des thérapeutiques cellulaires. Les modèles transgéniques utilisés dans ce projet sont les modèles de références unanimement validés par la communauté scientifique internationale. Tous les animaux produits seront utilisés dans différentes procédures autorisées dans notre établissement. Ces animaux seront utilisés soit à partir de 8 semaines pour renouveler les couples reproducteurs, soit pour être utilisés dans les différentes procédures et cela à partir de 5 semaines. Cinq semaines est l’âge à partir duquel les animaux peuvent subir une greffe de cellules hématopoïétiques humaines ou de tumeurs sans alterer leur croissance et leur bien-être.
Étude de la machinerie de synthèse des protéines chez la souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
128 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie profonde, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque souris reçoit un antalgique puis une anesthésie profonde, avant l'ouverture de la cage thoracique et une perfusion cardiaque qui fixe les tissus, pour étudier la composition des ribosomes dans différents organes. Le porteur indique n'attendre qu'un léger stress et une légère douleur liés aux injections. Il justifie le recours à l'animal par la nécessité de travailler sur "organisme entier", les protéines identifiées devant ensuite être étudiées in vitro.
Objectifs
Ce projet est un projet de recherche fondamentale. Il vise à élucider les mécanismes complexes qui régissent l’expression des gènes, un processus essentiel dans le fonctionnement cellulaire. Les ribosomes, les machines moléculaires qui synthétisent les protéines, jouent un rôle central dans ce processus. Historiquement, les ribosomes ont été décrits comme étant identiques dans toutes les cellules. Cependant, des études récentes ont mis en évidence une grande hétérogénéité dans la composition des ribosomes et ont émis l’hypothèse de l’existence d’une multitude de ribosomes différents, décrits comme ribosomes “spécialisés”, chacun avec une activité spécifique. Afin d’étudier ces ribosomes “spécialisés” dans différents organes (le foie, le cerveau ou la rate par exemple) et comprendre leur fonctionnement, nous avons mis en place une approche innovante permettant de déterminer la nature des différentes protéines qui les composent. Nos premiers résultats obtenus dans des cellules en culture, nous ont permis de mettre en évidence près de 600 protéines qui se lient directement aux ribosomes. Cela ouvre de nouveaux champs de recherche pour la compréhension des mécanismes fondamentaux du fonctionnement cellulaire qui sont contrôlés par les ribosomes. Actuellement, nous souhaitons étendre notre étude en caractérisant la composition de ribosomes spécialisés dans différents organes chez la souris. Pour cela, nous avons généré une souris qui nous permet de marquer tous les ribosomes de chaque cellule et de les purifier. Cette lignée de souris est viable et n’a pas de phénotype dommageable. Elle n’a pas non plus d’immunodéficience connu ou de phénotype immunologique. Pour effectuer nos analyses, nous devons fixer les tissus (aussi appelés organes) avec un produit chimique chimique afin de stabiliser les interactions entre les ribosomes et les protéines qui interagissent avec eux. . Nos résultats indiquent que si la fixation des organes récupérés a lieu après la mise à mort des souris alors la fixation n’est pas homogène et cela introduit des biais expérimentaux dans l’analyse de la composition des ribosomes. Pour réaliser des analyses fiables, les organes seront donc fixés sur les animaux sous anesthésie profonde sans réveil. Les tissus seront ainsi figés avant la mise à mort des animaux. Cette procédure garantit que les interactions entre les ribosomes et d'autres protéines restent inchangées, reflétant ainsi la situation réelle dans les cellules vivantes.
Bénéfices attendus
La réalisation de notre projet aura des apports importants pour la connaissance fondamentale sur les rôles spécifiques des ribosomes spécialisés présents dans chaque organe et permettra d’ouvrir une nouvelle voie de recherche afin de caractériser le rôle fonctionnel de l’interaction entre certains détecteurs de virus et les ribosomes, dans le cadre de la réponse immunitaire innée. En outre, les protéines identifiées comme associées aux ribosomes spécialisés dans les différents organes seront une ressource d’intérêt pour des chercheurs dans différents domaines de la biologie.
Procédures
Tous les animaux de notre protocole seront soumis aux interventions suivantes : changement d'animalerie 7 jours avant le début des expériences, injection sous-cutanée pour la livraison d’antalgiques : 1 fois par animal 30 minutes avant l'injection d'anesthésiques, durée de l’injection : 10 secondes puis 1 injection dans l'abdomen pour anesthésie profonde : 1 fois par animal, durée de l'injection : 10 secondes ; puis la cage thoracique sera ouverte par chirugie (temps de l'intervention 5 minutes) et une perfusion cardiaque sous anesthésie profonde (durée de la mise en place de la perfusion : 5 secondes, temps de perfusion : 12 minutes.
Impact sur les animaux
Cela entrainera donc un léger stress dû au changement d'animalerie, un léger stress dû à la contention puis une légère douleur due aux injections de l'antalgique et de l'anesthésique.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort puis les organes d'intérêt seront prélevés afin d’analyser les ribosomes spécialisés et de les comparer entre les différents organes.
Remplacement
L’objectif de ce projet étant de connaitre les partenaires des ribosome in vivo et de comparer la liste de ces partenaires entre plusieurs organes il est nécessaire de travailler sur organisme entier. Les protéines identifiées dans notre étude pourront ensuite être validées et leur fonction cellulaire étudiée dans des modèles cellulaires in vitro.
Réduction
Le nombre de souris par lot a été déterminé sur la base de données préliminaires. Le nombre d'animaux dans chaque lot a été réduit au maximum et sera composé de 8 souris contrôles non transgéniques et de 8 souris transgéniques.
Raffinement
Les souris utilisées dans notre projet n’ont pas de phénotype dommageable. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux au sein de chaque cagée (en moyenne 5 animaux par cagée). Afin de réduire la souffrance, le stress et la douleur de l’animal, la perfusion des souris sera réalisée sous anesthésie profonde. Aussi, des antalgiques seront administrés aux souris avant l’anesthésie afin d’éviter d’éventuelles douleurs liées à la procédure de perfusion. Pendant toute la durée de l’anesthésie profonde, les animaux seront placés sur un tapis chauffant, afin de limiter les risques d'hypothermie, et un gel oculaire sera appliqué sur les yeux afin d'éviter les risques de sècheresse oculaire. En cas de problème non anticipé lors de la perfusion intracardiaque, la souris sera immédiatement mise à mort par dislocatoion cervicale.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle pour étudier la composition des ribosomes notamment dans les cellules du système immunitaire présentes dans les organes du système immunitaire car il permet d’avoir accès à suffisamment de matériel biologique pour pouvoir réaliser des analyses biologiques. Par ailleurs, le choix du modèle souris est imposé par la nécessité de pouvoir réaliser, à terme des expériences d’infection par divers virus dans des animaux génétiquement modifiés afin de valider nos premiers résultats obtenus sur des lignées cellulaires. Nous utiliserons dans notre projet des animaux adultes afin d’étudier les fonctions des ribosomes dans des conditions physiologiques chez l’adulte.
Caractérisation en modèle murin de la pathogénèse de virus respiratoires humains et évaluation de vaccins
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
1 150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des virus respiratoires humains administrés dans les narines sous anesthésie, avec pesées quotidiennes et prélèvements de sang répétés, jusqu'à un prélèvement terminal par ponction cardiaque, pour caractériser de nouveaux candidats vaccins. Le porteur indique une perte de poids, une accélération respiratoire et une perte d'activité après administration du virus. Il décrit le recours à l'animal comme "indispensable" et renvoie aux "guidelines" de l'Agence européenne du médicament pour justifier le modèle murin.
Objectifs
Les virus respiratoires provoquent des infections respiratoires aigües entraînant des pathologies légères à sévères chez l’Homme et constituent la première cause de mortalité chez les jeunes enfants. Les possibilités de traitements ou de vaccinations contre ces virus restent limitées et/ou peu efficaces et le développement et l’approbation de nouveaux vaccins sont freinés par des efficacités de protection faibles et un manque de connaissances des réponses immunitaires induites. Pour les vaccins vivants atténués, la réponse immunitaire locale des muqueuses respiratoires (réponse mucosale) est encore peu décrite à ce jour mais elle contribuerait aussi à limiter la transmission des virus respiratoires. Aussi, de nouveaux candidats vaccins vivants atténués modifiés génétiquement sont en développement et permettraient d’avoir une couverture vaccinale plus large, protégeant contre plusieurs familles de virus respiratoires, à partir d’un seul vaccin. Sur la base de ces constats, ce projet vise à caractériser et valider l’efficacité de nouveaux candidats vaccins vivants atténués pour protéger contre deux familles de virus respiratoires humains, à l’aide d'un modèle expérimental de pneumonie virale chez la souris. Ce projet vise aussi à étudier de manière plus approfondie l’impact de ces candidats vaccins sur l’immunité, avec un focus particulier sur la réponse immunitaire des muqueuses respiratoires.
Bénéfices attendus
Les résultats de ces études seront utiles pour approfondir la compréhension de l'infection par les virus respiratoires et des réponses immunitaires et inflammatoires induites par ces infections. Cette étude permettra aussi de participer au développement et à la caractérisation de nouveaux candidats vaccins innovants contre ces infections respiratoires, pour lesquelles il n’existe aujourd’hui que peu d’option efficace disponible sur le marché.
Procédures
(1) 80 animaux subiront des prélèvements de sang au niveau de la joue : prélèvement sur animal vigile, jusqu’à 3 prélèvements par animal, 3 semaines d’intervalle entre chaque prélèvement. Durée du geste (contention comprise) : 1 minute ; (2) Tous les animaux (soit 80) seront pesés tous les jours : pesée d’animaux vigiles, une fois par jour pendant 63 jours consécutifs. Durée du geste : 30 secondes ; (3) 80 animaux subiront une injection d’un mélange d’anesthésiques avant chaque administration de virus : injection sur animal vigile, jusqu’à 3 injections réalisées à 3 semaines d’intervalle par animal. Durée du geste (contention comprise) : 30 secondes ; (4) 80 animaux subiront une administration de virus ou vaccin : administration sur animal anesthésié (anesthésie liquide), administration au goutte à goutte sur les narines de l'animal tenu en position dorsale, jusqu’à 3 administrations sur le même animal avec 3 semaines d’intervalle entre chaque administration. Durée du geste : 1 minute ; (5) 20 animaux subiront une injection intramusculaire (cuisse) de vaccin : injection sur animal anesthésié (anesthésie liquide), jusqu’à 2 administrations sur le même animal avec 3 semaines d’intervalle entre chaque administration. Durée du geste : 1 minute ; (6) 24 animaux subiront une injection sous-cutanée d’analgésiques 30 minutes avant anesthésie générale gazeuse et prélèvement de sang terminal (par ponction cardiaque). Analgésie + anesthésie + prélèvement de sang réalisé 1 fois en fin de procédure sur chaque animal. Durée du geste : 40 minutes ; (7) 32 animaux subiront une injection de pentobarbital : injection sur animal vigile, 1 injection par animal. Durée du geste (contention comprise) : 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux pourraient développer des signes de pathologies respiratoires, caractéristiques des infections à virus respiratoires : une perte de poids sur une durée de 1 à 10 jours après administration de virus (jusqu'à 3 administrations pendant une étude d’efficacité vaccinale) + une accélération du rythme respiratoire + une perte d’activité légère entre 2 et 7 jours après administration de virus. Les souris pourraient aussi subir des effets indésirables après la réalisation des gestes techniques de prélèvements sanguins ou d’injections éventuelles de vaccins, d’injection d’anesthésiques ou d’analgésiques. Ces effets indésirables seraient des douleurs locales et de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales pour le prelevement de sang total et organes (évaluation de la réponse immunitaire et protection vaccinale).
Remplacement
Toutes les étapes du présent projet et la caractérisation des nouveaux candidats vaccins en modèle murin font suite à des études effectuées et validées auparavant en laboratoire. Malgré le progrès des dernières années dans le développement de modèles d’études alternatifs, l’interaction entre les virus et le système immunitaire d’un individu est beaucoup trop complexe pour être réduit à l’utilisation de lignées cellulaires et requiert l’utilisation du modèle animal. A cet égard, le recours indispensable à l'animal de laboratoire pour la caractérisation de la pathogénèse des souches virales, de la réponse immunitaire globale face à l’infection, ainsi que le niveau de protection induit par un vaccin, figure dans les "guidelines" édictées par l'Agence Européenne du Médicament.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés par groupe expérimental tiendra compte du nombre minimal d'animaux pour atteindre une relevance expérimentale, réaliser des tests statistiques et maintenir des groupes sociaux au sein de chaque cagée, en tenant compte des animaux consacrés aux prélevements terminaux. Dans la mesure du possible, les groupes contrôle d'animaux seront mutualisés pour réduire le nombre total d'animaux.
Raffinement
Après anesthésie générale, un suivi accru sera fait jusqu’à réveil et reprise d’activité de chaque animal. Après chaque administration de virus ou de vaccin, chaque animal fera l'objet d'une surveillance pendant 14 jours au rythme de 1 fois par jour, accrue à 2 fois par jour au besoin, pour réaliser un suivi de poids et de signes cliniques. Pour limiter les effets indésirables dûs aux prélevements de sang au niveau de la joue, le volume de sang prélevé sera limité pour faciliter la compensation de la perte de sang en quelques heures. Pour réduire la douleur provoquée par le prélevement de sang par ponction cardiaque, l’administration d’analgésiques sera réalisée 30 min avant anesthésie gazeuse. Les potentielles nuisances identifiées lors de la réalisation des procédures seront prises en compte pour le raffinement des prochains protocoles incluant d’éventuelles analgésies et anesthésies supplémentaires pour des prélevements douloureux.
Choix des espèces
Bien que les modèles expérimentaux animaux pour l’étude des infections respiratoires se soient diversifiés ces dernières décennies (furets, rat des cotonniers, hamsters, bovins, primates non humains), aucun de ces modèles ne réflètent complètement la pathologie et la réponse immunitaire chez l’humain. La souris reste cependant le modèle sur petits animaux le mieux caractérisé pour l’étude des infections respiratoires virales. A ce stade de notre projet, il n’y a pas de justification à l’utilisation d’un autre modèle animal sans une validation au préalable chez la souris. Nos précédentes expérimentations ainsi que celles d’autres équipes ont montrés que des souris sevrées âgées de 4 à 8 semaines au début du protocole sont bien adaptées aux besoins de ce projet, puisque ce modèle permet non seulement l’observation de signes cliniques liés à l’évolution de la pathologie respiratoire mais aussi de réaliser aisément diverses analyses. De plus, le modèle murin est parfaitement maitrisé depuis plusieurs années par les responsables et manipulateurs.
Étude de la modulation de l’inflammation aiguë par induction de la senescence.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
228 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour une partie et sévère pour la majorité, 192 sur 228. Elles reçoivent des injections du vaccin anticovid de Pfizer pour induire des cellules sénescentes, puis des lipopolysaccharides ou une irradiation gamma pour déclencher une inflammation aiguë. Le porteur indique que ces agents peuvent provoquer un choc septique, de la fièvre, des tremblements et une prostration entre 15 et 48 heures après le traitement. Il affirme que la sénescence et l'immunité impliquent trop d'organes pour être reproduites en culture, ce qui rend selon lui le recours à l'animal "indispensable".
Objectifs
En vieillissant, l’organisme accumule des cellules potentiellement toxiques appelées « cellules sénescentes » ou CS. Leur impact sur le corps réduirait l’espérance de vie en favorisant l’apparition de différentes pathologies liées à l’âge. Il est généralement considéré que leur délétion diminuerait les comorbidités associées au vieillissement. Néanmoins, il a également été montré que la délétion de certains types de CS est néfaste pour certains organes, en particulier si les CS concernées font partie du système vasculaire. Leurs rôles et fonctions restent donc largement incompris et controverse. Ces CS s’accumulent soit lentement tout au long de la vie, soit au contraire apparaissent massivement à la suite d’un stress induit par une pathologie. Dans les 2 cas, il semble que ces cellules sénescentes puissent impacter le système immunitaire et notamment avoir des propriétés anti-inflammatoires. Des résultats récents laissent entendre que les cellules immunitaires sénescentes pourraient ainsi inhiber l’inflammation aiguë. L’objectif de ce projet est de déterminer si l’induction de la senescence a des effets protecteurs contre l’inflammation aiguë, permettant ainsi de diminuer les dommages tissulaires qui lui sont généralement associés. Pour répondre à cette question, nous utiliserons des modèles murins ou nous induirons, dans un premier temps l'apparition des CS en exposant nos souris au vaccin anticovid BNT162b2 de Pfizer. Puis, dans un second temps, nous exposerons les souris à des agents biologiques (lipopolysaccharides ou LPS) et physiques (rayonnement gamma) induisant une l’inflammation et des dommages cellulaires. Nous rechercherons ensuite dans les tissus de ces souris des signes de dommages cellulaires issus de l’inflammation aiguë.
Bénéfices attendus
L'inflammation et la détérioration des tissus qui lui est associée est une pathologie grave. Elle peut être causée par plusieurs facteurs, notamment une infection bactérienne ou virale, des maladies auto-immunes, plusieurs maladies associées au vieillissement comme le diabète ou des interventions cliniques comme la radiothérapie. L'inflammation est causée par une réponse incontrôlée ou prolongée du système immunitaire qui finit par produire des lésions tissulaires. Si nous pouvons trouver une nouvelle façon de contrôler ce processus, comme l’induction de cellules immunitaires sénescentes, nous pouvons établir de nouveaux protocoles pour combattre certains des symptômes les plus agressifs de certaines maladies comme l’infection par le SRAS-CoV-2 (covid) ou la septicémie. De plus, cela peut offrir une protection aux personnes qui subissent une radiothérapie pendant un traitement contre le cancer, en évitant les effets secondaires qui en découlent induits par les dommages tissulaires produits par l'irradiation. En outre, les patients atteints d'une maladie auto-immune comme le lupus peuvent être traités pour réduire ou retarder les symptômes de la maladie. En résumé, les bénéfices que la société recevra de ce projet pourraient avoir un impact sur la vie de nombreuses personnes.
Procédures
Injection intraperitoneale (maximum de 2 par souris, necessite quelques secondes), Irradiation (1 seule, necessite quelues minutes).
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable particulier n’est attendu dans la premiere des cinq procédures, sauf l’injection intrapéritonéal nécessaire pour traiter les souris avec le vaccin BNT162b2. En effet, celui-ci a déjà été testé sur différentes espèces animales aux doses indiquées sans compromettre le bien-être animal, et est couramment utilisé sur des patients humains lors d’essais cliniques dans différents pays. Trois procédures nécessiterons des injections IP de lipopolysaccharides. Les LPS sont de puissants agents inflammatoires pouvant notamment induire un choc septique, de la fièvre et une baisse de la pression artérielle. Nous attendons donc à une possible détérioration de l’état sanitaire de la souris entre 15 et 20 heures après l’injection de LPS. Cela pourrait se traduire par une prostration, des tremblements et une apathie de la souris. Afin de pouvoir intervenir rapidement et limiter au maximum leur souffrance si les souris atteignent un point limites, elles seront suivies au moins une fois par heures de 15H à 24H apres le traitement. Deux procédures nécessitant une exposition ont des rayons gamma induiront des symptômes similaires, mais décalé de 24 à 48H dans le temps.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement de tissus.
Remplacement
La senescence et le système immunitaire sont des processus impliquant une communication entre de nombreux tissu et organes différents, il est ainsi impossible de mimer leur interaction en culture cellulaire ou a l'aide d'un ordinateur. Pour ce projet, le recours à l’animal reste donc indispensable.
Réduction
Le nombre d'animaux proposés à utiliser au cours de ce projet a été déterminé pour garantir une population représentative permettant d'effectuer une analyse statistique valide.
Raffinement
Ce projet nécessite d’exposer nos modèles animaux à des traitements qui impacteront leur bien-être. Pour limiter au maximum leur souffrance, les souris seront suivies par les expérimentateurs à l’aide de fiches de scores adaptées aux procédures expérimentales qu’elles subiront, et permettant d’identifier précocement les animaux en souffrances. En effet, tant les signes de mal-être que leurs cinétiques d’apparition varieront suivant qu’on injecte des LPS ou qu’on expose les souris a des rayons gamma. Ces fiches comprennent des points limites qui correspondent à un score maximum prenant en compte les différents paramètres (comportement, état général, neuromusculaire, poids) et seront remplies tout au long de l'expérimentation. On notera en particulier un suivi chaque heure dans le cas des injections de LPS entre 15 et 24 heures post-traitement. Un soin particulier sera aussi apporté au suivi de leurs poids : une baisse de poids ≥15% par rapport au poids de la précédente pesée ou de ≥25% par rapport à la pesé avant traitement entraîneront une mise à mort. D'autre part, nous avons prévu un suivi sanitaire journalier par les membres de l’équipe (expérimentateurs + personnelles techniques). Nous nous assurerons que les souris ont un accès ad libitum a l’eau et la nourriture, qu’elles puissent satisfaire les besoins propres à leur espèce (abris pour souris, papier utilisable pour se faire un nid, petit bout de bois à ronger), litière en copeaux de bois. De plus, par souci de respect de la hiérarchie de l’espèce, les groupes expérimentaux seront formés au moment du sevrage et conservés intacts.
Choix des espèces
Il s’agit d’une étude exploratoire et innovante avec l’utilisation de modèles murins récents qui n'existent pas chez d'autres espèces. La souris, qui est l'animal le plus largement utilisé en recherche fondamentale, est particulièrement bien connue à tous les niveaux, a un cycle de reproduction court permettant une optimisation dans la sélection des génotypes d’intérêts. Notons également que cette espèce est facilement manipulable. La sénescence est un phénomène complexe impliquant plusieurs types cellulaires, voire plusieurs organes différents, comme le prouve sa composante immunitaire. Elle correspond à un processus impliquant une communication intra- et inter- cellulaire et tissulaire, qui nécessite une étude au niveau de l’organisme entier. Les souris seront des adultes de 2 mois.
Collecte de sang frais d’ovins pour la mise en culture des bactéries exigeantes et pour la caractérisation des populations cellulaires immunes en Infectiologie animale
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
30 moutons vont être utilisés comme donneurs de sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent des prises de sang de quinze minutes, quatre à six fois par an, pour produire des milieux de culture au sang et caractériser des cellules immunitaires, sans infection sur l'animal. Le porteur indique que la contention peut provoquer un léger stress et un hématome, et que les animaux restent dans le troupeau, tués plus tard en fin de carrière et "valorisés". Il affirme qu'aucun milieu de substitution ne permet la croissance de l'agent de la tuberculose bovine, ce qui rend selon lui le sang de mouton non remplaçable.
Objectifs
C'est une procédure de production de géloses ou collecte de sang frais de mouton en continu réalisée pour les recherches en Sante animale. Les principaux objectifs du projet sont : 1) Produire les géloses au sang frais de mouton pour l’étude de Mycobacterium bovis, l’agent de la tuberculose bovine ; 2) Etudier et caractériser les populations immunitaires circulantes (macrophages, monocytes, neutrophiles, lymphocytes...) chez le modèle ovin dans un contexte infectieux comme par exemple la toxoplasmose ou la néosporose et 3) étudier les bactéries pathogènes exigentes et analyser in vitro leurs caractéristiques propres dont les facteurs de virulence (adhésion, pénétration cellulaire....). Nous confirmons que cette demande d'autorisation de projet ne tient compte que des prélèvements de sang sur tubes ou sur poches nécessaires à faire pour étudier les agents infections ou leur réponse immunitaire in vitro. Aucune infection ne sera réalisée in vivo. Les donneurs sont nos ovins de l’élevage.
Bénéfices attendus
Les projets de recherche des scientifiques ou autres partenaires ont pour but d’améliorer les connaissances sur la physiopathologie des maladies infectieuses comme par exemple la tuberculose bovine. Ces projets permettront d’identifier des biomarqueurs d’intérêt pour le diagnostic, de caractériser les populations immunitaires induites dans le cadre de la vaccination ou de traitements médicamenteux/alternatifs.
Procédures
Réalisation de prise de sang pour tube ou poche : entre 4 et 6 fois par an sur des animaux différents. Durée 15 min.
Impact sur les animaux
La prise de sang nécessite une contention de l’animal et peu engendrer un léger stress, ainsi qu’un éventuel hématome au niveau du site de prélèvement.
Devenir
Les animaux font partis de l’élevage ovin de l'établissement utilisateur, qui fournit une partie des ovins pour l’expérimentation. Pour les donneurs de sang, il y a deux possibilités : 1) soit des animaux en fin de carrière qui seront euthanasiés et valorisés lors du renouvellement du troupeau, 2) soit de des animaux plus jeunes, qui eux seront maintenus au sein du troupeau jusqu’à la fin de carrière et permettront ainsi d’assurer le renouvellement du troupeau. Dans les deux cas, il y a un replacement soit sur un an pour les fins de carrière (courte), soit maintenue au sein du troupeau plusieurs années (longue).
Remplacement
A ce jour, il n’y a pas de milieu de substitution pour la croissance de l'agent infectieux de la tuberculose bovine, nous ne pouvons donc pas remplacer le sang pour la préparation de nos géloses, de même que pour caractériser les populations cellulaires de l’immunité.
Réduction
Nous optimisons toutes nos productions et mutualisons les analyses entre nos projets afin de réduire au maximum nos besoins. Le nombre d’animaux inclus dans le protocole a été déterminé grâce à l'expérience réalisée en 2012 et en 2018. Dans cette étude, l'effectif est de 30 ovins sur 5 ans pour produire le sang nécessaire pour la production des géloses ou la caractérisation des populations cellulaires immunitaires, tout en respectant la règle du bien être-animal. Il n'y aura pas d'analyses statistiques réalisées sur cette étude
Raffinement
Il y aura un enrichissement social (vie en groupe) et de structure (mise en place de paille, de pierre de sel et hébergement en stabulation conventionnelle pour petits ruminants. Un point de compression est appliqué lors du prélèvement sanguin pour accentuer le gonflement de la veine et faciliter sa visualisation puis, après retrait de l’aiguille, sur le site de ponction, afin d’éviter les risques d'hématome (2-3 min). Des granulés sont distribués après chaque prélèvement (récompense positive).
Choix des espèces
C’est à partir de sang frais de mouton qu’a été mis au point le milieu de croissance pour les bactéries. Les ovins correspondent à l’espèce cible de nombreuses pathologies ovines, telles que la toxoplasmose ou la néospore, afin de caractériser leur réponse immunitaire induite Pour la production de milieux de culture, des ovins de fin de carrière seront utilisés pour la fourniture de sang. Pour la caractérisation des cellules immunitaires, ce sera des ovins d'âge variable en fonction de l'agent pathogène étudié.
Antibiorésistance et infections invasives à méningocoques – Étude dans un modèle murin humanisé par xénogreffe de peau humaine
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système immunitaire
880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque souris reçoit une greffe de peau humaine sur le dos sous anesthésie, puis une injection de méningocoques qui déclenche une septicémie, évoluant selon le porteur d'une baisse d'activité vers la prostration puis la mort. Elles ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées car greffées et infectées, et sont tuées à la fin de chaque procédure. Le porteur décrit son modèle humanisé comme "le seul et unique" reproduisant ces infections chez la souris, pour étudier la résistance de la bactérie aux antibiotiques.
Objectifs
Les infections invasives à méningocoques sont causées par le méningocoque, une bactérie pathogène à Gram-négatif responsable de méningites et de chocs septiques. Ces infections restent malheureusement encore trop souvent létales malgré l’existence d’un traitement antibiotique. En effet, in vitro dans une boite de pétri, la bactérie est très sensible aux antibiotiques. Cependant, in vivo dans le corps humain, cette bactérie résiste aux traitements antibiotiques efficaces in vitro pour des raisons encore inconnues. L’objectif de ce projet est d’étudier les causes de cette antibiorésistance et de tester de nouvelles approches thérapeutiques pour la contrer.
Bénéfices attendus
Notre modèle murin humanisé par xénogreffe de peau humaine est à ce jour le seul et unique modèle murin permettant de reproduire chez la souris les grandes caractéristiques des infections invasives à méningocoques observées chez l’homme, à savoir la fixation et la multiplication des bactéries sur la paroi des vaisseaux sanguins entrainant le déclenchement d’une septicémie. A court et moyen terme, ce projet nous permettra : • D’étudier les déterminants impliqués dans la mise en place du phénomène de résistance aux antibiotiques • De tester et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour contrer la résistance aux antibiotiques A long terme nous espérons que ce projet permettra l’amélioration des traitements des infections invasives à méningocoques chez l’homme.
Procédures
Tous les animaux utilisés dans cette étude sont greffés avec de la peau humaine. Le greffon est implanté sur le dos de l’animal au cours d’une procédure chirurgicale d’une durée d’environ 30min réalisée sur des animaux anesthésiés. Les animaux portent un bandage pour protéger le greffon pendant 7 jours. Une fois les bandages enlevés et au minimum 4 semaines après l’implantation du greffon, les animaux seront utilisés dans 2 types d’expériences : 1. Des expériences où les animaux seront infectés par l’injection intraveineuse de bactéries. Les injections se feront via la veine caudale sur des animaux vigiles placé dans un tube de contention pendant 2min. Les animaux seront infectés pendant 3, 6 ou 16 heures puis seront mis à mort. 2. Des expériences d’imagerie intravitale pour l’étude de l’infection via des observations en microscopie réalisée in vivo, chez l’animal anesthésié. À la suite de l’infection des animaux par l'injection intraveineuse de bactéries, les observations seront réalisées pendant une période maximale de 6h00.
Impact sur les animaux
Plusieurs effets indésirables sont attendus lors des différentes procédures expérimentales présentes dans ce projet : • L’excision d’une petite partie de la peau du dos pour la remplacer par de la peau humaine entrainera une douleur modérée pendant quelques jours. • La présence de bandages maintenus pendant 7 jours pour protéger le greffon et favoriser sa prise entraineront une gêne et une mobilité réduite. • Lors des expériences d’infection par le méningocoque, les animaux infectés par l’injection intraveineuse de bactéries développent une septicémie entrainant progressivement une baisse de leur activité (0-6h post-infection) allant jusqu’à leur prostration (6h-16h post-infection) et la survenue du décès de l’animal (plus de 24h post-infection).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni être réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils seront greffés avec de la peau humaine et infectés par le méningocoque.
Remplacement
Du fait de la spécificité du méningocoque pour les cellules humaines, la majorité des études portant sur cette bactérie utilisent des cultures in vitro de cellules humaines infectées, notamment des cultures de cellules endothéliales ou épithéliales, les deux types cellulaires sur lesquels la bactérie peut se fixer. Il est cependant encore impossible de reproduire in vitro la complexité du système vasculaire et son interaction avec le système immunitaire. Notre modèle murin humanisé par xénogreffe de peau humaine est le seul à ce jour à fournir ce niveau de complexité et représente donc un modèle de choix pour l’étude des infections invasives à méningocoques.
Réduction
Le calcul des effectifs des groupes d’animaux de cette étude s’est fait sur la base du retour d’expérience d’une précédente étude où nous avons pu identifier plusieurs causes potentielles de perte d’animaux lors de nos expériences : 1. Une mort prématurée lors de la chirurgie de greffe de peau : hémorragie, non réveil de l’animal… 2. Une mauvaise évolution du greffon au cours du temps conduisant à l’exclusion de l’animal : lésions de grattage, diminution importante de la taille… 3. Une mauvaise qualité du greffon : présence de peu de vaisseaux humains 4. Une mort prématurée de l’animal lors des infections
Raffinement
Les animaux immunodéficients étant considérés comme ayant un « phénotype dommageable », ceux-ci seront hébergés dans une animalerie au statut SPF (specific pathogen free). Une inspection quotidienne permettra de vérifier qu’il n’y a aucune détérioration de leur état due à une potentielle infection. 30 minutes avant le début de la chirurgie, les animaux sont prémédiqués avec l’injection sous cutanée d’un antalgique et d’un anti-inflammatoire non stéroïdien. La chirurgie (~30 min) est réalisée sur des animaux anesthésiés,. Avant de placer les animaux greffés dans leur cage de réveil, ceux-ci sont réhydratés par une injection sous-cutanée de sérum physiologique. Les animaux sont ensuite placés dans une cage de réveil, propre et placée sous une lampe chauffante. Un gel de réhydratation enrichi en sucres est placé dans la cage pour favoriser leur récupération. Un traitement antalgique est fourni aux animaux pendant 5 jours après la chirurgie. Si des signes de souffrance persistent 3 jours après la chirurgie (poils hérissés, changements d’expressions faciales, abattement, perte d’activité …), les animaux sont mis à mort. Les animaux sont observés quotidiennement les 5 premiers jours suivant la chirurgie pendant le port de leur bandage afin de détecter des signes éventuels de souffrance et vérifier l’intégrité des bandages protégeant le greffon. Si l’animal a détérioré son bandage sans léser le greffon, le bandage est refait sous anesthésie. Si l’animal a détérioré son bandage et lésé le greffon de peau humaine, l’animal est mis à mort. Une fois le bandage enlevé, l’évolution des greffons est suivie hebdomadairement pendant 4 semaines. Les animaux sont placés après infection dans des cages contenant des gels de réhydratation enrichi en sucres et dont la moitié du sol de la cage est chauffé à l’aide de chaufferettes pour aider au maintien de la température corporelle des animaux infectés. Lors des expériences d’exploration par microscopie optique confocale, les animaux reçoivent un traitement préopératoire analgésique 30 min avant le début de l’anesthésie et la chirurgie permettant d’exposer le greffon pour l’observation des vaisseaux humains. Les animaux ayant subi une xénogreffe de peau humaine sont hébergés au nombre de 3 par cage dans des cages contenant du coton et un igloo. Des points limites sont établis pour chacune des procédures expérimentales et associés à des interventions pour réduire leur impact sur le bien-être animal.
Choix des espèces
Cette étude utilise des souris car le système vasculaire et immunitaire de la souris est proche du système vasculaire et immunitaire humain. De plus les modèles immunodéficients disponibles chez cette espèce en font le modèle le choix pour la xénogreffe de peau humaine. Les greffes de peau humaine sont réalisées chez des souris adultes immunodéficientes âgées de 6 à 12 semaines, période pendant laquelle la prise du greffon est maximisée selon nos observations. Les expérimentions sont ensuite réalisées 4 semaines minimum après la chirurgie, période nécessaire à une bonne prise du greffon.
Etude de l’inactivation d’un gène pour un modèle de neurocristopathie
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
896 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour un modèle génétique de malformations de la face et de l'intestin. Le porteur indique que les souriceaux les plus atteints meurent après la naissance de malformations qui les empêchent de se nourrir, et qu'une analgésie n'est pas possible pour ces animaux trop fragiles pour survivre au sevrage. La survie d'une partie est suivie pendant trois semaines au maximum avant mise à mort, tandis que des femelles et des mâles reproducteurs sont gardés et réutilisés pour d'autres portées. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro pour ces maladies rares et qu'il est "nécessaire" de faire naître des animaux.
Objectifs
Il existe dans la cellule des processus de régulation de la production d'energie. Nous avons montré que l'inactivation de l'une de ces voies dans les cellules à l'origine de la formation des os de la face et du système nerveux de l'intestin aboutissait à la naissance de souriceaux présentants de graves malformations de la face et de motricité digestive. Dans notre modèle génétiquement modifié dans lequel une voie de production d'ernergie est inactivée,nous inactivons un second gène. Il est décrit dans le littérature scientifique que cela avait des effets bénéfiques dans d'autres pathologies de la même famille.
Bénéfices attendus
Les malformations associées aux defauts de développement que nous étudions sont à l'origine de maladies congénitales chez l'enfant qui se traduisent comme dans notre modèle par des malformations de la face et du système nerveux de l'intestin. Ce groupe de maladies s'appelle des neurocristopathies. Parmi les plus connues il y a le syndrome de Hirschsprung et celui de Waardenburg. D'autres malformations sont aussi concernées comme celles qui surviennent suite à la consommation d'alcool pendant la grossesse ou la prise de médicaments dit tératogènes, c'est à dire qui peuvent induire des malformations du foetus lorsqu'ils sont pris en période de grossesse. Ce sont des maladies orphelines, pour lesquelles presque aucun traitement n'est disponible à ce jour. Les bénéfices attendus sont notamment une amélioration de nos connaissances sur le rôle des processus cellulaires de production d'ernergie et du métabolisme en général dans l'apparation de ces syndromes.
Procédures
Bien que le phénotype attendu soit sévère nous utilisons 42 % des animaux produit à la naissance ou avant. Pour ces animaux il n'y aura aucune souffrance. Pour 7% nous étudierons leur survie après inactivation d'un gène, pour une période de 3 semaines maximum. Les animaux seront observés et monitorés selon les points limites décrits dans le projet. Enfin 59% sont des animaux d'élevage pour lesquel il n'y aura aucune souffrance. Pour suivre les animaux reproducteur nous effectuerons avant leur 15jours un tatouage aux phalanges en conformité avec les recommandations de la CNEEA et sous la supervision de notre SBEA. En outre pour le génotypage de nos animaux, nous effectuerons 1 biopsie de moins d'un millimètre de large à l'oreille.
Impact sur les animaux
Les animaux les plus sévèrement atteint meurent après la naissance à cause de multiples malformations qui les empêches de se nourrir et de digérer normalement. La gravité de ces malformations est variable d'un individu à l'autre et les points limites nous permettrons de minimiser la souffrance de ces animaux. Une analgésie n'est pas possible pour ces animaux fragiles qui ne survivront pas jusqu'au sevrage. La biopsie pour le génotypage des individus pourra produire douleur légère de courte durée au moment du prélèvement.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure car leur maladie est sévère et incurable. L'euthanasie sera suivi de prélèvement post mortem pour des études de biologie moléculaire et d'histologie.
Remplacement
Nous travaillons sur des syndromes liés à des défauts de développement embryonnaire. Ces pathologies génétiques rares au tableau clinique complexe n'ont pas de modèle in vitro. En parallèle d'études des mécanismes moléculaires in vitro sur une lignée de cellule de crêtes neurales, il est nécessaire d'étudier le devenir de ces cellules in vivo, dans leur microenvironnement. Pour étudier l'impact réel des modifications génétiques sur l'évolution de ces pathologies, nous devons faire naitre des animaux.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux à faire naitre, nous obtimisons nos croisements pour maximiser les chances d'obtenir. Pour la réalisation d'une coube de survie, la dispersion le long de l'axe temporel nécéssite que nous utilisions 10 individus pour nos statistiques. hormis cette expérimentation, toutes nos analyses sont réalisés sur des tissus post-mortem. La pénétrance du phénotype étant variable d'un individu à l'autres 10 individus permet de nous assurer que nos conclusions sont robustes.
Raffinement
Les femelles seront regroupées et réutilisées après l'expérimentation pour générer d'autres portées. Les points limites prédictifs et précoces sont en place pour éviter toute souffrance aux animaux. (mise à mort si perte de poids, euthanasie des animaux avant l'apparition des tumeurs chez nos animaux reproducteurs. Les mâles reproducteurs devront être isolés après les accouplements car il n'est plus possible de les mettre entre mâles et les laisser avec des femelles engendrerrait trop de portées inutiles. Les cages font déjà l'objet d'un enrichissement important dans toutes les cages. Les cages ouvertes dans notre animalerie permet des échanges olfactifs et visuels. Les mâles pouvant reservir pour de nombreux accouplement nous les gardons pour les réutiliser.
Choix des espèces
La souris est un animal vertébré dont de developpement de l'embryon est très proche de celui de l'Homme, En outre, nous avons déjà beaucoup de donnée dans nos modèles animaux. Nous travaillons à la compréhension du famille de maladie du developpement induisant des malformations graves chez les enfants. Nous travaillons donc à un stade embryonnaire E15,5 et avec des animaux nouveaux-nés. Nous travaillons aussi avec quelques animaux en période de lactation pour évaluer l'évolution de la pathologie les jours suivants la naissance après des traitements correcteurs.