Recherche fondamentale

3 780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles d'une myopathie métabolique, elles reçoivent des injections d'un peptide antimicrobien et développent une faiblesse musculaire progressive, avec une biopsie de la queue pour le génotypage. Les tissus sont prélevés après la mise à mort. Le porteur affirme que seuls les modèles in vivo reflètent la complexité de la maladie et annonce des expériences sur cellules pour limiter le recours à l'animal.

Objectifs

Certaines myopathies héréditaires sont causées par un déficit en une enzyme conduisant à une accumulation progressive d'un sucre et à une dégénérescence des muscles (myopathie métabolique). Le seul traitement spécifique à ces maladies est la thérapie substitutive avec l'enzyme manquante qui vise à stopper l'évolution naturelle de la maladie. Cependant, les limites de la thérapie incitent la communauté scientifique à approfondir ses recherches sur la maladie. Nous souhaitons explorer si une molécule antimicrobienne joue un rôle dans la physiopathologie de la maladie. Nos études préliminaires et la littérature montrent que cette molécule est exprimée dans le muscle sans que son rôle soit connu. Notre projet a pour but de comprendre ce rôle dans un modèle préclinique de la maladie.

Bénéfices attendus

mise en évidence du rôle thérapeutique d’une molécule antimicrobienne dans une myopathie métabolique.

Procédures

-Injections intrapéritonéales de cathélicidine (douleur de quelques secondes) -Développement de la maladie caractérisée par une faiblesse musculaire progressive sans paralysie invalidante. -Risque d'aggravtion du phénotype dans la lignée nouvellement générée. -Biopsie de queue pour génotypage.

Impact sur les animaux

-Injections intrapéritonéales d'un peptide antimicrobien (douleur de quelques secondes) -Développement d'une myopathie caractérisée par une faiblesse musculaire progressive. Douleur légère pour la biopsie de queue.

Devenir

-Mise à mort à la fin de la procédure pour collecte des tissus post-mortem.

Remplacement

Pour étudier la physiopathologie de la maladie de Pompe, seuls les modèles in vivo sont capables de refléter la complexité de la maladie et notamment les interactions entre le systéme immunitaire et le muscle. Mise en place d’une veille bibliographique pour éviter toute répétition d’expérimentation bien menée sur les plans scientifiques et méthodologiques. Des expériences in vitro sur des cellules primaires seront réalisées pour remplacer autant que possible les expériences in vivo.

Réduction

L’étude sera arrêtée si les expérimentations initiales invalident l’hypothèse de travail. Des prélèvements auront lieu pour des analyses biologiques et extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique.

Raffinement

-nombre d’individus par cage : 5 souris par cage pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de stress engendrés par une surpopulation; Stratégies d’enrichissement pour assouvir leur besoin ludique (blocs de cotons); Surveillance de leur bien-être quotidien par le personnel de l’animalerie; Détermination de points limites précoces pour réduire la sévérité des procédures au maximum tout en préservant l’analyse scientifique. Concernant spécifiquement les souris présentant les symptômes de la myopathie (faiblesse musculaire) : nourriture humide (gel nutritif) en fond de cage.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Les souris C57BL/6 mutantes seront utilisées à 4, 12 et 24 semaines pour étudier les différents stades de développement de la myopathie.

3 380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles génétiques d'autisme, elles reçoivent des injections répétées, certaines une chirurgie stéréotaxique pour implanter une fibre optique ou une canule, puis passent des tests de comportement social, moteur et d'anxiété, le porteur reconnaissant des douleurs post-opératoires et des risques d'hémorragie ou d'infection. Les tissus sont prélevés après la mise à mort. Le porteur affirme que l'autisme ne peut être modélisé qu'au niveau de l'"animal entier" et présente les bénéfices thérapeutiques comme une perspective.

Objectifs

La prise en charge des patients souffrant de troubles autistiques nécessite le développement de nouveaux traitements pharmacologiques visant à soulager leurs déficits comportementaux. Le projet proposé a pour objectif (1) une meilleure compréhension des substrats biologiques de ces pathologies, (2) la mise à disposition de la communauté scientifique de modèles animaux des troubles autistiques présentant une bonne homologie avec les conditions cliniques, et (3) l'évaluation in vivo, dans ces modèles, de nouvelles stratégies thérapeutiques, le tout à des fins strictement scientifiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension des gènes impliqués dans le développement de l'autisme et proposera de nouvelles solutions thérapeutiques pour soulager la pathologie.

Procédures

Une partie des animaux de nos procédures expérimentales seront soumis à des injections chroniques (14 jours) de composés par voie intrapéritonéale et per-nasale. Nous allons également étudier des animaux qui recevront une administration unique de composés par voie intracerebroventriculaire. Enfin, un groupe d’animaux subira une chirurgie stéréotaxique dans le but d’implanter une fibre optique ou une canule d’injection. Les composés seront ensuite injectés, soit via la canule d’injection, soit par voie intrapéritonéale dans le cadre des souris implantées avec une fibre optique. Nous allons évaluer les compétences sociales des animaux ainsi que leurs compétences motrices et leur niveau d'anxiété. Chaque test sera réalisé une fois, avec une durée maximale de 10 minutes.

Impact sur les animaux

Pour le groupe d’animaux soumis à des administrations répétées d’agents pharmacologiques par voie intrapéritonéale, on ne peut pas exclure une inflammation au niveau du site d’injection. Pour les animaux subissant une administration per-nasale, à l’exception d’un inconfort, ce type d’injection n’est pas connu pour générer d’effets indésirables. L’administration de composés par voie intracérébroventriculaire sera réalisée sous anesthésie gazeuse. On peut donc s’attendre à une douleur modérée au niveau du site d’injection ainsi qu’à un inconfort au réveil de l’anesthésie. Les animaux subissant une chirurgie stéréotaxique présenteront une douleur post-opératoire, les conséquences d’une anesthésie, et un risque de complication post-opératoire (hémorragie, infection).

Devenir

À la fin de chaque expérience, les animaux seront euthanasiés et les tissus seront prélevés en vue d'expériences ex-vivo ultérieures.

Remplacement

La compréhension des mécanismes causaux de l'autisme et le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traiter nécessitent la mise à disposition de la communauté scientifique de modèles précliniques de cette pathologie. Une étude précise et détaillée du comportement des animaux modèles permet de valider l'existence de la pathologie autistique et, le cas échéant, l'efficacité d'une approche thérapeutique. L'évaluation des effets bénéfiques d'un traitement ne peut être réalisée dans ces modèles qu'au niveau comportemental : en effet, il n'existe pas de marqueur biologique pour l'autisme, dont le diagnostic clinique repose entièrement sur une évaluation comportementale. Cette pathologie ne peut donc être modélisée qu'au niveau de l'animal entier, exprimant toute la variété de son répertoire comportemental.

Réduction

Nous avons ajusté nos effectifs de manière à les réduire au maximum sur la durée totale du projet, tout en assurant la significativité des résultats.

Raffinement

Nous prendrons en charge l’ensemble des contraintes subies par les animaux au cours des expériences. En ce qui concerne l’hébergement, les souris seront regroupées en sociaux de 2 à 4 individus, avec mise à leur disposition du matériel nécessaire pour construire un nid (ouate et cabane en carton), et manipulation quotidienne par le même expérimentateur. Afin de réduire le nombre d'animaux, nous utiliserons des individus des deux sexes, les testerons dans différentes tâches, et appliquerons les tests statistiques appropriés. Tout au long des expériences, nous surveillerons quotidiennement le bien-être des animaux, en particulier leur poids, leur posture et leur point d'injection. Pour les chirurgies, nous mettrons en place une procédure d’anesthésie adéquate (anesthésique associé à un analgésique), ainsi qu'un suivi post-opératoire renforcé. En effet, nous administrerons un traitement anti-inflammatoire aux animaux pour réduire la douleur et effectuerons un suivi quotidien de la cicatrisation de la plaie, du poids et de la posture des animaux. Des points limites appropriés seront définis pour éviter de causer des souffrances inutiles aux animaux. Nous ne pouvons toutefois pas nous passer du modèle animal, car l’autisme est une pathologie complexe qui ne peut être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant tout son répertoire comportemental.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux sociaux chez lesquels des altérations des compétences sociales, symptôme clé de la pathologie autistique, peuvent être aisément étudiées. Par ailleurs, le répertoire comportemental de ces animaux est suffisamment étendu pour compléter cette étude par une évaluation de nombreuses autres réponses comportementales connues pour être affectées par la pathologie autistique. Plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées sont disponibles pour modéliser cette pathologie au niveau préclinique. Les déficits comportementaux détectés chez ces souris modèles sont suffisamment importants et robustes pour permettre de révéler des effets bénéfiques potentiels de composés pharmacologiques. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8-12 semaines), alors que le répertoire comportemental est totalement développé et les éventuels déficits comportementaux fixés.

Une chirurgie du thorax de trois heures pour implanter des sondes de mesure et un câble de stimulation cardiaque, puis, deux mois plus tard, deux interventions par voie percutanée à trois jours d'intervalle, la seconde s'achevant par la mise à mort : 80 porcs vont être utilisés, tous tués pour l'étude de leur cœur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une période de repos, une insuffisance cardiaque leur est provoquée par une pression artérielle et une stimulation cardiaque élevées, et certains devraient mal la supporter selon le porteur, avec baisse d'activité, perte d'appétit et poids qui stagne ou baisse en fin de protocole. Une thérapie cellulaire censée régénérer le cœur est le premier traitement testé. Le texte ne dit ni comment la pression est élevée, ni combien de temps dure la stimulation, ni par quelle voie la thérapie est administrée, et qualifie d'"indolores" tous les autres actes.

Objectifs

L’insuffisance cardiaque est une maladie grave qui se définit par l’incapacité du coeur à pomper suffisamment de sang pour répondre aux besoins de l’organisme. Elle survient généralement chez des individus majoritairement âgés dont la santé est fragilisée depuis plusieurs années par des troubles cardiaques ou respiratoires ou par de l’hypertension. Elle se présente par un essoufflement et une fatigue disproportionnés par rapport à l’effort produit, d’abord uniquement à l’effort, puis aussi au repos. Dans les cas les plus avancés apparaissent d’autres symptômes plus invalidants tels toux nocturne, oedème (des poumons, des membres inférieurs). Le nombre de cas d’insuffisance cardiaque a augmenté au cours des 30 dernières années, en raison du prolongement de l’espérance de vie des personnes atteintes. L’insuffisance cardiaque est une cause importante de mortalité chez les personnes âgées, et le taux de survie 5 ans après le diagnostic est d’environ 50%, avec au moins 165000 hospitalisations et plus de 70000 décès annuels en France. C’est pourquoi nous étudions l’insuffisance cardiaque (à fonction systolique conservée) avec un modèle de porc à pression artérielle et stimulation cardiaque élevées, car nous avons grand besoin de comprendre sa physiopathologie et de trouver de nouvelles stratégies visant à prévenir ou à réduire la progression du dysfonctionnement du coeur. Notre projet prévoit d’utiliser au maximum 80 porcs sur 5 ans. La fréquence cardiaque, la taille du cœur, l’anatomie coronaire, l’innervation, la circulation collatérale native du porc sont très proches de celle de l’Homme. Le plan général du projet est de pratiquer une chirurgie afin d’implanter des sondes de mesure de l’activité cardiaque et un câble de stimulation de pacemaker, et après une période de repos, d’induire une insuffisance cardiaque afin d’évaluer l’effet d’un traitement thérapeutique grâce aux sondes implantées, mais aussi grâce à des mesures échocardiographiques et aux analyses de sang et de tissus cardiaques prélevés. Le premier traitement prévu est une thérapie cellulaire permettant une régénération du tissu de l’organe. D’autres traitements pourront être testés par la suite.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’évaluer de manière très prédictive des stratégies de protection cardiaque, dont les résultats bénéfiques à long terme valent autant pour la santé humaine que pour la santé animale, et jouent sur l’amélioration globale de la qualité de vie, grâce à une amélioration de la fonction cardiaque.

Procédures

Chaque animal sera soumis 1 seule fois à une chirurgie thoracique réalisée sous anesthésie générale d’environ 3 heures, puis environ 2 mois plus tard à un acte chirugical percutané sous anesthésie générale d’environ une demie-heure, puis 3 jours plus tard à un acte chirugical percutané sous anesthésie générale se terminant par la mise à mort. Tous les autres actes sont indolores et consistent en des soins, ou à des échocardiographies ou à des enregistrements de paramètres hémodynamiques effectués sous sédation légère afin que l’animal soit bien calme.

Impact sur les animaux

L’insuffisance cardiaque se caractérisant essentiellement par une fatigue chronique, il est probable qu’un certain nombre d’animaux supportent moins bien ce traitement, ce qui entrainera une baisse d’activité et une perte d’appétit avec une stabilisation, voire une légère baisse de leur poids en toute fin de protocole.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour récupérer le coeur afin d'en faire l'étude histologique.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de tester totalement une stratégie de protection cardiaque sans passer finalement par l’expérimentation animale. Les traitements envisagés ont déjà été testés in vitro ou sur des animaux de petite taille (rongeurs) aux caractéristiques cardiaques trop dissemblables de l’Homme. Seuls des essais effectués sur un modèle d’étude cardiaque proche de l’Homme sont scientifiquement acceptables pour envisager une extrapolation vers la pratique clinique humaine.

Réduction

Il est prévu d’utiliser le minimum d’animaux pour chaque stratégie testée, et le nombre par lot est fixé à 8. De plus, à chaque fois que c’est possible, les animaux des lots témoins sont mutualisés pour chaque stratégie.

Raffinement

Des antalgiques, des anesthésiques et des tranquillisants sont utilisées à des doses adaptées (voir détails plus bas). Nous ne pensons pas observer de différences comportementales entre avant et après les actes chirurgicaux. Des signes indicatifs de gêne inhérents au modèle expérimental seront probablement observés en fin de protocole, et cette période sera particulièrement surveillée afin qu’elle soit le plus courte possible pour l’animal. Ils sont suivis quotidiennement et bénéficient de sciure pour satisfaire leurs réflexes de fouissage, et d’objets « manipulables » pour améliorer leur qualité de vie. Ils sont logés à plusieurs avant leur chirurgie.

Choix des espèces

L’animal choisi est le modèle le plus adapté pour ce projet, et validé depuis plusieurs années dans notre laboratoire. Le porc, par sa fréquence cardiaque, la taille de son myocarde, son anatomie coronaire, son innervation et l’absence de circulation collatérale native, est un modèle proche de l’Homme. Il permet de réaliser des études précliniques très prédictives sur le plan cardiovasculaire. A 2 mois ½ (25kg), âge minimal souhaité et poids maximal souhaité.

32 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après un jeûne de douze heures, une diarrhée est provoquée par gavage d'huile de ricin, puis chaque animal est isolé quatre heures dans une cage à métabolisme pour recueillir ses selles, le porteur reconnaissant un inconfort et un stress liés à l'isolement. Les intestins sont prélevés après la mise à mort. Le projet teste deux souches de probiotiques et le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne peut remplacer l'animal, dans la perspective d'un futur essai clinique.

Objectifs

La diarrhée est trouble digestif qui touche près de 4,5 milliards de personnes dans le monde chaque année et qui se manifeste notamment par l’émission de selles généralement liquides ou molles, dans une quantité et à une fréquence plus élevée que la normale. Les épisodes de diarrhées aiguës peuvent être la conséquence d’une infection bactérienne, virale ou parasitaire, ou survenir suite à une intolérance alimentaire ou médicamenteuse, notamment suite à la prise d’antibiotiques. Ces épisodes peuvent s’accompagner de déshydratation, de douleur abdominale, de fièvre ... Des médicaments peuvent faire cesser la diarrhée en ralentissant les mouvements intestinaux mais peuvent entrainer par la suite une constipation. D’autres diminuent la secrétion d’eau dans les intestins. Au besoin, des antibiotiques peuvent venir à bout d’une diarhhée causée par une bactérie ou un parasite. Les probiotiques sont des bactéries ou des levures qui modulent la prolifération bactérienne de l’intestin. Ils sont largement utilisés comme compléments alimentaires et comme médicaments dans le traitement et la prévention des diarrhées. Les objectifs de cette étude sont d’évaluer les effets sur la diarrhée et sur la douleur induite de 2 nouvelles souches de probiotiques chez des rats soumis à l’induction d’une diarrhée. Les effets observés seront comparés à ceux obtenus chez des rats traités avec un placebo ou avec un médicament de référence. A l’issue de l’étude, les rats seront euthanasiés et les intestins seront prélevés pour la réalisation d’analyses biologiques.

Bénéfices attendus

La réalisation de cette étude va permettre d’évaluer les effets de 2 nouvelles souches de probiotiques chez le rat soumis à l’induction d’une diarrhée expérimentale, et de comparer ces effets avec un placebo et un médicament de référence utilisé pour le traitement de la diarrhée aigüe. Les données des différents paramètres observés au cours de la mise en cage spéciale, temps de latence d’émission des premières selles, nombre et consistance des selles émises, ainsi que les données comportementales concernant l’activité, la posture, l’aspect de la fourrure et l’ouverture des yeux, et les analyses biologiques qui seront effectuées sur les intestins et le colon prélevés en fin d’expérimentation, permettront d’appréhender les effets bénéfiques ou non de traitements avec ces 2 nouvelles souches de probiotiques sur leur activité anti-diarrhéique et sur les effets sur la douleur perçue chez le rat. Cela permettra d’envisager la réalisation d’une étude clinique chez l’Homme avec l’une ou l’autre de ces 2 nouvelles souches de probiotiques, et à terme de proposer une nouvelle thérapie pour le traitement de diarrhée aigüe.

Procédures

Les rats seront placés à jeun pendant 12 heures avant la réalisation des essais. Après cette mise à jeun, un traitement par voie orale avec les composés à évaluer sera effectué, geste effectué en quelques secondes par une personne expérimentée. Une heure après le traitement, la diarrhée sera induite par administration par voie orale d’un composé induisant une diarrhée expérimentale (huile de ricin), geste également effectué en quelques secondes par une personne expérimentée. Après induction de la diarrhée, les rats seront placés individuellement dans des cages spéciales (cages à métabolisme) pendant 4 heures afin de recueillir les selles émises par chacun d’entre eux et d’observer leur comportement, permettant ainsi d’évaluer l’effet des composés administrés.

Impact sur les animaux

La mise à jeun des animaux la veille au soir de la réalisation des traitements et de l’induction de la diarrhée, nécessaire pour que l’ensemble des animaux soient dans les mêmes conditions physiologiques, va induire une légère perte de poids des animaux. Cette perte de poids sera en effet peu importante car les animaux étant placés en cycle de lumière inversé, la période de jeûne correspondra à la phase lumineuse du cycle au cours de laquelle les animaux sont peu actifs voire inactifs, avec une prise alimentaire très limitée voire nulle. L’induction de la diarrhée va quant à elle induire un inconfort des animaux, se traduisant par l’émission plus ou moins rapide et importante de selles au cours des 4 heures de mise en cage spéciale, et par des modifications du comportement des animaux se traduisant par une baisse de l’activité, une posture plus prostrée, une fourrure plus hérissée, et des yeux moins ouverts. Le traitement avec les 2 souches de probiotiques devraient limiter cet inconfort. La mise en cage spéciale, nécessaire pour recueillir individuellement les selles de chaque rat et observer individuellement le comportement de chaque rat pendant 4 heures suivant l’induction de la diarrhée, va induire un stress modéré par l’isolement et la perte des interactions sociales entre congénères.

Devenir

A l’issue de l’unique procédure expérimentale, les 32 rats seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement des intestins pour la réalisation d’un ensemble d’analyses.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant d’évaluer les effets anti-diarrhéiques et comportementaux de composés. Cela ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir des résultats d’études précédemment menées par notre laboratoire sur ce modèle expérimental de diarrhée, dont certains ont été publiés. Une analyse statistique de l’ensemble des données générées sera réalisée à l’issue des expérimentations.

Raffinement

Au cours de la semaine d'acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux seront placés à 2 par cage avec de l'enrichissement pour assurer leur bien-être, et avec accès libre à la nourriture et à l’eau de boisson. Une attention toute particulière sera portée aux animaux après la réalisation des traitements, l’induction de la diarrhée et la mise en cage spéciale, les animaux étant observés en continu pendant les 4 heures de mise en cage spéciale. L’expérimentation étant de très courte durée, sur 5 heures le jour des essais, les seuls points limites identifiés seraient des convulsions, tremblements ou paralysie des animaux suite à l’administration orale des produits à tester. Cela ne serait pas le cas après administration orale du médicament de référence et du composé induisant la diarrhée car nous avons une très bonne expérience de ce modèle et nous n’avons jamais observé de trouble des animaux traités avec ces composés. Ce modèle étant validé et ayant été utilisé de nombreuses fois en plaçant les animaux individuellement en cage spéciale pour une durée de 4 heures sans habituation à ces dispositifs, aucune habituation des animaux aux cages spéciale n’est envisagée. Les rats seront placés dans une salle d’expérimentation attenante à leur pièce d’hébergement, placée en lumière blanche attenuée pour ne pas les perturber et maintenir des conditions proches de celles de leur hébergement.

Choix des espèces

Le Rat est l’espèce animale la plus adaptée et majoritairement utilisée pour la mise en évidence des effets anti-diarrhéiques de candidats médicaments et de compléments alimentaires. Les animaux seront de jeunes rats âgés de 8-9 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 9-10 semaines pour la réalisation des expérimentations, correpondant à l’âge de rats que nous utilisons pour la réalisation d’expérimentations sur ce modèle de diarrhée.

2 016 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, la trachée est disséquée puis suturée pour y injecter une molécule provoquant une fibrose pulmonaire, avant des prélèvements sanguins et des injections de cellules et de molécules thérapeutiques, le porteur reconnaissant des difficultés respiratoires et une perte de poids. Les poumons sont prélevés après la mise à mort. Des cultures de cellules humaines sont utilisées en parallèle, mais le porteur conclut qu'aucune alternative ne modélise l'"organe entier" et qualifie la souris d'animal "incontournable".

Objectifs

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie chronique, évolutive et mortelle caractérisée par le remplacement du tissu pulmonaire normal par un tissu cicatriciel (fibrose) ne permettant plus les échanges gazeux au niveau des alvéoles pulmonaires. Les patients atteints souffrent d’une dyspnée (difficulté à respirer) qui peut s’aggraver dramatiquement au décours d’une maladie infectieuse respiratoire (exacerbation). Il n’existe actuellement aucun traitement pour stopper la progression de la maladie. Les mécanismes aboutissant à la FPI ne sont que partiellement connus. La FPI résulte d’un processus de cicatrisation excessive des alvéoles pulmonaires en réponse à des agressions répétées (tabac, infections virales, pollution…), et sa progression est probablement favorisée par un dérèglement des cellules immunitaires présentes dans les poumons (inflammation). Parmi ces cellules immunitaires, nous nous intéressons à une population de cellules X qui participent en temps normal à la lutte contre les infections bactériennes et virales. Cependant, ces cellules X constituent une arme à double tranchant car elles sont également capables d’amplifier l’inflammation et la fibrose. Nos résultats préliminaires chez l’homme et chez la souris montrent qu’il existe un lien entre ces cellules X et la progression ou la sévérité de la fibrose pulmonaire. En outre, des publications récentes ont montré leur rôle délétère dans la fibrose du foie. Les objectifs du projet sont 1) de caractériser le comportement des cellules X dans deux modèles expérimentaux de fibrose pulmonaire, 2) d’étudier l’effet de l’absence des cellules X sur la progression de la fibrose, et 3) d’étudier le potentiel thérapeutique de trois molécules capables de bloquer ou activer les fonctions des cellules X. Ces différentes approches fondamentales et précliniques permettraient de valider les cellules X comme nouvelle piste thérapeutique dans la FPI.

Bénéfices attendus

La FPI est une maladie progressive et fatale impliquant des interactions fonctionnelles multi-directionnelles entre tissu pulmonaire et cellules immunitaires. Dans cette étude, nous investiguerons le rôle d’un type de cellules immunitaires dans des modèles murins de fibrose pulmonaire afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques. L’étude de ces interactions complexes d’une façon fiable et appropriée dans nos modèles murins de fibrose pulmonaire assurerait une meilleure connaissance de l’immunologie pulmonaire chez les patients FPI. Les résultats des différentes parties du projet seront profitables, notamment via l’amélioration du diagnostic clinique de la FPI et via le développement de nouvelles thérapies efficaces et ciblées.

Procédures

En début de procédure, les souris recevront, sous anesthésie générale, une injection unique d'une molécule induisant la fibrose pulmonaire. Cette molécule sera injectée directement au niveau de la trachée chez les souris endormies, après dissection de la peau et des tissus sous cutanés : la visualisation directe de la trachée permet une meilleure chance de succès de la procédure. Après injection, la lésion sera suturée par un ou deux points de suture (la totalité de la procédure de l’incision de la peau à la suture durera de 5 à 7 minutes) : la souris recevra un antalgique au cours de la procédure, et qui pourra être répétée. Une semaine plus tard, un prélèvement sanguin à partir de la veine faciale (sous-maxillaire) est prévu (durée 25 secondes) sur animaux vigiles. Entre J9 et J20, les souris recevront deux doses d’une molécule thérapeutique dont on veut évaluer l'action sur la fibrose pulmonaire. L’injection se fera via 2 voies non invasives, la voie intranasale (durée 25 secondes) et la voie intrapéritonéale (durée 10 secondes). Pour la voie intranasale, les souris seront sous anesthésie générale afin d’éviter le réflexe de déglutition et ainsi le passage des molécules injectées dans l’oesophage au lieu de la trachée. Avant l’administration de la molécule thérapeutique, les souris recevront à l’état vigile une injection de cellules X par voie intraveineuse (veine caudale, durée 30 secondes). A l'issue de la procédure, les souris seront euthanasiées.

Impact sur les animaux

Un risque d'irritation au niveau de la cicatrice suite aux procédures est possible et constitue un point de surveillance en post-opératoire. L'induction de la fibrose pulmonaire chez les souris peut déclencher des difficultés respiratoires et une possible altération de l'état général avec perte de poids (entre le 7eme jour, et jusqu'au 14eme jour après injection). Une mise à mort est prévue en cas d'atteinte des points limites inférieur à 10% des effectifs selon notre expérience).

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure en suivant une méthode réglementaire. L'euthanasie de l'animal est nécessaire pour le prélèvement des poumons. Ces prélèvements sont nécessaires pour l’analyse des tissus afin d'étudier et de mieux comprendre les mécanismes immunitaires impliqués dans la fibrose pulmonaire.

Remplacement

Afin de limiter l’utilisation de modèles animaux, des méthodes alternatives sont déjà utilisées dans notre projet, comme des cultures ex-vivo de cellules pulmonaires humaines et une lignée de cellules X humaines. Cependant, ces méthodes alternatives ne nous permettent pas encore de répondre à l’ensemble de nos questions notamment parce que ces modèles n’intègrent pas 1- la complexité de la physiopathologie de la fibrose pulmonaire, 2- le système immunitaire dans sa globalité et 3- ne peuvent pas reproduire le dynamisme du recrutement cellulaire vers d’autres tissus/organes via la circulation sanguine. A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire. En outre, la bonne compréhension des mécanismes immunitaires au sein des poumons est strictement dépendante de l’étude du recrutement des cellules immunitaires issues.

Réduction

D’une part, nous utiliserons l'effectif minimal tout en respectant l’hypothèse scientifique. Le nombre d’animaux, calculé par un test statistique, est de 24 en moyenne par groupe. Ce chiffre tient également compte du risque d'atteindre les points limites définis selon notre grille de score amenant à la sortie précoce des animaux du protocole (habituellement entre 0% et 10% des effectifs entre les jours 7 et 14 après traitement). D’autre part, dans le but de réduire le nombre d’animaux élevés, nous prévoyons d’utiliser non seulement les souris transgéniques portant le gène d’intérêt (enrichies en cellules X), mais également les souris issues des mêmes portées mais ne portant pas le gène d’intérêt (ces dernières seront incluses dans des groupes contrôles). De plus, des stratégies d’optimisation de l’utilisation de chaque animal seront appliquées afin de respecter le principe de réduction : collecter le maximum d’organes de toutes les souris expérimentales, partage des tissus/organes au sein de notre unité de recherche, tri et utilisation des cellules d’intérêt ex vivo

Raffinement

Les contraintes induites par les conditions expérimentales seront réduites par plusieurs approches. L’ensemble des actes sera réalisé par du personnel qualifié et expérimenté. Nous veillerons à ce qu'il n'y ait pas d'animaux isolés dans les cages durant les expériences afin de préserver les groupes sociaux. Les animaux seront anesthésiés lors des procédures. Des antalgiques seront donnés en post opératoire. L'enrichissement consistera en la mise en place de coton dans les cages, et d'une nourriture gélifiée facile à ingérer en cours de protocole. En plus de la surveillance visuelle effectuée quotidiennement par les animaliers, les animaux bénéficieront d'une surveillance clinique après le réveil et jusqu’au moment du sacrifice. Cette surveillance clinique sera effectuée au moins 3 fois par semaine par l'expérimentateur afin de détecter précocément et réduire toute douleur, souffrance et angoisse infligée aux animaux . Cette surveillanve clinique évalue l’apparence de l’animal, son comportement, la diminution du poids et la fermeture de la suture. La fréquence de surveillance clinique des animaux pourra être augmentée selon l'état général des animaux et leur poids. Afin de prévenir une douleur légère, détectée par l’un de ces critères (moindre déplacement ou mauvaise posture ou toilettage excessif ou état défensif ou plissement des yeux) un analgésique sera administré aux animaux. Les souris seront mises à mort dès la détection de points limites.

Choix des espèces

L’utilisation du modèle animal murin dans notre projet se justifie par des raisons scientifiques. D’une part, les modèles de fibroses pulmonaires chez la souris sont largement décrits dans la littérature et reproduisent des aspects cliniques clés de la fibrose humaine. D’autre part, l’étude du système immunitaire murin a conduit vers de nombreuses découvertes dans le domaine d’immunothérapie. Les souris offrent aussi la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et ainsi de cibler le rôle d’un type de cellules immunitaires en particulier dans le poumon. Les cellules X sont très conservées entre espèces et présentent de nombreux points communs chez l’homme et la souris, permettant la mise en place de modèles pré-cliniques bien profitables dans le domaine thérapeutique. A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire, ainsi la souris est un animal incontournable pour répondre à des enjeux de santé humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 8 et 16 semaines. La fibrose pulmonaire est une pathologie du sujet adulte.

20 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une ovariectomie, l'implantation d'une capsule hormonale et des injections destinées à induire une endométriose, avec des douleurs post-chirurgicales et abdominales attendues. Les tissus sont prélevés après la mise à mort. Ce projet pilote vise seulement à mettre au point le modèle, le porteur affirmant qu'aucune méthode in vitro ou ex vivo n'existe et envisageant, en cas de succès, de tester ensuite une molécule sans refaire "toutes les étapes de toxicité".

Objectifs

L'endométriose est une affection gynécologique peristante qui se caractérise par la présence anormale de glandes endométriales et de tissu conjonctif en dehors de l'utérus. Ces lésions sont accompagnées d'une inflammation chronique. L'endométriose touche principalement les jeunes filles et les femmes en âge de procréer. Selon les données de l'Organisation mondiale de la santé, environ 10 % des femmes en âge de procréer (190 millions) dans le monde sont diagnostiquées avec cette maladie. Récemment, le rôle dans l’endométriose d’une protéine impliquée dans le développement du système nerveux central a été suggéré. Ce projet pilote qui utilisera au maximum 20 animaux a pour objectif de mettre en place un modèle murin d’endométriose afin d'étudier dans un prochain projet le rôle de cette protéine dans ce modèle.

Bénéfices attendus

Selon les données de l'Organisation mondiale de la santé, environ 10 % des femmes en âge de procréer (190 millions) dans le monde sont diagnostiquées avec cette maladie. Il existe actuellement peu de solution thérapeutique pour les patientes souffrant de formes sévères de l’endométriose. En 2022, la France a décrété la lutte contre l’endométriose comme cause nationale. Cette demande d’expérimentation a pour objectif la maitrise d’un modèle murin d’endométriose permettant de tester des nouvelles thérapies. Ainsi, nous devrions à terme être capables de tester un candidat médicament ciblant une protéine impliquée dans l’endométriose. A terme, nous proposerons un projet visant à tester l’effet d’une molécule thérapeutique ayant déjà montré un rôle prometteur dans une pathologie gynécologique : le cancer de l’endomètre. Il est important de noter que beaucoup de mécanismes cellulaires décrits dans l’endométriose rappellent ceux observés dans le cancer (multiplication cellulaire, migration à distance). Par conséquent, si nous montrons un effet de cette molécule dans un modèle murin d’endométriose, nous pourrons rapidement prévoir de faire des tests cliniques chez l’homme sans avoir à réaliser toutes les étapes de toxicités.

Procédures

Au sein de ce projet, les animaux seront soumis à plusieurs interventions. Ils subiront une ovariectomie qui visera à retirer les ovaires pour éviter la production d’hormones sexuelles. Les animaux seront également implantés avec une capsule délivrant des hormones. Enfin, les animaux recevront des injections sous-cutanées et une injection intrapéritonéale lors de l’induction de l’endométriose

Impact sur les animaux

Au sein de ce projet, les animaux seront soumis à différentes nuisances. La première des nuisances aura pour origine les douleurs post-chirurgicales. En effet, chaque animal subira l’ovariectomie. Ensuite, les animaux qui développeront l’endométriose pourraient être soumis à des douleurs abdominales liées à la pathologie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour collecter les tissus, puisqu'il faudra analyser les lésions générées par l'endométriose.

Remplacement

L’endométriose est une maladie multifactorielle qui fait intervenir de nombreux processus cellulaires et de nombreuses interactions tissulaires. En effet, l’endométriose est une maladie qui a pour origine la présence d’un tissu anormalement localisé. Le seul moyen de l’étudier est donc de mimer la pathologie chez l’animal en apportant expérimentalement un fragment d’utérus là où il ne devrait pas être. Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro ou ex vivo.

Réduction

Afin de réaliser ce projet de mise au point de ce modèle murin d’endométriose, nous avons décidé de réaliser 5 expériences avec 4 souris par expérience. La taille de l’échantillon testé ne repose sur aucune considération statistique mais seulement sur la prise en compte de la difficulté expérimentale. C'est une procédure pilote. Dans le cas où nous maitrisons le geste au bout de 3 essais, nous ne réaliserons pas les essais supplémentaires.

Raffinement

Afin de réduire la douleur, nous réaliserons l’intégralité des opérations chirurgicales sous anesthésie avec injection pré et post opératoire d’anti-douleur. Nous réaliserons les interventions de chirurgie dans des conditions d’antisepsie (application d’un produit antiseptique sur la région incisée. Avant de commencer la réalisation des chirurgies, il est important de noter que nous nous entrainerons pour la réalisation de ces gestes chirugicaux sur des cadavres (animaux mise à mort surnuméraires ou avec un mauvais génotype).

Choix des espèces

La souris présente l’avantage d’être très similaire à l’homme que ce soit anatomiquement, physiologiquement et génétiquement, c’est un organisme modèle en biologie. Dans notre cas, le modèle d’endométriose murin permet de se retrouver dans des conditions physiologiques très proches de ceux observés chez les patientes touchées par l’endométriose. L’expérimentation sera effectuée sur des souris femelles vierges d’au moins 8 semaines, possédant un utérus mature et fonctionnel.