Recherche fondamentale
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Etude du phénotype cérébrale et craniofaciale d’embryons de souris transgéniques
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
6 330 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 2 010 embryons prélevés puis anesthésiés par le froid. Les adultes subissent un génotypage par prélèvement de l'extrémité de la queue, décrit comme source d'inconfort passager, et les embryons sont prélevés entre le 14e et le 18e jour de développement pour examiner leur cerveau et leur crâne. L'objet est d'évaluer le rôle de variations génétiques dites synonymes dans une malformation rare du cerveau, l'holoprosencéphalie. Le porteur affirme recourir déjà à des cellules souches humaines et à l'édition du génome in vitro, mais conclut qu'un embryon de vertébré reste "essentiel" pour confirmer l'implication des gènes.
Objectifs
L'holoprosencéphalie (HPE) est une anomalie rare du développement du cerveau qui se produit lorsque le cerveau antérieur ne se divise pas correctement. Cette condition, qui touche environ 1 naissance sur 10 000, est associée à des problèmes variables au niveau du cerveau et du visage. Les mutations du gène Sonic Hedgehog (SHH) sont la principale cause génétique de cette maladie. Le dépistage génétique de l'HPE s'est amélioré, mais dans près de 70 % des cas, la cause génétique reste inconnue. Les variants synonymes, qui correspondent à des changements de nucléotides dans la séquence d'ADN sans entraîner de modification des acides aminés de la protéine, sont souvent négligés en raison de leur grand nombre présent dans le génome de chaque individu. Dans cette étude, nous nous intéressons à évaluer le rôle des variants synonymes dans le développement de l'HPE en utilisant un modèle murin. Ce modèle nous permettra de comprendre comment ces mutations peuvent influencer le développement du cerveau et du squelette du crâne, et d'explorer leur pertinence clinique dans l'HPE. Les résultats de cette étude contribueront à améliorer le diagnostic de l'HPE et à mieux comprendre les mécanismes de cette maladie.
Bénéfices attendus
Si ces animaux présentent des anomalies au niveau de l'hypophyse et des os du crâne, cela confirmera l'effet d'une variation génétique sur la maladie. Cette découverte permettra d'approfondir notre compréhension des mécanismes de la maladie. En étudiant ces phénomènes, nous pourrons obtenir des informations précieuses sur la façon dont la maladie se développe et comment elle peut être identifiée chez les patients. Cela ouvrira la voie à de meilleures options de dépistage et de diagnostic, ce qui sera bénéfique pour les personnes atteintes de cette condition.
Procédures
La procédure 1 permettra d'identifier les animaux à partir d’un échantillon de queue prélevé par biopsie caudale. Cela représente 864 animaux par an. La procédure 2 permettra d'explorer le phénotype de la tête des embryons entre les stades E14,5jpc et E18.5jpc (Dernier tiers de développement). Cela représente 402 embryons par an.
Impact sur les animaux
- Les effets indésirables attendus concernent uniquement les adultes devant être soumis au génotypage. Actuellement, le génotypage est effectué en extrayant l'ADN à partir de biopsies caudales ; ce qui peut engendrer une sensation d'inconfort chez l'animal. Cette gêne est passagère et n'entraîne pas de complications majeures.
Devenir
Tout les animaux des procédures 1, 2 et 3 seront euthanasiés
Remplacement
Nous utilisons des technologies innovantes, commme les cellules souches humaines induites et l’édition du génome (CRISPR/Cas9) pour examiner in vitro la fonction des gènes lors de la différentiation du neurectoderme, le tissu précédant la formation du cerveau. Ces études préliminaires nous permettent d’analyser comment un gène spécifique ou une mutation influe sur les processus biologiques liés au développement, facilitant ainsi l'identification des gènes les plus pertinents. Néanmoins, pour confirmer leur implication dans l'apparition de la pathologie, il est essentiel de recourir à un modèle d'embryon vertébré. Le modèle murin est adapté à nos recherches, car il permet d'obtenir des animaux transgéniques et présente des similitudes dans le développement précoce du cerveau avec celui de l'être humain.
Réduction
D’après notre expérience, seulement 70% des femelles accouplées (repérées par la présence d’un bouchon vaginal) développent une gestation. Afin d'éviter l'euthanasie inutile de femelles qui pourraient ne pas être gestantes, nous avons élaboré un protocole qui repose sur la surveillance quotidienne du poids des femelles accouplées. Seules les femelles ayant enregistré une prise de poids suffisante sont considérées comme gestantes. La population d'adultes, qui est élevée et génotypée, est restreinte au maintien de nos lignées transgéniques et à la réalisation des accouplements nécessaires pour obtenir des femelles en gestation pour prélèvement d’embryons. Notre équipe possède une longue expérience dans l'étude du développement précoce du cerveau antérieur chez la souris, englobant des compétences telles que la dissection des animaux, l'évaluation morphologique des phénotypes et l'analyse histologique. Cette expertise, combinée à nos recherches passées sur des modèles liés à notre pathologie d'intérêt, nous permet de diriger nos analyses de manière ciblée et de minimiser l'utilisation d'embryons de souris au strict nécessaire.
Raffinement
Un suivi périodique du score de grimace sera instauré pour les spécimens issus des nouvelles lignées transgéniques. Leur poids et comportement seront surveillés de manière à garantir un suivi constant de leur état de santé, permettant ainsi la détection éventuelle d'un phénotype dommageable. Les embryons seront soumis à une cryoanesthésie immédiatement après leur prélèvement pour assurer éviter toutes douleurs. Pour minimiser la douleur associée au prélèvement de l'extrémité de la queue des souris de 3 semaines, l'équipe de l'animalerie travaille activement à l'exploration de nouvelles techniques de génotypage. Des approches alternatives, comme le prélèvement de poils, de salive ou de fèces, sont actuellement en cours d'étude. Une surveillance quotidienne des animaux ainsi que des conditions d'hébergement est mise en place. Les souris bénéficieront d'un environnement enrichi comprenant du coton et/ou du carton, dans le but de les stimuler et de réduire le stress.
Choix des espèces
Le développement du cerveau chez la souris est proche de celui de l'humain. Le modèle murin présente l'avantage de disposer de nombreuses lignées trangéniques. Les animaux concernés sont soit juvéniles (3 semaines) ou des embryons compris entre 14.5 et 18,5 jours de développement.
Obtention de sérums hyper-immuns de lapin pour tests de séroneutralisation in-vitro en vue de l’élaboration d’un vaccin anti-rotavirus
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
60 lapines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la plupart euthanasiées par ponction cardiaque terminale, celles dont la réponse immunitaire est jugée insuffisante pouvant être replacées. Elles reçoivent deux injections d'un vaccin expérimental puis deux prélèvements de sang à l'oreille, pour produire des sérums riches en anticorps. L'objet réel est de sélectionner la composition d'un futur vaccin anti-rotavirus destiné aux porcs d'élevage. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative pour obtenir ces sérums polyclonaux et retient le lapin comme "espèce alternative classiquement utilisée".
Objectifs
De très nombreux sérotypes de rotavirus sont susceptibles d’infecter les porcs d'élevage causant des pertes économiques à toute la filière et affectant sérieusement le bien-être et la santé des porcelets. Il n'y a pas à ce jour de solution vaccinale satisfaisante. La grande variabilité génétique de cette espèce sur le terrain, engendre une variabilité de protection apportée par les approches classiques monovalentes de vaccination à partir d’antigènes anciens et non ciblés.L'objectif de cette recherche est d'obtenir des sérums hyper-immuns, en vue de réalisation de test in vitro de seroneutralisation pour investiguer les réaction immunitaires croisées entre différentes souches de rotavirus issues du terrain. Ces tests permettront de déterminer la composition optimale d'un vaccin spécifiquement adapté aux rotavirus prévalents actuellement en Europe. Ce vaccin sera utilisé pour vacciner les mères, qui transmettront alors aux porcelets leurs anticorps maternels. Ces anticorps protègeront les porcelets de la maladie dans leurs premiers jours de vie, période de sensibilité maximale au rotavirus. Il s'agit d'une transmission passive d'anticorps de la mère à la descendance, leur conférant un panel complet d'anticorps polyclonaux, approche immunitaire la plus efficace en matière de protection.
Bénéfices attendus
Ces tests permettront de caractériser les protections croisées pouvant exister entre les souches circulant sur le terrain, puis de sélectionner les souches de virus pertinentes pour le développement d'un vaccin ciblé et efficace, et les assemblages d’antigènes apportant un élargissement optimal du spectre de protection vaccinale.
Procédures
Pour tous les animaux (60) : injection d’un vaccin expérimental adjuvé: 2 injections sous-cutanées en un point entre les épaules à 4 semaines d'intervalle (environ 5 secondes); 2 prélèvements de sang à 3 semaines d'intervalle (2 mL, veine marginale de l'oreille, animal vigile, environ 10 secondes).
Impact sur les animaux
Hormis les 2 injections des vaccins expérimentaux (1 mL par injection, injection sous-cutanée en un point à chaque fois, entre les épaules) et les 2 prélèvements de sang (artère auriculaire), aucune nuisance particulière n'est attendue sur les animaux. Les virus entant dans la composition du vaccin étant inactivés, et l’adjuvant étant classiquement utilisé dans le cadre de vaccins commerciaux, aucune réaction générale n’est attendue. Comme lors de toute administration de vaccin, de légères réactions locales transitoires ne sont pas à exclure.
Devenir
Tous les animaux dont les réponses immunitaires donnent des taux d'anticorps exploitables pour les séroneutralisations seront euthanasiés. Les animaux dont la réponse immunitaire n'est pas satisfaisante pourront être replacés si possible.
Remplacement
Il n'y a pas de méthode alternative permettant d'obtenir les sérums requis par le projet. L’administration de vaccins expérimentaux dont les antigènes sont des virus entiers permet d’obtenir un panel d’anticorps polyclonaux représentatif des réactions immunitaires réelles sur le terrain. L'étude de séroneutralisation doit se faire avec ces anticorps polyclonaux, l'utilisation d'anticorps monoclonaux ne serait pas représentative de la réaction immunitaire complète de l'animal in-vivo. Dans le cadre du projet global de développement à long terme d'un vaccin pour les mères afin de transmettre leurs anticorps aux petits, la solution vaccinale apporte une réponse plus efficace et plus simple que d'administrer des anticorps monoclonaux anti-rotavirus directement aux porcelets (plus large spectre, plus rapide à produire, mise en application plus simple et plus éthique de vacciner les mères).
Réduction
Le nombre minimum d'animaux par groupe (3 animaux) est proposé pour tenir compte des différences individuelles de réponse immunitaire. De plus, la quantité de sérum obtenue par lapin (10 mL) à J49 est suffisante pour permettre de réaliser de nouveaux tests de séroneutralisation dans les années futures si de nouvelles souche virales émergeaient et devaient être testées (aliquotage des sérums prélevés, avant conservation à -80°C pour constitution d'une sérothèque). La constitution de cette sérothèque évitera d’utiliser d'autres lapins pour obtenir de nouveau de tels sérums.
Raffinement
Les sérums seront obtenus sur lapin EOPS et non pas sur porc (espèce cible du vaccin) car l’obtention de sérum hyper-immuns à partir de porcs nécessiterait l'hébergement de ces animaux sur une période plus longue (le temps que les animaux deviennent immunocompétents). De plus, la source de lapins EOPS utilisée sera confirmée exempte de rotavirus, alors qu’il n'existe pas de porc EOPS sans anticorps anti-rotavirus. L'utilisation de porcs serait très risquée techniquement (la présence d’anticorps anti-rotavirus nuirait au développement de la réaction immunitaire recherchée) et de nature à susciter des répétitions d’étude. Les animaux seront hébergés de façon collective, par groupes de 3, ceci leur permettant d'exprimer leur comportement grégaire. Même si à J0 les animaux seront non matures (âge 10 semaines), seules des femelles seront utilisées pour éviter les comportements agressifs entre mâles. Le prélèvement cardiaque final se fera sur animal non vigile après euthanasie et vérification de l'arrêt cardiaque. Tous les animaux seront observés quotidiennement pour surveiller leur état de santé et d’éventuelle réaction locale. En cas de dégradation de leur santé une euthanasie est prévue afin d’éviter toute souffrance. Enrichissement : Mise en place de tuyaux en PVC, diffusion de musique, distribution de pebble toys (gallettes de fruits compressés) pour enrichir le milieu des animaux.
Choix des espèces
Le lapin est une espèce alternative classiquement utilisé pour l'obtention de sérum. Ce sont des lapins EOPS (exempts d'organisme pathogènes spécifiques), notamment sans anticorps rotavirus ce qui interfèrerait avec la procédure. Animaux de 10 semaines afin que leur système immunitaire soit mature .
Effet du stress chronique sur la douleur post-chirurgicale chez le rat et la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 480
840 animaux non-humains, 480 rats et 360 souris, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont soumis à un stress chronique destiné à provoquer anxiété et dépression, puis à une incision chirurgicale de la patte, et subissent des dizaines de tests de douleur et de tests anxio-dépressifs, avec un jeûne de 24 heures pour l'un d'eux. Le porteur indique que la douleur ne peut pas être soulagée parce que c'est l'objet même de l'étude, et que les animaux présenteront les signes attendus d'anxiété et de dépression. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut remplacer l'observation comportementale d'un animal vivant.
Objectifs
La douleur chronique post-chirurgicale (DCPC) est une douleur qui perdure au moins 3 mois après une intervention chirurgicale. Elle n’a pas d'autre étiologie et n’est pas du a un problème préopératoire. Son incidence varie de 20 à 85 % et représente un fardeau clinique et économique. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent le développement de la DCPC. Parmi les facteurs de risques potentiels, les facteurs psychosociaux préopératoires, notamment l'anxiété et la dépression, joueraient un rôle clé dans le développement de celle-ci. Les modèles animaux ont fourni des informations essentielles sur l'interrelation et la neurobiologie qui sous-tendent l'association entre dépression et douleur chronique, mettant en évidence le cercle vicieux qui relie ces pathologies. Il a récemment été montré que la douleur post-chirurgicale est prolongée lorsque les animaux sont soumis à un stress conduisant à un état dépressif, ce qui confirme que cette observation clinique peut être reproduite dans des modèles animaux précliniques. L’objectif de ce projet sera d’étudier (1) les effets d’un stress répété et la réponse émotionnelle associée (anxiété, dépression) sur la DCPC puis nous déterminerons (2) les mécanismes neuro-immunitaires impliqués dans le développement, l'expression et le maintien de cette DCPC et des phénotypes anxio-dépressifs induits par le RRS. Ce projet s'efforcera d'examiner et de comparer les effets du stress sur la DCPC chez les mâles et les femelles et de déterminer si des dimorphismes sexuels existent en termes de comportement et de mécanismes neurobiologiques.
Bénéfices attendus
La douleur chronique post-chirurgicale est un résultat potentiellement dévastateur d'une intervention chirurgicale par ailleurs réussie, qui entraîne une augmentation des coûts médicaux directs par l'utilisation de ressources supplémentaires et des coûts indirects par l'absentéisme au travail et la perte de productivité. Elle a également un impact significatif sur les individus et leurs familles, affectant leur fonctionnement physique, leur état psychologique et leur qualité de vie. Ainsi, la compréhension des mécanismes qui sous-tendent le développement de la douleur chronique post-chirurgicale et l'identification de nouvelles stratégies de traitement contribueront grandement à améliorer la qualité de vie des personnes atteintes de cette affection et permettront d’éviter le développement à long terme de cette douleur post-chirurgicale. Cette recherche fournira un nouvel aperçu mécanistique de la façon dont le stress chronique est impliqué dans l'établissement et le maintien de la douleur chronique post-chirurgicale.
Procédures
Les animaux seront soumis à un stress chronique (temps à déterminer pour le rat via une étude pilote durée maximale envisagée de 6 heures et 1h par jour pendant 3 jour pour la souris) qui entraine le développement de troubles anxio-dépressifs ainsi qu’à une douleur de type post-chirurgicale qui perdure 15 jours environ. Ils subiront une chirurgie sous anesthésie gazeuse au niveau de la patte droite de l'animal d’une durée de 5 minutes environ, 48h après la fin du stress chronique. Les animaux subiront 6 tests nociceptifs d’une durée de 20min environ avant la chirurgie, puis 4 tests pendant le stress chronique puis 30 tests après la chirurgie. Ils subiront également 5 tests anxio-dépressifs d’une durée de 5 à 20 min (avec 24h minimum entre chaque test). Pour un de ces tests les animaux seront mis à jeûn 24h avant la réalisation de ce test mais garde accès à la boisson.
Impact sur les animaux
Nous travaillons sur l’effet de l’anxiété chronique sur la douleur post-chirurgicale. Il y a une douleur qui ne peut donc être soulagée car c’est l’objectif de l’étude. De même les animaux présenteront des signes d’anxiété et de dépression car c’est ce qui est attendu. Pour les procédures de stress chronique d'une durée maximale de 6h pour certains groupes d'animaux, il peut y avoir des risques d’irritation de la peau entrainées par une production excessive d'urine. Concernant l’incision de la patte, l'infection de la plaie après l'opération (dans 2% des cas) peut être observée. Chez les rats, une difficulté dans les déplacements peut être présente les heures suivants l’incision mais cette dernière disparaît dans les 48-72h après la chirurgie. Pour l’un des tests comportementaux, les animaux réaliseront un jeûne préalable de 24h.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux sont mis à mort pour prélèvements à la fin de l'étude.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l'analyse de l’effet d’un stress chronique dans un modèle de douleur post-chirurgicale nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Au regard de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 15 souris/rats mâles et 15 souris/rats femelles, le risque de variabilité lié à l’activité intrinsèque de ces réseaux cérébraux étant minime. Un calcul statistique a également été réalisé pour s’assurer que les résultats obtenus sont valides. Cela permet de calculer le nombre de sujets nécessaires pour tirer des conclusions scientifiques statistiquement fiables de notre étude. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés, les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus (souris) ou 2 ou 3 individus (rats) pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la SBEA de l’institut pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Les espèces et les souches utilisées sont représentatives de celles les plus couramment utilisées dans la recherche sur les neurosciences intégratives des systèmes entiers et correspondent à ce qui a été utilisé précédemment pour développer ce nouveau modèle. Les rats Sprague-Dawley sont utilisés couramment dans la recherche sur la douleur. Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, font également de la souris un modèle pertinent. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g pour les souris et poids supérieur à 200g à la chirurgie pour les rats).
Traitement pharmacologique locorégional de la pression générée par la croissance tumorale dans le cancer de côlon
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 90 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent l'implantation chirurgicale d'un aimant sous la peau, des injections intraveineuses répétées, des séances d'ultrasons et une greffe de cellules tumorales dans le côlon suivie de coloscopies, la tumeur pouvant provoquer perte de poids, saignements et diarrhée. L'objet est de tester un traitement anticancéreux ciblé sur la tumeur du côlon au moyen de nanoparticules magnétiques et d'ultrasons. Les retombées pour les patients sont renvoyées au-delà de cinq ans et à d'éventuels essais cliniques, le porteur affirmant qu'aucun système in vitro ne reproduit les pressions mécaniques de la croissance tumorale.
Objectifs
L’un des problèmes majeurs des traitements chimio thérapeutiques dans tous types de cancers est qu’ils sont majoritairement administrés de façon dite systémique, c’est à dire qu’ils se retrouvent présents dans le corps entier et pas uniquement dans les tumeurs à résorber. La nature toxique de ces traitements, bien que plus efficace dans les tumeurs, affaiblit le corps entier des patients, et laisse bien souvent des séquelles après guérison. Dans le cas du cancer colorectal, le traitement actuel standard repose essentiellement sur la chirurgie et la chimiothérapie. Les effets secondaires de cette chimiothérapie sont des nausées, l’inflammation de la bouche et aphtes, des diarrhées ou constipation, perte des cheveux, fatigue, et anomalies sanguines avec baisse des globules rouges, blancs et plaquettes, et fourmillements qui peuvent laisser des séquelles permanents. L’anti-cancéreux Vandétanib (Vande) est déjà autorisé comme chimiothérapie unique pour le cancer de la thyroïde et agit en inhibant l'action de certains récepteurs exprimés à la surface des cellules, dont le récepteur Ret. Ret est par ailleurs un senseur sensible aux contraintes mécaniques dans le colon de souris. Le récepteur Ret est aussi activé dans le cancer du côlon humain et en conséquence, utiliser le traitement Vande dans le cancer du côlon devrait avoir une action thérapeutique bénéfique dans le traitement de la maladie. Mais la Vande est une molécule particulièrement toxique pour le corps entier de l’organisme traité. L’objectif du projet est de mettre au point un traitement locorégional (qui concentre son action sur la zone de la tumeur et sa région avoisinante) par Vande dans les tumeurs du côlon uniquement, en associant Vande avec des nanoparticules magnétiques ciblés par champ magnétique dans le côlon, et en libérant la Vande avec des ultrasons focalisés spécifiquement dans les tumeurs.
Bénéfices attendus
Les gains potentiels consistent non seulement en l’élimination des effets secondaires toxiques de la chimiothérapie Vande pour le corps entier de l’organisme traité (ici la souris pour commencer), mais aussi une meilleure efficacité du traitement concentré dans les tumeurs cible. Du fait de la généricité de l’activation mécanique du récepteur tumorigène Ret dans différents types de tumeurs, mais aussi dans les métastases, ce type de traitement régional des tumeurs pourrait avoir un impact positif dans le traitement tumoral dans nombre d’organes, mais aussi dans celui des métastases chez l’homme. A court terme, c’est à dire durant la durée du projet d’environ 5 ans, la faisabilité d’une telle approche sera testée sur des souris porteuses de tumeurs humaines. A long terme (au-delà de 5 ans), en cas de succès, le procédé pourra être transféré en essais cliniques et pourra bénéficier aux patients, du moins dans le cancer du côlon, et peut-être dans nombre d’autres types de tumeurs, incluant les tumeurs métastatiques.
Procédures
Premier volet du projet : un groupe contrôle recevra seulement une injection intraveineuse dans la veine de la queue avec une solution saline (une fois, sous anesthésie pendant 5 minutes). L’autre groupe suivra une chirurgie pour l’implantation d’un aimant en sous-cutané dans le dos de la souris suivi d’une injection intraveineuse dans la veine de la queue du traitement (une fois par jour, jusqu’à 5 fois de suite toutes les 24h). La pose de l’aimant et son retrait 20 minutes après sera réalisé sous anesthésie pendant une durée maximale de 30 minutes. Les souris de deux groupes seront ensuite soumises aux ultrasons avec une sonde échographique (une fois par jour, entre 1 et 5 fois en fonction de conditions), sous anesthésie et pendant 10 minutes). Les 2 groupes seront divisés à nouveau en 2 groupes: 1) le premier groupe sera injecté dans la veine de la queue (une fois, sous anesthésie pendant 5 minutes). 2) le deuxième groupe, après retrait de l’aimant implanté, sera traité avec des ultrasons avec un échographe pendant 1h (sous anesthésie, une fois par jour). Deuxième volet du projet : les souris anesthésiées recevront une injection de cellules tumorales dans le côlon (contrôle par coloscopie) (durée 60 min max). Un groupe contrôle recevra seulement une injection intraveineuse dans la veine de la queue avec une solution saline (une fois, sous anesthésie pendant 5 minutes). L’autre groupe suivra une chirurgie pour l’implantation d’un aimant en sous-cutané dans le dos de la souris suivi d’une injection intraveineuse dans la veine de la queue du traitement (pose et retrait de l’aimant entre 1 et 5 fois en fonction de résultats obtenus dans le premier volet, sous anesthésie pendant maximum 30 minutes et jusqu’à 5 fois de suite toutes les 24h). Un suivi par coloscopie sera réalisé une fois par semaine sous anesthésie et pendant une durée maximale de 10 minutes. Les souris de deux groupes seront ensuite soumises aux ultrasons avec une sonde échographique (entre 1 et 5 fois en fonction de résultats obtenus dans le premier volet, sous anesthésie et pendant 10 minutes).
Impact sur les animaux
Les animaux seront injectés avec une solution de nanoparticules Ultra-Magnétiques encapsulés dans des Liposomes avec ou sans le médicament (LUM or LUM+Vande) dans la veine de la queue et un petit aimant sera inséré par voie sous-cutanée dans le flanc supérieur droit pour établir la pression équivalente à celle d'une tumeur dans le côlon. La douleur provoquée dans cette partie expérimentale du projet est associée à l'injection et à l'implantation de l'aimant, mais ne devrait pas s'étendre sur le temps où la pression mécanique est établie, maximum 5 jours (aucune réponse inflammatoire associée à la stabilisation des nanoparticules magnétiques n'a été trouvée dans nos travaux antérieurs). La technique d’application des ultrasons focalisés dans les tumeurs est utilisée de manière courante en médecine humaine (similaire à une échographie) et elle est considérée comme une procédure sûre, efficace et non invasive, sans effet indésirable. Egalement pour la stimulation acoustique via une sonde échographique, qui sera réalisée sur des souris anesthésiées. Les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. Les effets indésirables du modèle tumoral incluent une perte de poids, des saignements, de la diarrhée ou des changements de comportement grossiers (échelle des grimaces de souris) qui peuvent apparaître tout au long de la procédure (temps maximum 1 mois).
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Les questions auxquelles nous cherchons à répondre dans ce projet ne peuvent être abordées expérimentalement sans l'utilisation d'animaux en raison de la complexité présentée non seulement par l'architecture et l'arrangement des organes in vivo, mais aussi par leur interrelation et leur rétroaction avec les systèmes immunitaire et circulatoire. Le modèle de souris est le plus approprié pour le développement expérimental de ce projet en raison de plusieurs aspects, notamment la caractérisation approfondie de la maladie et la réponse immunitaire dirigée contre elle. De même, tous ces aspects ont une forte homologie avec l'homme, la souris étant un excellent modèle pour les études précliniques des maladies humaines. Les alternatives de remplacement partielles ou complètes telles que les approches in vitro ou ex vivo comme les cultures de cellules tumorales ou les organoïdes ne peuvent pas imiter avec précision la croissance tumorale in vivo, notamment les pressions de croissance mécaniques associées qui provoquent l’activation des cellules souches cancéreuses. Précédemment, nous avons réalisé des expériences sur deux modèles alternatives, Drosophile et anémones, pour caractériser et inhiber la voie mécano sensible que nous voulons maintenant cibler dans le cadre de ce projet. Pour optimiser au maximum les conditions du traitement, nous avons mis au point un protocole pour obtenir des liposomes magnétiques hautement concentrés en Vande et nous avons ensuite réalisé dans notre laboratoire des expériences in vitro nécessaires pour déterminer les conditions optimales pour le relargage du Vande par HIFU.
Réduction
Les résultats obtenus dans nos projets précédents nous ont permis de réduire et d’ajuster le nombre minimal de souris par condition nécessaire pour obtenir de résultats statistiquement fiables. Le nombre de souris pourra être réduit en fonction des résultats obtenus à chaque étape, permettant de cibler les meilleures conditions d’analyse. Compte tenu de la nature des modèles et du protocole de traitement, nous prévoyons d'utiliser 5 souris par condition de traitement. Nous affinerons constamment notre technique chirurgicale et nos routines de soins postopératoires afin de garantir que seul le nombre minimum de souris sera utilisé.
Raffinement
Toutes les souris seront surveillées quotidiennement et les expériences seront menées de manière à minimiser et à prévenir la douleur. Des soins seront prodigués aux souris pendant et après toutes les opérations chirurgicales afin de surveiller le processus de guérison. L'implantation de l'aimant et l'injection de particules magnétiques seront réalisées sous anesthésie et après injection d’un analgésique pour réduire la douleur post-opératoire. Pour éviter la déshydratation de la cornée un gel ophtalmique hydratant sera déposé sur les yeux. Des soins seront administrés après mise en place sous-cutanée de l'aimant pour contrôler la cicatrisation de la plaie. Les animaux seront surveillés tous les jours pendant la durée de l’expérience. Le bien-être des souris sera contrôlé quotidiennement tout au long de l'expansion de la tumeur, de l'implantation de la xénogreffe colique et de la croissance de la tumeur, ainsi que tout au long de la phase de traitement, afin de s'assurer du bon état clinique des animaux et, le cas échéant, de mettre en place des soins support adaptés à la situation. Toutes les souris recevront les anesthésiques, les analgésiques, les anti-inflammatoires et les soins postopératoires appropriés. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux et sera utilisée afin d’arrêter l’expérimentation dès atteinte d’un point-limite.
Choix des espèces
Ce projet nécessite l’utilisation d’un modèle animal anatomiquement proche de l’humain en vue d’une application clinique chez l’homme. La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en cancérogenèse et pour les essais thérapeutiques sur le cancer du côlon parce que les médicaments sont métabolisés de la même manière que chez l'homme, ce qui rend obsolète l'utilisation de lignées cellulaires ou d'autres animaux comme les poissons. Ainsi, la seule option disponible pour obtenir la croissance de tumeurs humaines chez la souris est d'utiliser une souris avec un fond immunodéficient pour permettre la croissance de cellules cancéreuses humaines. Les souris utilisées pour les expériences seront des souris adultes à partir de 3 mois et jusqu’à 6 mois maximum. Les expériences doivent être réalisées sur des souris avec un système immunitaire parfaitement développé.
Elevage de souris immunodéficientes pour étudier le développement de cancers humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
5 500 souris vont être utilisées dans un élevage de cinq ans, accouplées sur plusieurs cycles de reproduction, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ces souris n'ont pas de système immunitaire, ce qui les rend selon le porteur sensibles aux infections, avec comme signes possibles un amaigrissement, un poil terne, un isolement ou des troubles du comportement pendant l'allaitement, et ce qui permet de leur greffer des cellules humaines, cancéreuses ou non. Le porteur revendique une production locale de souris "non stressées par un voyage", testées au préalable pour leur capacité à accepter les greffons, et ajustée aux "besoins des projets expérimentaux". Il annonce la mise à mort des reproducteurs en fin d'élevage, "trop âgés" pour d'autres procédures, sans dire ce que deviennent les souriceaux nés de ces accouplements.
Objectifs
L'objectif du projet est d'étudier les mécanismes biologiques impliqués dans le développement normal et pathologique de différents types de cellules humaines, en particulier de certains cancers humains, comme les cancers du sang appelées leucémies. Certaines expériences, par exemple, nécessitent la transplantation de cellules humaines malades chez les animaux, pour créer des modèles expérimentaux in vivo permettant d’étudier et de traiter le développement du cancer ciblé par de nouvelles stratégies thérapeutiques, potentiellement applicables dans le futur aux patients. Ces projets reposent donc sur la greffe de cellules humaines normales ou cancéreuses, issues de patients, qui ont besoin d'une environnement particulier pour se développer, sans être rejetées pour le système immunitaire de l'hôte (ici la souris) transplanté. On parle de xénogreffe. Nous réalisons ces élevages localement afin de pouvoir disposer de souris bien intégrées dans leur environnement, non stressées par un voyage, en nombre suffisant et que nous avons préalablement testées pour leur capacité à accepter les greffons humains.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont de disposer de modèles animaux murins de qualité, en bonne santé, non stressées et bien intégrées dans notre animalerie, que nous avons testées au préalable pour être de bonnes receveuses de cellules humaines normales et cancéreuses, permettant d'avoir des résultats scientifiques reproductibles rapidement et donc d'utiliser moins d'animaux. En outre, la production locale de ces deux lignées pourra aider à comprendre plus rapidement comment traiter des cancers pour lesquels à l’heure actuelle les traitements sont à améliorer. Le fait de les produire en local permet aussi un gain de temps dans l’étude et la recherche de traitement.
Procédures
Les souris seront mises en accouplement pour plusieurs cycles de reproduction pendant les 5 ans de la procédure.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées sont immunodéficientes (sans système immunitaire), elles sont donc théoriquement sensibles aux infections bactériennes et virales. Les effets indésirables pourraient être en lien avec une infection (amaigrissement, poil terne, isolement, changement de comportement lors de l’allaitement)
Devenir
Les souris utilisées pour la reproduction seront euthanasiées en fin de procédure d'élevage car ces animaux seront trop âgés pour être replacés dans d'autres procédures expérimentales.
Remplacement
Les projets que nous développons étudient le développement physiologique normal et pathologique du sang (notamment le développement de certains cancers du sang comme les leucémies). Quand cela est possible nous réalisons des expériences de culture cellulaire. Toutefois certains aspects ne peuvent pas être réalisés dans une boite de culture (in vitro) car ils nécessitent d’être étudiés dans un organisme entier et font notamment appel à la complexité des interactions entre cellules dans un organe entier ou entre différents organes qu'il n'est pas possible de générer autrement que dans un modèle animal. Il n'y a donc pas d'alternative non animale aux élevages de ces souris, même si nous faisons de notre mieux pour étudier les questions déjà ex-vivo avant de poser des questions in-vivo.
Réduction
Nous essayons de rationaliser notre production d'animaux, donc de ne pas avoir trop de couples en route, afin d'éviter une sur-production par rapport à la demande pour les projets en cours. Si les productions de souriceaux sont optimales pour répondre aux besoins des projets expérimentaux, nous régulons la production en diminuant le nombre de couples. Le nombre d’animaux prévu pour ces élevages dépend des projets de recherche dans lesquels ils sont utilisés. Nous l'avons calculé en prenant comme base des travaux de recherche réalisés au sein de notre laboratoire sur les dernières années et en essayant de programmer au mieux nos futurs projets.
Raffinement
Les souris immunodéficientes sont élevées et accouplées en confinement, sous atmosphère filtrée, donc exempt de pathogènes, soit en isolateur, soit en cages de portoir ventilé. Les changes des cages sont réalisés sous poste de sécurité microbiologique afin de réduire au maximum les risques de contact avec des agents infectieux. L'eau de boisson est une eau filtrée en bouteille du commerce et l'alimentation est stérilisée par irradiation. Toutes les manipulations des animaux sont réalisées avec des gants et des pinces aseptisées à l'alcool.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris qui sont des mammifères de petite taille à l'âge adulte, faciles à élever et à reproduire en captivité. Leurs génétique et comportement sont bien connus ce qui permet de mesurer facilement le bien-être, la souffrance et l'angoisse des animaux en captivité et d'y remédier le cas échéant ; ce qui en fait un bon modèle pour atteindre les objectifs scientifiques adossés aux élevages. Dans ce protocole nous avons besoin de souris adultes, en âge de reproduction, qui sont une espèce bien intégrée. Les souches de souris que nous élevons n'ont pas (ou peu) de défense immunitaire ce qui permet à des greffons cellulaires d'origine étrangère (nous travaillons avec des cellules humaines normales et cancéreuses et on parle de xénogreffe) de s'implanter et de se développer.
Étude des effets du sexe sur le métabolisme de souris juvéniles nourries avec un régime pauvre en protéines
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, tandis que 35 mères non soumises aux procédures sont réutilisées. Les souriceaux sont soumis dès le sevrage à un régime pauvre en protéines qui freine leur croissance, à un probiotique déposé dans la joue cinq jours sur sept, à une pastille d'estrogène et à des tests de tolérance au glucose avec prélèvements de sang répétés au bout de la queue. L'objet est d'étudier les effets du sexe et d'un probiotique sur le métabolisme dans un contexte de malnutrition infantile. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité d'un "organisme dans son entier" et retient la souris comme modèle en nutrition humaine.
Objectifs
La malnutrition infantile est un problème majeur à travers le monde, qui impacte négativement l'équilibre glucidique. Des études ont montré que le microbiote des individus mal nourris était sévèrement impacté. De plus, un traitement avec une bactérie probiotique (micro-organisme vivant qui, lorsqu’il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets positifs sur la santé, au- delà des effets nutritionnels traditionnels) permet d’améliorer l’équilibre glucidique chez des souris femelles et mâles malnutris, avec des différences entre les sexes. L'objectif de ce projet est donc d'explorer de façon détaillée l’effet de cette bactérie probiotique dans un contexte de malnutrition protéique sur le métabolisme glucidique et d'examiner l’effet des hormones féminines dans ces conditions.
Bénéfices attendus
Les altérations métaboliques induites pas la malnutrition dans un contexte juvénile sont encore mal connues, de même que les effets bénéfiques des probiotiques. Ce projet permettra d’identifier les modifications précises qui s’opèrent lors d’un régime métaboliquement délétère et d’évaluer les potentiels effets positifs d’un traitement avec une bactérie probiotique. Nous pourrons ainsi identifier au cours du projet de futures cibles thérapeutiques permettant d’optimiser à long terme la prise en charge des enfants souffrant de malnutrition au travers d’un traitement nutritionnel et probiotique adapté.
Procédures
- Les animaux seront soumis à un régime nutritionnel faible en protéines ou à un régime contrôle pendant la durée de la procédure, ainsi qu’à un traitement avec une bactérie probiotique ou un placebo dans le creux de la joue 5 jours sur 7. Le traitement dure environ 1 minute par souris. - Une partie des animaux recevra une pastille de placebo ou d’estrogène en sous-cutanée (une seule injection au début de la procédure). Cette injection prendra 2-3 minutes. - Des tests de tolérance au glucose, à l’insuline et au pyruvate seront réalisé sur les animaux vigiles et 7 prélèvements sanguins (2-3 μL) seront réalisés au bout de la queue afin de mesurer la glycémie au cours du temps. Les animaux soumis à un test de tolérance orale au glucose subiront un gavage ainsi que trois prélèvements additionnels de 20 µL pour mesurer l’insulinémie au cours du temps. L’ensemble des interventions seront réalisées sur 160 animaux (80 animaux recevront un test de tolérance au glucose, à l'insuline et au pyrivate ; les 80 autres animaux auront un test de tolérance au glucose ainsi qu'un test de tolérance à l'insuline).Chacun de ces tests dure deux heures au total. - Un seul prélèvement de 200 µL de sang sera réalisé sur animal vigile avant la mise à mort. Ce prélèvement durera environ 1 minute.
Impact sur les animaux
Cette procédure devrait entraîner des nuisances modérées sur les animaux. - Le régime pauvre en protéines utilisé dans le cadre de ces procédures vise à modéliser le retard de croissance induit par la malnutrition protéique chronique, il entraîne donc une plus faible croissance en taille et en poids par rapport au régime contrôle pendant la durée de la procédure. - Les tests de tolérance au glucose et au pyruvate impliquent des prélèvements sanguins au bout de la queue pouvant induire une douleur et un stress. - La délivrance d’estrogènes chez des mâles juvéniles peut s'accompagner de la modification de certains paramètres métaboliques et d'une légère réduction de la croissance.
Devenir
L'ensemble de animaux mis en procédure seront mis à mort en vue du prélèvement des organes d'intérêt. Les 35 mères, qui n'auront pas subi de procédure expérimentale, seront réformées dans l'animalerie.
Remplacement
Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires et d’une bactérie probiotique, ce qui nécessite une étude chez l’animal. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d'un organisme dans son entier dans un contexte de malnutrition et pour l'étude des fonctions métaboliques liées à la communication entre plusieurs organes. C'est pourquoi cette étude nécessite l'expérimentation animale. La souris sera utilisée car il s'agit d'un bon modèle pour étudier les modifications induites par une malnutrition protéique sur le métabolisme dans un contexte physiologique, ainsi que les conséquences locales et systémiques de ces modifications.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus, tout en contournant le problème de la variabilité inter-individuelle des paramètres étudiés. Le nombre de 10 animaux par groupe a été évalué en prenant en compte la puissance du test statistique souhaité (90%), la différence de moyenne attendue entre les groupes ainsi l’écart-type attendu des données au vu de nos résultats précédents. Dans une optique de réduction, nous allons prélever en fin de procédure l’ensemble des organes qui pourraient nous intéresser (muscle, tissu adipeux par exemple) mais sur lesquels nous n’avons pas prévu de travailler pour le moment et les conserver au congélateur pour d’éventuelles analyses ultérieures. Notre protocole expérimental utilisera des souris issues d’une reproduction chez un fournisseur agréé. Le choix d’utiliser des souris issues d’un fournisseur nous permettra de mieux contrôler certains paramètres liés à l’âge et à la croissance juvénile afin d’assurer une analyse pertinente et un résultat statistiquement significatif. Les mères seront réutilisées pour d’autres procédures.
Raffinement
Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de cette procédure expérimentale, une surveillance accrue des animaux sera mise en place avec des visites quotidiennes. La croissance en taille et en poids sera mesurée individuellement chaque semaine afin d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. Les animaux seront tatoués en début de procédure afin de permettre un suivi individuel de ces paramètres. La prise alimentaire sera également mesurée pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement, et la nourriture sera mise directement dans la litière au début de la procédure expérimentale afin de faciliter l’accès aux souriceaux qui viendront d’être sevrés. Lors des tests de de tolérance à l’insuline et au pyruvate, l’apparition d’un œdème ou d’un gonflement au point d’injection sous-cutanée ainsi que la bonne cicatrisation du bout de la queue suite aux prélèvements sanguins seront surveillés quotidiennement et pourront donner lieu à l’application locale d’antiseptiques le cas échéant. Lors du test de tolérance à l’insuline, si la glycémie des animaux chute sous une valeur limite au cours de l’expérience, celle-ci sera arrêtée et les animaux recevront une injection intrapéritonéale d’une solution de glucose. L’atteinte des points limites entraînerait alors la mise à mort des individus concernés. Le protocole du régime expérimental et l’administration de probiotique a déjà été employé au laboratoire et ne devrait pas apporter de souffrance animale.
Choix des espèces
La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin de comparer l'effet d'un probiotique dans une étude nutritionnelle. Les animaux utilisés seront suivis à partir du jour d'identification par tatouage dans la paume de patte , et pendant les 35 jours de traitement post-sevrage (traitement commencé à jour 21 (P21) en fonction du poids du juvénile (poids non inférieur à 8g) jusqu’à jour 56 (P56). L'objectif du projet est d'étudier les effets d’un probiotique sur le métabolisme pendant la période juvénile. Pour cela, les animaux doivent être inclus dans la procédure dès le sevrage, qui est une période clé pour la croissance et la maturation métabolique.
Modèle préclinique de vaccination avec biopuces
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
590 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections de biopuces, puis sont infectées par gavage avec la bactérie Salmonella Typhimurium et développent les symptômes de la maladie, avec pesée quotidienne et prélèvement de sang par voie rétro-orbitale avant la mise à mort. L'objet est une preuve de concept sur l'usage de biopuces chargées en bactéries inactivées comme vaccin. Le porteur qualifie cette recherche de vaccin d'"indispensable" et affirme que la protection ne peut être évaluée que sur un modèle animal entier.
Objectifs
Les Salmonelles sont des bactéries intracellulaires Gram négatives dont les souches non typhiques, parmi lesquelles Salmonella Typhimurium, provoquent des gastro-entérites spontanément résolutives (95 millions de cas par an au niveau mondial) mais aussi des infections systémiques chez les enfants, personnes âgées et patients immunodéprimés avec des taux de létalité élevés (3,4 millions de cas et 680 000 décès par an au niveau mondial). Le contact direct et indirect avec de nombreuses espèces d'animaux infectés, leurs excréments et les denrées qui en sont dérivées, la viande, le lait cru, les œufs, les produits à base d'œufs et l'eau contaminés sont souvent à l'origine des Salmonelloses. Il s'agit donc d'un important problème de santé publique et des approches vaccinales sont donc pertinentes pour protéger les populations à risque. Cependant, jusqu'à présent aucun vaccin n'a encore fait l'objet d'essais avancés. Notre projet vise à utiliser des biopuces chargées avec des bactéries pathogéniques Salmonella Typhimurium inactivées dans un cadre vaccinal afin d'induire une protection chez la souris et étudier cette protection. Cela représenterait la première preuve conceptuelle de l'efficacité de telles puces en vaccination.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera une preuve de concept de l'utilisation de biopuces chargées en agents pathogènes inactivés comme méthode de protection contre ces agents in vivo et potentiellement une solution vaccinale innovante. En effet, s’il existe une solution vaccinale disponible dans un cadre vétérinaire pour les poulets, aucun vaccin contre les salmonelles n’est disponible chez les mammifères. Or, comme indiqué plus haut, les souches de salmonelles non typhiques comme Salmonella Typhimurium peuvent entrainer des infections systémiques chez les enfants, personnes âgées et patients immunodéprimés avec des taux de létalité élevés, rendant la recherche de nouvelles approches vaccinales telles que celle proposée dans ce projet indispensable.
Procédures
1- Injection des biopuces par différentes voies d'administration (intrapéritonéale, intraveineuse, intradermale, intramusculaire et intraplantaire) sur animaux anesthésiés une à trois fois espacées d'une semaine. 2- Gavage des souris avec les salmonelles en une seule prise effectuée sur souris vigiles. 3- Perte de poids mesurée sur souris infectées vigiles réalisée quotidiennement le soir. 4- Prélévement sanguin rétro-orbital sur souris anesthésiées réalisé une fois juste avant euthanasie. Chacune de ces interventions dure moins d'une minute par animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables de courte durée attendus sont les anesthésies à l'isoflurane nécessaires à l'injection des biopuces et aux prélévements rétroorbitaux ainsi que les gavages sur souris vigiles. L'injection des biopuces chargées en salmonelles inactivées est susceptible d'induire une inflammation.Les infections par les salmonelles pourront entrainer les symptômes classiques de la maladie chez la souris.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure et les tissus d'intérêt prélevés en vue d'analyses.
Remplacement
Les analyses préalables effectuées in vitro sur des cellules primaires pertinentes (cellules présentatrices d'antigènes, lymphocytes B et T) permettent d'évaluer la cytotoxicité et la dose optimale de biopuces/cellule cible. Par contre, la protection conférée par cette stratégie vaccinale innovante ne peut être évaluée que sur un modèle animal murin entier dont l’infection par Salmonella Typhimurium est connue pour mimer les conditions d’infection systémique chez l’homme (recherche préclinique).
Réduction
Le projet est organisé de façon à réduire au strict nécessaire le nombre de tests et donc de souris utilisées. Le nombre estimé de souris nécessaires à ce projet (590) a été calculé à l'aide d'un logiciel approprié afin d’obtenir une puissance statistique d'au moins 80% avec une erreur de première espèce de 5%.
Raffinement
Afin de limiter leur stress, les souris seront acclimatées à leur nouvel environnement pendant une semaine avant toute expérimentation. Elles seront hébergées dans des cages de 530 cm² avec la nourriture et l’eau fournies à volonté. Des dômes et du papier seront mis à disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. La température, l’hygrométrie et la photopériode de l’animalerie sont contrôlées et régulées. Les souris seront anesthésiées pour réaliser les expérimentations. Les injections intraplantaires seront réalisées sur le dessus de la patte pour éviter toute gêne lors de la marche. Lors des expériences d’injection des biopuces et d'infection par les salmonelles sur les animaux vaccinés ou non avec les biopuces, le poids et l’apparition des symptômes de la salmonellose seront suivis quotidiennement en fin de journée afin de respecter le cycle de sommeil de la souris. Le score de souffrance animale sera calculé suivant les points limites des 4 catégories suivantes : apparence générale , prise alimentaire et poids corporel, détection de signes cliniques et comportement général. Suivant le score obtenu des mesures seront prises pour soulager l'animal, administration d'analgésique ou dans les cas les plus sévères euthanasie.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle idéal pour effectuer les expérimentations prévues dans ce projet. Son infection orale par Salmonella Typhimurium est en effet connue pour mimer une infection systémique par les salmonelles chez l’homme et est donc parfaite pour tester l’efficacité vaccinale dans un modèle préclinique. Le modèle murin permet aussi d'étudier les réponses immunitaires spécifiques d'antigènes modèles utilisés dans le cadre de ce projet et d'analyser précisément les populations immunitaires et leur état d'activation grâce au grand nombre d'anticorps disponibles sur le marché pour cette espèce. Afin de limiter les variations expérimentales qui seraient dues à des différences d'âge, les souris seront utilisées à l'âge adulte entre 6 et 8 semaines.
Rôle de sous-populations de neurones à POMC dans la préférence à la nourriture hypercalorique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
3 709 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont hébergées seules dès sept semaines, subissent une neurochirurgie avec injection intracérébrale sous anesthésie, des gavages cinq jours de suite, une immobilisation en tube et un séjour de dix jours en cage métabolique fermée, pour étudier des neurones qui pourraient pousser à consommer des aliments hypercaloriques. Le porteur reconnaît que l'isolement social est une source de stress amplifiée par les cages métaboliques. Les retombées annoncées contre l'obésité sont renvoyées au long terme, et le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ni informatique ne peut remplacer l'animal pour étudier le comportement alimentaire.
Objectifs
La capacité à identifier et consommer des aliments riches en calories est primordiale à la survie des individus dans le règne animal, en particulier lorsque l’accès aux sources de nourriture est dangereux et/ou incertain. Des mécanismes biologiques, notamment cérébraux, œuvrent ainsi à analyser la nourriture consommée et guider l’individu vers des aliments caloriques, permettant de constituer des réserves qui assureront sa survie en cas de pénurie. Cependant, ces mêmes mécanismes biologiques peuvent devenir un handicap lorsque de la nourriture hypercalorique est disponible facilement et sans aucune restriction. En effet, en favorisant l’accumulation excessive de graisse corporelle, ces mécanismes peuvent conduire au développement de l’obésité et de nombreuses comorbidités associées (diabète de type 2, maladies cardiovasculaires, certains types de cancers, etc.). Dans ce contexte, il existe dans notre cerveau des neurones capables de détecter différents nutriments issus de l’alimentation, afin d’adapter nos choix alimentaires. Certains de ces neurones ont longtemps été considérés comme responsables de la satiété, mais des études récentes ont dévoilé leur grande hétérogénéité. Une sous-population particulière de ces neurones s’active préférentiellement lorsque des aliments hypercaloriques sont ingérés. Les raisons et conséquences de cette activation ne sont cependant pas connues, et c’est ce que nous cherchons à étudier dans ce projet. Notre hypothèse est que certains de ces neurones pourraient, dans des conditions particulières, augmenter la consommation d’aliments hypercaloriques, ce qui irait à l’encontre du rôle de promoteur de la satiété qu’on leur connaît actuellement.
Bénéfices attendus
À l’heure actuelle, l’Organisation Mondiale de la Santé estime à plus d’1 milliard le nombre de personnes obèses à travers le monde, ce qui représente un problème de santé publique de la plus haute importance. Malheureusement, les traitements disponibles à l’heure actuelle ne sont que peu efficaces pour lutter contre cette pathologie, et seules des techniques chirurgicales extrêmement invasives permettent une perte de poids durable (sans garantie de succès systématique). Il est donc crucial d’approfondir nos connaissances sur les mécanismes biologiques participant au développement de l’obésité, dans l’espoir de fournir à l’avenir de meilleurs traitements aux personnes affectées. À court terme, notre projet apportera des informations nouvelles sur les mécanismes biologiques qui favorisent la consommation d’aliments hypercaloriques et participent ainsi au développement de l’obésité et des comorbidités associées. En outre, il s’inscrit pleinement dans un contexte de recherche international visant à décrypter les rôles spécifiques des différentes sous-populations de « neurones de la satiété ». À plus long terme, ce projet pourrait ainsi conduire à la mise au point de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre l’obésité.
Procédures
Voici la liste des interventions sur les animaux : 1) Hébergement individuel (3709 souris) : toutes les souris de ce projet seront hébergées de manière individuelle dès l’âge de 7 semaines, jusqu’à la fin de l’étude, pour une durée variant de 6 à 17 semaines, suivant les lots. 2) Neurochirurgie (3533 souris) : cette technique d’injection intra-cérébrale est réalisée sous anesthésie générale, pour une durée totale d’environ 90 minutes. Une injection sous-cutanée sera réalisée sur souris vigiles 30 minutes avant la neurochirurgie, puis 1 par jour dans les 2 jours suivants, afin d’administrer les médicaments anti-douleurs. Six autres injections sous-cutanées seront réalisées lorsque les souris seront anesthésiées (2 d’anesthésiques locaux, 1 d’anti-douleur et 3 de réhydratation). Les souris concernées ne subiront qu’une seule neurochirurgie au cours de l’étude. 3) Injections sous-cutanées (3533 souris) : en-dehors de la neurochirurgie, les souris recevront des molécules par injection sous-cutanée ponctuelle sans anesthésie. Au maximum, 6 injections séparées d’au moins 1 semaine. 4) Injection abdominale (3621 souris) : ces souris recevront un euthanasiant par voie abdominale (injection unique), sans anesthésie préalable. 5) Gavage oral (2696 souris) : un gavage oral sera réalisé 1 fois par jour durant 5 jours, sans anesthésie. 6) Immobilisation (2016 souris) : l’analyse de la composition corporelle nécessite que la souris soit bloquée en position fœtale à l’extrémité d’un tube en plastique, pour une durée maximale de 5 minutes, sans anesthésie. Les souris subiront 2 analyses de ce type au cours du projet, espacées de 4 semaines. 7) Cages métaboliques (2016 souris) : les souris seront transférées dans des « cages métaboliques » hermétiquement fermées, ce qui augmente leur état d’isolation social. Elles vivront dans ces cages pour une durée de 10 jours. Cela n’aura lieu qu’une seule fois au cours de l’étude. 8) Mise à jeun (1605 souris) : pour certaines expériences, les souris seront mises à jeun pendant 3 heures, au cours de la phase diurne (phase inactive, équivalent de la nuit pour les rongeurs).
Impact sur les animaux
Les différents tests utilisés dans ce projet nécessitent de pouvoir étudier la prise alimentaire individuelle des souris. Toutes les souris de ce projet seront donc hébergées de manière individuelle dès l’âge de 7 semaines et jusqu’à la fin des procédures. Cette absence d’interactions sociales est une source de stress pour les animaux. Ce stress d’isolement sera amplifié chez les souris qui vivront pendant 10 jours dans les cages métaboliques, hermétiquement fermées. Certaines souris subiront un stress d’immobilisation (de 5 min) lors de l’analyse de composition corporelle, qui se déroule dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Enfin, des douleurs post-opératoires sont possibles pour les souris qui subiront une neurochirurgie. Ces douleurs devraient s’estomper dans les jours suivant la chirurgie, grâce au traitement analgésique mis en place.
Devenir
À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des tissus seront récupérés (cerveaux ou autres), pour des études réalisées post-mortem.
Remplacement
Le but de ce projet est d’étudier la relation entre l’activité de certains neurones et la consommation d’aliments hypercaloriques. Dans ce contexte, les neurones nous étudions interagissent avec d’autres structures du cerveau mais également avec d’autres organes qui influencent leur activité, notamment via des hormones. Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre tous ces acteurs biologiques. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et les caractéristiques étudiées ici telles que le comportement alimentaire nécessitent évidemment un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.
Réduction
Nous avons utilisé un test statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Nous avons regroupé dans la mesure du possible différents tests sur les mêmes lots de souris, et avons conçus nos expériences de manière à obtenir un maximum d’informations à partir des mêmes animaux. Par exemple, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes souris, au lieu d’avoir recours à des lots différents. Le nombre d’animaux que nous demandons est le nombre maximal dont nous estimons avoir besoin. Si nous nous rendons compte en cours de projet que ce nombre peut encore être réduit, il le sera bien évidemment (par exemple en regroupant les mâles et les femelles dans nos analyses, si nous constatons que le sexe n’influence par les résultats de nos tests).
Raffinement
Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux seront habitués pendant au moins 2 semaines avant le début des expériences. Celles-ci seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnets en bois pour ronger et de tunnels en carton, qui permettront aux souris de se cacher. En outre, nous utiliserons ces tunnels pour transporter les souris, qui est la méthode de manipulation la moins stressante pour ces animaux. 3) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 4) Notre étude nécessite de réaliser sur certains animaux une neurochirurgie, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole analgésique approprié. Durant la chirurgie, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique ou de vaseline médicale. Le traitement anti-douleur se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 5) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été́ définis, en fonction de différents critères cliniques et comportementaux. Une grille de scores permet de prendre des décisions adaptées en cas de modification de l’état de l’animal. Il peut s’agir soit de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude (après avis vétérinaire), soit de sa mise à mort si rien ne peut être fait pour le soulager.
Choix des espèces
La régulation du poids corporel et du comportement alimentaire sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De plus, les lignées transgéniques dont nous avons besoin pour mener à bien ce projet ont été créées chez la souris. Enfin, la forte proximité́ biologique entre l’Homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de cette espèce un bon modèle prédictif. Toutes les souris de ce projet arriveront à l’âge de 6 semaines dans notre animalerie, mais nous ne débuterons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines, sur des souris adultes. Cet âge est celui auquel on estime que le crâne a fini sa croissance, ce qui nous permet d’utiliser les atlas cérébraux de référence nécessaires à la neurochirurgie.
Thérapie ciblée des maladies chroniques du foie chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
946 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil ou impliquant un niveau de souffrance modéré. Une fibrose du foie est induite par chirurgie, puis les animaux reçoivent des injections de vecteurs de thérapie génique et des séances d'imagerie hebdomadaires sous anesthésie, avant prélèvement terminal du foie entier. Le porteur affirme que le ciblage d'un organe par un vecteur injecté dans la circulation n'est pas modélisable in vitro. Les applications thérapeutiques chez l'humain restent annoncées comme précliniques et lointaines.
Objectifs
Les maladies du foie, de causes très variées (excès de gras, alcool, virus, médicaments, atteinte biliaire, génétique etc), sont un enjeu majeur de santé publique. Elles mènent à la cirrhose qui est la 14ème cause de mort dans le monde et au cancer du foie, 3ème cause mondiale de décès par cancer. Quelle que soit l’origine de la maladie, un tissu cicatriciel excessif responsable de la maladie est fabriqué par des cellules appelées « myofibroblastes ». En même temps, les cellules assurant les principales fonctions du foie appelées « hépatocytes » meurent. De nombreux traitement ont été proposés mais jusqu’à présent aucun ne s’est montré satisfaisant par manque d’efficacité de ciblage sécurisé d’un type cellulaire présent dans le foie et l’apparition d’effets secondaires indésirables (ex : l’élimination de cellules saines en même temps que les cellules pathogéniques). Ce projet vise à développer et tester l’efficacité préclinique d’un vecteur de thérapie génique permettant l’élimination spécifique des myofibroblastes rendant le foie malade quelle que soit l’origine de la maladie, et d’un vecteur de thérapie génique protégeant les hépatocytes de la mort au cours des maladies chroniques du foie.
Bénéfices attendus
Il n’existe aucun traitement curatif des maladies chroniques du foie. Ce projet comprend des études précliniques de validation de vecteurs de thérapie génique ciblée pour les maladies chroniques du foie chez les animaux en vue d’application clinique thérapeutique chez l’humain.
Procédures
Des souris auront une intervention chirurgicale unique et terminale, sous anesthésie générale et sous analgésique (10 min). Des souris subiront une opération chirurgicale d’environ 15min sous anesthésie générale et sous analgésique. 15 jours après ces souris auront une intervention chirurgicale terminale, sous anesthésie générale et sous analgésique (10 min). Des souris recevront une injection (5min). Une partie d’entre elles recevront une deuxième injection 1 à 3 semaines après (5 min). 1 fois par semaine, pendant 2 mois maximum, ces souris seront soumises, en même temps, à une imagerie médicale d’une durée de 10 min et à un prélèvement d’un faible volume sanguin, le tout sous anesthésie. Des souris seront opérées chirurgicalement (environ 15min) sous anesthésie et sous analgésique. Ces souris recevront deux injections à 1 semaine d’intervalle en 5min. 1 fois par semaine pendant 2 semaines, ces souris seront soumises en même temps à une imagerie médicale d’une durée de 10 min et à un prélèvement d’un faible volume sanguin, le tout sous anesthésie. Des souris seront nourries avec un régime particulier pendant 16 semaines maximum et recevront deux injections à 1 à 3 semaines d’intervalle (5min/acte). 1 fois par semaine pendant 8 semaines maximum, ces souris seront soumises en même temps à une imagerie médicale d’une durée de 10 min et à un prélèvement d’un faible volume sanguin, le tout sous anesthésie générale. Des souris seront injectées 2 à 3 fois par semaine pendant 12 semaines (5min). 1 fois par semaine pendant 6 semaines, sous anesthésie, ces souris seront soumises en même temps à une imagerie médicale d’une durée de 10 min et à un prélèvement d’un faible volume sanguin.
Impact sur les animaux
Pour induire la fibrose du foie, un des modèles expérimentaux est chirurgical (15 minutes par intervention). Une perte de poids post-opératoire, des infections ou des ruptures de sutures pourraient survenir. Plusieurs actes seront pratiqués sous anesthésie (10 minutes environ par intervention) pouvant induire des nuisances comme le risque d’arrêt cardio-respiratoire, l’hypothermie et la perte de repère transitoire au moment du réveil. Des nuisances peuvent également être induites par les prélèvements sanguins et les injections comme un stress émotionnel de courte durée (5min maximum par acte) liés à la contention et la douleur de l’introduction de l’aiguille ou des saignements et irritations. Les régimes alimentaires ou le produit injectable utilisés pour induire une fibrose hépatique aux animaux entrainent une perte de poids pendant les 3 premières semaines qui se stabilise ensuite. Un des modèles de fibrose nécessite l’utilisation de souris transgéniques développant spontanément une fibrose hépatique qui reste asymptomatique jusqu’à l’âge de 12 mois. Dans ce projet ces souris seront maintenues jusqu’à l’âge de 4 mois maximum.
Devenir
L'euthanasie de tous les animaux de toutes les procédures est nécessaire pour pouvoir isoler les cellules du foie, évaluer la maladie du foie et pour valider le ciblage cellule spécifique des vecteurs de thérapie génique. Le prélèvement du foie entier ne permet pas la survie des animaux.
Remplacement
Les maladies du foie reposent sur de multiples interactions dans l’organisme entier entre les processus de régénération, d'inflammation, de vascularisation et de cicatrisation impliquant le support des autres organes du corps et n’est pas modélisable in vitro. Le ciblage spécifique d'un organe par rapport à un autre via l’injection d’un vecteur génique dans la circulation sanguine et l’étude de sa répartition corporelle n’est pas modélisable in vitro. De même, le ciblage spécifique d’un sous type cellulaire du foie par rapport aux autres cellules du foie nécessite d’étudier l’organe en entier. Aucun modèle 3D in vitro du foie ne reproduit actuellement la réelle complexité cellulaire du foie ni sa structure. Enfin, Il n’existe pas de lignées cellulaires proche de la physiologie réelle du foie. Pour étudier les signatures cellulaires saines ou malades dans l’organe entier, nous serons donc contraints d’utiliser des cellules primaires dont la survie est limitée en culture et qui ne peuvent être obtenues qu’à partir du foie des souris. Ainsi, pour développer cliniquement une thérapie génique ciblée, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire
Réduction
A cause des variabilités entre animaux et des risques d’échec des procédures, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Le nombre d’animaux utilisés pour le projet est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre notre objectif scientifique. Le nombre d’animaux a été évalué à 948 maximum. Les tests in vitro seront réalisés sur des cellules primaires mais qui ne peuvent être maintenues à long terme après isolement. Pour les types cellulaires qui le permettent, une amplification sera réalisée en culture. Afin de réduire le nombre d’animaux, un seul modèle de fibrose sera utilisé pour réaliser les expériences in vitro. Autant que faire se peut, nous nous efforcerons d’isoler plusieurs types cellulaires à partir des mêmes animaux. Le nombre de candidats vecteurs sera réduit progressivement de 10 vecteurs à 1 au cours des procédures réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Grâce aux prélèvements sanguins et au suivi du transgène fluorescent qui nous permettent d’observer dans le temps la pathologie et l’expression de notre vecteur au cours des expérimentations, 1 seul temps d’euthanasie est nécessaire. Ceci permet de réduire le nombre d’animaux utilisés dans cette étude.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats scientifiques dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les animaux seront anesthésiés pour chacune des procédures et un analgésique sera administré en per et/ou post opératoire pour éviter toute souffrance liée à l’intervention chirurgicale. Au cours des chirurgies, les souris seront placées sur une plaque chauffante pendant et après l’opération, jusqu’au réveil total, et leurs yeux seront protégés au cours de l’anesthésie. Au cours des expériences impliquant le produit médicamenteux induisant la fibrose, aucun analgésique ne sera administré en même temps aux souris afin d’éviter toute surdose et une insuffisance hépatique. Dans le cas des injections répétées, plusieurs sites d’injection seront alternés au cours des procédures pour éviter une irritation locale et diminuer le risque d’ascite. Des points limites ont été définis suivant une grille d'évaluation établie sur l’apparence physique, le poids et le comportement animal, adaptés à chaque procédure. Si l’animal atteint un point limite il sera soulagé par l’administration d’un analgésique et si les symptômes persistent où sont trop sévères, l'animal sera euthanasié. Les prélèvements sanguins et l’imagerie médicale réalisés au cours des procédures permettent également de surveiller précisément toutes déclarations de symptômes. Les souris seront prises en charge par du personnel qualifié et entrainé aux procédures, et examinées quotidiennement. Les animaux seront hébergés 7 jours avant le début des procédures jusqu’à l’euthanasie en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles dans un environnement enrichi favorisant les comportements exploratoires et réduisant ainsi le stress. Les animaux seront hébergés dans une pièce où les paramètres environnementaux (température, hygrométrie, lumière) et sanitaires sont contrôlés. Au cours des 7 jours d’hébergement avant procédure, les souris s’adapteront à leur nouvel environnement et un contact sera mis en place afin de les habituer aux manipulations et ainsi réduire leur stress au cours des procédures. Les personnes non formées agiront en tant qu’observateurs et toujours accompagnés par un membre formé.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris, dans la littérature est la plus référencée pour les modèles de maladies hépatiques notamment pour leur grande reproductibilité et leur capacité à développer une pathologie très proche de l’homme. De plus la souris possède une vésicule biliaire tandis que le rat n’en possède pas. Or la vésicule biliaire possède un rôle dans la régénération du foie et son absence au cours des modèles biliaires pourrait biaiser les résultats. La fibrose hépatique est un processus insidieux et indolore pouvant mettre plusieurs années à se déclarer chez l’humain adulte. Chez la souris elle est également asymptomatique et peut prendre jusqu’à 3 mois pour s’installer en fonction des modèles. Dans ce projet, les souris utilisées seront donc de jeune adulte de 8 à 10 semaines afin de participer à des procédures pouvant durer plusieurs mois sans être affectées par un vieillissement avancé.
Rôle du facteur de transcription MAF dans la production d’anticorps chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal subit sous anesthésie des prélèvements de sang et des injections d'un agent immunisant, avant d'être tué pour prélever sang et tissus, afin d'étudier le rôle du facteur MAF dans la production d'anticorps par les lymphocytes B. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne remplace l'animal pour valider ces observations in vivo. Les bénéfices évoqués, traitements des maladies auto-immunes ou amélioration de la vaccination, restent renvoyés au conditionnel.
Objectifs
La protéine sur laquelle nous travaillons possède la capacité de modifier l'expression des gènes, soit en les diminuant ou en les augmentant. Cette protéine joue un rôle important dans le développement et le bon fonctionnement de nombreux organes et tissus de notre corps. Elle participe à des processus comme la croissance cellulaire, la formation du système nerveux et la régulation du système immunitaire. Nous avons émis l'hypothèse que cette protéine pourrait contrôler la capacité des lymphocytes B (LB) à produire des anticorps qui sont indispensables pour une réponse immunitaire optimale. La production d’anticorps par les LB est en effet un des moyens essentiels pour le système immunitaire d’assurer son rôle de défense contre les pathogènes extérieurs (bactériens ou viraux) mais également d’assurer l’immuno-surveillance permettant d’éliminer les cellules cancéreuses. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer le rôle de cette protéine dans la réponse physiologique des LB et plus particulièrement sur leur capacité à produire des anticorps suite à différentes vaccinations. Pour ce faire nous utiliserons une lignée de souris transgénique pour laquelle le gène codant pour la protéine d'interêt a été spécifiquement supprimé des LB. Notre objectif est d'évaluer l'impact de l'absence de la protéine sur la capacité des animaux à développer des anticorps et donc une réponse immunitaire compétente, ceci par comparaison avec un groupe contrôle pour lequel la protéine n'a pas été enlevée. Ceci nous apportera des éléments de compréhension sur les mécanismes qui permettent au corps de produire des anticorps et donc de nous défendre contre les agents infectieux.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons mieux comprendre le développement des cellules B du système immunitaire qui produisent les anticorps afin de pouvoir produire de nouveaux traitements pour les patients. Deux bénéfices sont susceptibles d’en découler, soit éliminer les effets néfastes des anticorps produits dans les maladies auto-immunes pour lesquelles il n’existe pas de traitements curatifs et /ou améliorer la vaccination contre les infections virales et bactériennes comme face à la pandémie de COVID19. Ce projet s'inscrit dans un objectif d'augmenter les connaissances sur la production d'anticorps.
Procédures
Tous animaux seront soumis à des anesthésies pour toutes les interventions afin de diminuer le stress. Les animaux anesthésiés auront au maximum : deux prélèvements de sang de moins de 2 minutes espacés de 5 jours, deux injections d'agent immunisant, geste durant moins de 1 minute à 90 jours d'intervalle et certains pourront avoir une injection d'agent traceur, geste durant moins de 1 minute.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues pour les animaux sont : (1) du stress lors des anesthésies (2) au reveil de l'animal, les injections peuvent causer une légère douleur d'une durée de 1 à 3h, au point d’entrée de l’aiguille (3) les prélèvements sanguins réalisés peuvent entraîner une anémie et déshydratation transitoires d'une durée de 2 à 6 heures (4) une douleur légère et un gonflement transitoire peuvent être observés au point de prélèvement sanguin, persistant en moyenne moins d'une heure.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever le sang et les tissus d'intérêt.
Remplacement
Les observations initiales réalisées sur des cellules humaines peuvent donner des informations précieuses, mais la validation in vivo de ces observations nécessite l'utilisation de modèles animaux. À l'heure actuelle, il n'existe aucune méthode alternative qui puisse totalement remplacer l'utilisation d'animaux pour étudier comment les molécules agissent sur des processus complexes dans notre corps, comme la réponse immunitaire.
Réduction
Nos analyses seront basées sur des tests statistiques de comparaison des moyennes entre le groupe expérimental et le groupe contrôle, dans le cas d’échantillons indépendants. Un calcul des effectifs a été réalisé nous appuyant sur les données de la littérature. Pour un risque d’erreur de 5%, une puissance du test statistique de 90%, et compte tenu des différents écarts types estimés, les tailles d’échantillons calculées varient entre 40 et 60 individus au total par protocole expérimental (20 ou 30 animaux par groupe).
Raffinement
Nous avons optimisé nos procédures en définissant des points limites permettant d’identifier le moment à partir duquel la souffrance et /ou la détresse de l’animal doit être arrêtée. Un tableau de suivi de soin sera complété pour chaque individu inclut dans les procédures adaptant la réponse et les points limites au regard de la souffrance de l'animal. Le stress des procédures sera limité par l'utilisation d'anesthésie et d'analgésie lors des étapes de prélèvement de sang ainsi que lors des étapes d'injection.
Choix des espèces
Nous utilisons des modèles transgéniques pour lesquels certains gènes ont été modifiés et qui ne sont disponibles que chez cette espèce. Les animaux seront utilisés entre 6 et 14 semaines car c'est dans cette intervalle que les animaux sont à pleine maturité sexuelle et que leur réponse immunitaire est maximale.
Test de faisabilité de l’imagerie par résonnance magnétique avec manganèse chez l’ovin
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des moutons subissent deux anesthésies à dix jours d'intervalle pour un passage en IRM, la première d'une heure, la seconde de six heures, ainsi que six prises de sang à la jugulaire sur animal éveillé et une injection dans le péritoine. Les 9 moutons, adultes et de sexe indifférent, sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tous sont tués sous anesthésie générale à la suite des acquisitions d'images, leur cerveau étant prélevé pour une nouvelle IRM hors du corps. Il s'agit de mettre au point l'IRM au manganèse chez le mouton, pour étudier plus tard la plasticité cérébrale liée aux changements de durée du jour chez cette espèce saisonnière. Le porteur rappelle que le manganèse est neurotoxique à forte dose, n'attend aucun effet indésirable de son injection et annonce trois doses à tester, sans préciser par quelle voie le produit est donné, la seule injection décrite en dehors des inductions d'anesthésie étant intrapéritonéale.
Objectifs
L’objectif est de mettre en place la technique d’Imagerie par Résonnance Magnétique du manganèse in vivo à l'échelle du cerveau entier chez l’ovin. Les propriétés paramagnétiques du manganèse (Mn2+) permettent son utilisation comme agent de contraste pour l'IRM (MEMRI : IRM du ManganEse). C’est un composé qui pénètre et s'accumule dans les neurones actifs, donc sa concentration intracellulaire est le reflet direct de l'activité neuronale. Cette technique permet de visualiser les changements structurels et fonctionnels en réponse à des stimulis. La dynamique du Mn2+ (biodisponibilité, pharmacocinétique) dépend de l'espèce, il est donc nécessaire de réaliser des mises au point sur le cerveau d’ovin pour lequel aucune étude n’est disponible dans la littérature.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de définir la dose minimale de Mn2+ nécessaire pour l’obtention du meilleur contraste en IRM MEMRI. Il permettra également de se placer dans la fenêtre temporelle la plus favorable pour l’acquisition d’un contraste optimum. Les mises au point des conditions de dose et temps dans cette expérimentation préliminaire bénéficieront à des appels à projet ultérieurs.
Procédures
Les animaux subiront 2 anesthésies à 10 jours d'intervalle pour passage à l'IRM. La première durera 1 heure, la 2ème 6 heures. Ils recevront également une injection intra-péritonéale (durée totale contention comprise d'une minute). Ils subiront 2 injections par voie intraveineuse à la jugulaire pour induire les anesthésies, ainsi que 6 prises de sang vigiles (durée totale contention comprise d'une minute).
Impact sur les animaux
Bien qu’il soit un élément nécessaire au bon fonctionnement de l’organisme, le manganèse est cependant neurotoxique à forte dose. Chez l’homme, il provoque maux de tête, insomnies, pertes de mémoire, instabilité émotionnelle, dystonie, tremblements, troubles du langage et des troubles de la marche. Selon la littérature, les cas de toxicité aigüe au manganèse chez les ruminants sont très peu probables. Nous n’attendons donc pas d’effets indésirables suite à l’injection de Mn2+, mais les animaux seront surveillés étroitement après l'injection. Pour chaque anesthésie les animaux pourront subir un stress lors de la manipulation. Un hématome peut apparaître lors de l’induction de l’anesthésie par voie intraveineuse, ou après les prises de sang à la veine jugulaire.
Devenir
A la suite des acquisitions, tous les animaux seront mis à mort toujours sous anesthésie générale, car leurs cerveaux seront prélevés et ré-analysés ex-vivo par IRM à plus haut champ.
Remplacement
Cette étude d‘imagerie cérébrale permettant de déterminer la dose minimale de Mn2+ et la fenêtre d’acquisition optimum pour obtenir le meilleur contraste ne peut être réalisée qu’in vivo. Il est en effet impossible d’étudier ou de reproduire ces expériences in vitro et encore moins in silico. Ce projet est un prérequis pour développer l’approche d’imagerie MEMRI qui permettra, ultérieurement, de mettre en place des projets longitudinaux, avec des nombres restreints d’animaux expérimentaux.
Réduction
Ce projet concerne 9 animaux expérimentaux maximum, qui seront utilisés pour tester trois doses de Mn2+ et déterminer la fenêtre d’observation optimale de l’activité cérebrale par IRM MEMRI. Pour cette expérience pilote, nous avons besoin de déterminer la dose minimale qui nous permet d’acquérir des images IRM informatives, et pour cela nous ne disposons que de quelques données dans la littérature sur les rongeurs uniquement. Par conséquent, il nous faut tester plusieurs doses. De la même manière, nous n’avons aucune donnée sur la biodisponibilité du manganèse dans l’organisme d’ovin et donc nous ne connaissons pas la cinétique de disponibilité du manganèse dans le cerveau.
Raffinement
Les animaux expérimentaux feront l’objet d’une surveillance accrue dans la période qui suivra l’administration de Mn2+ jusqu’à l’anesthésie pour l’imagerie. Au cours de cette période, l’apparition de tremblements, les difficultés de déplacement, la prise alimentaire seront particulièrement surveillés. Nous serons attentifs à la survenue de signes de mal être (position des oreilles, port de la tête, prostration). Dans le cas où de tels signes apparaitraient, un traitement analgésique sera administré. Pendant toute la durée de l’expérimentation, les animaux expérimentaux seront maintenus en groupe au sein d'un environnement social stable, dans des conditions adaptées aux herbivores, litière de paille et foin ad libitum. Ils seront manipulés dans le calme par des agents expérimentés. Ils arriveront la veille de l’anesthésie, et seront mis à jeun avant l’intervention, avec abreuvement adlibitum. Les brebis seront maintenues sous oxygène à la fin de la première anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé.
Choix des espèces
Nous souhaitons développer la technique de l’IRM réhaussé par le manganèse (MEMRI) chez l’ovin adulte pour plus tard étudier les mécanismes de plasticité cérébrale associés aux changement de photopériode chez cette espèce saisonnée. La dynamique du Mn2+ dépendant de l'espèce, il est donc nécessaire de réaliser des mises au point sur le cerveau d’ovin pour lequel aucune étude n’est disponible dans la littérature. Nous utiliserons des adultes pubères, de sexe indifférent.
Évaluation des effets radio-protecteurs préventifs et thérapeutiques de médicaments candidats sur l’amélioration du syndrome d’irradiation aiguë survenant après une exposition à fortes doses de rayonnements ionisants.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
2 962 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la déclaration en comptant 201 en souffrance légère, 1 024 en souffrance modérée et 1 737 en souffrance sévère. Pour l'étude de la moelle osseuse, elles sont irradiées sur tout le corps, gavées jusqu'à quatre fois, pesées tous les un à deux jours et soumises à une prise de sang chaque semaine pendant 30 jours, jusqu'à 29 gestes par souris. Pour l'étude de l'intestin, l'irradiation vise l'abdomen, sous anesthésie gazeuse. Le porteur suit leur survie sur 30 jours et attend une perte de poids, une anémie, une prostration, une déshydratation ou une septicémie, pour tester des molécules à donner avant ou après une exposition à de fortes doses, lors d'un accident ou d'une attaque nucléaire. Il justifie le choix de ces rongeurs par un précédent : "Le modèle rongeur est pertinent car il a été utilisé dans de nombreuses études précliniques dans le cadre d'une irradiation."
Objectifs
Les individus exposés dans un laps de temps très court (quelques minutes) à une forte dose d’irradiation, provoquée par exemple par un accident dans une centrale nucléaire ou lors d’une attaque nucléaire dans un contexte conflictuel, vont souffrir d’un syndrome d’irradiation aiguë (SIA) avec pronostic vital engagé. A l’heure actuelle, les traitements curatifs sont très invasifs (greffes de moelle osseuse) ou inexistants. Certains médicaments peuvent néanmoins soulager les symptômes (traitement des diarrhées et vomissements) ou prévenir les éventuelles infections, mais le pronostic vital reste sombre. C’est dans ce contexte que nous proposons un projet d’étude pré-clinique chez la souris, dans le but de démontrer l’efficacité de plusieurs molécules dans le traitement du syndrome d’irradiation aiguë. Le SIA est le nom donné à une combinaison de trois syndromes : hématopoïétique (affectant la moelle osseuse), gastro-intestinal et neurovasculaire. Dans ce projet, nous nous intéresserons uniquement aux syndromes hématopoïétique et gastro-intestinal. L’effet protecteur ou curatif de ces molécules sera évalué sur la capacité de deux tissus très sensibles aux irradiations après exposition à se reconstituer plus ou moins rapidement : le tissu hématopoïétique (moelle osseuse) et l’intestin grêle. Ceux-ci se renouvellent constamment tout au long de la vie d’un individu et l’impact d’une irradiation sur leur fonctionnement est donc majeur pour la survie de chaque individu. En effet, la moelle osseuse contient les cellules souches hématopoïétiques responsables de la production et du renouvellement des cellules sanguines tout au long de la vie. De même, l’intestin grêle contient des cellules souches permettant le renouvellement tous les 4 à 5 jours des cellules intestinales qui constituent une barrière imperméable dont le rôle majeur est d’empêcher les bactéries du microbiote de passer dans la circulation sanguine. Il est donc primordial de préserver ces deux tissus des effets néfastes d’une irradiation. Nous nous attendons à ce que l’administration de ces molécules avant (effet préventif) ou après (effet curatif) une forte dose d’irradiation améliore l’état général, mais également la survie des animaux. Le modèle rongeur est pertinent car il a été utilisé dans de nombreuses études précliniques dans le cadre d’une irradiation.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de révéler si le traitement des animaux avec les molécules d’intérêt, administrées avant ou après irradiation, (1) améliore leur survie, (2) diminue les effets indésirables associés à l’irradiation, (3) permet une récupération plus rapide de l’état général des souris grâce à une accélération de la régénération des tissus lésés (moelle osseuse et intestin grêle). Des bénéfices sur la population humaine sont susceptibles de découler de ce projet, comme : - une prise en charge immédiate des personnes ayant été exposées à de fortes doses d’irradiation ionisante avec l’administration rapide d’un traitement permettant un meilleur pronostic vital et une meilleure récupération hématopoïétique et intestinale (exemple : après un accident ou une attaque nucléaire). - la possibilité d’administrer préventivement une molécule qui protégerait les personnes susceptibles d’être exposées à de fortes doses d’irradiation (exemples : les militaires, la population civile avec risque d’exposition). Ce projet a donc un intérêt clinique majeur car les traitements curatifs actuels sont inexistants et/ou inapplicables à grande échelle. En effet, actuellement, -la prise en charge des patients souffrant d’une atteinte sévère du tissu hématopoïétique nécessite des traitements invasifs et coûteux, non généralisables à grande échelle (greffe de moelle osseuse) et présentant de nombreux inconvénients (recherche d’un donneur compatible, traitement immunosuppresseur à vie, risque de rejet). -la prise en charge des patients souffrant d’une atteinte gastro-intestinale sévère repose uniquement sur des traitements symptomatiques (antibiotiques, anti-diarrhéiques et antiémétiques). Il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif.
Procédures
Dans l’étude du syndrome hématopoïétique induit après irradiation : Les gestes techniques sont listés ci-dessous : -1 tatouage (1 minute) -1 irradiation corps entier (durée < 10 minutes) -gavages avec de l’eau ou avec la molécule à tester (4 maximum d’une durée de 2 minutes) -des pesées régulières (tous les 1 à 2 jours) sur une durée de 30 jours (16 x 30 secondes) -prélèvements de sang 1 fois/semaine sur une durée de 30 jours (4 maximum de 3 minutes), puis un prélèvement de sang juste avant la mise à mort, sous anesthésie gazeuse avec analgésie (35 min en comptant l’effet de l’analgésie et de l’anesthésie). -1 à 2 injections sous-cutanées (2 maximum de 1 minute) -1 injection intra-péritonéale (1 minute) Les souris subiront au maximum 29 gestes techniques sur 30 jours. Dans l’étude du syndrome gastro-intestinal induit après irradiation : Les gestes techniques sont listés ci-dessous : -1 tatouage (1 minute) -1 irradiation locale au niveau abdominal, sous anesthésie gazeuse (durée < 10 minutes) -1 gavage avec de l’eau ou avec la molécule à tester (2 minutes) -des pesées régulières (tous les 1 à 2 jours) sur une durée de 30 jours (16 x 30 secondes) -1 prélèvement de sang juste avant la mise à mort, sous anesthésie gazeuse avec analgésie (35 min en comptant l’effet de l’analgésie et de l’anesthésie). -2 injections sous-cutanées (2 x 1 minute). Les souris subiront au maximum 22 gestes techniques sur 30 jours.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont une perte de poids, une anémie, une prostration, de la déshydratation, ou une septicémie. Un stress est envisagé lors des pesées et au moment du gavage. Des douleurs ponctuelles sont possibles lors des prélèvements et/ou des injections.
Devenir
L’étude de la survie des animaux se fera sur une durée de 30 jours. A terme, ils seront mis à mort. A différents temps après irradiation, les animaux traités ou non seront mis à mort afin de prélever les tissus et organes connus pour être très impactés par l’irradiation. Les analyses permettront d’évaluer l’efficacité du traitement sur ces tissus au cours du temps.
Remplacement
1)Pour l’étude de la survie des individus après irradiation, aucune alternative non animale ne peut être mise en place. 2)Dans l’analyse de la reconstitution hématopoïétique après irradiation, il n’est pas possible d’utiliser des alternatives comme par exemple des organoïdes ou des cultures cellulaires. En effet, les cellules souches de la moelle osseuse agissent de concert avec leur microenvironnement, constitué de plusieurs types cellulaires, pour permettre la reconstitution hématopoïétique après irradiation. L’étude sur l’animal corps entier est donc la seule approche possible pour une analyse physiologique des effets d’un traitement après irradiation depuis la cellule souche jusqu’aux cellules matures. 3)Dans l’étude du syndrome gastro-intestinal aigu, les organoïdes peuvent être une alternative dans le cadre d’une analyse moléculaire ciblée. Nous ne ferons pas ce type d’analyse dans ce projet. Notre but est de mesurer des paramètres physiologiques impliqués dans la restauration de la barrière intestinale après irradiation, ce qui nécessite une étude sur l’animal corps entier.
Réduction
Les modèles de souris que nous utiliserons sont des lignées consanguines montrant moins de variabilité phénotypique intra-souche. Ainsi, il sera possible d’obtenir des résultats significatifs en utilisant la puissance statistique moins de souris par rapport au nombre qui serait nécessaire si l’on utilisait des lignées non consanguines. Ceci permet de réduire le nombre de souris. Nous avons également utilisé un logiciel permettant de déterminer le nombre d’animaux nécessaire et suffisant par groupe d’étude pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Avec le traitement proposé dans ce projet, nous avons évaluer un bénéfice d’environ 20%. Nous devons donc inclure 8 souris par groupe irradié avec ou sans traitement. Pour les souris non irradiées, aucun effet n’est attendu. Nous inclurons donc 3 souris par groupe.
Raffinement
Les souris seront régulièrement pesées et observées (posture, comportement, niveau d’activité, déshydratation). Nous utiliserons une grille de score pour évaluer leur état général et avons établi des points limites. Pour éviter une infection due à une diminution du système immunitaire, les cages seront placées, soit en portoirs ventilés, soit en portoir classique avec un couvercle filtrant. Les souris seront hébergées en groupe, avec enrichissement (coton, tunnels en carton). L'utilsation d'anesthésie et d'analgesie sera mise en place lors des procédures.
Choix des espèces
Les souris consanguines utilisées sont les mieux caractérisées en biomédecine et sont largement utilisées pour étudier le rôle d’un gène spécifique dans un organisme. Elles font l’objet d’un grand nombre d’étude pour analyser les effets biologiques des rayonnements ionisants et leur consanguinité réduit les effectifs utilisés car elles montrent moins de variabilité phénotypique. Ainsi, la puissance statistique est obtenue avec moins de souris par rapport au nombre qui serait nécessaire si l’on utilisait des lignées non consanguines. De plus, les syndromes d’irradiation que nous souhaitons étudier sont bien caractérisés chez ces souris . Tout ceci présente des avantages scientifiques et éthiques. Nous utiliserons des souris adultes de 9 à 16 semaines (une souris est considérée comme étant adulte à l’âge de 7 semaines). Une souris prépubère (moins de 7 semaines) a un environnement médullaire (nécessaire à la production des cellules sanguines et à la préservation des cellules souches) qui n’est pas définitif. Une souris de plus de 7 mois est considérée comme âgée d’un point de vue hématopoïétique. Ceci restreint notre choix à l’utilisation de jeunes souris adultes. Pour des raisons de reproductibilité des expériences, le poids et la taille des souris doivent être identiques entre les groupes, ce qui est le cas chez les jeunes adultes à l’âge choisi.