Recherche fondamentale

5 321 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux de quelques jours reçoivent une injection de chimiothérapie, des mâles subissent une vasectomie et des femelles une réimplantation d'embryon, pour évaluer l'effet des traitements sur le sperme et l'embryon. Le porteur décrit des douleurs postopératoires, des infections de plaie et une perte de poids possibles, et prévoit l'euthanasie avant prélèvement du tissu testiculaire ou des ovocytes. Il affirme que la spermatogenèse in vitro complète n'est réalisable que chez la souris et présente comme "indispensable" la recherche d'épi-mutations transmissibles.

Objectifs

Ce projet permet d’évaluer, chez un modèle murin, l’impact des traitements de chimiothérapie sur l’intégrité du tissu testiculaire, sur la capacité des spermatogonies à se différencier in vitro et sur la qualité des gamètes produits. L’architecture de la chromatine ainsi que l’expression des transcrits dans les spermatozoïdes provenant de souris traitées par chimiothérapie sera évalué par une approche de sc-ATAC-seq et de sc-RNA-seq. Avant d’établir ce projet, une étude bibliographique a été réalisée au préalable. Aucune étude n’a évalué l’impact des agents de chimiothérapie sur (i) l’épigénome et la chromatine spermatique et (ii) le développement et l’épigénome de l’embryon précoce. Il apparait donc indispensable de rechercher la présence d’éventuelles épi-mutations dans le noyau des spermatozoïdes produits in vivo ou in vitro et d’évaluer les risques de transmission transgénérationnelle de ces altérations, qui pourraient être à l’origine de défauts du développement embryonnaire ou d’anomalies congénitales.

Bénéfices attendus

Il est nécessaire d’évaluer l’impact des traitements de chimiothérapie sur l’intégrité du tissu testiculaire, sur la capacité des spermatogonies à se différencier in vitro et sur la qualité des gamètes produits avant d’envisager une application chez les patients guéris de LAL mais devenus stériles. Les échantillons humains étant rares et précieux, nous utiliserons du tissu testiculaire murin pour attendre les objectifs du projet.

Procédures

Injections de molécules de chimiothérapie (et sérum physiologique) en intra-péritonéales sur souricaux de 3,5 jpp. 1 injection d'1 seule dose par animal. Acte nécessitant 2 minutes maximum par souriceau. Procédure chirurgicale : vasectomie de souris mâles. 1 acte chirurgical par animal (avec vasectomie bilatérale ; permettant de générer des mâles castrés, utiles pour l'obtention de femelles pseudo-gestantes). Acte nécessitant une procédure de 10-15 minutes par souris. Procédure chirurgicale : réimplantation d’embryon chez des femelles pseudo-gestantes au niveau de l'infundibulum. 1 acte chirurgical par animal. Acte nécessitant une procédure de 20-25 minutes par souris.

Impact sur les animaux

Stress lié à l’injection de molécules de chimiothérapie, nuisances liées à l'acte chirurgical et stress lié à la mise à mort. La chirurgie peut entrainer des nuisances telles qu’une infection au niveau de la plaie, notamment suite à une déhiscence (séparation de bords de la plaie) ; des saignements ; une douleur, souvent au niveau de la cicatrice ou un état de fatigue. Lors de la croissance de l’animal, le principal critère sera la perte de poids par rapport à la moyenne du groupe témoin. Ce paramètre intègre non seulement l’éventuelle perte de poids de l’animal, mais aussi le différentiel de gain de poids, pathologique pour les souriceaux et très jeunes souris. Peu après les injections, des diarrhées (spécialement si le signe est prolongé plusieurs jours) seront également considérés comme des points limites. Pour des animaux plus âgés, la perte de poids par rapport au poids initial ou au poids le plus élevé de l’animal sera considérée comme anormale. Enfin, des points critiques classiques tels qu’un poil hérissé, un dos rond, un abdomen distendu, une léthargie ou tout signe clinique jugé par un technicien expérimenté comme indiquant un état moribond sévère seront considérés comme des points limites. Afin de pouvoir suivre le poids des animaux dans le temps, les souriceaux de 3,5 jpp seront marqués avec un stylo chirurgicale en attendant qu'il soit assez grand pour qu'une pose de puces au transpondeur soit possible pour poursuivre le suivie des souris à l'âge adulte.

Devenir

Les animaux ne pouvant pas vivre après prélèvement chirurgical du tissu testiculaire sans traitement hormonal de substitution, ils seront euthanasiés en amont du prélèvement. Les femelles subissant un prélèvement de leurs ovocytes (post-stimulation ovarienne) seront euthanasiées en amont du prélèvement.

Remplacement

La technique de spermatogenèse in vitro complète permettant la génération de spermatozoïdes à partir de cellules souches germinales mâles (les spermatogonies) ne peut s'effectuer qu'à partir de tissus testiculaires vivants. La culture organotypique en interphase gaz-liquide d'explants testiculaires de souris permet d'obtenir des cellules haploïdes utilisables dans ce projet. Des techniques similaires se basant sur des organoïdes ou des cultures en 2D et 3D sont à l'étude mais (i) ces techniques ne sont pas encore au point et ne permettent pas d'obtenir des résultats similaires à ceux de la culture organotypique et (ii) elles utilisent des cellules issues de tissus testiculaire prépubères également.

Réduction

Nous utiliserons des tests paramétriques permettant d’obtenir des résultats exploitables à partir d’un petit nombre d’animaux. Nous limiterons ainsi le nombre de réplicas à n=6 souris par expériences. Tous les souriceaux mâles de chaque portée seront utilisés, quelle que soit la taille de la portée. Les tissus qui ne sont pas exploités le jour du prélèvement seront cryopréservés pour une mise en culture ultérieure. Le nombre d’animaux estimé sera revu à la baisse si nous nous apercevons qu’une molécule de chimiothérapie est trop délétère pour l’animal.

Raffinement

Les souris seront obtenues via reproductions au sein de notre Service de Ressources Biologiques ; limitant le stress lié à d’éventuels transports. Les souriceaux seront conservés auprès de leur mère jusqu’au prélèvement tissulaires à 6,5 jpp afin de ne pas perturber leur développement. Les animaux utilisés comme contrôles ou in vivo seront sevrés au bout de quatre à cinq semaines afin de limiter le nombre de souris par cage. Les animaux qui subiront un acte chirurgical seront anesthésiés avec un système d'anesthésie gazeuse diffusant 5% d’isoflurane dans un mélange protoxyde d’azote/oxygène (70%/30%) puis maintenu sous anesthésie avec 2% d’isofluorane. Vingt minutes avant l’opération, une injection de buprénorphine sera réalisée (Buprécare® 0.5 mg/kg ; IP) afin d’atténuer/limiter les douleurs de l’animal. Deux minutes avant incision, de la lidocaïne en gel sera appliquée pour atténuer la douleur. Des « points limites » (ou critère d’arrêt anticipé) seront observés quotidiennement, notamment sur les animaux post-chirurgie. Enfin, les données obtenues lors de ces expérimentations seront exploitées au mieux afin de donner des résultats scientifiquement exploitables de par la bonne prise en charge des animaux.

Choix des espèces

Actuellement, la spermatogenèse in vitro complète par culture organotypique en interphase gaz-liquide n’est réalisable que chez la souris. Nous réaliserons les injections des différents traitements à 3,5 jpp. Nous travaillerons à partir de tissu testiculaire pré pubère issu de souris mâles de 6,5 jpp de façon à pouvoir mettre en culture le tissu avant le début de la première vague de spermatogenèse. Les souris âgées de 6,5 et 36,5 jpp seront utilisées comme contrôles in vivo pour permettre la comparaison avec les tissus testiculaires en culture in vitro d’âges correspondants (tissus prélevés à 6,5 jpp + 30 jours de culture). Les femelles donneuses d’ovocytes seront utilisées à l’âge de 5 à 9 semaines (période à laquelle les souris répondent le mieux aux traitements hormonales de stimulation ovarienne). Les mâles donneurs de spermatozoïdes testiculaires seront utilisés comme témoin à l’âge de 36,5 jpp (âge correspondant aux tissus testiculaires après 30 jours de cultures). Les mâles donneurs de tissus testiculaires seront utilisés à l’âge de 6,5 jpp, de façon à ce que les tissus testiculaires pré pubères soient mis en culture avant le début de la première vague de spermatogenèse qui commence à 8 jpp. Les mâles vasectomisés seront utilisés dès leur puberté (environ 5 semaines). Les femelles Black Swiss pseudo-gestantes seront utilisées dès leur puberté (environ 7 semaines). Nous utiliserons des femelles Black-Swiss afin de s’assurer que l’embryon obtenu est bien le résultat de l’ICSI réalisée au préalable. L’ICSI sera réalisée à partir d’un ovocyte d’un spermatozoïde de souris CD-1 (blanche) afin d’obtenir un embryon qui sera par la suite implanté dans une souris Black Swiss (noire). Lors de la césarienne, si le souriceau obtenu est blanc, cela nous permettra de valider notre ICSI.

390 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du cerveau pour une infection virale, avec ou sans implantation de fibres optiques, puis un isolement de quatre à cinq semaines et un test de peur conditionnée. Le porteur décrit un stress lié à l'isolement social et à la contention, et prévoit l'euthanasie pour des analyses d'électrophysiologie et d'histologie. Il affirme qu'aucune approche in silico ou en culture cellulaire ne peut se substituer à l'animal entier pour étudier la mémoire chez les mammifères.

Objectifs

La mémorisation des évènements passés nous permet de mieux réagir aux situations présentes. Elle permet notamment d’éviter les dangers et d’assurer la survie des individus, mais est également au cœur des phénomènes d’apprentissages. Sans surprise, les mécanismes fondamentaux de la mémoire sont théorisés et étudiés depuis plusieurs décennies par les neuroscientifiques, mais c’est seulement récemment que la démonstration expérimentale des conséquences physiologiques de l’expérience vécue et de sa rétention - la mémoire - sur le cerveau a été rendue possible par des approches optogénétiques. Il a notamment été montré que des groupes de neurones – les cellules constituant le cerveau et briques élémentaires de la cognition – dispersés dans diverses régions cérébrales étaient nécessaires et suffisants pour permettre l’encodage et le rappel de la mémoire. Ces groupes de neurones constituent l’engramme. L’objectif global de notre projet et de comprendre les processus d'encodage et de stockage de la mémoire, chez les mammifères en utilisant des outils de dernière génération permettant d’identifier et de manipuler les cellules de l’engramme. Nous voulons étudier les mécanismes cellulaires et synaptiques de la formation des cellules de l'engramme dans le cortex préfrontal du cerveau, une structure corticale impliquée dans les fonctions cognitives supérieures. Dans ce projet, Nous souhaitons valider les conditions d’utilisation de deux nouveaux outils moléculaires CaMPARI2 et Cal-light, afin de les utiliser pour cibler et manipuler les cellules de l'engramme dans le cortex préfrontal afin de pouvoir déchiffrer les mécanismes de la mémoire.

Bénéfices attendus

Notre objectif est la compréhension des mécanismes fondamentaux de la mémoire. Néanmoins, leur bonne connaissance nous permettra à terme de mieux comprendre les pathologies qui sont associées à des troubles de la mémoire, comme les maladies neurodégénératives - Alzheimer, Parkinson – ainsi que les pathologies génétiques liées aux déficits cognitifs.

Procédures

L’ensemble des animaux subiront une chirurgie pour infection virale (30min) avec ou sans implantation de fibres optiques (1h30). La pose d’implant et le test comportemental nécessite que les animaux soient placés en hébergement individuel pour une durée de 4-5 semaines suite à la chirurgie pour éviter le risque de perte d’implant dû à l’interaction avec ses congénères.

Impact sur les animaux

Les étapes de la chirurgie entrainant des effets indésirables sur les animaux :stress,douleurs post-opératoires. L’animal subit également un stress lié a la restriction de comportement social suite à l'isolement des animaux après la chirugie et le stress physique lié à des contentions et à la tache comportementale de peur conditionnée.

Devenir

L'ensemble des animaux est euthanasié à la fin de chaque procédure afin de réaliser des expériences d'électrophysiologie in vitro ou des études histologiques.

Remplacement

En l’état actuel de nos connaissances, la recherche proposée ne peut pas être substituée par des approches in silico car le projet traite de fonctions cérébrales complexes à la base de la mise en place de la mémoire chez les mammifères. Il n’y a donc aucune alternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques de réseaux sont modifiées dans ces préparations. Déterminer comment les informations cognitives et sensorielles sont traitées exigent que l'animal soit intact.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les conditions de l'élevage seront standardisées et en adéquation avec le bien-être des animaux de façon à obtenir des groupes d'animaux les plus homogènes possibles et ainsi diminuer le nombre d'individus pour les analyses statistiques. Afin de réduire autant que possible les erreurs statistiques qui pourraient résulter d'un nombre insuffisant d'animaux, tout en limitant le nombre d’animaux, nos tests seront strictement basés sur un seuil de significativité de 0.05. L’utilisation de tests statistiques pour ces expériences nous permet d’estimer un nombre minimal de souris nécessaires pour satisfaire les conditions statistiques de significativité.

Raffinement

Les animaux sont surveillés chaque jour par les zootechniciens. Cette surveillance est renforcée (2/jours) dans les jours qui suivent la chirurgie jusqu’à récupération complète des animaux.Des critères de bien être seront évalués : allure du poil, dos vouté, blessures dues à des bagarres entre congénères, lésions cutanées, agressivité ou repli, respiration accélérée/saccadée. Le constat de signes de souffrance sans lien avec les procédures expérimentales entraine la création d’une « fiche individuelle de soin» (FIS), qui renseigne les soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc…) et l’évolution des signes. La cage est alors signalée par une étiquette « animal à surveiller ». Cette fiche est fermée quand l’animal a récupéré ou qu’une décision de mise à mort a dû être prise. Un suivi spécifique établi pour les procédures de chirurgie sera décrit dans les procédures. La chirurgie est réalisée sous anesthésie .Un contrôle de la respiration et de l’absence de reflexe est vérifié faite par pression de pâte arrière afin de contrôler la profondeur de l’anesthésie de l’animal. sera effectué tout le long de la chirurgie. La douleur induite par l’incision sera couverte par l’injection préalable en sous cutané d’un anesthésique local. L’injection en sous cutané des analgésiques en début de chirurgie va permettre une couverture analgésique jusqu’au réveil de l’animal. Une seconde injection d'analgésique est réalisée en fin de chirurgie pour assurer une couverture analgésique pendant les 4-6 heures post-opératoire. Les jours suivants si l’animal montre des signes de souffrance, il recevra en sous cutanée une injection quotidienne d’un anti inflammatoire non stéroïdien, jusqu’à disparition des signes de mal être. Afin que la perfusion intracardiaque soit indolore, ce geste est précédé d’une injection d’une double dose d’analgésique.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des mammifères. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine afin de mieux comprendre l’importance des mécanismes synaptiques sur l’adaptation comportementale. Le projet sera réalisé sur des animaux de 6 à 16 semaines d'âge, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.

108 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, une cavité est creusée dans leurs molaires puis laissée ouverte 24 heures pour déclencher une inflammation de la pulpe dentaire, avant l'application d'un hydrogel expérimental. Le porteur reconnaît une douleur buccale et une gêne pour s'alimenter, et prévoit l'euthanasie de groupes de six animaux à 24 et 72 heures pour récupérer les molaires. Il affirme que les expériences in vitro ne reproduisent pas les interactions cellulaires complexes de l'inflammation et que le recours au rongeur reste "nécessaire" pour valider le biomatériau.

Objectifs

La carie dentaire touche environ 98% de la population en Europe. La dent représente un environnement spécialisé où la pulpe dentaire est un tissu conjonctif mou entouré d'une barrière minérale dure faite de dentine et d'émail. Lors d’une carie, les micro-organismes pénètrent l’émail et la dentine et déclenchent ensuite une réponse inflammatoire/immunitaire dans la pulpe dentaire (pulpite). Cette pulpite peut entraîner des douleurs dentaires très aiguës (la forme la plus répandue de douleur orofaciales). Le traitement des dents en pulpite est encore controversé. Le traitement « classique » canalaire radiculaire présente un bon taux de succès (85%) : il consiste après mise en forme et désinfection à l’aide d’une solution d’hypochlorite de sodium 2,5% à obturer de manière tridimensionnelle l’intégralité de l’endodonte avec un ciment et de la gutta percha (polymère naturel). Cependant, les dents traitées sont plus cassantes que les dents non traitées ; il y a une perte des capacités de cicatrisation, et un risque de dissémination bactérienne dans l'organisme subsiste toujours après traitement radiculaire. Une approche alternative consiste à retirer uniquement la partie enflammée de la pulpe pour maintenir et préserver son potentiel de guérison. Les avantages de ces thérapeutiques sont : le maintien des mécanismes de défense, la perception de la douleur comme système d'alerte, la cicatrisation et la régénération des tissus, l'achèvement de la formation des racines chez les jeunes patients. Malgré ces avantages évidents, cette approche alternative est encore peu pratiquée notamment parce que le résultat est difficilement prévisible en raison de l'état inflammatoire du tissu pulpaire restant. En effet, l'inflammation pulpaire est souvent trop importante et entraîne une nécrose pulpaire. L'originalité de ce projet est de contrôler la réponse immunitaire qui est le principal facteur de succès.

Bénéfices attendus

Ce modèle nous permettra d’induire une inflammation dans un système global ce qui n’est malheureusement pas possible avec les expérimentations in vitro. Nous pourrons alors évaluer l’effet anti-inflammatoire de ces nouveaux hydrogels d'acide hyaluronique à base de nanoémulsion chargée en lipoxine A4 (LXA4). Les nouvelles stratégies thérapeutiques utilisant des LXA4, qui améliorent la résolution de l’inflammation pourraient avoir un meilleur rapport bénéfice/risque. A court terme ce protocole nous permettra de répondre à plusieurs questions. Tout d’abord, nous pourrons choisir une formulation d’hydrogel, la plus efficace pour favoriser la résolution de l’inflammation. Nous pourrons également valider l’effet de la LXA4 in vivo dans un système complexe et non seulement in vitro sur les macrophages. Notre proposition peut également être avantageuse par rapport à d'autres systèmes d'administration de médicaments qui ont des effets immunotoxiques indésirables potentiels. A plus long terme, ce protocole marquera une avancée dans l’élaboration d’un système complexe permettant de relarguer des molécules anti-inflammatoires telles que la LXA4 de manière contrôlée dans le temps. En clinique, l’objectif final sera d’apporter une alternative supérieure en termes de cicatrisation et de régénération des tissus concernés dans le cadre des pulpites (maintien des mécanismes de défense, perception de la douleur comme système d'alerte, cicatrisation et la régénération des tissus, l'achèvement de la formation des racines chez les jeunes patients). Bien que notre perspective se concentre sur le domaine de la dentisterie, l'utilisation de notre proposition thérapeutique pourrait être déployée afin de traiter de multiples maladies inflammatoires et/ou des défauts osseux.

Procédures

Le jour de la procédure, les rats seront anesthésiés. L’ouverture buccale sera maintenue par instrument dentaire. Pour induire l’inflammation, nous formerons une cavité à l'aide d'instruments dentaires sur les molaires, la cavité formée sera rincée au sérum physiologique avant d’être laissée à l’air libre durant 24h. Après 24h d’exposition, la cavité sera de nouveau rincée au sérum physiologique pour éliminer tous débris éventuels puis nous viendrons injecter dans la cavité la proposition thérapeutique (ou bien les solutions contrôles) à l’aide d’une seringue, le volume sera adapté à chaque cavité de manière à la remplir. La cavité sera ensuite refermée avec un biomatériau utilisé en dentisterie. Pour chaque groupe, 6 rats seront euthanasiés à 24h et 6 autres à 72h. Nous récupérerons les maxillaires de manière aseptique afin de procéder aux différentes analyses.

Impact sur les animaux

Ce modèle entraine une inflammation « contrôlée » et limitée du tissu pulpaire. Ce protocole de classe modérée pourrait conduire à : - Une douleur au niveau buccal après avoir exposé le tissu pulpaire à l’environnement oral - Une gêne pour s’alimenter (normalement pendant 24h) liée aux dents laissées ouvertes. Le design de l’étude permet de conserver un coté sans atteinte dentaire permettant une alimentation normale. Nous resterons bien évidemment très attentifs sur tout comportement anormal des animaux de manière à soulager leur douleur si celle-ci venait à apparaître.

Devenir

Les animaux doivent être mis à mort afin de pouvoir récupérer les molaires traitées et controlatérales (qui serviront de témoins).

Remplacement

Cette étude prend en compte la règle des 3R. Les expériences in vitro ne permettent malheureusement pas de mimer les interactions complexes intervenant entre les différents acteurs cellulaires (macrophages, neutrophiles, monocytes…) et les différents systèmes (immunitaires, vasculaires…). Il est donc nécessaire de travailler sur des systèmes biologiques complexes représentés par les animaux afin de mieux étudier les mécanismes mis en jeu lors de la réponse inflammatoire. L’utilisation de rongeurs reste nécessaire afin de valider les propriétés des biomatériaux chargés en termes de biocompatibilité, et bioactivité. Il n’existe malheureusement pas de solution de remplacement complet ou par des invertébrés.

Réduction

Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les formulations d’hydrogels ont été testées et sélectionnées en amont pour leur biocompatibilité et leur caractère anti-inflammatoire in vitro. Le nombre de 6 animaux par groupe est calculé à partir d’un test de puissance statistique pour une différence significative de 20%, un écart-type de 10% et un risque consenti de 5%.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse, les animaux seront manipulés plusieurs jours avant l’expérimentation dans un but d’habituation et leur environnement sera enrichi par alpha dri. Les rats seront hébergés à raison de 3 rats par cage. Nous raffinerons également en réduisant les douleurs via : - 1. Une anesthésie réalisée localement avant toute procédure sur la dent. - 2. Des antalgiques en post opératoire. Les rats seront observés et pesées quotidiennement jusqu’à la fin de l’expérimentation. Par ailleurs, des points limites ont été identifiés et les procédures de raffinement à mettre en oeuvre lors de l’atteinte de ces points limites ont été décrites. De plus, pour faciliter la prise alimentaire, l’alimentation des rats sera posée sur le sol de manière à être plus accessible. Enfin, les analyses menées sur chaque animal seront complètes. Les molaires traitées et les molaires controlatérales seront prélevées pour effectuer des analyses complètes afin d'exploiter le tissu extrait dans sa totalité.

Choix des espèces

Notre choix se base donc sur l’étude de la bibliographie. Notre projet fondé sur une approche translationnelle est un préalable nécessaire à un développement préclinique sur d'autres espèces plus proches de l'Homme. Ce modèle est bien maitrisé dans notre laboratoire. Le modèle de carie induite sur la molaire de rat est couramment utilisé dans la littérature pour l’étude des biomatériaux et/ou la réponse immunitaire de la pulpe dentaire tout particulièrement pour l’approche moléculaire, histologique et imagerie 3D. Nous avons choisi d’utiliser uniquement des mâles. Il existe des différences liées au sexe dans la prévalence des lésions carieuses chez l’Homme. Ces différences sont dépendantes d’un grand nombre de variables (milieu socio-économique, accès à l’éducation, accès aux soins). En revanche ces différences n’ont jamais été démontré dans des modèles animaux de caries dentaires. La réponse immunitaire est capitale dans la cicatrisation et il peut y avoir des différences de réponse entre mâles et femelles. Nous prévoyons d’utiliser que des mâles pour justement éliminer ce biais et cela correspond de plus à des publications qui nous ont servi de références pour l’élaboration du protocole. Les animaux reçus auront 7 semaines, ils auront une semaine d’acclimatation dans l’animalerie avant le début du protocole. Les rats auront donc 8 semaines au début du protocole et presque 9 semaines à la fin du protocole. Ce choix correspond à notre volonté de travailler sur de jeunes adultes afin d’éviter les effets liés à la sénescence, de plus cela correspond aux protocoles standards retrouvés dans la littérature concernant ce modèle d’inflammation de la pulpe dentaire.

96 poules vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Inoculées avec le virus de la maladie de Marek, elles subissent huit prélèvements de sang et trois prélèvements de plumes, et le porteur indique s'attendre à ce que la majorité développe la maladie, avec fièvre, paralysie, lymphome, perte de plumes ou mort subite. Les oiseaux sont hébergés en isolateurs qui restreignent leurs mouvements, et ceux présentant des symptômes graves sont euthanasiés après confirmation du diagnostic. Le porteur affirme qu'aucune approche in vitro ne permet d'étudier la latence virale et qu'aucun autre modèle animal ne convient, ce virus n'infectant que les gallinacés.

Objectifs

Le virus de la maladie de Marek est un herpès virus aviaire hautement contagieux et entrainant des lymphomes mortels pour les animaux dans un délai de quelques semaines. Ce virus est actuellement sous contrôle grâce à des protocoles de vaccination très stricts, bien que ceux-ci ont montré des failles dans les dernières années. Ce virus est également un outil en recherche biomédicale de par son côté modèle d’oncogenèse viro-induite. L’objectif de ce projet est d’approfondir les connaissances sur l’oncogenèse induite par ce virus. Alors que celle-ci a été longtemps réduite au résultat de l’expression d’un facteur de transcription viral dérégulant la biologie cellulaire des cellules infectées de manière latente, les découvertes successives d’acides ribonucléiques (ARN) non-codants impactant le cycle viral et l’oncogenèse viro-induite ont remis en cause ce modèle. Dans le cadre de ce projet, nous proposons qu’un ARN non-codant nouvellement découvert et encodé à partir du même gène permettant l’expression de l’oncogène majeur du virus puisse avoir un impact sur l’apparition de la lymphomagenèse. Pour répondre à cette question deux virus OGM ont été produits en laboratoire et testés in vitro avant cette approche in vivo. L’approche in vitro a montré ses limites car l’effet est suspecté de se produire durant la latence du virus, qui n’est pas observable dans les modèles cellulaires. Ce projet nécessitera au maximum l’utilisation de 96 poules.

Bénéfices attendus

L’étude de l’impact de l’ARN circulaire étudié sur l’oncogenèse requiert un volet in vivo pour répondre à la question de recherche. Actuellement, et depuis leur première description en 2018, aucun ARN circulaire viral n’a été décrit pour ses rôles promouvant l’oncogenèse viro-induite in vivo. Le virus de la maladie de Marek est un modèle adéquat pour investiguer ce pan inexploré de l’oncogenèse viro-induite. Au travers de ce projet, nous espérons comprendre le rôle de l’ARN circulaire associé au locus de l’oncogène majeur du virus de la maladie de Marek. Les bénéfices sont donc à répartir sur plusieurs niveaux : 1- Maladie de Marek : Meilleure compréhension du cycle viral et de la tumorigenèse viro-induite 2- Biologie moléculaire : Descriptions de nouvelles fonctions des ARN circulaires, notamment viraux 3- Virologie : Description d’un pan très récent de la virologie.

Procédures

une inoculation de virus sur animaux vigiles + 8 prélèvements de sang sur animaux vigiles + 3 prélèvements de plumes sur animaux vigiles. Durée de chaque acte : moins d’une minute.

Impact sur les animaux

1/ L’hébergement des animaux en isolateurs est nécessaire dans le cadre des recherches portant sur le virus de la maladie de Marek. Cependant, l’hébergement en isolateurs peut induire une compétition sur les ressources alimentaires en fonction de la fréquence des nourrissages. Ce type d’hébergement réduit également la liberté de mouvement des animaux. 2/ La maladie de Marek est une maladie virale hautement contagieuse et fatale pour la majorité des animaux infectés. Il est attendu que la majorité des animaux de l’étude soient atteints de la maladie durant le temps de l’étude. Parmi les symptômes possibles : fièvre, paralysie, mort subite, lymphome, perte de poids, perte de plumes, difficultés respiratoires, ailes pendantes, boiterie. 3/ Les prises de sang et prélèvements de plumes entraineront un stress récurrent chez les animaux concernés. Ces manipulations entraineront également des douleurs ponctuelles : un animal dont la contention serait mal assurée pourrait se faire mal ou se blesser ; l’injection intramusculaire peut entrainer une douleur au niveau du site d’injection et les prises de sang peuvent être sources d’hématomes au site de prélèvement. Les prélèvements de plumes entrainent une douleur ponctuelle pour l’animal.

Devenir

En fin d’expérience, tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser différents prélèvements d'organes et de plumes.

Remplacement

Il est impossible de remplacer le modèle par des approches in vitro ou in silico car les méthodes actuelles n‘offrent qu‘une approche limitée de la maladie. Notamment, il n‘est pas possible d‘étudier in vitro la latence virale, responsable de la lymphomagenèse. L’utilisation d’un autre modèle animal, moins sensible, est également impossible car cet herpès virus n’infecte que les gallinacés.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque lot a été établi afin d’être en conformité avec le principe de réduction des règles de bien-être animal et de manipuler un nombre d’échantillons suffisants pour établir si les différences mesurées entre lots sont statistiquement significatives et donc non dus au hasard. Les meilleurs tests statistiques seront appliqués dans les comparaisons des différents groupes pour permettre un traitement optimal des données.

Raffinement

Une visite des animaux est effectuée 2 fois par jour par le personnel technique qualifié afin de détecter l’apparition de symptômes de la maladie ou tout autre signe anormal lié à la santé et au bien-être des animaux. Les animaux présentant des symptômes graves de la maladie de Marek seront euthanasiés après confirmation du diagnostic par le responsable du projet. Les animaux présentant des symptômes légers feront l’objet d’une surveillance accrue pour détecter l’apparition de nouveaux symptômes. L’ensemble des gestes techniques est assuré par du personnel formé et compétent, ce qui limitera le stress des animaux. La contention est effectuée en douceur et les prélèvements sont le plus rapide possible. Les prélèvements de plumes et de sang sont réalisés simultanément pour limiter le stress. Le nombre de prélèvements a été réduit au minimum et espacés au minimum de 7 jours pour limiter la manipulation et la souffrance liées aux prélèvements répétés. Dans le cas des prélèvements de plumes, de petites plumes seront prélevées, ce qui limite la douleur par rapport aux prélèvements de plus grosses plumes. Afin de limiter la douleur lors de l’inoculation du virus, nous utiliserons des seringues avec des aiguilles fines et courtes. Les injections seront réalisées sous PSM (poste sécurité microbiologique) avant l’entrée des animaux dans les isolateurs afin de faciliter la manipulation, notamment la contention des animaux et ainsi rendre l’injection plus simple et moins stressante pour les animaux. des vers de farine seront testés comme aliment de récompense après les prélèvements. Des points limites adaptés ont été définis.

Choix des espèces

Le virus de la maladie de Marek ne provoque des lymphomes que chez les gallinacés. L’utilisation de la race choisie permet d’obtenir des effets plus importants et donc, de limiter le nombre d’animaux utilisés dans l’étude. De plus, chaque année, malgré la vaccination, des élevages de poulets présentent des cas de maladie de Marek malgré la vaccination. Cela peut être dû à une mauvaise vaccination, à des souches hypervirulentes ou à des environnements très contaminés. Pour des raisons techniques, les poulets seront infectés à l’âge de 14 jours. Ils seront euthanasiés à maximum 75 jours d’âge. L’âge d’inoculation de 14 jours a été déterminé car il permet de commencer les prélèvements sanguins dès le début de l’expérience, tout en restant suffisamment sensible à la maladie pour obtenir des résultats robustes en un minimum de temps.