Recherche fondamentale

Pour tester un anticorps contre le canal TRPV6 sur les métastases du cancer de la prostate, notamment osseuses, 650 souris swiss nude, immunodéficientes, sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une fois sous anesthésie des cellules cancéreuses humaines, sous la peau pour 260 d'entre elles, dans le cœur, dans la veine ou dans le tibia pour 130 chacune, et des injections d'anticorps dans le péritoine deux fois par semaine, pendant une durée qui peut atteindre trois mois. Le porteur attend des tumeurs pouvant entraîner prostration, perte de poids, pelage dégradé, comportements agressifs avec morsures et, en cas de métastases osseuses, une destruction de l'os suivie aux rayons X. Les souris montrant des signes graves associés à un point limite sont mises à mort, et toutes les autres le sont à la fin de chaque protocole, le porteur donnant pour raison de "mettre fin à la souffrance des animaux".

Objectifs

Un vaste ensemble de preuves suggèrent que l'expression de la protéine TRPV6 est un événement commun dans le développement du cancer de la prostate. En effet, cette protéine qui constitue un canal calcique est totalement absente dans la prostate saine mais devient de plus en plus exprimé au cours du développement du cancer jusqu'à être présente chez 100% des patients ayant des stades tardifs du cancer. Pourtant, le rôle de cette protéine dans le développement des métastases et notamment les métastases osseuses (apparaissant majoritairement chez les patients atteint du cancer de la prostate) reste entièrement méconnu. Pour cela, notre projet vise à étudier la possibilité de cibler et supprimer des tumeurs et des métastases exprimant TRPV6 en utilisant un modèle de xénogreffe de cellules cancéreuses humaines dans des souris immunodéficientes afin de déterminer la faisabilité du traitement par notre anticorps TRPV6 ainsi que les mécanismes moléculaires impliqués. Afin de préciser le rôle du canal TRPV6 dans la formation de métastases in vivo, dont les métastases osseuses, il est nécessaire d’utiliser plusieurs modèles d’injection qui reflètent divers mécanismes/étapes de cancérogénèse.

Bénéfices attendus

Retombées scientifiques et économiques attendues : Comme partie fondamentale du projet, nous allons d’abord démontrer le rôle du canal TRPV6 dans l’acquisition du phénotype agressif/métastatique tels que la migration, l’invasion et, et ainsi évaluer son implication dans le guidage et l’installation des cellules cancéreuses dans l’os. Ces données nous permettront de corréler la présence/expression de ce canal à sa fonction pathophysiologique particulière et le proposer comme outil de diagnostique en clinique. Ce dernier point est crucial pour le diagnostic du cancer de la prostate pour éviter un sur-traitement inutile et possiblement nocif pour le patient. L’application la plus importante de ce projet sera la preuve de concept de la stratégie thérapeutique en utilisant l’anticorps mabTRPV6 afin de cibler spécifiquement et de stopper les tumeurs exprimant TRPV6. Finalement, nos outils pour cibler TRPV6 in vivo comme mabTRPV6 seront validés pour être humanisés et utilisés chez l’humain. Les perspectives quant à la possibilité d’empêcher l’apparition de métastases et/ou leur expansion, notamment, les métastases osseuses, seront également considérées afin de les mettre sur l’échelle des essais cliniques.

Procédures

Tous les animaux seront soumis une fois à l'injection de cellules cancéreuses sous anesthesie par isoflurane : soit par la voie souscutanée: 260 animaux soit par la voie intracardique: 130 animaux soit par la voie intraveineuse: 130 animaux soit par la voie intratibiale : 130 animaux Les animaux seront injectés en intrapéritoneal avec des anticorps monoclonaux anti-TRPV6 (2 fois par semaine) pour suivire le développement des tumeurs. Au maximum cela sera 650 animaux. La durée peut aller jusq'à 3 mois. Les tumeurs seront photographiées une à deux fois par semaine sous anesthésie par isoflurane si les animaux développeront des métastases.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules cancéreuses entraînera l’apparition de tumeur qui constituera la nuisance principale attendue. Des signes de stress peuvent apparaître à la suite du développement de la tumeur : prostration, perte de poids, pelage dégradé ou encore des comportements agressifs avec morsures qui seront suivis quotidiennement. Dans le cas où des métastases osseuses apparaissent, il peut également y avoir une lyse osseuse (qui sera suivie par rayons X). L’anesthésie par isoflurane ne constitue qu’une nuisance légère, les souris se réveillant extrêmement rapidement (quelques secondes).

Devenir

Afin de mettre fin à la souffrance des animaux, à la fin de chaque protocole, les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Les caractéristiques morphologiques, physiologiques et immunologiques de la souris ne sont pas reproductibles in vitro. L’utilisation d’animaux d‘expérimentation est particulièrement pertinente dans le cadre de recherche en cancérologie reflétant ce qui se produit en pathologie humaine. De plus, le trafficking/guidage et l’installation dans l’os au niveau d’un organisme entier n’est pas reproductible in vitro.

Réduction

Réduction : Le logiciel statistique BiostaTGV a été utilisé pour réaliser une analyse de puissance afin de déterminer la taille des groupes nécessaires à la génération de données fiables. Afin d’observer une différence statistiquement significative entre deux groupes, 10 souris par groupe expérimental (nombre de groupes: 13) seront nécessaires pour réaliser un test de Wilcoxon requis pour ce type d’étude. Nous ferons donc 5 protocoles de 130 souris chacun. Des expériences préalables ont été effectuées dans le but de déterminer la dose optimale de mAbs, ne permettant pas de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Raffinement : Les souris cohabiteront par groupe de 5 dans un environnement enrichi (tunnel en papier, batôn à ronger, coton) pour réduire le stress des animaux et aucun nouvel animal ne sera introduit dans des groupes déjà formés. L'environnement des animaux, l'équipement, système d’abreuvoir, la qualité de l’eau, la nourriture et la litière seront révisés régulièrement. L’état de bien être des souris sera évalué quotidiennement par l’observation des signes physiologiques (perte de poids, aspects du pelage, morsures, etc). Les expérimentations se feront dans un environnement confiné. Lors de chaque anesthésie, la température des animaux sera maintenue grâce à l’utilisation de coussins chauffants. En cas de plaies causées par les souris (lutte entre animaux), des soins seront immédiatement prodigués afin de réduire la douleur. En cas de signes graves de stress associé à un des points limites, les animaux correspondant seront mis à mort afin de mettre fin à leur souffrance.

Choix des espèces

Les souris swiss nude sont couramment utilisées en oncologie. Elles sont immuno-déficientes, ce qui permet l’injection de cellules tumorales humaines et reproduire les tumeurs humaines in vivo. Elles ne possèdent pas de lymphocytes T, mais les autres cellules du système immunitaire (lymphocytes B, macrophages, cellules dendritiques, cellules NK) sont présentes et ne sont pas affectées dans leurs fonctions. Les protocoles seront réalisés avec des souris âgées de 5 semaines. L’incidence, et le développement des tumeurs humaines est très faible chez les animaux plus âgés.

410 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris, porteuses d'une insuffisance rénale chronique d'apparition spontanée, reçoivent des traitements pharmacologiques quotidiens et subissent des passages en cage métabolique jusqu'à quatorze heures et une injection rétro-orbitaire pour mesurer la filtration rénale. Le porteur prévoit de tuer les animaux perdant plus de 20 % de leur poids ou présentant des signes de souffrance, seuils qu'il présente comme des points limites. Il affirme le recours à l'animal "indispensable", les mécanismes de la maladie étant selon lui impossibles à reproduire in vitro.

Objectifs

L’insuffisance rénale chronique (IRC) est une maladie souvent associée à l’hypertension artérielle et au diabète. Si l’IRC n’est pas correctement traitée, elle peut conduire à la dialyse. L’IRC mettant en jeux plusieurs organes, la découverte de nouveaux traitements de cette maladie nécessite des études précliniques chez l'animal. Nos travaux antérieurs ont montré l’efficacité de certains traitements chez la souris diabétiques Notre objectif est de tester l’efficacité de ces traitements dans un autre modèle non-diabétique présentant un développement spontané et rapide de l’IRC .

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de mieux comprendre les mécanismes de mise en place de l'insuffisance rénale, et de proposer de nouvelles pistes de traitement.

Procédures

Les souris de 4 semaines seront soumis à des 3 séries de traitements pharmacologiques quotidiens jusqu'à 8 /10 semaines d'âge. Au cours du traitement, les souris seront soumises (1) à un suivi régulier de leur poids (1 fois par semaine), (2) à une mesure de leur composition corporelle (2 à 3 fois), (3) à la mesure de leur diurèse (1 à 2 fois), (4) à une évaluation du débit de filtration glomérulaire (DFG) (1 fois, 1 semaine avant la fin du traitement. A l’issue des traitements, les souris seront euthanasiées et analysées.

Impact sur les animaux

(1) suivi régulier de leur poids : léger stress lié à leur manipulation de la cage à la balance et vis versa (2) mesure de leur composition corporelle: léger stress lié à leur contention transitoire (3 minutes) dans ll’EchoMRI (3) à la mesure de leur diurèse (1 à 2 fois): léger stress lié au passage (14h max) dans la cage métabolique (4) évaluation du débit de filtration glomérulaire: légère douleur liée à l’injection rétro-orbitaire

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure en vue de l'analyse de leur sang, leur urine, et leurs organes.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation sur des animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes physiopathologiques complexes mis en jeux dans le développement de l’IRC et qui sont impossibles à reproduire in vitro.

Réduction

Les modèles expérimentaux utilisés sont bien maitrisés par les expérimentateurs, ce qui évite les étapes de mise au point couteuses en animaux. Le nombre d’animaux est calculé au plus juste d’après notre connaissance du modèle pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes scientifiquement interprétables pour chaque paramètre principal. Il est prévu d’utiliser 410 souris. Le nombre de souris par groupe (n=10) est calculé au plus juste pour espérer observer une différence significative.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un service de zootechnie agréé par le ministère : 4 souris par cage équipée d’éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), et alimentée en eau et en aliment ad libitum. Les animaux sont observés quotidiennement afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés une fois par semaine. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale, et les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Des points limites ont été définis : 1) Perte de poids supérieure à 20% du poids initial ; 2) Signes de souffrances (posture de prostration ou léthargie, comportement ou apparence anormaux, présence de lésions, absence de toilette…) sans amélioration pendant plus de 24h. Si un de ces points est atteint au cours du protocole, les animaux concernés seront euthanasiés.

Choix des espèces

L’espèce utilisée permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons le plus souvent la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Les traitements pharmacologiques débuteront sur des souris âgées de 4 à 6 semaines quel que soit le génotype. A ces âges, les reins sont pleinement développés et les souris ne présentent aucune altération détectable de protéinurie ou d’urémie (critères de détérioration de la fonction rénale). Les traitements seront poursuivis durant 8 à 10 semaines avant euthanasie.

50 gerbilles de Mongolie vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur induit d'abord un cholestéatome, une otite chronique destructrice, par cautérisation des trompes d'Eustache sous anesthésie, puis teste un outil chirurgical robotisé couplé à un laser pour détecter et détruire la lésion. Il indique que la formation du cholestéatome peut entraîner une baisse d'audition et des infections de l'oreille et que les deux interventions durent une quinzaine de minutes chacune. Il revendique la gerbille comme seule espèce non humaine sujette au cholestéatome spontané et juge le recours à l'animal "incontournable" pour reproduire des conditions chirurgicales réalistes.

Objectifs

Le cholestéatome est une forme grave d'otite chronique caractérisée par une croissance anormale et proliférative de la peau dans la cavité épitympanique, à l’origine d’infections répétées . C’est une lésion bénigne, mais son extension locale peut être destructrice : extension à l'oreille moyenne, remplissant la cavité tympanique autour des osselets, puis autour de l’oreille interne, du nerf facial, ou des méninges. Les patients souffrant de cholestéatome ont généralement des otorrhées purulentes chroniques, des pertes auditives, des vertiges, et plus rarement une paralysie faciale. Des complications graves liées à la propagation du cholestéatome vers le crâne peuvent se produire, entraînant des abcès cérébraux, méningite ou empyème. La chirurgie est le seul traitement connu pour enlever le cholestéatome. Elle doit préserver autant que possible les fonctions normales de l'oreille moyenne et interne. En raison de la structure délicate des structures de l’oreille moyenne telles que le tympan, la chaine des osselets, le nerf facial ou celles de l’oreille interne telles que la cochlée ou le vestibule, une telle microchirurgie est réalisée sous microscope et sous anesthésie générale. L’objectif du projet est de tester un outil chirurgical intelligent visant à détecter puis éradiquer ce type de lésion histologique dans un modèle animal de cholestéatome connu. Un outil robotisé intelligent visant à améliorer la détection et le traitement du cholestéatome sur le site opératoire dans l’oreille moyenne a été préalablement développé. La détection sera améliorée à l’aide d’un système d’imagerie multimodale associant imagerie par fluorescence et tomographie par cohérence optique (ou Optical Coherence Tomography, OCT). Il sera couplé à cette détection un laser de traitement dans le but de détruire les lésions de cholestéatome. Le système a déjà été validée sur des pièces anatomiques humaines et sur des tissus biologiques humains inertes cholestéatomateux ou non (contrôle) obtenus au cours d’intervention chirurgicale. Il nécessite une évaluation sur modèle animal afin de reproduire des conditions chirurgicales réalistes (saignement) et la possibilité d’un cholestéatome résiduel en cas d’ablation incomplète de la lésion primitive.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de cette étude sont une validation d’un outil de détection et de traitement du cholestéatome. Après la mise au point et validation du prototype sur des modèles cadavériques humains, la validation sur modèle animal est l’étape suivante en vue d’une translation clinique chez l’homme. La mise au point d’un outil clinique pour cette pathologie pourrait diminuer le nombre d’intervention chirurgicale chez l’homme. En raison de la complexité de l'anatomie de l'oreille moyenne, de la taille millimétrique de ses structures et la difficulté de reconnaissance des limites du cholestéatome. Il en résulte souvent l'impossibilité de réséquer complètement le cholestéatome, ce qui entraîne une maladie résiduelle et des opérations de révision chirurgicales. L’utilisation d’un microscope opératoire ou d’endoscopes réduisent mais n'éliminent pas complètement le taux de récidive, en raison des résidus microscopiques potentiels qui ne peuvent pas être facilement distingués des tissus sains. L'incidence élevée des cholestéatomes résiduels chez l’enfant est encore plus élevée et varie de 20 à 25% par rapport à 15% environ chez les adultes. Cela nécessite une ou plusieurs interventions systématiques. Éradiquer le cholestéatome en une chirurgie réduirait les coût des interventions, de l’hospitalisation, et la médication itérative sur les otorrhées à répétition. .

Procédures

Tous les animaux subiront deux interventions sous anesthésie générale, d’une durée d’environ 15 minutes. Les études des cinquante dernières années sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité́ lors de ce type de chirurgie, avec des douleurs contrôlées et des animaux se ré alimentant rapidement après la chirurgie. Les animaux auront ensuite un examen de l’oreille sous anesthésie gazeuse. L’examen durera environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

La cautérisation des trompes d’eustache a été largement décrite et utilisée dans la littérature sur de gerbilles. Les études des cinquante dernières années sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité. Les douleurs engendrées par ce geste chirurgical sont contrôlées par les antalgiques habituels et les animaux récupèrent en quelques jours. La formation de cholestéatome peut entrainer une hypoacousie chez les Gerbilles. Parfois, le cholestéatome peut entrainer une infection de l’oreille. Dans ce cas, ces animaux suivent un traitement antibiotique adapté.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés, puisque nous souhaitons faire de l’histologie et des coupes de l’oreille après l’intervention pour vérifier l’absence de cholestéatome.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative que ce soit des études au niveau cellulaire ou tissulaire ne sont connues et envisagées pour ce projet. L’oreille est un organe complexe et il n'existe pas, à ce jour, de modèle permettant de reproduire un cholestéatome. Le seul moyen permettant d’évaluer la détection et la destruction d’un cholestéatome reste l’utilisation d’un modèle animal vivant pour simuler les conditions chirurgicales réelles et notamment la présence de saignement sur le cholestéatome. Ainsi, le recours à l’animal est incontournable pour évaluer notre outil robotisé.

Réduction

Les groupes sont constitués afin de garantir une puissance statistique de 80% pour des différences de 20%. Nous utilisons classiquement des tests statistiques pour tester la significativité́ de nos résultats. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment (la pathologie touche indifféremment l’homme et la femme), et nous nous concentrerons sur le nombre limité d’animaux en fonction de la capacité des dispositifs expérimentaux et de l’application des mesures sur le même animal le cas échéant. La mise au point (étape 1) permettra de valider le modèle de cholestéatome car la formation d’un cholestéatome n’est pas systématique. Dans la littérature, le taux de succès varie entre 60 et 75%. Dans cette étude, nous visons un taux de réussite de l’ordre de 60% : chaque animal ayant 2 oreilles, pour 50 animaux, nous espérons obtenir 60 oreilles (/100) avec cholestéatome à 12 semaines de suivi. La seconde étape permet d’évaluer l’outil robotique intelligent. Nous jugerons de deux critères de jugement principaux : (i) détection du cholestéatome et (ii) destruction du cholestéatome. En cas de cholestéatome bilatéral chez un même animal, les deux oreilles seront utilisées.

Raffinement

La semaine précédant l’expérimentation, les gerbilles seront manipulées plusieurs fois afin de les habituer au contact de l’expérimentateur et ainsi minimiser le stress le jour de la procédure expérimentale. Les méthodes sélectionnées pour cette étude sont les moins invasives et les moins douloureuses actuellement. Deux chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale par un chirurgien ORL expert et dureront 15 minutes environ : cautérisation des trompes d’eustache (étape 1, mise au point) et test de l’outil robotique intelligent (étape 2). Les animaux du projet seront ensuite suivis quotidiennement. La surveillance otoscopique sera courte et réalisée sous anesthésie gazeuse par un chirurgien ORL expert, elle durera 5 minutes environ. D’après la littérature, la cautérisation des trompes d’eustache n’entrainait pas de surmortalité. Les douleurs étaient contrôlées par des antalgiques habituels. Les points limites seront déterminés, selon une grille, pour évaluer une éventuelle souffrance, détresse ou inconfort. Des mesures de gestion de la douleur seront mises en place en fonction du score avec un protocole antalgique adapté. Les gerbilles seront hébergées en groupe dans un environnement enrichi pour favoriser un comportement naturel.

Choix des espèces

La gerbille est le modèle d'étude le plus approprié, car c'est la seule espèce, en dehors de l'homme, qui est sujette à des cholestéatomes spontanés. Les cholestéatomes des gerbilles présentent plusieurs caractéristiques similaires à celles des humains, tant au niveau macroscopique que microscopique. Il a déjà été démontré dans la littérature que l'oblitération expérimentale du conduit auditif externe ou de la trompe d'Eustache permettait d'induire des cholestéatomes chez ces animaux, avec des caractéristiques très similaires à celles qui se produisent spontanément. Le taux d’occurrence spontanée de cholestéatome serait équivalent à 45%, et après cautérisation de la trompe d’eustache il serait de 60–75% et après 12 semaines de suivi. Par ailleurs, la trompe d'Eustache de la gerbille est plus facile d’accès, courte (1,8 mm) et orientée très verticalement (81° contre 15° chez le rat). Le modèle de gerbille est utilisé par d’autres équipes de recherche, et nous pourrons bénéficier de leur expérience. Le projet impliquera exclusivement des animaux adultes. Les études menées jusqu’à présent dans le laboratoire ont utilisé des animaux de cet âge. Les données obtenues dans l’étude présente pourront être comparées à celles déjà obtenues avec des protocoles voisins.

630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'inhibiteurs et de molécules inflammatoires, dont une instillation intra-rectale par cathéter provoquant une inflammation intestinale, et un prélèvement de sang, pour tester des inhibiteurs des NADPH oxydases dans des modèles d'inflammation chronique. Le porteur annonce une douleur modérée, une perte de poids et des selles molles. Il évoque des systèmes de co-cultures capables d'imiter certaines fonctions d'organes, tout en les jugeant limités par l'absence de flux sanguin.

Objectifs

Les maladies inflammatoires sont des causes majeures de mortalité dans le monde développé. Au cours de la réponse inflammatoire pathologique, c’est-à-dire lorsque la réponse inflammatoire est non résolue, devient prolongée et chronique, les cellules du microenvironnement produisent de manière accrue des dérivés toxiques de l’oxygène. Ces dérivés sont des substances chimiques qui sont formées à partir de l’interaction de l’oxygène avec d’autres composés et peuvent endommager les cellules car ils sont toxiques. La production excessive de ces dérivés peut donc entraîner des lésions tissulaires contribuant à la progression des maladies inflammatoires chroniques. Dans l’organisme, les dérivés toxiques de l’oxygène sont produits principalement par une famille de protéines spécialisées appelées NADPH oxydases (NOXs). Le dysfonctionnement ou l’expression anormale de ces protéines pourrait donc contribuer aux maladies inflammatoires. Pour de nombreuses maladies inflammatoires chroniques, les solutions thérapeutiques restent insuffisantes. C’est dans ce contexte de santé publique que se tient notre projet d’étude qui visera à valider in vivo, c’est-à-dire dans un organisme vivant, les NOXs comme cibles thérapeutiques clés pour le traitement des maladies inflammatoires, et à évaluer in vivo, dans des modèles murins d’inflammation chronique l’action anti-inflammatoire de nouvelles molécules qui inhibent les NOXs ou leurs voies d'activation que nous avons récemment identifiées in vitro.

Bénéfices attendus

Notre étude permettra d’identifier de nouvelles molécules capables d’inhiber in vivo la progression des maladies inflammatoires chroniques apportant ainsi la preuve du concept. Elle permettra d’envisager des essais cliniques chez des patients atteints de maladie inflammatoires chroniques.

Procédures

Les principaux types d’interventions auxquels les animaux seront soumis sont : des injections intra-péritonéales (administration directement dans la cavité abdominale) et sous-cutanées à l’aide d’une aiguille fine, une instillation (administration lente goutte à goutte) de molécules inflammatoires à l’aide d’un cathéter fin par voie intra-rectale, et un prélèvement de sang par ponction au niveau de la queue avec une aiguille fine. Excepté le prélèvement de sang qui sera effectué une seule fois sur tous les animaux à la fin de l’expérience, le nombre des interventions variera selon les modèles expérimentaux (3 modèles expérimentaux). Dans le 1er modèle expérimental, d’une durée de 3 jours, les souris vont subir: 1 injection en sous-cutanée pour l’anesthésie, 2 en intrapéritonéales pour l’administration de l’inhibiteur (substance qui a la capacité de bloquer un processus biologique spécifique, ici l’inflammation), 1 en intra-rectale pour l’administration de la molécule inflammatoire. Dans le 2ème modèle expérimental d’une durée de 11 jours les souris vont subir uniquement 4 injections en intrapéritonéales pour l’administration de l’inhibiteur, la molécule inflammatoire est ajoutée dans la boisson. Finalement dans le 3éme modèle expérimental d’une durée de 8 jours, les souris vont subir 2 injections en intrapéritonéales pour l’administration des molécules inflammatoires et 4 injections en intrapéritonéales pour l’administration de l’inhibiteur.

Impact sur les animaux

Les modèles d’inflammation utilisés dans cette étude sont des modèles de sévérité modérée. L’animal sera susceptible d’éprouver une douleur modérée de courte durée et son bien être pourra être impacté de façon modérée. Les animaux pourront présenter une perte de poids, les fèces pourront apparaître inconsistantes. Ils pourront également présenter une mobilité réduite. Les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel de zootechnie et les points limites seront surveillés (état général, poids, consistance des fèces, mobilité). Un analgésique sera administré si nécessaire toutes les 12 heures. Si l’animal présente des points limites atteints, il sera euthanasié. A la fin des procédures tous les animaux seront euthanasiés.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés et les tissus seront prélevés pour analyse.

Remplacement

Les connaissances issues de cette étude in vivo ne peuvent pas être obtenues actuellement par d’autres méthodes compte-tenu de la complexité physiologique de la réponse inflammatoire qui fait intervenir plusieurs types cellulaires, ce qui nous oblige à travailler à l'échelle d'un organisme. Il sera cependant possible d’envisager des systèmes de co-cultures entre les cellules immunitaires et des structures tridimensionnelles cultivées en laboratoire pouvant imiter certaines caractéristiques et fonctions d'organes humains ou animaux tel que l’intestin. Ces co-cultures pourront reproduire les interactions entre les différents types cellulaires au cours de la réponse inflammatoire de la même manière que dans un organisme vivant. Cependant ce modèle reste limité par le fait de l’absence de flux sanguin ou de déformations mécaniques (modification de la structure d’un organe en réponse à des forces mécaniques) qui sont essentiels pour la modélisation des maladies.

Réduction

Dans ces différents modèles le taux de mortalité est faible (moins de 10%), nous avons déterminé le nombre d’animaux nécessaires et suffisants dans chaque sous-groupe pour avoir des résultats statistiquement exploitables à 6 par sous-groupe. Cette démarche a été validée lors de la demande d’autorisation de projet utilisant des animaux à des fins scientifiques précédente.. Les organes (intestins, pattes, plasma) seront conservés de façon adéquate pour des études ultérieures en cas de besoin sans avoir à recourir à de nouvelles expérimentations animales.

Raffinement

Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes et le stress imposées aux animaux : hébergement en groupe, portoirs ventilés, période d’acclimatation d’au moins 5 jours dans les mêmes conditions environnementales que celles qui prévaudront lors du protocole expérimental afin de stabiliser les animaux au point de vue physiologique et comportemental et de diminuer leur stress. Un enrichissement sera proposé aux animaux tout au long de l’expérience (coton et lanières cartonnées pour la confection de nids). Des critères comportementaux, physiologiques et cliniques seront observés pour définir le point limite précoce adapté. Les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel de zootechnie et les points limites seront surveillés (état général, poids, consistance des fèces, mobilité). Un analgésique sera administré si nécessaire toutes les 12 heures. Si l’animal présente des points limites atteints, il sera euthanasié. A la fin des procédures tous les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser l’espèce souris dans notre projet de recherche car la physiologie de l’inflammation intestinale et de l’arthrite induite dans cette espèce animale est proche de celle de l’homme. De plus la taille et le poids limité de l’animal permet de restreindre les traitements à administrer et de nombreux outils biologiques sont disponibles pour caractériser l’inflammation chez la souris. L’espèce souris est donc la plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants. Les souris âgés de 8 à 12 semaines seront utilisés car les publications ayant validé les différents modèles utilisés, ont montré que ces stades sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants (souris adultes de poids suffisant).

1 926 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau, des injections de lymphocytes et d'anticorps, des gavages et des prélèvements de sang, pour étudier l'épuisement des lymphocytes T anti-tumoraux. Le porteur indique ne prévoir aucun analgésique ni anti-inflammatoire, y compris morphinique, au motif qu'ils interféreraient avec l'inflammation étudiée. Il affirme que la complexité de l'environnement tumoral ne peut être reproduite in vitro et impose un organisme intégré.

Objectifs

En France le cancer représente la première cause de mortalité, c’est pourquoi de nombreuses stratégies thérapeutiques ont été mises en place pour un meilleur traitement des cancers parmi lesquelles se trouve l’immunothérapie. L’immunothérapie repose notamment sur l’utilisation de lymphocyte T (LT) modifiés génétiquement (Cellules chimeric-antigen-receptor T ou CAR-T) et sur l’utilisation d’anticorps dans le but de redynamiser les LT anti-tumoraux fonctionnellement “épuisés” qui ont perdu leur capacité à tuer les cellules tumorales. Le phénomène d’épuisement lymphocytaire est un obstacle majeur pour l’efficacité des réponses immunitaires contre le cancer et constitue la cible principale des nouvelles immunothérapies du cancer. Ce projet vise à une meilleure compréhension des mécanismes qui régissent le phénomène d’épuisement des LT dans des modèles de tumeurs implantées et en particulier du rôle joué par deux régulateurs de l’expression des gènes appelés Id2 et Msc. En effet nos résultats préliminaires suggèrent que ces deux molécules pourraient réguler l’épuisement des LT anti-tumoraux. Les objectifs de ce projet de recherche consistent à : 1.) Évaluer le potentiel thérapeutique sur la croissance tumorale de la manipulation de l'expression de Id2 et Msc dans les LT anti-tumoraux. 2.) Déterminer si et comment Id2 et Msc contrôlent le programme génétique d’épuisement des LT.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce projet contribueront à l’optimisation de nouvelles approches thérapeutiques visant à améliorer l’efficacité des immunothérapies contre le cancer et aussi potentiellement pourraient permettre la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les souris subiront 1 injection sous-cutanée sur le flanc d’une lignée tumorale (mélanome, Lymphome, adenocarcinome) ou dans le coussinet graisseux mammaire (lignée tumorale mammaire), une injection intraveineuse de lymphocytes T, des injections intrapéritonéales d'anticorps (1 injection tous les 3-4 jours pour un maximum de 4 semaines), des gavages (1 par jour pour un maximum de 4 semaines) et des prélèvements de sang mandibulaire (1 par semaine-maximum de 3 semaines). Toutes les injections ne durent que quelques secondes et s'effectuent sur animaux anesthesiés à l'exception des injections intrapéritonéales et des gavages qui s’effectuent sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les souris subiront des injections intrapéritonéales, sous-cutanées, intraveineuses et des gavages ainsi que des prélèvements de sang. Ces manipulations peuvent potentiellement induire un stress, une angoisse ou un inconfort et/ou une douleur de faible intensité et de manière très transitoire (secondes) . Certaines tumeurs sous-cutanées peuvent se nécroser dans ce cas les animaux sont euthanasiés, occasionnellement les animaux peuvent subir une perte de poids. La thérapie ICB peut induire un peu de diahrée et une perte de poids transitoire. Dans le cas des tumeurs mammaires des métastases pulmonaires peuvent être observées à un temps tardif pouvant engendrer un deficit d'oxygénation.

Devenir

Tous les animaux intégrés dans chaque procédure expérimentale seront mis à mort en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude se fait après de nombreuses études in vitro dans des modèles cellulaires. Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne reproduiraient pas l’ensemble des voies impliquées dans des modèles physiologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de cette pathologie humaine. L’utilisation de modèles expérimentaux intégrés est essentielle à ce projet. En effet, l’environnement tumoral et l’organisation tri-dimensionnel de la tumeur sont des paramètres clés qui régulent le recrutement, l'activation et les fonctions des LTs anti-tumoraux. A ce jour, cette complexité ne peut être entièrement reproduite in vitro. De même les différents acteurs du système immunitaire, cellules dendritiques et cellules T patrouillent par voie sanguine dans l’ensemble de l’organisme et leur recrutement dans la tumeur est défini par l’anatomie de la tumeur. Cette régulation de l'adressage tissulaire des cellules immunitaires, n'est à ce jour pas reproduit fidèlement par les systèmes de microfluidique.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux. Afin de réduire le nombre d'animaux nous utilisons des modèles de tumeurs transplantées robustes dans des conditions expérimentales optimisées pour une prise de tumeur chez plus de 90% des animaux. Nous avons également pu valider certaines approches expérimentales in vitro permettant d’optimiser l’utilisation des animaux. Afin d’assurer la fiabilité de nos résultats, nous travaillerons avec des groupes tests et contrôles d’au minimum 5 animaux et répéterons nos experiences 3 fois. Le nombre d’animaux utilisés correspond dans nos expériences et dans celles des groupes travaillant sur des modèles équivalents au nombre minimal permettant une interprétation sans ambiguïté des résultats. Ceci garantira la valeur statistique de l'étude en intégrant les variations expérimentales et les variations inter-individus. Les tests statistiques varient suivant les expériences et sont réalisés avec le module statistique de Prism.

Raffinement

Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale. Nous prenons ceci en compte grâce au suivi rapproché quotidien des animaux par le personnel de la zootechnie qui évaluera leur état général (toilettage, mouvements), l’enrichissement de leur environnement et le respect de l’aspect social du groupe (pas d’isolement ni de changement de cage); et tous les deux jours-trois jours par l'expérimentateur qui vérifiera leur poids et apportera une aide à l’alimentation en cas de besoin (ajout dans la cage d'aliment et d'eau sous forme de gelée (gel-diet et water-gel)), et qui évaluera le développement de la tumeur, et l'état de santé globale des animaux (comportement, prostration, plaies) . L’expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation trop importante de la santé d’un animal selon les points limites d’arrêt de la procédure définis en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal (SBEA) pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Si immédiatement après ou le lendemain d’un gavage ou d’une injection s.c., i.p. ou i.v., un animal cesse de s’alimenter et devient prostré, il sera euthanasié. Le projet ne prévoit pas l’utilisation d’analgésiques ou anti-inflammatoires, car ils risquent d’interférer avec les processus inflammatoires au cours de notre expérimentation. Même les anti-douleurs de type morphinique ont des propriétés immunomodulatrices.

Choix des espèces

La possibilité de générer des modèles soit sur-exprimant (transgénèse) soit déficient (KO) pour une molécule d’intérêt font des souris un modèle de choix pour mieux comprendre les interactions entre le système immunitaire et les tumeurs naissantes. Par ailleurs, les modèles murins pré-cliniques ont montré leur pertinence dans la découverte et le développement de nouvelles immunothérapies. La disponibilité d'anticorps spécifiques d'un nombre conséquent de molécules permet d'analyser finement les différentes composantes du sytème immunitaire et de leur environnement par cytométrie en flux ou par imagerie. De plus, nombre de ces anticorps sont des agonistes ou antagonistes des voies de signalisations induites par ces récepteurs, ils peuvent donc être utilisés afin de moduler le système immunitaire ou de préciser les mécanimes impliqués dans le processus biologique étudié. Des souris adultes, agées de 2 mois seront utilisées afin de pouvoir étudier les effets des manipulations sur un système immunitaire mature. Les souris sont considérées comme adultes entre 6-8 semaines d’âge. Avant toute procédure elles auront une semaine d’acclimatation.

212 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans la veine de la queue puis une série de prélèvements de sang répétés sur animal vigile, échelonnés sur vingt-huit jours, pour suivre le devenir sanguin de candidats médicaments anticancéreux. Le porteur indique que le micro-échantillonnage réduit le volume de sang prélevé et le nombre de souris. Il affirme qu'un "organisme entier" et vivant est "nécessaire" et qu'aucune alternative ne peut remplacer la souris.

Objectifs

Ce projet vise à déterminer les données de pharmacocinétiques, c’est à dire le devenir du médicament dans le sang, au cours du temps. Ces données pharmacocinétiques sont nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront d’évaluer au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité antitumorale et de tolérance qui seront également effectuées sur des modèles souris. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats de pharmacocinétique (projet actuel), d’efficacité et de tolérance seront objectivables entre l’humain et le modèle souris et serviront, à terme, de définir les modalités d'administration du médicament (dose et fréquences), lors des premiers essais cliniques. Une méthode de micro-échantillonage (prélèvement d’un échantillon de volume faible par le biais d’un dispositif adapté) sera utilisée afin d’améliorer la significativité de ces études, tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires en prélevant beaucoup moins de volume sanguin et à des fréquences adéquates.

Bénéfices attendus

La pharmacocinétique de composés thérapeutiques est un élément essentiel pour analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité et de tolérance et permettront, à terme de déterminer les doses et fréquences des premières études cliniques chez l’Homme.

Procédures

1/ Après une semaine de stabulation, les souris seront pesées et numérotées vigiles par poinçonnement auriculaire. 2/ Une contention suivie d'une injection/prélèvement sur animal vigile sont prévues sur chaque animal : - lors de l’injection par intraveineuse dans le veine caudale des candidats médicaments (t-0). - Lors de chacun des prélèvements dans la veine caudale et échantillonnage par microcapillaire (10min, 1h, 6h, 24h, 72h, 3 jours, 7 jours, 14 jours, 21 jours et 28 jours).

Impact sur les animaux

1/ La contention et les injections/prélèvements induisent un stress de l’animal durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte). 2/ les injections/prélèvements induisent un stress et une douleur de type modérée durant plusieurs secondes (pendant l’acte). Note : Les composés de cette classe thérapeutique, injectés à cette dose sont parfaitement tolérés dans la littérature et n'induisent pas d’évènements indésirables à cette dose. Ces derniers seront néanmoins surveillés lors de chaque manipulation.

Devenir

Les animaux ayant atteint un point limite par rapport à la grille de score, ainsi que l’ensemble des animaux à l’issue de la procédure, seront euthanasiés.

Remplacement

S’agissant d’analyses pharmacocinétiques, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs et robustes. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet se comportant de façon identique dans la souris comme chez l’humain (cible exprimée de la même façon et sans mutation entre les deux espèces), aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris.

Réduction

Le procédé de micro-échantillonnage lors des prélèvements sanguins permet d’obtenir l’ensemble des valeurs pour un même animal en ne lui prenant que de très faibles quantités de sang. Le nombre d’animaux utilisés est ainsi considérablement réduit par rapport à un prélèvement sanguin classique et les variations inter-individus sont également mieux maitrisées. Ainsi, seuls 4 animaux par groupe seront nécessaires pour ces expériences. Une majoration de 10% sur ce nombre d’animaux est appliquée en cas de problèmes non anticipables afin de ne pas mettre en péril les résultats de cette expérience.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté ainsi qu'un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger, ou équivalents). Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Afin de de mettre en évidence tout signe de souffrance ou d’évènements indésirables pouvant provenir du traitement, les animaux seront suivis quotidiennement et avant chacun des prélèvements (10 min, 6h, 1 jour, 3 jours, 7 jours) puis deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Les animaux seront également pesés avant le traitement, puis 1 jour, 3 jours, 7 jours post-traitement, puis deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Les animaux seront euthanasiés à la fin du dernier prélèvement (à 28 jours post-traitement). Une grille de score suffisamment prédictive et adaptée à l’étude, permettra d'éviter la souffrance des animaux avec une surveillance physiologique et comportementale. Un système de surveillance sera mis en place avec l’EU pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue les autres jours, y compris le WE.

Choix des espèces

Les études pharmacocinétiques nécessitent d’être effectuées dans un organisme vivant. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études (permettant de transposer ces données chez l’Homme). En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de tolérances seront également générées sur cette espèce animale afin de déterminer au mieux les doses cliniques à injecter de ces candidats médicaments. Des souris de souche CD-1 seront utilisées car plus massive et bien adaptée à ces expériences nécessitant des prélèvements répétés. Ces animaux seront inclus en expérience à des âges de 8-9 semaines. A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une pharmacocinétique pertinente par rapport au type de thérapies utilisées dans ce projet.