Recherche fondamentale

1 425 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe des lignées de cellules cancéreuses puis on leur injecte deux fois par semaine des anticorps, des inhibiteurs immunitaires ou des chimiothérapies, pour tester une thérapie ciblée contre les cancers de la cavité orale. Le porteur indique que le développement tumoral altère la prise alimentaire des animaux. Il revendique un "avantage éthique" à faire pousser les tumeurs sous la peau plutôt que dans la bouche, ce qui facilite le suivi, toutes les souris étant tuées en fin d'expérience.

Objectifs

Les cancers de la cavité orale et du pharynx sont un problème de santé publique puisqu'ils se situent au 5eme rang les cancers les plus fréquents chez l'homme avec 20000 nouveaux cas pour l'année 2018 en France. Les principaux facteurs de risque sont le tabac et l'alcool. Le cancer de la cavité orale peut se développer à partir de lésions orales pre-malignes dont la plus fréquente est la leucoplasie orale. Cependant, nous n’avons pas aujourd’hui assez de connaissances pour prédire quelles lésions vont se transformer en cancer et nous ne disposons pas de traitement pour prévenir/empêcher cette transformation cancéreuse. L'objectif notre projet est d’étudier l’effet d’une thérapie ciblée seule ou en association avec des inhibiteurs de point de contrôle sur le développement des cancers de la cavité orale dans des modèles murins. Ceprojet se déroulera selon quatre procédures.

Bénéfices attendus

Les travaux présentés dans ce projet permettront une meilleure compréhension du fonctionnement d’un candidat médicament anctuellement en essai clinique. Ils permettront également de mieux définir le profil des patients éligibles au traitement et susceptibles d’y répondre. Les modèles générés à partir des différentes lignées cellulaires seront également à la disposition de la communauté scientifique. Même s’ils sont complémentaires du modèle originel 4-NQO (évaluation de l’initiation tumorale et de la progression vs croissance tumorale), Ils présentent un avantage éthique par la possibilité de réaliser certains tests in vitro préalables à des investigations chez l’animal et les tumeurs se développent de manière visible en sous-cutané (non dans la cavité buccale), ce qui permet un meilleur suivi des affections potentielles des animaux.

Procédures

Injections intrapéritonéales d'anticorps ciblés (2 injections par semaine sur toute la durée du suivi tumoral) et/ou inhibiteurs de point de contrôle (selon 3 injections espacées de 4 jours) ou Chimiothérapies (une injection par semaine sur toute la durée du suivi tumoral). Injection sous-cutannées de lignées cellulaires (une seule fois). Toutes les injections sont réalisées dans un volume de 100μL qsp. PBS.

Impact sur les animaux

Altération de la prise alimentaire due au développement tumoral dans la cavité bucale.

Devenir

Tous les animaux sont porteurs de tumeurs, ils seront donc mis à mort en fin de procédure expérimentale.

Remplacement

Le modèle 4-NQO est un modèle intégré qui récapitule les phases précoces du développement cancéreux. La présence de tous les acteurs micro-environnementaux est nécessaire à la compréhension des mécanismes biologiques qui impliquent notre cible thérapeutique dans la procédure 1. Il n'existe pas de modèles d'étude in silico ou in vitro permettant l'évaluation de l'efficacité des inhibiteurs de point de contrôle car ils nécessitent la présence d'un système immunitaire fonctionnel (procédure 3). Des expériences in vitro seront menées sur les lignées générées en procédure 2 pour déterminer la sensibilité des cellules aux agents de chimio thérapie. Ces résultats conditionneront le maintien ou non des bras de traitement avec ces agents dans la procédure 4 et peuvent conduire à une réduction.

Réduction

Nous avons calculé le nombre minimal de souris à inclure, en prenant en compte notre expérience, les études déjà publiées utilisant ce modèle ainsi que pour de disposer de suffisamment de matériel biologique pour rendre nos résultats interprétables. Pour la procédure 1) D'après notre expérience (75% de tumeur semaine S32), nos objectifs (réduction 30% tumeurs observées avec le traitement), le nombre de souris nécessaires est 30/groupe. Procédure 2) Un nombre de 5 souris est suffisant pour évaluer la prise de greffe des différentes lignées cellulaires. Pour les procédures 3 et 4) D'après notre expérience la variabilité des modèles de greffes syngéniques traitées avec ces composés ne permet pas de voir l'effet de ces drogues seules ou en combinaison au-dessous d'un effectif de 12 souris. Compte tenu des aléas de prise tumorales combinés au fait que nous ne connaissons pas encore l'efficacité de prise de ces modèles, nous envisageons des groupes de 15 souris. Une réduction a été opérée dans la procédure 3 en mutualisant les bras contrôle pour plusieurs lignes de traitement. Une réduction sera opérée dans la procédure 2 sur la base des réponses aux chimiothérapies observées in vitro.

Raffinement

Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux permettra la recherche de tout signe de souffrance. Dans la procédure 1, les tumeurs se développant dans la cavité buccale, nous prêterons un soin particulier à la prise alimentaire des animaux. Le poids des animaux sera évalué 2 fois par semaine. En cas de perte de poids, des aliments liquides/semi-solides seront mis à disposition dans les cages. En cas de signe de morbidité trop importante, ceci conduira à l'arrêt anticipe de la procédure. Dans les procédures 2 à 4, le volume tumoral sera évalué 2 à 3 fois par semaine avec un pied à coulisse. Le poids des animaux sera évalué 1 fois par semaine. Pour l’ensemble des procédures, les signes de souffrance (prostration, propreté, cachexie, isolement social) seront sur veillés à chaque mesure tumorale ou pesée soit 2 à 3 fois par semaine plus les visites de l’animalerie pour le change et les surveillances de week-end.

Choix des espèces

Certaines de ces molécules sont des anticorps dirigés contre les molécules de souris. Par conséquent, les modèles de souris immunocompétentes tels que les souris C57b6 sont nécessaires à la réalisation de cette étude. Le modèle de carcinogenèse par 4-NQO est un modèle immunocompétent établi dans la littérature et représentatif des conditions humaines (similitudes de mécanismes physiopathologiques et moléculaires), et est le plus utilise pour tester des agents thérapeutiques de chimio prévention. Il a récemment été utilisé pour tester l’effet d'une immunothérapie sur la prévention de progression maligne des lésions prémalignes. Nous l’avons également déjà utilisé dans le cadre d’une précédente étude. Par ailleurs, dans les conditions du projet, il s’agit d’une espèce de laboratoire usuelle et dont le génome a été complètement séquencé. Les expérimentations seront effectuées sur des souris adultes (âge supérieur à 7 semaines) conformément au modèle établi.

672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte des cellules tumorales dans une glande mammaire, puis des traitements deux fois par semaine pendant six semaines, avec des séances d'imagerie répétées, pour tester des anticorps contre un cancer du sein triple négatif, seuls ou combinés à de l'eau "riche en hydrogène". Le porteur indique que le traitement peut faire nécroser les tumeurs et que les anesthésies et imageries répétées seront une source de stress. Les bénéfices annoncés pour les patientes restent au conditionnel, l'étude servant à valider des résultats obtenus en éprouvette, les souris étant tuées par dislocation cervicale.

Objectifs

Le cancer du sein constitue le cancer le plus fréquent chez la femme et la première cause de décès par cancer chez la femme en France. Il s’agit d’une maladie hétérogène constituée de plusieurs sous-types dont la réponse aux traitements diffèrent fortement. Le cancer du sein triple négatif (TNBC) constitue l’un des plus agressifs du fait de sa résistance aux traitements actuellement disponibles et de son taux de rechute élevé. Ce projet a pour but d’évaluer le potentiel anti-tumoral d' anticorps dans le cadre du développement de nouvelles immunothérapies, utilisées seules ou en combinaison avec de l'eau riche en hydrogène. Au travers de la réalisation de cette étude, nous déterminerons quels sont les anticorps susceptibles de devenir des anticorps thérapeutiques et parmi les plus efficaces, si la combinaison avec l'utilisation d'eau riche en hydrogène potentialisent leurs effets.

Bénéfices attendus

Le TNBC est insensible aux hormonothérapies et aux thérapies ciblées. Les avancées récentes dans le domaine de l’immunothérapie démontrent que l'utilisation d' anticorps spécifiques pourrait améliorer la survie chez les patientes atteintes d'un TNBC. Les bénéfices attendus avec l'utilisation des anticorps qui seront testés dans ce projet sont une diminution de la croissance tumorale et/ou une augmentation de la réponse immunitaire et/ou une diminution de la vascularisation tumorale. L'utilisation de l'eau riche en hydrogène devrait apporter un effet additif à l'immunothérapie. La réalisation de ce projet d’expérimentation animale nous permettra de valider les résultats in vitro obtenus précedement et confirmera la pertinence de la stratégie thérapeutique basé sur l'utilisation de nouveaux anticorps thérapeutiques pour le traitement du TNBC.

Procédures

-Identification des souris par tatouage au niveau de la queue (durée: moins d'1 min) sous anesthésie générale par inhalation de gaz anesthésique (1 fois). Injection de cellules tumorales au niveau de la 4ème glande mammaire sous anesthésie générale par inhalation de gaz anesthésique (1 fois, durée: moins de 5min) -Injection de traitement (durée< 1min) 2 fois par semaine pendant 6 semaines. - Injection de sondes fluorescentes et injection de produit de contraste sur animaux anesthésiés . - Examen d'imagerie préclinique (1 fois/semaine/20 min) soit 6 fois au maximum sur la durée totale du protocole.

Impact sur les animaux

Etant donné que le traitement anti-CD160 peut induire un effet anti-angiogénique, il est possible que les tumeurs nécrosent. Les anesthésies, les manipulations et les expériences d'imagerie répétées (1 fois par semaine ) pourra être source de stress chez les animaux.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiées par dislocation des vertèbres cervicales sous anesthésie générale (isoflurane 3%)

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative non animale validée pour étudier l'évaluation d'anticorps anti-tumoraux dans les TNBC. Les modèles de tumoroides, trop simples, ne permettent pas de fournir une réponse pertinente. Seuls les modèles in vivo impliquant un organisme complet peuvent le faire.

Réduction

Le nombre d'animaux qui seront utilisés dans cette procédure été déterminé grâce au calcul de la puissance statistique nécessaire pour pouvoir observer une efficacité des traitements (regression d'au moins 20% du volume tumoral). Une logique de non démarrage de la deuxième partie de la procédure sera mise en place si les anticorps n'indusient pas de regression du volume tumoral d' au moins 30%.

Raffinement

Lors de leur arrivée à l'animalerie, une période de quarantaine d’une semaine sera appliquée afin que les souris s'acclimatent à leur nouveau lieu d'hébergement. Les cages seront enrichies avec des igloos et des tubes en carton. Les animaux seront anesthésiés pour le tatouage, l'injection des cellules tumorales, les séances d'imagerie, afin de limiter le stress et la douleur. Une observation quotidienne des souris sera réalisée afin de garantir leur bien-être et détecter d’éventuels signes de douleur ou de stress. Une attention particulière sera portée à l’observation des points limites fixés tout au long du projet afin d’éviter toute souffrance non soulagée par les soins apportés, auquel cas l’animal sera mis à mort. Des outils d’imagerie non invasifs seront utilisés dans cette procédure.

Choix des espèces

La souris représente le modèle de mammifère le plus décrit dans la littérature pour l'étude du cancer mammaire. Par ailleurs, la souris étant un animal de petite taille, son hébergement en groupe sociaux de plusieurs individus est facilité au sein de notre établissement utilisateur en regard du matériel à disposition. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique rencontrée en médecine humaine, les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 8 semaines à l’initiation de la procédure.

348 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le jour de leur naissance elles reçoivent une injection intracérébrale sous anesthésie, subissent à trois semaines un traumatisme crânien présenté comme léger, puis une batterie de tests comportementaux répétés à un, trois et six mois (open field, poutre et échelle, sensibilité tactile de von Frey, labyrinthe surélevé, boîte clair-obscur, labyrinthe de Barnes) et des IRM sous anesthésie. Le porteur choisit des souris de 21 jours pour représenter un enfant de 4 à 6 ans, présenté comme plus vulnérable. Il affirme qu'une fois réveillé l'animal "ne montre aucun signe de douleur" et que les conséquences à long terme ne sont "pas anxiogènes ou douloureuses".

Objectifs

Les études cliniques, et pré-cliniques chez les rongeurs, ont clairement montré que le traumatisme crânien (TC) est suivi d’un processus neurodégénératif dépendant d’une inflammation chronique au niveau du cerveau, entrainant des effets secondaires tels que formation d’œdème, modifications de la perfusion cérébrale, perméabilisation de la barrière hémato-encéphalique et mort neurale. Dans le cadre de cette étude, nous allons chercher à mieux caractériser les processus de neuro-inflammation et de dégénérescence au niveau du système nerveux central en se focalisant sur le rôle neuroprotecteur des cavéolines. Spécifiquement nous testerons l’effet neuroprotecteur de la protéine Cav-1 dans les astrocytes, cette protéine étant impliquée dans la régulation de la perméabilité de la barrière hématoencéphalique. Dans la mesure où les jeunes enfants sont des populations particulièrement vulnérables au TC et plus sensibles à l’inflammation, nous allons mener nos études sur un modèle juvénile de TC léger, réalisé sur des souris 21 jours après la naissance correspondant chez l’humain à un âge de 4 à 6 ans.

Bénéfices attendus

Les mécanismes physiopathologiques découlant d’un traumatisme survenant pendant l’enfance sont encore assez peu connus. Ainsi on ne sait pas pourquoi seule une partie des enfants souffrant d’un traumatisme crânien léger vont développer à plus ou moins long terme des symptômes tels que des maux de tête, pertes d’équilibre, problèmes de concentration ou retards d’apprentissage… De plus il n’existe à ce jour aucun traitement efficace pour prévenir les conséquences d’un traumatisme crânien survenant chez l’enfant. Notre étude permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à ces traumatismes et devrait permettre de mieux cerner les conditions propices au développement de symptômes post-trauma (notamment l’influence du sexe de l’individu). D’autre part ce projet déterminera si la protéine CAV1 représente une cible thérapeutique intéressante dans le cadre du développement de traitements post-trauma chez l’enfant.

Procédures

Les 348 animaux subiront tous les procédures non-terminales suivantes : 1. injection unique (virus inactivé non-pathogène) intracérébrale le jour de naissance sous anesthésie générale courte (moins de 15 minutes) adaptée à ce stade de développement. 2. traumatisme crânien léger unique sous anesthésie générale courte (5 minutes) pour moitié des animaux et anesthésie générale courte seule pour l’autre moitié (animaux contrôles dits « sham ») à 3 semaines après la naissance. 3. Exploration comportementale sur animal vigile répétée à 1 mois, 3 mois et 6 mois après le trauma. Chaque série comportementale comprendra 1 test d’exploration de 5 minutes (Open Field), 2 tests de coordination motrice sur poutre et échelle (Beam walk et Foot Fault) d’environ 5 minutes chacun, 1 test de sensibilité tactile (Von Frey test) d’environ 5 minutes, 2 tests d’évaluation de l’état anxieux (Elevated Plus Maze et White/Black box) de 5 minutes et un test d’apprentissage spatial (Barnes Maze) qui nécessite des sessions quotidiennes de 5 minutes sur 5 jours. Chaque test sera effectué à un jour différent, ainsi chaque série comportementale comprendra 11 tests quotidiens d’environ 5 minutes répartis sur 2 semaines. 4. Exploration d’imagerie fonctionnelle par IRM réalisée sous anesthésie générale d’environ 1 heure répétée à 1, 3 et 6 mois après le trauma, un jour après le dernier test comportemental.

Impact sur les animaux

Notre projet repose sur l’utilisation d’un modèle léger de traumatisme crânien chez l’animal juvénile. Le traumatisme est réalisé chez l’animal anesthésié, et une fois réveillé l’animal ne montre aucun signe de douleur, il reprend immédiatement un comportement normal. Comme il s’agit d’un traumatisme léger, les conséquences à long terme ne sont pas anxiogènes ou douloureuses pour l’animal. Ces conséquences sont principalement des retards/défauts d’apprentissage et une légère altération de la coordination motrice, sans altération de la mobilité de l’animal. De plus, le modèle murin utilisé n’engendre pas de phénotype dommageable.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure, soit 348 animaux.

Remplacement

Le projet vise à caractériser les atteintes du tissu cérébral suite à un TC ainsi qu’à évaluer l’intérêt d’une cible thérapeutique sur la récupération post TC. À ce jour, aucun modèle in vitro ou informatique ne permet de simuler la complexité des interactions cellulaires mise en jeu, tant nos connaissances demeurent encore superficielles en la matière. Notre recherche sur des bases de données (PubMed, Web of science, …) permet d’affirmer qu’à notre connaissance, il n’existe pas d’autre modèle expérimental que l’animal afin d’étudier ces réactions tissulaires dans leur ensemble. Par conséquent, notre projet ne peut pas se passer de l’expérimentation animale.

Réduction

Le projet concerne 348 souris mais permet de réduire le nombre d'animaux utilisés sans compromettre les objectifs du projet en effectuant un suivi longitudinal non invasif par imagerie. Nous planifions des groupes expérimentaux correspondant au nombre minimal permettant l'utilisation de tests statistiques visant à comparer les différents groupes : analyses multi-ANOVA avec répétition / analyses de régression entre les différents paramètres mesurés pour des tests comportementaux / IRM (voir annexes pour le plan expérimental).

Raffinement

Le projet permet de raffiner l'expérimentation animale en utilisant un modèle pertinent par rapport à la situation chez l'homme, en s'appuyant sur la mise en place d'une démarche de suivi des animaux permettant de limiter et traiter la souffrance éventuelle des animaux, et en employant les méthodes d'imagerie les plus sensibles disponibles actuellement. L'ensemble des procédures mises en place dans le projet sera assuré par des personnes qualifiées en expérimentation animale. Le stress des animaux sera limité à son maximum, avec un sevrage mis en place à 25 jours post-natal, et des conditions d'hébergement enrichies (matériels de nidification) et permettant les interactions sociales en adéquation avec les directives européennes. La réalisation du projet repose sur l'établissement de points-limites et de pratiques permettant de minimiser au maximum le stress, la détresse et la souffrance des animaux. La procédure chirurgicale d’injection stéréotaxique chez le nouveau-né sera réalisée avec des protocoles d’anesthésie/analgésie permettant de supprimer toute douleur durant et après la procédure. Les traumatismes crâniens seront réalisés sur animal anesthésié en utilisant des impacts calibrés. De plus, la cage de réveil est placée sur un tapis chauffant afin de prévenir toute hypothermie. Lors de la réalisation des tests comportementaux, les animaux ne se retrouveront isolés que peu de temps : 5mn pour la plupart des tests et 1h au maximum. Les protocoles expérimentaux s'appuient notamment sur l'utilisation d'un agoniste opioïde, la Buprénorphine, afin de prévenir ou traiter la manifestation de douleurs.

Choix des espèces

Le système nerveux central de la souris est parmi les mieux connus et les plus étudiés. Son organisation est aussi très proche de celle du cerveau humain. Les résultats obtenus permettent ainsi de proposer des hypothèses de dysfonctionnement du cerveau humain suite à un traumatisme crânien et de proposer des pistes thérapeutiques pour leur traitement. Dans ce projet, les souris seront injectées en intracérébral le jour de la naissance afin de permettre une transfection robuste 3 semaines plus tard. Les traumatismes crâniens seront donc réalisés sur des souris juvéniles à 21 jours post natal, ce qui nous permet de modéliser les effets d’un TC en pédiatrie chez des enfants de 4 à 6 ans. Nous conserverons les animaux jusqu’à 6 mois après le TC afin d’évaluer les conséquences à moyen terme.

390 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections stéréotaxiques dans le cerveau, la pose de pompes osmotiques et l'injection d'une toxine destinée à détruire certains neurones, pour étudier la propagation d'agrégats de protéines liés à des maladies neurodégénératives. Le porteur affirme que les produits injectés ont un impact "très limité" sur le comportement et une symptomatologie "très réduite", les effets attendus étant surtout moléculaires. Les retombées annoncées, mieux connaître ces maladies, restent générales et renvoyées au long terme, l'objectif immédiat étant de tester si la mort provoquée de neurones libère les agrégats.

Objectifs

Certaines pathologies neurodégénératives sont caractérisées par l'apparition d'agrégats intracellualires de synucléine au sein de certaines cellules nerveuses, comme par exemple les neurones, et par l'augmentation progressive "en tache d'huile" des régions cérébrales atteintes. Cette évolution "en tache d'huile" correspondrait à une transmission de ces agrégats entre les neurones. Nous souhaitons à travers cette étude nous intéresser aux mécanismes cellulaires de dispersion et de transmission de ces agrégats dans des zones cérébrales de plus en plus éloignées et de plus en plus étendues, 1/ en utilisant un modèle de maladie neurodégénérative induite chez la souris, modèle maîtrisé par notre institut, 2/ en provoquant la libération massive des agrégats contenus dans les neurones atteints, grâce à l’utilisation d’une toxine (l’acide 3 nitripropionique) largement utilisée pour détruire certains neurones dans les régions cérébrales d’intérêt (substances noire, striatum). En pratiquant de telles injections au niveau de la substance noire et de l’aire tegmentale ventrale, nous avons observé une apparition progressive d'agrégats intraneuronaux localement au site d'injection, mais aussi plus tardivement à distance et latéralement opposé au site d’injection. Cependant, au bout de 4 mois ces agrégats contenus dans un type neuronal particulier du striatum (MSNs pour medium spiny neurones) apparaissent stationnaires et ne se propagent absolument pas aux neurones corticaux, qui pourtant ont des connexions avec le striatum. Il semblerait donc que la propagation interneuronale du processus d'agrégation par transfert de fragments amyloïdes d'un neurone à l'autre n'ait pas lieu. La propagation longue distance observée entre le site d'injection, la substance noire, et le striatum, quant à elle, pourrait simplement s'expliquer par la progression intracellulaire du processus d'agrégation de la terminaison vers le corps cellulaire. En revanche, l'absence de transmission secondaire aux étages corticaux laisse penser que la libération de fragments amyloïdes par les MSNs n'a pas lieu. Nous souhaitons donc savoir si la mort provoquée des MSNs porteurs d'agrégats pourrait provoquer la libération extracelllulaire complète de ces agrégats et ainsi de provoquer une transmission secondaire au niveau du cortex dans le même hémisphère cérébral mais aussi dans l’hémisphère opposé.

Bénéfices attendus

A court terme : Ce projet permettra peut-être d’améliorer la voie d’administration d’une toxine pour l’utilisation d’un modèle animal de destruction de neurones. A plus long terme : Ce projet permettra de mieux connaître les mécanismes de transmission des agrégats entre les neurones distants et parfois même dans l’hémisphère cérébral opposé. Ainsi, ce projet s’inscrit dans la thématique de notre institut et contribuera à améliorer les connaissances sur la mise en place moléculaire des pathologies neurodégénératives.

Procédures

Les animaux sont soumis à des procédures chirurgicales : 1/ injection stéréotaxique de composé (durée 30 min maximum par animal) pour une partie des groupes 2/ pose de pompe osmotique pour une partie des groupes 3/ Les deux types de chirurgie, mais à 1 mois d'intervale, pour une partie des groupes Il seront aussi soumis à des injections intrapéritonéales (répétées pendant 7 jours à raison de deux fois par jour espacées de 12heures)

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables sont ceux liés aux chirurgies réalisées sur les animaux ainsi qu'a la fréquence d'injection intrapéritonéale. A contrario, que ce soit les produits injectés dans le cerveau ou en intrapéritonéal, ceux-ci ont un impact très limité sur le comportement (moteur par exemple) et ont une symptomatologie très réduite, car les effets attendus sont moléculaires, concernent peu de neurones et sont liés à la méchanistique de la pathologie.

Devenir

Le sacrifice des animaux permet de récupérer le cerveau pour réaliser une étude histologique des zones cérébrales impliquées dans la pathologie.

Remplacement

Nous souhaitons étudier et caractériser des modèles mimant la pathologie chez l’humain nécessitant ainsi l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

Modèle : la souris C57BL6/JR a été choisie car nos études antérieures ont montré une bonne stabilité et reproductivité, permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux pour réaliser ces études. De plus, le statut sanitaire des animaux étant maîtrisé, la stabilité du modèle est éprouvée. Enfin, nous testerons l’utilisation de pompe Alzet, pour essayer de s’affranchir d’une administration répétée par ip.

Raffinement

Acclimatation : une période de deux semaines permet une bonne acclimatation des animaux à leur nouvel environnement. Hébergement : les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. Contention : les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise des méthodes de préhensions douces, les animaux sont attrapés soit par la peau du dos soit dans des tubes, afin de ne pas les manipuler par la queue. Chirurgie : une attention particulière est apportée pour un maintien de l'aseptie pendant la période opératoire. Formation : une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal.

Choix des espèces

Les modèles de neurodégénérescence induite chez la souris sont bien établis au sein de notre institut. Ces travaux d'étude des maladies neurodégénératives en utilisant la souris comme modèle sont largement decrits dans la littérature ce qui nous donne une base solide pour valider nos résultats. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte qui est compris entre 8 et 12 semaines.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un gène de l'autophagie est invalidé, puis les animaux passent des tests d'interaction sociale et d'ultrasons avant une perfusion intracardiaque sous anesthésie ou une dislocation cervicale. Le porteur indique que les nuisances tiennent à une période d'isolement, au stress des tests et aux contentions. Il affirme que l'étude d'un défaut d'autophagie sur le comportement "ne peut se faire autrement" qu'in vivo, la retombée contre les troubles du neurodéveloppement restant renvoyée au long terme.

Objectifs

Les troubles du développement sont en augmentation constante, avec un nombre de cas estimé par exemple pour les troubles du spectre autistique (TSA) à 1 enfant sur 54 aux Etats-Unis pour l'année 2014 et 1 enfant sur 89 en Europe. Les troubles du spectre autistique se caractérisent notamment par une perturbation du comportement social. Parmi les causes récemment décrites dans la littérature scientifique, l’hypothèse d’un défaut d’un processus cellulaire appelé autophagie, au sein des cellules du cerveau, lors du développement chez l’enfant, est émise. Des études récentes ont ainsi démontré, chez l’homme et chez l’animal, un rôle de la dérégulation de ce mécanisme dans la survenue de comportements de type autistique. Par ailleurs l’autophagie est le moyen par lequel les cellules éliminent des composés d’origine environnementale. Un défaut dans ce mécanisme d’élimination apparaît alors crucial dans le cadre de l’apparition de troubles du développement, reconnus comme étant le résultat d’une combinaison « gènes x environnement ». Dans ce contexte, notre projet vise alors à étudier entre autre les capacités d’interaction sociale et d’ultravocalisations, à différents âges, chez des souris pour lesquelles un gène de l’autophagie a été invalidé. Les échantillons prélevés à l’issue des tests nous permettront d’étudier les mécanismes d’autophagie et de mise en place des connexions nerveuses, par des techniques complémentaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie dans le développement du système nerveux central et dans la survenue de troubles du neurodéveloppement, en constante augmentation dans la population générale. A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant ce mécanisme cellulaire pour atténuer la survenue de ces troubles.

Procédures

Les animaux sont soumis à des tests de comportement non invasifs. Ils sont ensuite soumis à un protocole de quelques minutes (perfusion intracardiaque sous anesthésie se finissant par l’euthanasie de l’animal).

Impact sur les animaux

A notre connaissance, cette souris n’a jamais été étudiée d’un point de vue de son développement cérébral ou de son comportement. Le phénotype n’est à ce jour pas connu comme étant dommageable. Dans la procédure du présent projet, les animaux subissent des tests non invasifs de comportement, jusqu’à la perfusion intracardiaque (n = 120), pour laquelle un protocole d’anesthésie est mis en place ou jusqu’à l’euthanasie par dislocation cervicale (n = 120). Des nuisances et effets indésirables classés comme modérés sont attendus, en lien avec notamment la mise en place d’une période d’isolement pour les animaux, le stress induit par les tests de comportement, la réalisation de contention et d’injection de molécules anesthésiques.

Devenir

La procédure décrite dans ce projet sera réalisée sur des souris. C’est une procédure modérée qui concerne les 120 animaux issus de la lignée (animaux résidents) et les 120 animaux naïfs (visiteurs WT). L’ensemble des animaux sera euthanasié en fin de procédure.

Remplacement

L’étude de l’effet d’un défaut de l’autophagie sur le comportement de l’individu ne peut se faire autrement que par des explorations fonctionnelles menées in vivo. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle in vivo, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.

Réduction

Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 240 souris. Le nombre d’animaux est réduit en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. D'une manière générale, conçu les lots sont conçus pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des tests et des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les données obtenues seront ultérieurement étudiées statistiquement de manière classique. Par ailleurs, pour chacune des approches expérimentales, ce travail servira de base pour de futurs travaux intégrant une exposition précoce à un facteur environnemental afin de calculer le nombre juste d’animaux requis pour comparer d’une manière statistique et robuste les conditions mutantes à la condition contrôle avec une excellente reproductibilité.

Raffinement

Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés quotidiennement et une grille de suivi (annexe) est en place. Paramètres environnementaux : humidité comprise entre 45 % et 65 %, température constante entre 20 à 24 °C. L’éclairage est circadien (8h/20h) pour respecter le rythme biologique des animaux. Ils ont accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Le milieu est enrichi avec du matériel de construction de nid. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et des observations du bien-être sont réalisées quotidiennement. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de comportements anormaux (manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), l’état des animaux est surveillé plusieurs fois par jour. Un aliment enrichi et de l’eau sont mis à disposition directement dans la cage pour les animaux apathiques, surveillés 1 ou 2 fois/ jour. Si l’état général de l’animal atteint les points limites définis dans la procédure expérimentale (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture, perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids normal attendu selon la courbe de croissance standard de la souche C57BL/6Ncrl), alors il sera euthanasié. Pour le protocole de perfusion intracardiaque suivi des prélèvements de tissus, un protocole d’anesthésie adéquat est mis en place. Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur. Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 240 souris.

Choix des espèces

L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique, ici Irgm1, est souvent complexe et long à mettre en œuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins le modèle Irgm1 KO existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, de nombreux outils ont été conçus et sont disponible pour étudier le comportement, les paramètres physiologiques et biologiques chez la souris et nous maitrisons l’utilisation des outils à disposition. Ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement. Plusieurs stades de développement seront analysés pour comprendre les conséquences de la mutation sur l’élagage synaptique et sur la fonctionnalité de l’autophagie, qui sont des événements majeurs du développement du système nerveux central. Pour cela plusieurs stades de développement, seront étudiés : jeune (test à 20 jours de vie), adolescent (test à 33 jours de vie) et adulte (tests avant 90 jours de vie).

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux modèles pathologiques sont induits, puis les animaux subissent des mesures de sensibilité avant une mise à mort par surdose d'isoflurane et dislocation cervicale pour prélèvement de tissus. Le résumé annonce l'étude de la rosacée oculaire, mais ses justifications glissent vers le syndrome de l'intestin irritable et une infection à C. rodentium, sans que le protocole soit détaillé. Le porteur affirme qu'il est "indispensable de travailler sur des animaux" et qu'il n'existe "pas d'autre alternative".

Objectifs

La rosacée est une maladie commune de la peau, inflammatoire et chronique, avec une variété de manifestations cliniques telles que l’érythème centro-facial, les papules et les pustules, ainsi qu’une atteinte oculaire. Il s’agit d’une pathologie fluctuante, avec une alternance de poussées et de rémissions. Plusieurs facteurs exacerbant la pathologie ont été décrits, comme l’alcool, l’exposition au soleil, le sport, la nourriture épicée, le stress, les émotions et les changements de température.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet étant de mieux comprendre les mécanismes des douleurs et d'inflammation associées à la rosacée occulaire afin de développer de nouveaux outils pharmacologiques, le premier bénéfice attendu serait la caractérisation de cette physiopathologie et l’identification de nouvelles cibles pharmacologiques. Dans un second temps, la validation pré-clinique des effets bénéfiques de nouvelles molécules agissant sur les nouvelles cibles identifiées nous permettraient d’envisager une étude clinique grâce à une collaboration avec des services de gastroentérologie. L’objectif à plus long terme serait donc de mettre en place cette étude clinique qui ferait intervenir des patients atteints de SII afin de tester les potentiels outils pharmacologiques développés au laboratoire. Cette étude permettrait d’ouvrir le champ des perspectives thérapeutiques visant à traiter les symptômes associés au SII et, in fine, à soulager les patients SII douloureux. Le bénéfice à long terme serait ainsi une meilleure prise en charge des douleurs chez le patient, qui reste actuellement extrêmement limitée.

Procédures

Suite à l'induction des 2 modèles (procédures 1 et 2), l'ensemble des animaux subiront les procédures 3 et 4 une seule fois et une semaine après l'induction du modèle.

Impact sur les animaux

Les animaux seront mis à mort par une overdose d’isoflurane puis dislocation cervicale. Ceci concernera les animaux en fin d'expérimentation mais aussi si un animal présente au moins 1 des points limites décrits par la suite.

Devenir

Pour l'ensemble des procédures, les animaux seront maintenus en vie. A l’issue de la procédure 4 (mesure de la sensibilité mécanique), les animaux seront mis à mort pour effectuer différents prélèvements de tissus.

Remplacement

Il apparait indispensable de travailler sur des animaux afin de pouvoir étudier l’impact de C. rodentium sur la sensibilité colique, le comportement et le microbiote intestinal. De plus, une étude comparant des données de métagénomique entre animaux infectés et animaux non infectés permettra d’établir un lien de causalité avec C. rodentium. Ce type d’étude n’est concevable que chez l’animal. D’autre part, nous voulons également évaluer les conséquences physiologiques sur la sensibilité viscérale et la perméabilité intestinale, pour lesquelles il n’existe pas d’autre alternative. L’utilisation de différents modèles cellulaires in vitro pour répondre aux objectifs de ce projet n’est donc pas envisageable.

Réduction

Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Les tests statistiques seront réalisés grâce au programme d'analyse statistique GraphPad Prim 9.0 et les principales analyses, notamment de suivi du poids seront effectuées grâce à des test ANOVA one-way ou two-way suivi d'un post test adéquat en fonction du résultat.

Raffinement

Afin de réduire une éventuelle souffrance, les animaux seront surveillés quotidiennement (Week-end et jours fériés compris) par l'expérimentateur mais aussi par le personnel de l'animalerie. Si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20%, celui-ci sera euthanasié par le personnel de l’unité de stabulation animale. Ces animaux seront au maximum 5 par cage (5 mâles ou 5 femelles) et ceci en respect de la réglementation en vigueur concernant la superficie au sol par souris. De plus, ces cages contiendront des milieux d'enrichissements de type petite maisonnette de chez Genobio ainsi que du coton.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle expérimental est appuyé par la disponibilité de lignées d’animaux génétiquement modifiés et l’existence de nombreux outils d’analyse (anticorps, kit ELISA…) développés pour cette espèce. Les souris seront utilisées au stade de jeune adulte (4-5 semaines). En effet, l’utilisation des animaux à ce stade de développement permet de limiter les biais liés à des différences pouvant se développer au cours de la vie de l’animal. La réduction de la variabilité inter-individus permet ainsi de réduire le nombre d’animaux à expérimenter.

132 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte dans l'artère caudale des cellules de cancer du sein humain, une partie recevant en plus un gavage quotidien d'inhibiteurs, pour étudier le rôle de certains lipides dans les métastases osseuses. Le porteur indique que ces métastases provoquent chez l'humain des douleurs liées à la dégradation de l'os, et prévoit d'arrêter les procédures à sept jours, avant tout point limite. Il affirme que ce phénomène "ne peut pas être apprécié" par des tests in vitro, les retombées annoncées pour les patientes restant lointaines.

Objectifs

Le cancer du sein est une tumeur maligne qui peut se propager dans tout l'organisme : on dit alors que la tumeur a métastasé. Les cellules de cancer du sein migrent préférentiellement à l’os, ou elles vont être responsables d’une destruction massive de l’os. Celles-ci génèrent de grandes douleurs et des fractures pathologiques et peut même engager le pronostic vital des patientes. A l’heure actuelle, les métastases osseuses sont incurables et les traitements sont donnés uniquement pour améliorer la qualité de vie des patients. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes moléculaires par le biais desquels les métastases dérivant d’un cancer du sein se forment afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Les leucotriènes sont des lipides biologiques produits naturellement par les leucocytes dans des conditions inflammations. Il a été observé récemment que les cellules cancéreuses sont elles-mêmes capables de produire ces lipides car elles possèdent les enzymes nécessaires. Cependant, le rôle des leucotriènes produits par les cellules cancéreuses dans la formation des métastases osseuses n’est absolument pas connu. Notre projet vise à comprendre comment ces leucotriènes peuvent contribuer à la formation des métastases osseuses des cancer du sein.

Bénéfices attendus

A terme ce projet apportera des informations indispensables pour limiter la rechute métastatique à l’os des cancers du sein et d’améliorer la survie des patients.

Procédures

Une suspension de cellules cancéreuses sera injectée dans l’artère caudale des souris. Pour cela les souris seront anesthésiées sous isoflurane, maintenues à 37°C et un gel anesthésiant de lidocaïne sera placé sur le dos des souris. Les animaux recevront une seule injection de cellules cancéreuses pour les procédures 1 et 2. Dans le cas de la procédure 2 les animaux recevront un traitement quotidien par gavage d’une solution pharmacologique d’inhibiteurs des enzymes de la voie de synthèse des leucotriènes. La durée des procédures 1 et 2 est de 7 jours.

Impact sur les animaux

La formation de métastases osseuses a pour caractéristique chez l’homme d’induire des douleurs. On sait que ces douleurs sont dues à la dégradation de l’os. Dans le but de réduire la douleur des animaux toutes les procédures seront arrêtées 7 jours après l’injection des cellules tumorales où aucune dégradation osseuse n’est détectable et où aucun point limite n’est atteint. La quantification des métastases osseuses sera réalisée par histologie post-mortem.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de pouvoir évaluer post-mortem in vitro le nombre de cellules métastastiques ayant colonisé les os longs.

Remplacement

L’influence que peuvent avoir les enzymes clés de la synthèse des leucotriènes sur des phénomènes tumoraux tels que la migration, la colonisation et l’ancrage osseux lors de la formation des métastases ne peut pas être appréciée par des tests in vitro. L’utilisation d’une lignée cellulaire d’origine humaine du sein que nous avons préalablement testée in vitro pour sa capacité à être invasive nous permettra de reproduire chez la souris le plus fidèlement possible la situation pathologique du cancer du sein chez la femme.

Réduction

La procédure n°2 ne sera réalisée que si la procédure n°1 donne les résultats attendus. La taille des groupes a été déterminée à l’aide d’une analyse de puissance réalisée avec le logiciel BiostaTGV. Sur les 3 ans de réalisation du projet, un nombre total de 132 souris sera nécessaire

Raffinement

Les souris cohabiteront par groupe de 5 dans un environnement enrichi (maison rouge, coton) renouvelé une fois par semaine. Afin de permettre l’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement, les souris seront placées en stabulation durant deux semaines au sein de l’animalerie d’accueil sous surveillance journalière. Tous les protocoles d’injection des cellules tumorales seront réalisés sur des souris anesthésiées au moment des injections. L’état de bien être des souris sera évalué quotidiennement par l’observation des principaux signes physiologiques, comportementaux et de l’apparence de l’animal. Les animaux seront pris en charge au premier signe d’inconfort.

Choix des espèces

La souris Balb/c nude est couramment utilisée en oncologie. Ces souris présentant une déficience du système immunitaire nos conditions d’hébergement dans un local à air contrôlé sont adaptées à cette spécificité des animaux. Les protocoles seront réalisés avec des souris âgées de 6 semaines. Nous utiliserons des souris femelles car notre étude porte sur le cancer du sein.