Recherche fondamentale

26 jeunes chevaux vont être utilisés, gardés vivants et rendus à l'élevage à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poulain subit un sevrage imposé à six mois et deux examens IRM à dix mois d'intervalle, pour mesurer les effets du sevrage précoce sur le développement social et cérébral. Le porteur reconnaît que le sevrage imposé induit "potentiellement du stress" mais décrit un hébergement en groupe qu'il présente comme supérieur à la pratique courante en box individuel. Il affirme que le recours au cheval domestique est "nécessaire" car le projet porte sur l'élevage même de cette espèce.

Objectifs

Le sevrage est souvent réalisé atour 6 mois dans la pratique (voir encore plus tôt) pour plusieurs raisons. Tout d’abord, il s’agit d’une pratique qui est répétée par habitude car étant traditionnelle et majoritaire. Elle est donc peu questionnée. Ensuite, elle permettrait de remettre plus rapidement la jument à la reproduction et de limiter la fatigue physique liée à la lactation. De plus, certaines personnes considèrent que retirer la mère permet de réorienter l’attention du poulain vers l’humain, et donc de faciliter son entrainement. Enfin, l’hébergement en box individuel est encore très répandu et est donc incompatible avec le maintien d’une vie sociale – y compris avec la mère – des jeunes animaux. Les bienfaits d’un sevrage plus tardif sont encore peu connus alors qu’il existe un fort contraste entre ce sevrage imposé à 6 mois et ce qui est observé en conditions libres (sevrage très progressif de 9 mois jusqu'à parfois 2-3 ans) . Nos résultats permettront de déterminer si 1/ le sevrage imposé influence le développement social, cognitif et/ou cérébral des poulains, 2/ si de tels effets se maintiennent dans le temps ou si au contraire les poulains compensent cet évènement perturbateur sur le long terme lorsqu’ils sont élevés dans un milieu social par ailleurs riche, et 3/ si le sevrage impact à long-terme le bien-être, la personnalité et la maniabilité des jeunes chevaux. Si nos résultats montrent qu’un sevrage réalisé à cet âge et dans ces conditions a des conséquences néfastes durables, alors ils ouvriront la voie à une nouvelle étude où nous pourrons tester d’autres âges de sevrage (e.g. 7 ou 8 mois) pour trouver le meilleur compromis à recommander pour la pratique. Le suivi longitudinal du groupe « sevrage spontané » nous aidera à cibler la période idéale. S’il s’avère que le sevrage pratiqué dans les conditions de l’étude n’induit pas des déficits sociaux, cognitifs et/ou cérébraux durables, ni n’altère durablement le bien-être ou la relation à l’humain, alors les recommandations pourront se concentrer sur la manière de faciliter ce type de sevrage et ne nécessiteront pas nécessairement de tester d’autres âges. Dans tous les cas, des recommandations concrètes sur la gestion des poulains pourront être faites. De manière plus globale, cette étude ouvrira la voie à cette thématique sur l’optimisation de l’élevage des jeunes afin de garantir un développement idéal et adapté aux conditions domestiques.

Bénéfices attendus

Meilleure caractérisation de l'impact du sevrage équin et apport de connaissances en matière de bien-être animal.

Procédures

Tous les animaux seront utilisés pour des scans IRM à deux reprises (10 mois d’intervalle) pour évaluer les aspects développementaux

Impact sur les animaux

Potentiellement du stress lors du sevrage imposé.

Devenir

Tous les animaux retourneront en élevage après la procédure.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer nos animaux avec une autre espèce ou un substitut non-vivant. L’utilisation du cheval domestique est nécessaire car notre projet répond à des questions précises concernant l’élevage de cette espèce. De plus, nous avons besoin d’un modèle animal qui présente un développement assez long et pour lequel nous avons déjà les bases quant à l’étude de son comportement et de sa neurobiologie.

Réduction

Pour une étude basée sur un approche IRM, notre effectif est plutôt important (N=2x12 poulains). Ainsi, nous optimisons nos chances d’obtenir un contraste suffisant entre les groupes expérimentaux, voire entre les individus. Les conditions de vie sont en adéquation avec les besoins de l’espèce (i.e. herbivore social). Les conditions de vie du groupe « sevrage imposé » (i.e. traitement avec l’impact supposé le plus négatif) correspondent en fait à la réalité observée dans la pratique, voire mieux puisque nos animaux ne seront pas maintenus en isolement social alors que l’hébergement en box individuel est encore courant au sein de la filière. Enfin, les animaux ne seront pas sacrifiés à la fin de protocole. La taille de nos effectifs (12 individus par traitement expérimental) nous permettra de réaliser des analyses statistiques. Le choix des tests dépendra de la distribution des données et de l’homogénéité des variances. Si les conditions de normalité de la distribution et d’homogénéité des variances sont remplies, nous utiliserons des tests paramétriques. Si les conditions ne permettent pas d’utiliser des tests paramétriques, alors nous utiliserons des tests non-paramétriques du type tests de permutation pour comparer les lots expérimentaux. Des matrices de corrélation pourront être utilisées pour tester les éventuels liens entre paramètres comportementaux et neurobiologiques, si la variabilité inter-individuelle intra-groupe le permet. Dans le cas où une différence de 15% est observée entre les deux groupes expérimentaux pour un paramètre donné, avec des écart-types de 12% autour de la moyenne et un seuil de 0,05, nous obtiendrions une puissance de test de 87% pour un test t de student et 83% avec un test de Mann Withney (outils AnaStats).

Raffinement

Les conditions de vie des animaux seront en adéquation avec les besoins de l’espèce. En tant qu’espèce sociale, ils bénéficieront d’un maintien en groupe social. Ils seront hébergés en pâture ou en stabulation (grand box collectif), selon les conditions météorologiques. Des objets d’enrichissement seront présents en stabulation (ex. brosse électrique, bois à ronger…). Leur alimentation sera principalement composée de fourrage et d’herbage afin qu’ils aient la possibilité en continu de s’alimenter avec une alimentation riche en fibres. L’hébergement collectif leur donnera également une liberté de mouvement et un budget d’activité a priori conformes à ce qui attendu en conditions libres. Ainsi, l’ensemble de ces conditions de vie que nous proposons sont au-delà des conditions standards généralement observées dans la pratique, où l’hébergement en box individuel est très répandu (ce qui induit donc un isolement social et une restriction de l’activité locomotrice importante).

Choix des espèces

L’utilisation du cheval domestique est nécessaire car notre projet répond à des questions précises concernant l’élevage de cette espèce. De plus, nous avons besoin d’un modèle animal qui présente un développement assez long et pour lequel nous avons déjà les bases quant à l’étude de son comportement et de sa neurobiologie. Notre équipe possède cette expertise sur le modèle équin. Nous utiliserons des poulains à partir de l’âge de 6 mois, c’est-à-dire l’âge du sevrage tel qu’il est pratiqué sur le terrain et qui correspond à la période de vie qui nous intéresse. Les animaux seront ensuite suivi durant 1 an.

186 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chocs électriques pour induire un état de stress post-traumatique, sont hébergées seules pendant toute la procédure puis reçoivent des stimulations ultrasonores transcrâniennes évaluées par des tests comportementaux, avant une perfusion intracardiaque pour prélever le cerveau. Le porteur reconnaît que l'isolement, reproduit pour coller à un modèle existant, "risque d'induire un stress supplémentaire prolongé", et que ses résultats précédents n'avaient pas reproduit un vrai modèle de stress post-traumatique. Il affirme qu'aucune méthode in vitro n'est disponible, le modèle reposant sur l'observation du comportement de l'animal vivant.

Objectifs

Ce projet a été évalué sous le numéro L'État de Stress Post-Traumatique (ESPT ou PTSD, pour Post-Traumatic Stress Disorder, APA 1994) est une pathologie psychiatrique qui touche 8 à 12% de la population générale qui survient après l'expérience d'un événement traumatique pouvant être létal, causer une blessure grave ou menacer l'intégrité physique. Les bases neuroanatomiques et physiopathologiques sont bien établies. Elles font état d'une altération du système limbique (qui comprend notamment hippocampe et amygdale) avec une suractivation de l'amygdale et une sous-activation du cortex préfrontal. Cet état dysfonctionnel entraîne des troubles cognitifs et émotionnels (notamment un déficit dans l'extinction du conditionnement de peur) caractéristiques des symptômes du PTSD. La symptomatologie du PTSD se définit alors par un syndrome de reviviscence traumatique, un évitement et émoussement affectif et une activation neurovégétative. L’efficacité des thérapies pharmacologiques (antidépresseurs) ou psycho-cognitive utilisée pour le traitement de la pathologie est cependant relative et limitée. L'amélioration de l'arsenal thérapeutique représente donc un enjeu de santé publique majeur. Ces dernières années, les techniques de neurostimulation sont en train d’émerger. Au laboratoire, nous avons mis au point le traitement par Stimulation Transcrânienne Ultrasonore répétée (rTUS) du cortex infralimbique dans le traitement de la dépression. C’est une technique qui offre l’avantage d’être non-invasive. Employé dans le cadre du traitement du PTSD, cette option thérapeutique n'en est qu'à ses prémices. Le but de cette étude porte sur les effets de la rTUS sur la physiopathologie du PTSD et de comparer ces effets à ceux d’un traitement chronique avec un antidépresseur. Avenant : Le premier objectif sera donc d’obtenir un modèle murin de PTSD robuste et montrant différents aspects de la symptomatologie du PTSD. Après obtention du modèle murin de PTSD, l’efficacité thérapeutique de la rTUS sur le comportement des animaux sera évaluée. Les cerveaux seront prélevés pour d’ultérieures études mécanistiques.

Bénéfices attendus

Dans un premier temps, nous allons raffiner le modèle de Trouble de Stress Post-Traumatique. Il est impératif, pour des études sur des maladies psychiatriques en préclinique, d’avoir un modèle robuste reproductible et permettant de représenter différents symptômes de la maladie. Dans un second temps, nous reproduirons des résultats déjà démontré au laboratoire : l’activation neuronale induite par la stimulation ultrasonore. Cette approche à l’avantage d’être non invasive, plus focale et permettant d’aller stimuler des régions plus profondes que d’autres méthodes de neurostimulation. Cependant, cette technique n’a pas encore été testée en tant qu’approche thérapeutique dans un modèle préclinique de PTSD. Notre étude permettrait donc de mettre en évidence l’efficacité de l’activation répétée du cortex infralimbique dans notre modèle. A l’aide des différents tests comportementaux, nous pourront confirmer les effets thérapeutiques à long terme de la stimulation transcrânienne ultrasonore répétée ainsi que l’absence d’effets délétères sur le cerveau lié à la répétition de la stimulation.

Procédures

Dans un premier temps, les animaux seront soumis à des chocs électriques d’intensité modérée et de durée variable puis l’effet de ces chocs sera évalué par des tests comportementaux. Puis avec l'appui ce ces premiers résultats obtenus, nous réaliserons l’étude proprement dite impliquant la génération d’un stress, l’application d’ondes ultrasonores, des tests comportementaux pour évaluer les effets du stress et du traitement par stimulation ultrasonore. L’étude se poursuivra par une analyse immunohistochimique des cerveaux, une perfusion intracardiaque nous permettra de prélever les cerveaux pour tous les animaux.

Impact sur les animaux

Le PTSD est caractérisé selon les critères du DSM-5 par une persistance de différents symptômes envahissants sur une durée de plus d’un mois. Lors de la mise au point du modèle, nous serons donc tenus de montrer la persistance de différents symptômes sur le long terme. Il a de plus été montré à plusieurs reprises, au laboratoire comme dans d’autres études, que la mobilité des souris ayant subis le traumatisme était réduite lors de l’exploration dans différents contexte comparé à des souris n’ayant pas subis de traumatisme et ce plusieurs jours à plusieurs semaines après. De plus le souris montrerons des comportements de peur associé au contexte traumatique encore un mois après le conditionnement. Toutefois, les souris ne devraient pas montrer de perte de poids importante lié à l’induction du PTSD ni des signes de mal-être dans la cage d’hébergement. Enfin le modèle de PTSD a montré son efficacité chez la souris C57BL6N dans plusieurs études ultérieures. Dans ces études, les souris étaient hébergées seules au moins 14 jours avant le début des expérimentations. Nous hébergerons donc les souris en cages isolées afin de reproduire le modèle de PTSD et d’obtenir la même symptomatologie mais ceci risque d’induire un stress supplémentaire prolongé.

Devenir

Les animaux destinée à la mise au point du projet seront euthanasiés soit par injection léthale soit par asphyxie au CO2. Les souris étant isolées pour l’ensemble de la procédure afin de reproduire un modèle de PTSD existant et ayant été validée dans différentes études, il ne sera pas possible de les regrouper à la suite de cette procédure. En effet des souris regroupées après isolement deviennent agressives et tendent à se battre violemment. Les animaux ayant terminé l’expérimentation finale seront ensuite sacrifié pour prélever les cerveaux afin de réaliser l’étude immunohistochimique.

Remplacement

Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le PTSD chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant.

Réduction

Avenant : Afin de pouvoir étudier les effets d’une stimulation transcrânienne ultrasonore répétée et de se demander si cela peut être utilisée comme traitement contre le syndrome de Stress post-traumatique (PTSD), il est nécessaire d’avoir un modèle animal stable, reproductible et permettant de représenter différents symptômes de la maladie. Nos derniers résultats ont montré une ré-expérience de la peur lors de la réexposition au contexte, phénomène aussi visible lors d’un apprentissage de peur non traumatique, mais n’ont pas permis de reproduire les résultats obtenus dans d’autres études et permettant de parler de modèle de PTSD (l’évitement, la généralisation et sensibilisation de la peur, l’anxiété…). Nous avions pourtant un nombre d’animaux plus important que celui prévu pour les expériences finales. Il nous parait donc nécessaire de refaire des tests préliminaires pour valider le modèle avant de poursuivre l’étude. Nous serions de plus assurés d’avoir un protocole modélisant au mieux le PTSD. Enfin, les effectifs sont optimisés, les observations comportementales nécessitent une taille d’effectifs suffisant compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n=15 sujets par groupe). Les souris seront uniquement mâles, afin d’éviter les variations comportementales provoquées par le cycle menstruel de la femelle et ainsi réduire le nombre total d’animaux.

Raffinement

Le stress traumatique appliqué aux animaux, deux chocs électriques de 2sec à 1.5 mA dans un contexte inconnu, peut être qualifié de moyen, en raison de sa brièveté. Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur. Tous les animaux seront hébergés ensemble, stressés et non stressés, avec enrichissement du milieu (cabanes, smarthome® et tubes). Les expérimentateurs sont experts dans la préhension/contention des souris et sont soucieux d’éviter tout stress lors de la réalisation des procédures. Les injections quotidiennes d’antidépresseur ont été remplacées par un traitement dans l’eau de boisson. Pendant la stimulation rTUS, les animaux sont sous anesthésie gazeuse, ils sont placés sur une couverture chauffante pour éviter toute hypothermie et leurs cornées sont protégées de la déshydratation par un gel.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par la similarité entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, par l’obtention de résultats pertinents avec cette même approche méthodologique ainsi que par l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs. En effet, la zone ciblée dans cette étude (cortex infralimbique) existe chez l’Homme (pour ce qui est du cortex moteur) ou alors sont des équivalents fonctionnels de zones existant chez l’Homme (le cortex infralimbique est un équivalent fonctionnel du cortex cingulaire antérieur subgénual BA 25 chez l’Homme). Les souris C57/BL6 seront adultes (âgées de 9 semaines) à J0 de l'expérimentation afin de comparer les effets chez des animaux dont le phénotype comportemental est stabilisé (période neuro-développementale terminée).

264 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit cinq injections intrapéritonéales, subit une incision de 2,5 cm dans le muscle de la patte et un prélèvement de 100 mg créant une perte musculaire d'environ 20%, avant qu'un hydrogel expérimental ne soit déposé dans la plaie. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne peut se substituer aux animaux et qu'un modèle physiologique est "nécessaire" pour valider la preuve de concept. Les retombées annoncées pour des personnes blessées, militaires et accidentés, restent renvoyées au conditionnel, l'objectif immédiat étant de caractériser les hydrogels sur la cicatrisation.

Objectifs

L’ingénierie tissulaire se base sur l’utilisation de biomatériaux reproduisant la matrice extracellulaire native en fournissant un support aux cellules et à la formation de nouveaux tissus. Les biomatériaux peuvent orienter les phénotypes cellulaires et guider la régénération de tissus fonctionnels à travers des propriétés mécaniques modulables. Ils sont donc de plus en plus étudiés comme nouvelle stratégie de régénération des tissus et organes lésés. Parmi ces biomatériaux, les hydrogels, sont des réseaux tridimensionnels de polymères hydrophiles. Leurs capacités d’hydratation et leurs propriétés mécaniques ajustables en font des biomatériaux attractifs. Si l’utilisation potentielle d’hydrogels comme supports de la régénération musculaire est étudiée de façon croissante, des difficultés persistent en regard de la qualité et fonctionnalité du tissu formé. De fait, peu d’études montrent l’obtention d’un muscle fonctionnel – permettant la contraction – suite à une plaie volumétrique. La régénération du muscle est basée sur la prolifération et la différentiation de cellules souches musculaire qui une fois activées par l’inflammation liée à la création de la plaie, peuvent coloniser la plaie et reconstruire les fibres musculaires endommagées. La bonne cicatrisation repose sur une coordination efficace de tous les acteurs cellulaires impliqués afin de retrouver l’homéostasie du tissu. Les plaies profondes graves entraînant une perte musculaire volumétrique significative provoque donc une altération fonctionnelle permanente et handicapante. Les conséquences pour les personnes affectées (militaires, accidentés, victimes) sont très importantes et il n’existe actuellement aucune solution clinique permettant de restaurer la fonctionnalité des tissus lésés. C’est dans ce contexte que ce projet s’intéresse à la régénération structurelle et fonctionnelle du muscle squelettique en cas de lésion en utilisant des hydrogels injectable et poreux innovants.

Bénéfices attendus

Cette approche permettra d’identifier des biomatériaux à utiliser à des fins biomédicales. Une fois implantés au niveau du tissu musculaire lésé, nous déterminerons si ces hydrogels sont capables de mimer l’environnement cellulaire, améliorant ainsi la réparation fonctionnelle des tissus et organes, en particulier le tissu musculaire.

Procédures

5 injections intrapéritonéales (traitement anti-douleur et anesthésie), sous anesthésie; incision de 2.5 cm dans le muscle qui loge le tibia et prelevement de 100mg de muscle et enfin traiter cette plaie à l'aide des hydrogels à tester.

Impact sur les animaux

La chirurgie d’implantation réalisée pourra entraîner des douleurs localisées au niveau de la zone d’implantation et une plaie volumétrique d’environ 20% pourra potentiellement créer dans un 1er temps (la 1ere semaine) une gêne pour marcher/se déplacer. Les dommages de types lésions musculaires sont souvent accompagnés d’une inflammation passagère.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir prélever et analyser la zone d'implantation de l’hydrogel.

Remplacement

Aucune autre méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation d’animaux pour la réalisation de ce projet car la régénération du muscle repose sur des interactions complexes entres les tissus lésés et les systèmes immunitaires et vasculaires ainsi que sur la coordination efficace de multiples types cellulaires. Les preuves de concept in-vitro et ex-vivo de la biocompatibilité des hydrogels pour les cellules musculaires ont déjà été effectuées avec succès. A présent, un modèle physiologique complexe est nécessaire pour permettre d’en définir une première approche qualitative et cinétique.

Réduction

Cette étude est menée dans un but prospectif. Ainsi l’utilisation de 7 rats par groupe et par temps est considérée comme suffisant pour une validation de preuve de concept. Elle constitue en soi une réduction du nombre des animaux pour répondre à la question posée. La présence dans les 2 premiers bras de la procédure d'étapes d'évaluations décisionnelles engageant la poursuite de la procédure, nous permettra aussi de réduire le plus possible le nombre d’animaux.

Raffinement

Avant le début de chaque procédure, les animaux suivront une période d’acclimatation d’au moins une semaine. Les animaux seront observés et pesés quotidiennement pendant 1 semaine suivant la procédure expérimentale. La mise en place d’une grille de score (incluant la mobilité de l’animal, sa prostration ainsi que son niveau d’interaction sociale) et d’une fréquence de surveillance des animaux adaptée à l’étude, permettra d'éviter toute souffrance animale. La surveillance des animaux sera effectuée au moins 4 fois par semaine avec une analyse scorée du comportement animal et du poids corporel deux fois par semaine Une attention particulière sera portée au comportement moteur, l’activité, l’accès à la nourriture et à l’eau et à l’intégrité du pansement. Suite à la procédure de chirurgie, les animaux seront surveillés régulièrement (4 fois par semaine) afin d’identifier l’apparition de troubles du comportement pouvant traduire une douleur ou un stress néfaste. Les fils de suture non résorbables seront retirés au bout de trois semaines tandis que l’intégrité du pansement sera monitorée à chaque observation. Si un animal a retiré son pansement, la plaie sera désinfectée et un nouveau pansement mis en place. Les cages seront enrichies avec de la nourriture humide au cours de la première semaine post-opératoire, pour prendre en compte les difficultés éventuelles de mobilité. Leur ajout sera constamment ré-évalué au cours de la surveillance dans les semaines suivantes. De même, des analgésiques locaux seront appliqués aux abords de la plaie chirurgicale juste avant la suture et en cas de signe de douleur et/ou si le pansement a été retiré (lidocaïne 5mg/kg, 1-2 ml).

Choix des espèces

Etude basée sur un modèle de perte volumétrique musculaire standardisée chez le rat [1]. De plus, pour cette étude, il est nécessaire d’avoir un muscle permettant la mise en place d’un défaut pouvant accueillir un volume d’au moins 100µL pour que le système d’injection soit opérant (tests déjà réalisés sur rats mis à mort pour la standardisation de la procédure). [1]X. Wu, B. T. Corona, X. Chen, and T. J. Walters, “A Standardized Rat Model of Volumetric Muscle Loss Injury for the Development of Tissue Engineering Therapies,” Biores. Open Access, vol. 1, no. 6, pp. 280–290, 2012. L’objectif du travail étant d’observer l’effet de biomatériaux dans les processus de cicatrisation, les rats utilisés dans le cadre de ce protocole seront âgés de 2 mois (Jeunes adultes) en début de protocole. Sexuellement mature pour les males (65-110jours) Sprague Dawley or Wistar (ceux qui sont préconisés pour aspect chirurgicaux). Les temps d’implantations ont été choisis pour caractérisation du tissu à 3 moments clés de la cicatrisation : - 3 semaines : fin de l’inflammation aigue et différentiation des cellules satellites en cours - 6 semaines : possibilité de quantification du nombre de fibres musculaires au sein de l’hydrogel - 3 mois : Validation du bon remodelage de la plaie.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau, une autre un cancer colorectal chimiquement induit provoquant colite, diarrhée et saignements, pour étudier le rôle du gène Fpr1 dans la réponse à la chimiothérapie. Le porteur prévoit une mise à mort dès qu'une tumeur atteint 225 mm² ou qu'une souris perd plus de 20 % de son poids, et affirme que la réponse immunitaire au cancer ne peut s'étudier qu'in vivo. Les retombées annoncées pour les patients atteints de cancer du sein ou colorectal restent situées en amont de toute application.

Objectifs

Les dernières années ont vu l'émergence du concept de l'activation du système immunitaire contre le cancer, qui à son tour détermine le succès à long terme des traitements anticancéreux. Nous allons étudier comment compenser la perte de fonction du gène Fpr1 pour restaurer l’efficacité de la chimiothérapie in vivo. Les modèles expérimentaux in vivo sont les seuls moyens d’approche possibles car la réponse immunitaire n’a pas lieu dans les modèles in vitro ou ex vivo. Ce projet vise à une compensation des défauts associés à la perte de fonction de FPR1, un facteur pronostique négatif pour la réponse aux traitements anti-cancéreux à base d’anthracyclines et oxaliplatine, afin d’orienter la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques chez les patients atteint de cancer du sein ou colorectal.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à une compensation des défauts associés à la perte de fonction de FPR1, un facteur pronostique négatif pour la réponse aux traitements anti-carcéraux à base d’anthracyclines et oxaliplatine, afin d’orienter la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques chez les patients atteint de cancer du sein ou colorectal. Nous préconisions que l’accomplissement de ce projet fournira des connaissances sur la régulation de la réponse immunitaire aux cancers pour la mise en place de stratégies thérapeutiques ciblées.

Procédures

Les animaux seront soumis a : - Procédure 1 : L’injection de cellules tumorales en sous cutané sur l’animal anesthésié par inhalation d’isofluorane L’injection des traitements intra péritonéaux par contention de l’animal vigile - Procédure 2 : Un suivi du poids de l’animal vigile à l'aide d'un récipient posé sur une balance L’induction de cancer colorectal par l’injection des traitements intra péritonéaux par contention de l’animal vigile et l’administration d’un traitement dans l’eau de boisson en 3 cycles de 4 jours. Ce modèle aura pour conséquence l’induction d’une colite.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis a : - Une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie - L’injection des traitements cités par voie intrapéritonéale par contention de l’animal vigile. Certains de ces traitements entrainent une altération de l’état de l’animal : perte de poids (inférieure à 20%) ainsi qu’une diarrhée passagère et d’éventuels saignements dans les feces. - Un suivi de la croissance tumorale par contention de l’animal vigile à l'aide d'un pied à coulisse 3 fois par semaine - Un suivi du poids sur l’animal vigile à l'aide d’une balance selon le planning décrit Ces différentes manipulations pouvant entrainer du stress chez l’animal, tout sera mis en œuvre pour le limiter. Notamment, l’injection de cellules tumorales sera faite sous anesthésie sur le dos de l’animal afin de réduire les phénomènes de gêne que peut engendrer la croissance tumorale. Les injections de traitements et le suivi de la croissance tumorale pseront effectuées par contention de l’animal vigile, technique parfaitement maitrisée par les expérimentateurs dans le but de limiter l’exposition des souris à des anesthésiques.

Devenir

Les souris seront euthanasiées dès l’atteinte des points limites suivants : lorsque les tumeurs atteindront 225 mm2, en cas de diarrhée prolongée (>4 jours); en cas de perte de poids supérieure à 20% du poids initial; comportement général anormal (prostration, auto-mutilation, perte de fourrure) ou à la fin de l’expérience 80 jours après l’injection d’AOM, l’euthanasie étant requise pour les analyses post-mortem.

Remplacement

La question scientifique ne peut être abordée qu’in vivo car il n’est pas possible d’étudier l’implication du système immunitaire sur le développement du cancer dans des systèmes in vitro.

Réduction

Nous souhaiterons effectuer cette étude sur un total de 540 souris pour permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Notamment, les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si nous constatons que notre hypothèse n’est pas confirmée par nos résultats expérimentaux. Le modèle choisit est très bien documenté, permettant ainsi de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Nous utiliserons des souris transgéniques viables, fertiles, de taille normale et ne présentent pas d'anomalies physiques ou comportementales. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et/ou tunnels en cartons). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Il assure également une veille scientifique continue, évitant toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : - Les souris âgées de 6 à 10 semaines seront utilisées dans cette étude. afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature. Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection de cellules cancéreuses ou l’apparition de lésions cancéreuses induites, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation. Les protocoles expérimentaux d’induction tumorale sont bien établis. - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Nous utilisons principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce.

35 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont maintenus par restriction alimentaire à 90 % de leur poids pour les inciter à rapporter de la nourriture à leur nid pendant un mois d'apprentissage, avant mise à mort et prélèvement du cerveau pour un marquage du gène c-fos, afin d'identifier les régions cérébrales de l'intégration des trajets. Le porteur héberge individuellement une partie des rats et prévoit un retour à l'alimentation libre au-delà de 15 % de perte de poids. Il présente ce projet fondamental comme une remise en question possible de l'hypothèse de la carte cognitive dans la navigation.

Objectifs

La navigation spatiale chez les mammifères repose sur la perception et le traitement de multiples informations sensorielles dont la source peut être environnementale (informations allothétiques : visuelles, olfactives, auditives) ou interne à l'animal (informations idiothétiques générées par le déplacement: vestibulaires, tactiles, proprioceptives, etc.). La conjonction de ces informations va permettre à l’animal de mettre en œuvre des stratégies spatiales variées lui procurant une flexibilité comportementale. L'importance des informations idiothétiques et le rôle des régions cérébrales dans le traitement de ces informations ont longtemps été sous-estimés et restent méconnus. Des travaux comportementaux ont montré que les mammifères sont capables au cours de leur déplacement de revenir à un lieu de référence, par exemple leur "nid", en n'utilisant que des informations idiothétiques. Cette capacité est appelée intégration des trajets car elle repose sur l'intégration par le système vestibulaire des accélérations linéaires et angulaires lors du mouvement ce qui aboutit au calcul et à la mise à jour d'un vecteur pointant sur le lieu de retour. Dans une série d’études lésionnelles, nous avons montré que l'intégration des trajets implique plusieurs régions du cerveau, comme le cortex pariétal et le cortex entorhinal. Dans le cortex entorhinal, une population neuronale (les "cellules-grilles") pourrait être le centre de l’intégration des trajets du cerveau. Cette hypothèse est séduisante mais le cortex entorhinal n'est certainement pas la seule région du cerveau impliquée. Le traitement des informations idiothétiques dans le cerveau implique un réseau nerveux étendu mais notre connaissance des contours de ce réseau reste très lacunaire. L'objectif du projet est d'identifier l'ensemble des régions impliquées dans ce réseau en faisant un marquage de l'expression du gène d'expression précoce c-fos au cours d'une tâche d'intégration des trajets. Nous faisons l’hypothèse que la tâche implique une activation rapide du gène c-fos et donc une synthèse de proteines c-fos en particulier dans les structures sollicitées par le processus d’intégration des trajets.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet nous permettront d'identifier les structures cérébrales impliquées spécifiquement dans la mise en œuvre de l'intégration de trajet. Ces résultats nous permettront également de tester l'hypothèse selon laquelle l'intégration de trajet peut se faire à partir d'un autre point de l'environnement que celui à partir duquel l'animal initie son trajet. Ce dernier résultat, s'il est confirmé, nous permettrait de remettre en question le recours quasi-systématique à une hypothèse alternative (existence d'une carte cognitive) pour expliquer les comportements de navigation complexes observés chez les animaux (humains compris).

Procédures

Procédure comportementale : Apprentissage d'une tâche d'integration des trajets. Procédure se déroulant sur un mois environ à raison de 2 essais de durée variable (mais n'excédant pas 5 minutes chacun) par jour et par animal.

Impact sur les animaux

Afin d'assurer un contrôle individuel de la prise alimentaire, les animaux des groupes 1, 2 et 4 seront hébergés individuellement. Cette mesure particulière d'hébergement sera maintenue durant une période la plus courte possible et les rats ainsi isolés pourront avoir des contacts visuels, auditifs et olfactifs avec leurs congénères. Puisqu’un contrôle alimentaire est prévu pendant toute la durée de l’expérience afin de réduire le poids des animaux à 90% de leur poids initial, les rats sont pesés tous les jours afin d'éviter des réductions trop importantes de leur poids. Si la perte de poids d'un animal est trop importante (e.g. >15%), l’alimentation de l’animal devient ad libitum jusqu’au retour du poids désiré.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort (n=35) par injection d'euthanasiant (Pentobarbital sodique, 200 mg/kg, IP, soit 0.5 mL/kg d'EUTHASOL VET. SOLUTION INJECTABLE) après sédation profonde (Médétomidine, 500 μg/kg, IP, soit 0.5 mL/kg pour le DOMITOR). La mise à mort permet le prélèvement des cerveaux afin de réaliser le marquage de l'expression du gène d'expression c-fos par immunohistochimie. La quantification de ce marquage est l'objectif de l'étude car il permettra d'identifier les structures nerveuses impliquées dans l'intégration des trajets.

Remplacement

La nature même des expériences proposées dans ce projet ne permet pas d'envisager de remplacement. En effet, ces expériences reposent sur l'exploration de l'environnement effectuée par les animaux en réponse à diverses manipulations environnementales et ne peuvent être réalisées à partir de modèles in vitro, in silico ou ex vivo. Ces expériences, du fait du caractère invasif des procédures de collecte des données (prélèvement du cerveau afin de révéler le marquage de certaines structures nerveuses), ne peuvent pas non plus être conduites chez le sujet humain.

Réduction

Cette étude nécessitera un total de 35 rats. Deux groupes expérimentaux et deux groupes contrôles sont indispensables pour permettre de conclure sur l'implication des structures dans les processus ciblés : Un groupe expérimental (n=8) entraîné dans la tâche d'intégration des trajets, un groupe contrôle (n=8) entraîné dans une tâche spatiale ne nécessitant pas l'intégration des trajets, un groupe contrôle (n=6) ne réalisant aucune tâche (explorant librement l'environnement pendant 3 mn) et un deuxième groupe expérimental (n=8) entraîné dans une tâche alternative d'intégration de trajet. Enfin, 5 animaux sont ajoutés au total pour pallier d'éventuels problèmes de marquage immunohistochimique (aux alentours de 15%). Le nombre d'animaux dans ces groupes permet de tenir compte de la variabilité individuelle inhérente aux études comportementales et d'obtenir des résultats fiables. L'analyse des résultats comportementaux reposera essentiellement sur l'utilisation de tests statistiques de proportion (type Chi 2). En ce qui concerne l'analyse des résultats issus des marquages immunohistochimiques, plusieurs scenari sont envisagés. Si la normalité des distributions n'est pas avérée, nous utiliserons des tests statistiques non-paramétriques tels que le test de Kruskal-Wallis. Si la normalité des distributions est avérée mais pas l'homogénéité des variances, nous utiliserons l'ANOVA à un facteur de Welch (associé au test post-hoc de Games-Howell). Si la normalité et l'homogénéité sont avérées, nous aurons recours à un test ANOVA à un facteur (associé au test post-hoc de Tukey). Ce plan d'analyse statistique nous permettra d'exploiter les données quelque soit l'ampleur de la variabilité inter-individuelle tout en conservant des effectifs d'animaux réduits.

Raffinement

La tâche comportementale repose essentiellement sur le comportement spontané des rongeurs à explorer un environnement et à récupérer un morceau de nourriture pour le ramener dans son nid et le consommer. L'animal apprend à faire cette tâche sans contrainte externe ce qui réduit considérablement son état de stress. L'hébergement des animaux s'effectue dans le respect des protocoles d'enrichissement validés par la Structure de Bien-Etre Animal de notre établissement d'expérimentation. Puisqu’un contrôle alimentaire est prévu pendant toute la durée de l’expérience afin de réduire le poids des animaux à 90% de leur poids initial, les rats sont pesés tous les jours afin d'éviter des réductions trop importantes de leur poids. Si la perte de poids d'un animal est trop importante (e.g. >15%), l’alimentation de l’animal devient ad libitum jusqu’au retour du poids désiré.

Choix des espèces

Le rat constitue un modèle animal privilégié pour les études sur la navigation spatiale du fait de ses excellentes capacités d'orientation spatiale. Nous avons montré que ces animaux sont capables de réaliser la tâche d'intégration des trajets dans sa version classique (Groupe 1). L'étude de l'activation des réseaux de structures nerveuses au cours d'un comportement de déplacement dans l'environnement ne peut pas être réalisé en utilisant des procédures in vitro, ex vivo ou in silico. Les animaux seront des rats adultes agés de 4 mois. Les capacités d'apprentissage chez ces animaux de cet âge sont optimales.

40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'implantation d'électrodes dans le cerveau avec injection d'un vecteur viral, puis sont soumis à une restriction alimentaire les maintenant à 90 % de leur poids pour les pousser à explorer un dispositif en quête de nourriture, l'objet étant de cartographier l'activité du cortex rétrosplénial pendant la navigation spatiale. Le porteur les héberge individuellement et prévoit un retour à l'alimentation libre si la perte de poids dépasse 15 %. Il présente les retombées pour les maladies neurodégénératives comme une simple piste de réflexion issue de cette recherche fondamentale.

Objectifs

Les capacités d'orientation et de mémoire sont déficitaires chez les sujets vieillissant et les patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Le cortex rétrosplénial est impliqué dans ces processus mnésiques et de navigation. et semble être une structure fondamentale pour s'orienter dans des environnements complexes. Ce projet permet de comprendre quelles informations de l'espace sont nécessaires aux activités neuronales du cortex rétrosplénial et également d'étudier l'influence de cette structure sur les autres aires cérébrales impliquées dans la navigation, notamment le cortex entorhinal médian. Ce projet, de nature fondamentale, ouvre des pistes de réflexions sur la nature des déficits de navigation inhérents aux maladies neurodégénératives qui affectent la mémoire.

Bénéfices attendus

Ce projet, de nature fondamentale, ouvre des pistes de réflexions sur la nature des déficits de navigation inhérents aux maladies neurodégénératives qui affectent la mémoire.

Procédures

Procédure comportementales : exploration libre à la recherche de nourriture suite à une privation contrôlée de nourriture; et procédures chirurgicales : implantation d'un système d'électrode avec l'injection d'un vecteur viral pour utiliser les outils d'inactivation neuronale pharmacogénétique. Tous les animaux subiront la procédure comportementale. 1 groupe de 20 animaux sera soumis à la procédure chirurgicale d'implantation des électrodes seule, et un 2ème groupe d'animaux sera soumis à la chirurgies d'implantation d'électrode et d'injection du vecteur viral.

Impact sur les animaux

Afin d'assurer un contrôle individuel de la prise alimentaire, les animaux seront hébergés individuellement. Cette mesure particulière d'hébergement sera maintenue durant une période la plus courte possible et les rats ainsi isolés pourront avoir des contacts visuels, auditifs et olfactifs avec leurs congénères. Puisqu’un contrôle alimentaire est prévu pendant toute la durée de l’expérience afin de réduire le poids des animaux à 90% de leur poids initial, les rats sont pesés tous les jours afin d'éviter des réductions trop importantes de leur poids. Si la perte de poids d'un animal est trop importante (e.g. >15%), l’alimentation de l’animal devient ad libitum jusqu’au retour du poids désiré.

Devenir

La mise à mort permet le prélèvement des cerveaux afin de réaliser le marquage des neurones par cresyl violet ou thionine et d’identifier la position des électrodes d’enregistrement dans les structures d’intérêts. L'identification de la position des électrodes est cruciale car elle permet d'affirmer que les activités neuronales mises en évidence proviennent bien de la structure cérébrale ciblée dans le projet.

Remplacement

Ce projet repose sur les méthodes invasives d'enregistrement des neurones isolés ainsi que de l'inactivation de l'activité cérébrale chez le rat jeune adulte Long Evans, qui ne sont pas compatibles avec une approche chez le sujet humain, ni adaptables aux études in vitro ou de modélisation.

Réduction

Le projet comporte deux expériences qui utiliseront chacune 20 animaux. Ce nombre est indispensable pour deux raisons : 1-éviter statistiquement une variabilité inter-individuelle et 2-enregistrer un nombre suffisant d’activité neuronale pour effectuer des tests statistiques. L'analyse des résultats reposera essentiellement sur l'utilisation de tests statistiques paramétriques. Cependant, si la normalité des distributions n'est pas avérée, nous utiliserons des tests statistiques non paramétriques. Ce plan d'analyse statistique permettra d'exploiter les données si une variabilité inter-individuelle est toutefois présente tout en conservant des effectifs d'animaux réduits.

Raffinement

La tâche comportementale repose essentiellement sur le comportement spontané des rongeurs à explorer un environnement pour aller manger des granulés de nourriture. L'hébergement des animaux s'effectue dans le respect des protocoles d'enrichissement validés par la Structure de Bien-Etre Animal de notre établissement d'expérimentation. Puisqu’un contrôle alimentaire est prévu pendant toute la durée de l’expérience afin de réduire le poids des animaux à 90% de leur poids initial, les rats sont pesés tous les jours afin d'éviter des réductions trop importantes de leur poids. Si la perte de poids d'un animal est trop importante (e.g. >15%) ou en dessous de 90% de leur poids initial (points limites), l’alimentation de l’animal devient ad libitum jusqu’au retour du poids désiré. Une grille de score approuvée par la SBEA permet de s’assurer du bien-être animal pendant et en dehors des temps d’expérience. Cette grille permet d’évaluer si l’animal est dans un état normal ou en souffrance. L’arrêt des souffrances est prévu dans cette grille de score par des mesures d’observation attentive, des méthodes de soulagement, l’arrêt complet de l’expérience ou la mise à mort de l’animal. Les méthodes d’arrêt des souffrances se font de concert avec les zootechniciens de l’animalerie et sont reportées pour chaque animale sur une feuille de soins disponibles à l’animalerie.

Choix des espèces

Le rat représente le modèle de choix pour les études du comportement spatial qui est à la base des protocoles comportementaux qui seront utilisés. Il présente d'excellentes performances dans les tâches de navigation spatiale. Enfin, 90% des études portant sur les bases neurales de la navigation réalisées chez le rongeur reposent sur l'utilisation du rat, ce qui permet de disposer d'une littérature abondante sur laquelle s'appuyer. Par ailleurs, j'ai réalisé la seule étude qui a mis en évidence les cellules bidirectionnelles du cortex rétrosplénial chez le rat. Utiliser le rat me permet de comparer les résultats issus de ce projet avec ceux précédemment obtenus. Le projet vise à établir le rôle de certaines structures cérébrales chez le rat jeune adulte. Afin de pouvoir comparer les résultats avec les travaux antérieurs, nous utiliserons des animaux qui auront 3 mois au début de l'expérience.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent sous anesthésie une chirurgie stéréotaxique d'injection de virus dans le cerveau, puis passent une série de tests comportementaux (labyrinthe surélevé, open field, reconnaissance d'objet et reconnaissance sociale, enfouissement de billes, nidification), pour tester une thérapie génique contre le syndrome de l'X fragile sur une lignée de souris Fmr1-KO. Le porteur revendique une preuve de concept déjà obtenue in vitro et affirme que ces mécanismes comportementaux ne peuvent être étudiés que dans un "organisme complexe" comme la souris. Les bénéfices annoncés pour les patients restent au stade de la preuve de concept, l'objectif immédiat étant de mesurer une correction du comportement avant prélèvement du cerveau.

Objectifs

Le syndrome de l’X fragile (FXS) représente la première cause héréditaire de déficience intellectuelle et d’autisme pour lequel il n'existe à ce jour aucune thérapie. Nous avons récemment découvert un mécanisme moléculaire qui serait à l’origine du FXS. Nous proposons maintenant de tester une approche par thérapie génique afin de corriger le mécanisme moléculaire défaillant pour traiter le FXS. Pour mettre en œuvre cette approche expérimentale, nous utiliserons un modèle animal FXS qui a été développé chez la souris. La souris FXS récapitule une grande partie des phénotypes observés chez l’homme et constitue un excellent modèle animal de la maladie. Ainsi ce projet vise à déterminer : 1. Est-ce que la thérapie génique permet de restaurer le mécanisme moléculaire défaillant pour traiter le FXS ? 2. Est-ce que la thérapie génique permet de restaurer le comportement du modèle de souris FXS ?

Bénéfices attendus

Notre étude a pour but de fournir la preuve de concept que le mécanismes moléculaire que nous avons identifié précédemment contribue à la pathologie du FXS. Nous proposons des nouveaux outils de thérapie génique pour corriger ce mécanisme moléculaire défaillant et le comportement du modèle de souris FXS. Jusqu'à présent, toutes les stratégies thérapeutiques envisagées pour traiter le FXS ont échoué cliniquement. Notre projet s'appuie sur des connaissances nouvelles acquises au laboratoire, et qui pour la première fois, lient le FXS à un nouveau mécanisme moléculaire. Notre approche repose ainsi sur des données préliminaires publiées et solides pour fournir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter le FXS.

Procédures

480 animaux subiront, sous anesthésie générale, une chirurgie stéréotaxique afin d’injecter des adénovirus associés dans une zone particulière du cerveau. La durée de la chirurgie, de l’induction de l’anesthésie au réveil, est 1h – 1h30. Après l'injection de virus, ils seront soumis à des tests comportementaux : semaine 1. Analyse du rythme circadian (36H) + Labyrinthe surelevé (5min). semaine 2.Open field (15min), toilettage (15min). semaine 3. nidification (24h) + reconnaissance d’objet (2x10min) + enfouissement de billes (15 min) semaine 4. Reconnaissance sociale (3x10min).

Impact sur les animaux

La chirurgie stereotaxique est utilisée pour délivrer des vecteurs viraux (adénovirus associés) dans une zone particulière du cerveau. Ces vecteurs permettront l'expression de notre protéine d'intérêt ou de récepteurs particulier dans des populations neuronales spécifiques. La chirurgie pourrait provoquer une réaction inflammatoire locale post- chirurgicale.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études histologiques.

Remplacement

Toutes les validations experimentales in vitro ont été réalisées et publiées. Nous avons ainsi apporté la preuve de concept in vitro que notre approche expérimentale fonctionne. Il convient maintenant de valider in vivo nos données. Etant donné que le phénotype comportemental est l'un des traits les plus importants du FXS, ces mécanismes complexes ne peuvent être étudiés que dans des organismes complexes tels que la souris

Réduction

Nous utiliserons un total de 480 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs procédures expérimentales (avec un temps de récupération adaptée pour les animaux) seront réalisées chez les mêmes cohortes de souris. Pour toutes ces raisons, le nombre d'animaux a éte déterminé en prennant en compte les contraintes experimentales.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages avec un enrichissement essentiel pour leur bien-être (Coton + Carton). La litière des animaux est remplacée une fois par semaine. Le stress lié aux procédures nécessitant l'isolement des animaux sera diminué par l'usage de cages transparentes rendant leurs congénères visibles. Aucune douleur ou souffrance n'est attendu dans la plupart des procédures expérimentales utilisées mais l'usage d'anesthésique et d'analgésique sera systématique pour les procédures expérimentales potentiellement douloureuses. L'habituation des souris à l'opérateur aura systématiquement lieu quelques jours avant l'expérience et les différentes expériences seront réalisées par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié pour prendre les mesures appropriées en cas d'apparition de signes d'inconfort ou de douleur après avis vétérinaire. Des points limites seront déterminés pour éviter toute souffrance animale. Les injections stéréotaxiques seront réalisées par une personne détentrice d'une formation en chirugie et formée spécifiquement à cet acte chirurgical.

Choix des espèces

L’utilisation des souris se justifie par l’existence d'une lignée génétiquement dans laquelle la protéine Fmr1 est invalidé. La souris Fmr1-KO récapitule une grande partie des phénotypes observés chez l’homme (altération de la mémoire, perte d’interaction sociale, hyperactivité, macro-orchidisme, anomalie des épines dendritiques) et constitue un excellent modèle animal de la maladie. Les chirurgies stéréotaxiques concernant l'injection des AAVs seront réalisées chez des animaux chez les nouveau nés à P0 pour prévenir le phénotype du FXS. Chez des souris âgées de 8 semaines (jeune adulte), stade auquel toutes les structures cérébrales sont pleinement développées et chez des anuimaux adultes de 20 semaines afin de corriger le FXS Les animaux seront injectés dès l'âge de 8 semaines pour la première partie du projet (PE1).