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Immunisation de rongeurs en vue du développement d’anticorps monoclonaux.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 120
600 rongeurs, 480 souris et 120 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 420 tués à l'issue et 180 réutilisés. Ils reçoivent plusieurs injections d'un immunogène émulsionné avec l'adjuvant de Freund, puis un rappel sous anesthésie, avant d'être tués pour prélever leur rate et récupérer les anticorps. Le porteur indique que les bons répondeurs sont tués tandis que les mauvais répondeurs sont tués ou versés à un programme de formation. Il affirme le recours aux rongeurs "indispensable" et le prélèvement d'organes possible seulement sur un "organisme entier".
Objectifs
Depuis les années 1980, les anticorps monoclonaux ont profondément modifié la thérapeutique dans un grand nombre de pathologies, comme le cancer et les maladies inflammatoires chroniques. Bien que le développement des anticorps monoclonaux soit un processus complexe, et que certains d'entre eux peuvent entraîner des effets indésirables préoccupants, leur apport dans l'arsenal thérapeutique est majeur. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Après immunisation de l’animal, l’objectif est de récupérer les cellules B productrices d’anticorps (spécifiques de l’immunogène) pour générer des lignées monoclonales d’hybridomes sécrétant les anticorps d’intérêt. Une phase dite de « tolérisation » où le système immunitaire de l’animal sera rendu tolérant pour les antigènes « non-d’intérêt » pourra être réalisée par l’ajout d’une drogue immunosuppressive. L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps monoclonaux contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif. Les immunisations seront réalisées par voie intrapéritonéale dans un premier temps et par voie intrapéritonéale chez la souris ou intraveineuse chez le rat (stimulation forte des lymphocytes, qualifié de boost final). Le volume administré sera choisi en respectant les volumes maximaux d’administration chez la souris et le rat. Des prélèvements de sang pourront être réalisés à la veine sub-mandibulaire afin de suivre le niveau d’immunisation des souris ou la veine jugulaire chez le rat. A la fin du protocole, les prélèvements de rate et de ganglions lymphatiques seront réalisés afin de récupérer les cellules B productrices d’anticorps à la vue de la fabrication d’hybridome.
Bénéfices attendus
Les anticorps monoclonaux et leurs dérivés constituent la classe des principes actifs qui connaît le plus fort taux de développement actuel dans les domaines biotechnologique et pharmaceutique. En effet, ces anticorps sont des outils de recherche, des réactifs pour les tests d'analyses biologiques et des candidats potentiels à une utilisation thérapeutique. Ils offrent de nouvelles perspectives pour générer une réponse immunitaire protectrice et durable. Ainsi, ils sont aujourd’hui utilisés dans les traitements de cancers, de maladies inflammatoires, de migraine et plus récemment dans la lutte des formes graves de la Covid 19. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Ce présent projet a pour but d’engendrer une réponse immunitaire spécifique de l’immunogène injecté à l’animal. L’objectif principal est de récupérer les cellules B productrices d’anticorps (spécifiques de l’immunogène) pour générer des lignées monoclonales d’hybridomes sécrétant les anticorps d’intérêt.
Procédures
Pour la génération d’anticorps monoclonaux chez la souris BALB/c ou le rat Wistar, nous effectuerons deux à trois injections par voie intrapéritonéale (i.p.) à quinze jours d’intervalle puis un rappel par voie intrapéritonéale et par voie intraveineuse, trois jours avant la mise à mort. Les administrations i.p. (5-10 ml/kg) sont réalisées sur animaux vigiles en contention. Lors de la première i.p., le liquide injecté contient l’immunogène émulsionné volume à volume avec (ou sans) de l’adjuvant complet de Freund. Les injections suivantes se déroulent de la même façon mais en présence (ou non selon la nature de l’immunogène) d’adjuvant incomplet de Freund. Quinze jours plus tard, le « boost » final est réalisé par voie intrapéritonéale (ou intraveineuse chez le rat). Ce dernier est réalisé via la veine pénienne sous anesthésie gazeuse. Pour ce rappel, l’immunogène est repris uniquement dans du tampon PBS dans un volume final de 0,1mL/animal. Trois jours plus tard, les animaux seront mis à mort et la rate sera prélevée stérilement. Les ganglions lymphatiques pourront également être récupérés. Une phase dite de « tolérisation » où le système immunitaire de l’animal sera rendu tolérant pour les antigènes « non-d’intérêt » pourra être réalisée par l’administration d’une drogue immunosuppressive. Deux à quatre injections ip seraient réalisées à 14 jours d'intervalle (soit 4 injections sur 42 jours au maximum), trois jours avant le début du protocole de l'immunisation décrit ci-dessus. Chez la souris, des prélèvements de sang via la veine mandibulaire permettront de tester la présence d’anticorps spécifiques dans le sérum. Le prélèvement sera réalisé sur souris vigiles. Un prélèvement sera réalisé un jour avant l’immunisation (basal) puis 7 jours après la deuxième immunisation et 7 jours après la troisième immunisation s’il y en a une. Le volume maximal prélevé est de 0,5 mL de sang total. Chez le rat, les prélèvements se feront au même timing par ponction de la veine jugulaire au travers du muscle pectoral sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (4% pour l’induction puis maintien à 2% avec un mélange 50% air / 50% O2). Le volume maximal prélevé est de 1 ml. Un prélèvement terminal de sang pourrait être demandé par le sponsor. Dans ce cas, l’animal sera anesthésié comme indiqué ci-dessus, et un volume de 1 ml pour la souris et 4ml pour le rat serait prélevé. L’animal serait ensuite mis à mort.
Impact sur les animaux
Les points limites ont été fixés sur la base de l’évaluation de signes caractéristiques de la douleur mais aucune mortalité et souffrance n’est attendue dans ce projet (Raffinement). Une grille d’évaluation clinique avec établissement d’un score sera utilisée et des mesures adaptées seront prises pour réduire ou supprimer la douleur des animaux en fonction de ce score.
Devenir
Après analyse des échantillons de sang par nos sponsors, les animaux montrant une bonne réponse immunitaire seront sélectionnés. Ces animaux seront mis à mort afin de pélever leur rate pour récupérer les anticorps monoclonaux. Après analyse des échantillons de sang par nos sponsors, les animaux montrant une mauvaise réponse immunitaire ne seront pas sélectionnés. Ces animaux seront soit mis à mort ou gardés en vie pour être réhabilité dans un programme de formation.
Remplacement
L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps monoclonaux contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif. Ces développements nécessitent l’utilisation d’animaux. En effet, ces tests doivent être réalisés sur un organisme entier afin de prélever les organes tels que la rate où sont retrouvés les cellules excrétrices d’anticorps.
Réduction
Le nombre d’animaux inclus dans ce projet est une estimation des projets à venir et a été déterminé par un calcul de N = 10 animaux par série expérimentale. Ce nombre est suffisant pour générer les anticorps par la technique d’hybridomes.
Raffinement
L'acclimatation des animaux durera au minimum 5 jours. À réception, les souris seront collectivement hébergées (au minimum 3 souris par cage selon le poids) dans des cages dédiées de dimensions conformes aux recommandations en vigueur. Les rats seront hébergés par deux dans des cages dédiées de dimensions conformes aux recommandations en vigueur. L'eau et la nourriture (RM1, SDS Dietex, ou équivalent) seront données ad libitum. Les animaux auront accès à différents types d’enrichissements, changés de manière hebdomadaire afin d’éviter une éventuelle lassitude ou habituation (maison, coton, cubes de bois, rouleaux de carton, papier kraft). Les conditions d’hébergement et le bon état de santé́ des animaux seront contrôlés quotidiennement. Bien que aucune douleur ne soit attendue si les animaux venaient à présenter des signes de souffrance, des administrations de buprénophine seront réalisées jusqu'aux prélèvements terminaux. La buprénorphine serait administrée par voie sous cutanée, BID, à 0,01 mg/kg pour le rat et 0,05 mg/kg pour la souris. Pour les injections i.v., une anesthésie gazeuse à l'isoflurane sera utilisée.
Choix des espèces
Pour de nouvelles cibles antigéniques, l’utilisation d’animaux pour l’immunisation et la génération d’hybridomes reste nécessaire car aucun modèle in silico (modèle mathématique, analyse bio-informatique) ne permet à l’heure actuelle de recréer la réponse du système immunitaire de l’animal en présence d’un antigène. Les nouveaux modèles de génération d’anticorps monoclonaux (utilisation de souris transgéniques « xenomouse » produisant des anticorps humains ou immunisation in vitro de lymphocytes B de souris) ne permettent pas de s’affranchir également de l’utilisation des animaux. La maturité sexuelle des souris et des rats se situant aux alentours des 6 à 8 semaines selon le sexe, il convient d’utiliser des animaux jeunes âgés d’au moins 8 semaines pour les programmes d’immunisation. Généralement, les jeunes animaux sont de meilleurs producteurs d’anticorps que les animaux plus âgés parce que la fonction immunitaire atteint son apogée à la puberté et diminue lentement par la suite. Les souris BALB/c ou les rats Wistar seront donc âgées de 8 à 10 semaines lors du démarrage du protocole d’immunisation.
Rôle de l’environnement parental précoce sur le développement émotionnel et comportemental de rongeurs monogames et polygames
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Autres rongeurs : 250
500 rongeurs, 250 souris domestiques et 250 souris glaneuses, vont être utilisés et tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Aucun acte invasif n'est prévu, seulement des mesures comportementales et de la thermographie infrarouge pour comparer le développement émotionnel des jeunes selon un environnement parental monogame ou polygame. Les couples reproducteurs sont maintenus vivants le temps des tests successifs, puis les parents comme les jeunes sont mis à mort après le sevrage. Le porteur affirme que ces conséquences comportementales ne peuvent être évaluées autrement que sur des animaux, sans autre justification du choix.
Objectifs
La monogamie est rare chez les mammifères, mais existe chez quelques espèces de rongeurs, dont la souris glaneuse. Chez cette espèce, si les unités familiales biparentales sont les plus fréquentes, il n’est pas exceptionnel de trouver dans la nature des unités familiales composées de 2 voire 3 femelles et 1 mâle. Cette structure familiale polygame a un fort impact sur le succès reproducteur des femelles, qui auront moins de jeunes par portée et des portées plus espacées dans le temps comparativement à des femelles vivant seules avec un mâle. Par ailleurs, chez cette même espèce, le mâle s'impliquant fortement dans les soins parentaux, son départ ou sa mort constituent une perte en terme de soins aux jeunes difficilement compensable par la femelle. Chez les rongeurs polygames tels que la souris domestique, la structure familiale la plus commune dans le milieu naturel est composée d'un mâle adulte et de plusieurs femelles apparentées ou non, celles-ci contribuant à l’élevage des différents jeunes naissant au sein du groupe familial. Chez cette espèce, les soins paternels sont généralement peu intenses. Ces différentes structures familiales dans lesquelles naissent les jeunes mammifères constituent une diversité d’environnements précoces dont les conséquences sur le développement émotionnel et comportemental de la progéniture demeurent mal comprises. L'objectif de notre projet est d'en évaluer les effets sur les profils émotionnels de la progéniture. Ces profils seront caractérisés par une série de tests effectués à différents âges où des paramètres comportementaux constitueront la base de cette caractérisation. Ceux-ci seront toutefois complétés par des mesures physiologiques non invasives par l'emploi de la thermographie infrarouge. Les tests comportementaux seront répétés afin d'évaluer la stabilité des caractéristiques émotionnelles des animaux.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont d'apporter des informations d'une part sur les conséquences d'une monogamie contrariée chez les espèces monogames, du fait par exemple de la mort du partenaire, et d'autre part sur les conséquences d'une polygynie contrariée chez les espèces polygames, du fait par exemple de la non disponibilité de multiples partenaires lorsques les conditions écologiques dans lesquelles ces animaux évoluent se trouvent perturbées. Un autre bénéfice attendu est d'apporter des informations sur les traits émotionnels des rongeurs, et en quoi leur environnement précoce peut affecter ces traits. Une meilleure connaissance des caractéristiques émotionnelles de ces animaux peut notamment apporter des informations pertinentes relatives à l'appréciation de leur bien-être.
Procédures
Les animaux ne seront soumis à aucun traitement invasif. Seules des mesures comportementales seront effectuées et des mesures non invasives de réponses émotionnelles par thermographie infrarouge.
Impact sur les animaux
Aucun acte invasif n'est prévu dans le cadre de ce projet. Les effets indésirables pouvant survenir sont ceux que l'on peut occasionnellement observer ches les rongeurs hébergés en animalerie (apathie, stéréotypie, ou intolérance sociale). Des enrichissements continus (tubes de carton, barres de bois, nids) sont prévus pour palier à ces nuisances.
Devenir
Procédure 1: Les unités parentales (140 individus - 70 par espèce) sont maintenues jusqu’à la procédure n°3, où les jeunes individus sont alors sevrés. Les jeunes individus issus de la reproduction de ces unités parentales (360 individus – 180 par espèce) sont maintenus en vie pour être testés dans les procédures suivantes. Le projet portant sur les conséquences de l'environnement parental précoce sur développement comportemental et émotionnel des individus ceux-ci doivent être maintenus vivantpour les différentes procédures où les animaux sont testés à des âges différents. Procédure 2: idem. Les parents sont maintenus avec leurs jeunes, ces derniers ont alors 8 à 10 jours. Procédure 3: Après la reproduction et le sevrage de leurs jeunes, les animaux constituant les unités parentales seront mis à mort (140 individus - 70 par espèce). Les femelles potentiellement gestantes une seconde fois sont isolées des mâles, et mises à mort ainsi que leurs jeunes lorsque ces derniers atteignent l’âge du sevrage. Les jeunes sevrés sont conservés en vie pour les procédures suivantes (360 individus - 180 par espèce). Procédure 4: Tous les animaux testés ici sont maintenus en vie (360 individus – 180 par espèce). Ils serviront de sujets pour les procédures suivantes. Des études corrélationnelles sont prévues afin de relier les profils obtenus par ces individus lors de cette procédure et les profils comportementaux identifiés dans les autres procédures. Procédure 5: Tous les animaux testés ici sont maintenus en vie (360 individus – 180 par espèce). Ils serviront de sujets pour la procédure suivante. Des études corrélationnelles sont prévues afin de relier les profils obtenus par ces individus lors de cette procédure et les profils comportementaux identifiés dans les autres procédures. Procédure 6: Sur les 360 individus, 120 individus (60 au sein de chacune des deux espèces) seront utilisés dans cette procédure, les autres seront mis à mort dès que leurs congénères seront mis en couple reproducteur. A l'issue de cette procédure, ces 120 individus seront eux aussi mis à mort. Les individus mis en couple s'étant reproduits seront mis à mort ainsi que leur jeunes après leur sevrage.
Remplacement
Les conséquences des l’environnement parental précoce sur le développement des caractéristiques comportementales et émotionnelles des individus ne peuvent être évaluées par d’autres moyens que ceux où l’utilisation d’animaux est requise.
Réduction
Le projet sera mené sur deux espèces distinctes: l'une monogame, la souris glaneuse, l'autre polygame, la souris domestique. Trois conditions parentales seront testées pour chacune d’elles : la monoparentalité (la femelle élève seule ses jeunes), la bi-parentalité (le mâle et la femelle élèvent le jeunes), la pluriparentalité (2 femelles et un mâle élèvent les jeunes). Une dizaine d'unités parentales par condition sont nécessaires afin d'obtenir une représentativité acceptable des conditions parentales testées. Pour chacune des deux espèces, cette trentaine d'unités parentales (10 mono-, 10 bi-, 10 pluri-parentales, soit 70 individus au total par espèce) produira un nombre moyen estimé de 6 jeunes par portée. Sur cette base, 70 individus parents produiront 180 souris glaneuses et 70 individus parents produiront 180 souris domestiques, soit un total de 500 animaux seront utilisées pour la globalité du projet. Ce projet est une étude longitudinale. Les différentes caractéristiques émotionnelles, sont évaluées sur les mêmes individus permettant ainsi de relier ces caractéristiques les unes aux autres, mais également de réduire considérablement le nombre d’individu testés si celles-ci devaient être évaluées indépendamment.
Raffinement
Des enrichissements environnementaux (matériels de construction de nid, rondins de bois à ronger) seront constamment fournis aux animaux, et un système de surveillance vidéo placé au dessus des cages pour notamment quantifier les comportements parentaux sans perturbations externes et permettra également de veiller à l'absence d'agressions au sein des cages. Tous les transferts des animaux d'une cage à une autre ou à un dispositif de test se feront sans manipulation directe mais par l'emploi d'une petite boite dans laquelle l'animal sera incité à entrer. Les différents tests auxquels seront soumis les animaux seront brefs (10 minutes maximum), et non invasifs. Ces tests laissent généralement aux sujets la possibilité d’adopter une solution comportementale qui leur convient. C’est cette solution comportementale adoptée par l’animal qui constitue généralement la mesure expérimentale qui nous intéresse.
Choix des espèces
La souris glaneuse Mus spicilegus est une espèce monogame et la souris domestique Mus musculus domesticus est une espèce polygame. L'objectif de l'étude étant d'évaluer les conséquences du milieu parental et des soins parentaux sur le comportement et les profils émotionnels de la progéniture, et l'une de nos hypothèses étant que les environnements parentaux ont des effets différents selon que l'espèce soit monogame ou polygame, nous avons choisi deux espèces de rongeurs relativement voisines au système d'appariement différent. L'objectif du projet étant d'évaluer les conséquences des conditions de vie précoce des animaux sur leurs profils comportementaux, les indivdus seront testés tout au cours de leur développement: - des tests précoces, avant le sevrage, auront pour objectif d'évaluer la nature sécurisante que constitue l'environement parental. Les premiers tests auront lieu quand les animaux auront 9-10 jours, où les vocalisations ultrasonores des animaux lors de la séparation seront quantifiées. Des tests de ce type plus tardifs risquent de compromettre les productions ultrasonoes caractéristiques des jeunes souriceaux. A l'âge de 19 jours, les animaux seront testés selon un protocole différent, où les réponses comportementales à un situtation anxiogène seront évaluées en présence et en absence de membres de 'lunité parentale. Ces tests seront brefs et les animaux rejoindront leur unité parentale aussitôt après le test effectué. - des tests après le sevrage jusqu'à la maturité sexuelle seront éffectués pour évaluer les profils émotionnels des individus. - des tests sociaux de rencontre avec un congénère étranger de même sexe et de sexe opposé, et une évaluation des comportements reproducteurs seront effectués chez les ainmaux ayant atteint l'âge adulte (80-90 jours).
Administration de nanoparticules fonctionnalisées biocompatibles pour surveiller le métabolisme cardiaque par imagerie non invasive
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
170 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie tuée à l'issue de l'imagerie. Rendus diabétiques par la streptozotocine ou soumis à l'isoprotérénol pour induire une hypertrophie cardiaque, ils reçoivent chaque semaine, sous anesthésie, des prélèvements de sang et d'urine et l'injection d'un produit de contraste testé. Le porteur reconnaît qu'un surdosage d'isoprotérénol pourrait provoquer un infarctus mortel chez près d'un tiers des animaux. Il indique avoir mené des tests cellulaires préalables mais juge le recours à l'animal "primordial" pour valider la nanoparticule sur un organisme complet.
Objectifs
L'objectif du projet est de tester un composé stable, efficace et biocompatible pour l'imagerie par particules magnétiques (MPI). Le composé sera absorbé/retenu au niveau du cœur selon la préférence de substrat énergétique. Dans ce projet, il sera ciblé l’utilisation préférentielle des acides gras. En effet, nous souhaitons optimiser une technique d'imagerie multimodale (IRM et tomodensitométrie) non invasive qui discrimine des pathologies métaboliques.
Bénéfices attendus
Le projet fournira un nouvel outil d'imagerie pour discriminer les préférences de substrat énergétique du cœur. Le choix du substrat énergétique (principalement le glucose et les acides gras) est influencée par l'homéostasie et les pathologies cardiaques. Or, il n'existe actuellement aucune modalité d'imagerie qui combine les avantages d'une sensibilité et d'une résolution métabolique élevées. Le produit de contraste mis au point nous permettra de tester et de valider une nouvelle méthode d'imagerie multimodale afin de discriminer le substrat préférentiel et ouvrir ainsi de nouvelles stratégies diagnostiques et de la caractérisation des maladies cardiaques. La méthode à tester sera présentée lors de conférences et publier dans des journaux à comité de lecture.
Procédures
Les animaux seront soumis, selon le groupe d'enrôlement, à une injection intrapéritonéale unique ou quotidienne de streptozotocine (injection unique, 44 animaux) ou d'isoprotérénol (7 à 30 injections, 44 animaux). Du sang (de la veine caudale) et de l'urine (du massage abdominal) seront prélevés chaque semaine sous anesthésie pendant la procédure d'imagerie. Ils expérimenteront, lors de l'imagerie, une injection du nouveau ou du produit de contraste biocompatible testé pour le MPI.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent ressentir du stress pendant les injections intrapéritonéales, les périodes de jeûne et les prélèvements de sang/urine. Celles-ci seront effectuées sur des courtes durées et uniquement par du personnel formé afin de réduire au maximum l'inconfort des animaux. Le modèle pharmacologique de l'hypertrophie cardiaque n'est pas signalé comme créant de détresse à long court chez les animaux. Néanmoins, un surdosage d’isoprotérénol pourrait provoquer un infarctus du myocarde mortel chez 30% des animaux. Cela sera évité par une injection à une dose optimale, un monitoring quotidien incluant une surveillance les changements de poids corporel. Concernant le modèle de diabète STZ, la durée de vie des animaux traités est raccourcie. Néanmoins, la fenêtre de mortalité est indiquée de 8 à 18 semaines. Or, cela dépasse la durée d’application de notre protocole expérimental appliqué aux animaux. Les procédures d'imagerie seront toutes réalisées sous anesthésie générale, sous thermorégulation et réveil assisté, pour surveiller et limiter l'inconfort des animaux.
Devenir
Selon le stade de suivi, les animaux pourront être euthanasiés à la fin des protocoles d'imagerie (procédures 3 ou 4). Les procédures 1 et 2 ne prévoient pas la mort de l'animal si ce n'est en cas d'événements indésirables incontrôlables ou d'atteinte d'un point limite nécessitant la mise à mort.
Remplacement
Dans ce projet, l'utilisation d’animaux est limitée à l'étude de la biodisponibilité systémique du produit de contraste et à la caractérisation du statut métabolique dans le tissu cardiaque. Avant la phase d'étude in vivo, plusieurs tests sur lignées cellulaires immortalisées seront menés pour estimer les effets potentiels des agents de contraste à court et moyen terme, dont la cytotoxicité et les événements indésirables cardiaques. L'utilisation d'animaux dans le cadre de ce projet est primordial afin d'avoir une validitié du concept sur les intéractions complexes du corps, et qui pourra être extrapoler aux réactions du corps de patients.
Réduction
Les animaux seront utilisés pour plusieurs procédures expérimentales, incluant compris l'imagerie, les analyses de sang et des prélèvements d'urine pour suivre l'absorption et la clairance du nouveau produit de contraste à tester. Cette approche transversale nous permettra d'utiliser le moins d'animaux possible pour la robustesse statistique et la solidité technique de notre nouvelle approche d'imagerie.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions de soins en fonction de l'espace de cage individuel spécifique à l'espèce, des besoins sociaux, c'est-à-dire sans isolement (à l’exception des très courtes durées de déroulé des procédures), et de la stimulation avec enrichissement environnemental (igloo, bois à ronger...). De plus, les animaux seront suivis par du personnel formé aux meilleurs soins pour les rongeurs.
Choix des espèces
L'utilisation de rats (Wistar wild type) nous permet d'utiliser des techniques d'imagerie à haute résolution – imagerie par résonance magnétique 9.4T et CT – qui sont fondamentales pour révéler les caractéristiques précises de l'agent de contraste. Pour l'imagerie, les rats le meilleur rapport signal/bruit et ils peuvent être utilisés pour les deux modalités d'imagerie envisagées. De plus, les rats permettent la création des modèles pharmacologiques du diabète et de l'hypertrophie cardiaque, de manière reproductible et rapide. Adulte, à partir de 10 semaines afin d’avoir des animaux dont la croissance est achevée.
Dérégulations Précoces pour Expliquer la Prédisposition aux Cancers dans le Syndrome de Li-Fraumeni
- Recherche fondamentale
- Oncologie
15 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité sévère. Porteuses de mutations du gène TP53 qui prédisposent aux cancers, elles ne subissent pas d'intervention mais sont suivies puis tuées avant six mois pour analyse post-mortem de leurs organes, toute suspicion de tumeur entraînant une mise à mort anticipée. Le porteur étudie le syndrome de Li-Fraumeni et vise des biomarqueurs ou des cibles thérapeutiques transposables en clinique. Il affirme avoir d'abord travaillé sur des modèles cellulaires mais juge le modèle murin "irremplaçable" pour analyser plusieurs organes.
Objectifs
Le syndrome de Li-Fraumeni (LFS) est une maladie autosomale dominante de prédisposition aux cancers multiples dès le plus jeune âge, portée par des mutations germinales du gène tumeur suppresseur TP53. La prévalence des mutations de TP53 dans la population générale est estimée à 1/5000. Nos recherches utilisant des lignées de fibroblastes (non cancéreuses) de patients atteint de LFS, ont déterminé que les mutations de TP53 engendrent des défauts transcriptionnels et métaboliques, qui pourraient être à l'origine de la prédisposition aux cancers. Nous souhaitons maintenant aller plus loin et transposer nos résultats dans des contextes physiologiques, afin de cartographier les dérégulations transcriptionnelles et métaboliques qui ont lieu dans de nombreux organes murins, dont ceux qui sont susceptibles au développement de cancers.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra, grâce aux modèles murins, de mieux caractériser les perturbations moléculaires qui prédisposent à l'apparition de cancers dans le syndrome de Li-Fraumeni. Les perspectives de ce travail sont de transposer nos découvertes en clinique pour une utilisation de type biomarqueur ou cible thérapeutique.
Procédures
Nous ne prévoyons pas d'interventions sur nos animaux pour ce projet.
Impact sur les animaux
Les lignées murines du LFS (R270H et R172H) présentent une médiane de survie de 16 mois, et peuvent développer différents cancers au cours de leur vie. L’âge auquel peuvent apparaître les cancers n'est pas bien documenté. Notre projet vise à étudier des souris de la colonie à un âge inférieur à 6 mois, afin de limiter au maximum l'apparition de cancers et des douleurs associées. Un suivi strict des souris sera mis en place (voir points limites) et toute suspicion de développement rapide de tumeurs entraînera l'euthanasie de l'animal. Une analyse rétrospective de ces 2 modèles murins sera menée afin de raffiner le modèle et d'étendre les connaissances concernant l'âge auquel les cancers se développent dans différents organes.
Devenir
Tous les animaux sont sacrifiés à la fin de la procédure pour analyse post-mortem (récolte d'organe, histologie et analyses moléculaires).
Remplacement
REMPLACEMENT : nous avons réalisé en amont les expériences sur des modèles cellulaires pour éviter d'utiliser l'animal, mais à ce stade de nos recherches nous ne pouvons pas nous en passer car aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle murin pour analyser les différents organes et la physiologie des individus porteurs du LFS.
Réduction
REDUCTION : Nous avons réalisé un design d'élevage et d'expérimentation qui utilise juste le bon nombre de souris, et nous plafonnons le nombre d'animaux grâce à la multiplication des tests/analyses sur un seul animal.
Raffinement
RAFFINEMENT : Nous tenons compte des meilleures conditions d'hébergement pour nos modèles murins et nous veillerons au bien-être animal de nos souris. Pour se faire, nous utilisons des points limites spécifiques et des critères d'arrêt de souffrance.
Choix des espèces
La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l’homme, notamment dans le cadre d’études visant à comprendre le développement de cancers, avant d’entreprendre des études cliniques chez l’humain. De plus, la majeure partie des études expérimentales sur l'étude du LFS utilisent les modèles murins, ce qui permettra une comparaison et confrontation des résultats obtenus avec la littérature. Les modèles d'études murins de LFS R270H et R172H sont admis par la communauté scientifique et sont disponibles chez Jax. Leur phénotype a été initialement décrit dans Mutant p53 Gain of Function in Two Mouse Models of Li-Fraumeni Syndrome (Olive et al, Cell, 2004). Ces modèles de souris ont une faible mortalité dans les 10 premiers mois de la vie, ainsi qu'une faible pénétrance de cancers. Le but de notre étude étant d'étudier les tissus sains, avant qu'ils ne développent de cancers, nous n'excéderons pas un âge de 6 mois pour l'étude de ces souris. Les animaux seront sacrifiés à 1 mois, 3 mois et 6 mois. En effet, nous souhaitons étudier différents organes sains, chez des animaux qui n'ont pas encore développés de tumeurs, afin de mesurer les effets délétères de la mutation germinale de TP53, qui pourraient prédisposer au développement de cancers au cours de la vie.
Modèle de fatigue chronique chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 264 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent sept jours de privation de sommeil paradoxal pour reproduire une fatigue chronique, passent un test moteur et exploratoire, puis sont tués par prélèvement de sang intracardiaque sous anesthésie ou par décapitation à la guillotine pour prélever le cerveau. Le porteur cherche à modéliser le syndrome de fatigue chronique et à y tester des molécules candidates. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour évaluer la fatigue chronique, rendant selon lui le recours à l'animal "nécessaire".
Objectifs
La fatigue chronique est l’un des principaux facteurs qui dégradent la santé humaine ; aussi appelée syndrome de fatigue chronique (SFC), il se définit comme un ensemble de symptômes d’épuisement intense et quasi permanent qui apparaissent sans raison apparente ou pathologie sous-jacente. Afin d'étudier la physiopathologie de la fatigue chronique, ce projet consiste : 1) Dans un premier temps, à mettre en place un modèle animal de fatigue chronique chez le rat. Les animaux seront exposés à une privation continue de sommeil à mouvements oculaires rapides (REM) pendant 7 jours. L’impact de cette privation de sommeil sera étudié dans un test de comportement moteur/exploratoire. A la fin de l’étude, différents prélèvements (sang et cerveau) seront réalisés pour des mesures de paramètres biochimiques; 2) Puis, dans un deuxième temps, l’objectif sera de tester, dans ce modèle, des médicaments candidats pouvant réduire la fatigue généralisée.
Bénéfices attendus
Les origines du syndrome de fatigue chronique (SFC) restent méconnues et à ce jour il n’existe pas de traitement spécifique au SFC dont l’efficacité ait été démontrée. Les traitements proposés visent à soulager les symptômes qui lorsqu’ils se manifestent de façon intense deviennent particulièrement invalidants pour le malade. Ce modèle est utile pour : 1) identifier les voies neurobiologiques impliquées dans ce syndrome; et 2) tester de nouvelles molécules candidats, pour améliorer sa prise en charge.
Procédures
La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes régulières dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal. Selon les directives du donneur d’ordre les prélèvements de sang sont réalisés : 1) soit en intracardiaque sous isoflurane pour un prélèvement sanguin compris entre 1 ml à 4 ml maximum ; 2) soit par décapitation, sous anesthésie générale, avec une guillotine dans le cas d’une nécessité de prélèvement sanguin important (supérieur à 4 ml). A la suite, du prélèvement sanguin, le cerveau de l’animal est prélevé.
Impact sur les animaux
Durant la période d'induction de la fatigue , les animaux sont pesés et leur état général est évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance pour évaluer le niveau de souffrance des animaux. Les données issues de ce suivi individuel seront enregistrées dans un tableau définissant les points limites expérimentaux, et aussitôt analysées. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort. Par ailleurs, certains effets indésirables des produits tels que des crampes abdominales ou la sédation, peuvent apparaître après administration. Ainsi pour vérifier une éventuelle toxicité et en limiter les risques, les animaux sont suivis après administration.
Devenir
L’impact de la privation de sommeil sera étudié dans un test de comportement moteur/exploratoire. A la fin de l'étude, pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à : 1) à un prélèvement de sang en intracardiaque sous isoflurane ou par décapitation (sous anesthésie générale) avec une guillotine dans le cas d'une nécessité de prélèvement sanguin important et 2) à un prélèvement de cerveau.
Remplacement
A ce jour, il n’existe pas de méthode alternative pour évaluer la fatigue chronique, le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour étudier la physiopathologie de la fatigue et évaluer l’efficacité de nouvelles molécules qui pourrait la réduire.
Réduction
Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables ; ceci afin d'éviter de multiplier les expériences. Il correspond à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p < 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des locaux appropriés et dans des cages contenant des enrichissements conformément aux standards réglementaires. Ils seront pesés et leur état général évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance. Cette grille permet d’évaluer le niveau de souffrance des animaux selon des critères cliniques spécifiques, par un personnel dûment formé. Les données issues de ce suivi individuel seront enregistrées dans un tableau définissant les points limites expérimentaux, et aussitôt analysées. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Le répertoire comportemental des rats correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Espèce/lignée utilisée : rat mâles Sprague-Dawley Ce modèle est reconnu et sa validité a été démontrée chez le rat. Stade de développement : 6-7 semaines au moment du test (âge adulte). Les produits testés sont destinés à des patients adultes.
Etude de la physiopathologie des infections aspergillaires au cours de la BPCO
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant du léger au sévère, 232 relevant de la gravité la plus élevée. Exposées douze semaines à la fumée de cigarette pour reproduire une bronchopneumopathie chronique, elles sont infectées par le champignon Aspergillus fumigatus par voie intranasale, puis subissent un prélèvement de sang rétro-orbital avant d'être tuées pour prélever poumons, rate, cœur et cerveau. Le porteur vise l'identification de marqueurs précoces d'une infection au pronostic sombre chez les patients atteints de BPCO. Il affirme que la complexité de la réaction de l'hôte rend un modèle in vivo "nécessaire".
Objectifs
L’objectif de notre projet est d’étudier les mécanismes impliqués dans les aspergilloses invasives (AI) au cours de la BPCO. En effet, ces infections ont une incidence de 1,6-3,9%, surviennent principalement chez des patients BPCO traités par corticothérapie systémique, et sont associées à une mortalité élevée (72-100%). Cependant, peu de données sont disponibles sur la physiopathologie des AI au cours de la BPCO. L’exposition à la fumée de cigarettes et les infections aspergillaires se traduisent par une inflammation pulmonaire et le recrutement et l’activation de nombreux types cellulaires. Cette réaction est sous la dépendance d'un réseau complexe de facteurs et de structures de l’hôte qui ne peuvent être reproduites in vitro, de même que la production de biomarqueurs pulmonaires et sanguins associés aux infections aspergillaires. C’est pourquoi l’utilisation d’un modèle in vivo est nécessaire.
Bénéfices attendus
Ce travail devrait permettre de mieux comprendre la contribution des macrophages au défaut de réponse anti-Aspergillus au cours de la BPCO et d’identifier des marqueurs précoces afin d’améliorer la prise en charge diagnostique, thérapeutique et le pronostic de ces infections.
Procédures
Les interventions prévues sur les animaux vigiles sont : - L’inoculation intra-nasale de conidies d’A. fumigatus : n=1, durée environ 10 min (temps d’anesthésie par injection IP de xylazine/kétamine inclus) - La réalisation de prélèvements sanguins par voie rétro-orbitale : n=1, durée environ 10 min (temps d’anesthésie par injection IP de xylazine/kétamine inclus)
Impact sur les animaux
- Inoculation intra-nasale de conidies d’A. fumigatus : accélération transitoire du rythme respiratoire (le retour à la normale après quelques minutes sera vérifié). - Prélèvement sanguin par voie rétro-orbitale : ce prélèvement étant réalisé sous anesthésie, juste avant euthanasie des animaux, aucun effet indésirable ayant un impact durable n’est attendu.
Devenir
Une mise à mort étant nécessaire pour permettre le recueil des échantillons utilisés pour la réalisation des analyses (poumons, rate, coeur, cerveau, LBA, sang par ponction intra-cardiaque), elle sera réalisée pour l'ensemble des animaux.
Remplacement
L’exposition à la fumée de cigarettes et les infections aspergillaires se traduisent par une inflammation pulmonaire et le recrutement et l’activation de nombreux types cellulaires. Cette réaction est sous la dépendance d'un réseau complexe de facteurs et de structures de l’hôte qui ne peuvent être reproduites in vitro, de même que la production de biomarqueurs pulmonaires et sanguins associés aux infections aspergillaires.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour chaque expérience, et le nombre de réplicats (n=2) sont réduits à leur minimum tout en permettant d’atteindre une puissance statistique significative dans l’analyse de nos paramètres, notamment de la mortalité, ainsi que des charges fongiques pulmonaires et cardiaques.
Raffinement
Les conditions d'hébergement (notamment l’enrichissement des cages par ajout d’abri en carton et papier de nidification) et de réalisation des expériences (anesthésie lors de l’inoculation intra-nasale des conidies, de l’évaluation de la fonction pulmonaire, de la réalisation de prélèvements sanguins ; établissement de points limites et mise à mort en cas de dépassement de ces points) permettront de réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux.
Choix des espèces
L’étude des pathologies pulmonaires est facilitée chez la souris du fait de la grande disponibilité des outils d’exploitation et d’analyse, ce dont les autres espèces sont dépourvues. La BPCO touche majoritairement les adultes, très peu les populations jeunes ou les enfants, nous utiliserons donc des animaux adultes. Les souris commencent à être exposées à la fumée de cigarettes à partir de 7-8 semaines d’âge. Le protocole d’exposition à la fumée de cigarettes est de 12 semaines, afin de reproduire une inflammation pulmonaire chronique associée à une altération fonctionnelle pulmonaire. Les souris sont donc infectées par A. fumigatus à l’âge de 19-20 semaines.
Etude de la réponse inflammatoire dans les modèles d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
6 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant du léger au sévère, 1 200 relevant de la gravité la plus élevée. Toutes subissent une biopsie de queue pour génotypage, une partie recevant des injections intracérébrales, la pose d'une fenêtre crânienne ou des injections dans la cisterna magna, avant une perfusion intracardiaque terminale pour prélever le cerveau. Le porteur suit la douleur au moyen d'une grille d'expressions faciales et administre buprénorphine et kétoprofène. Il affirme que la réaction inflammatoire de la maladie d'Alzheimer ne peut s'étudier que dans un "organisme entier", les cultures d'organoïdes ne la reproduisant pas.
Objectifs
Les études d’analyse génomique concernant la maladie d’Alzheimer montrent l’influence de gènes intervenant dans la réponse immunitaire notamment ceux exprimés dans les cellules de la microglie. Afin de suivre cette réponse inflammatoire durant l’évolution de la maladie nous allons utiliser une souris reportrice HexdtTomato. Chez cette souris les cellules de la microglie expriment une protéine fluorescente (dtTomato) sous le contrôle de la sous-unité bêta du gène hexominidase (Hexb) facilitant la localisation et le suivie de ces cellules in vivo et ex vivo. Nous allons utiliser cette souris dans nos modèles de la maladie d’Alzheimer. Ainsi nous allons déterminer l’influence de 2 gènes d'intéret dans la réponse inflammatoire dans le modèle de souris APPSwe/Ind. La souris APP Swe/Ind exprime une forme humaine de la protéine APP (Amyloid Precusor Protein) porteuse de la mutation humaine Swedish/Indiana. Cette souris développe des plaques amyloïdes à partir de 8 mois. Nous travaillerons sur des animaux âgés de 2 à 4 mois et de 10-11 mois. Nous voulons déterminer comment évoluent les cellules de la microglie à des temps précoces de la maladie (2-4 mois) et à des temps où la maladie est installée soit 10-11 mois. Ainsi on pourra définir les rôles de nos deux gènes d’intérêt dans l’évolution de la réaction inflammatoire au sein du modèle APP Swe/Ind.
Bénéfices attendus
La mise en œuvre de ce projet provient des résultats des analyses génétiques réalisées sur des malades de la maladie d’Alzheimer. En effet de nombreux gènes liés au système immunitaire ont été retrouvés tel que Trem2. En travaillant sur 2 temps, on peut voir comment la réaction inflammatoire évolue aux cours du développement de la maladie d’Alzheimer. La réalisation de ce projet nous permettra de caractériser les différents types de microglie et nous permettra de définir la « bonne microglie » qui favoriserait la clairance et la dégradation des plaques amyloïdes.
Procédures
En vue du génotypage des animaux, ces derniers doivent subir une biopsie de queue qui se fait sous anesthésie. Nombre 6900 fréquence une fois. Sur des animaux vigiles, nous effectuons des injections intrapéritonéales (nombre 600, fréquence 5, une fois par jour), intranasales ( nombre 800, fréquence 5 fois, une fois par jour ), intraveineuses ( nombre 800 fréquence une fois) et des gavages (nombre 600 fréquence une fois par jour pendant 30 jours ou une fois par jour pendant une semaine). Sur des animaux anesthésies avec un suivi postopératoire nous réalisons des injections intracérébrales (nombre 600 une fois Injection), injection dans la cisterna magna (nombre 200 une fois) et la pose d’une fenêtre crânienne (nombre 400 une fois). Sur des animaux anesthésiés nous les sacrifions après une perfusion intracardiaque (nombre 6900 une fois).
Impact sur les animaux
Les animaux sont suivis régulièrement. Les effets indésirables dans ce projet sont essentiellement pour les procédures qui impliquent un acte chirurgical soit les procédures 6-7-9. Un tableau de « scoring » a été établi pour suivre les animaux (tableau joint). La durée maximale avant le sacrifice est de 7 jours dans le cas de la procédure 7. La phase post opératoire est la suivante: - lors de la phase de réveil, l’animal est placé dans une cage sur du papier propre afin d’éviter des contacts entre la sciure et la suture, et sous une lampe chauffante pour éviter toute hypothermie due à l’anesthésie. Pour la réhydratation de l’animal on injecte du NaCl 0.9% glucosé à 5% (500µl). - lors du réveil, les animaux reviennent dans la salle d’hébergement. Des observations fréquentes sont réalisées (2 fois par jour sur une semaine) pour vérifier l’état de la suture. Pour réduire la douleur due à certaines procédures chirurgicales nous utilisons BUPREMORPHINE (0.1MG/KG, SC 100µL) ET KETOPROFENE (5MG/KG, SC 100µL) DEUX FOIS PAR JOUR DURANT 2 JOURS. Les animaux reçoivent une nourriture humide et du Diet Boost gel pour récupérer son poids initial. -Si la perte de poids de l’animal dépasse 15% il est euthanasié. Si les animaux présentent une activité absente, une immobilité et des déplacements difficiles dans les 24 heures postopératoire, l’animal est sacrifié.
Devenir
L'ensemble de nos procédures se terminent par le sacrifice des animaux et par la réalisation de la procédure 8. En effet nous devons prélever le cerveau ce qui implique le sacrifice de l'animal pour déterminer le nombre de plaques amyloïdes, réaliser des dosages d'Abeta42, suivre l'activité de certaines enzymes intervenant dans le métabolisme de la protéine précurseur de l'amyloïde (APP).
Remplacement
Les études d'analyse génomique concernant la maladie d'Alzheimer montrent l'influence de gène intervenant dans la réponse immune notamment les cellules de la microglie. Le développement de la maladie d'Alzheimer est accompagnée d'une réponse inflammatoire. Cette réponse ne peut se faire qu'au sein d'un organisme entier de l'animal. Les techniques de culture d’organoïdes in vitro ne nous permettent pas de suivre le développement d’une réaction inflammatoire lors du développement de la maladie d’Alzheimer. Mais l'utilisation d'une souris reportrice HexbdtTomato (sous unité beta du gène codant pour l'hexosaminidase), nous permettra de limiter le nombre de souris car les cellules de la microglie pourront être suivies grâce au gène rapporteur Tomato.
Réduction
Le nombre d’animaux inclut dans ce projet a été établi par rapport à des études précédentes que nous avons effectuées. Nous utilisons les 2 sexes afin de minimiser le nombre d’animaux. Pour réduire le nombre, nous effectuons sur un hémisphère cérébral pour les analyses immunohistologiques et sur le second les extractions d’ARNm ou de protéines. Le test d’analyse de variance (logiciel Graphpad) est le test que nous avons choisi afin de comparer les différents génotypes a été déterminé à l’aide du logiciel BiostatTGV. Nous utilisons le test Man et Whiney pour les études pilotes.
Raffinement
NOUS OBSERVONS REGULIEREMENT LES ANIMAUX. NOUS AVONS INCLUS DIFFERENTS POINTS LIMITES DANS NOS EXPERIENCES (PERTE DE POIDS, PILOERECTION, DOS ROND, HYPOACTIVITE, DEMARCHE ANORMALE). NOUS AVONS ETABLI UN TABLEAU DE SCORING (NC3R) DANS LEQUEL NOUS SUIVONS LES PARAMETRES D'EXPRESSION FACIALES SUIVANTS : CONTRACTION ORBITRAIRE, GONFLEMENT DU NEZ, DES JOUES, POSITION DES OREILLES ET DES MOUSTACHES). L'EVALUATION DE LA DOULEUR PAR LE SUIVIE DES EXPRESSIONS FACIALES A ETE UTILISE DANS LE CAS DE CRANIOTOMY (SCIENTIFIC REPORTS (2019)9:359). NOUS AVONS ETABLI UN TABLEAU OU SELON L'OBSERVATION EFFECTUEE NOUS NOTONS ZERO POUR UN CAS NORMAL,1 POUR UNE ALTERATION MODEREE ET 2 POUR UN SIGNE EVIDENT. LA SOMME DES OBSERVATION NOUS DONNERA UN SCORE QUI INDIQUERA L'ETAT DE L'ANIMAL. CONTRE LA DOULEUR, NOUS ADMINISTRONS DE LA BUPREMORPHINE (0.1MG/KG, SC 100µL) ET KETOPROFENE (5MG/KG, SC 100µL) DEUX FOIS PAR JOUR DURANT 2 JOURS. NOUS AJOUTONS DANS LES CAGES DE L’ALIMENT ET DE L’EAU EN GELEE. NOUS DEVELOPPONS DES CULTURES D’ORGANOÏDE MAIS NOUS POUVONS PAS ETUDIER L’ETABLISSEMENT DE LA REACTION INFLAMMATOIRE DANS LE DEVELOPPEMENT DE LA MALADIE D’ALZHEIMER AVEC CE TYPE DE MODELE.
Choix des espèces
Dans cette espèce différents outils génétiques existent : des souris transgéniques, KO, KI permettant de réaliser des études dans des conditions physiologiques. Nous disposons donc de modèle qui développe la maladie d'Alzheimer mais également de souris reportrice nous permettant de suivre des cellules de la microglie par l'expression d'une protéine fluorescente la protéine tomato. Ainsi en utilisant ces souris nous pouvons suivre le développement de la réaction inflammatoire lors de l'établissement de la maladie d'Alzheimer. Pour cela nous travaillerons à deux temps, un temps précoce 2-4 mois et un temps plus tardif où la maladie est installée soit 10-11 mois. Au stade 10-11 mois nous pouvons observer des plaques amyloïdes dans le cerveau des souris. Grace à la souris reportrice HexdtTomato, nous pourrons déterminer le rôle de la microglie dans la formation de ces plaques (taille, forme, ...).
Étude de la microcirculation par échographie super-résolue, dite ULM chez le rongeur (rat)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
55 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, tués avant tout réveil. Tous sont anesthésiés puis imagés par échographie, quarante d'entre eux subissant en plus une opération chirurgicale sous analgésie, pour mettre au point une technique d'imagerie ultrasonore de la microcirculation. Le porteur formule l'espoir d'un futur diagnostic du diabète ou du cancer chez l'humain, sans résultat clinique à ce stade. Il affirme que les modèles physiques et les simulations ne reproduisent pas la complexité des mouvements et des artefacts observés in vivo.
Objectifs
L’échographie super-résolue est une nouvelle technique basée sur les ultrasons qui permet de visualiser de manière non invasive les vaisseaux à une échelle micrométrique, même en profondeur. La faisabilité de cette technique a pu être démontrée chez le rongeur pour visualiser le cerveau ou d'autres organes, ainsi que chez l'homme pour visualiser la circulation cérébrale. L’intérêt de cette technique est qu’elle permet de décrire l’anatomie, mais surtout la physiologie de la circulation dans de très petits vaisseaux (microcirculation). Elle consiste en une imagerie ultrasonore ultrarapide permettant de visualiser un agent de contraste ultrasonore injectable, utilisé en clinique (microbulles de gaz). L’échographie super-résolue ou plus précisément la technique d’Ultrasound Localization Microscopy (ULM) permet alors de mesurer la vitesse de microbulles individuelles dans les vaisseaux sanguins, décrivant la dynamique sanguine à des profondeurs et des précisions jusqu’ici inaccessibles. Cette technique prometteuse ouvre la voie à des applications pour diagnostiquer et caractériser des pathologies vasculaires chez l'homme. L’objectif global de ce projet est de caractériser la microcirculation à l’intérieur d’organes abdominaux de modèles animaux afin de déterminer le lien entre sa structure et sa fonction. En particulier, nous souhaitons étudier la microcirculation du rein et du pancréas pour développer un nouvel outil diagnostic.
Bénéfices attendus
L'espoir de ce protocole de recherche est de mettre au point cette technique, permettant ensuite de diagnostiquer chez l'Homme des maladies impactant la microcirculation telles que le diabète ou le cancer.
Procédures
Tous les rats seront placés en anesthésie générale, et seront imagés par une technique atraumatique (échographie) (N=55). Certains rats subiront une opération chirurgicale sous analgésie adaptée (N=40). Certains rats seront mis à jeun 4h avant la procédure d'imagerie (N=20).
Impact sur les animaux
Tous les rats seront anesthésiés dès le début de chaque procédure entrainant une perte de leur capacité à se réchauffer. Leur température sera donc suivie et les animaux seront réchauffés tout au long des expériences. Certains rats subiront une procédure chirurgicale et seront donc analgésiés, pour éviter toute douleur lors de l'expérience. Les procédures sont sans réveil, tous les animaux seront mis à mort à l'issue de l'expérience.
Devenir
Les procédures sont sans réveil, tous les animaux (55) seront mis à mort à l'issue de l'expérience. Il n'est pas prévu de suivi à long terme de ces animaux.
Remplacement
Les mises au point de la technique ULM ont été faite sur des modèles physiques ou approchés par simulation, mais ces approchent ne permettent pas de refléter la complexité des mouvements et artefacts d'imagerie in vivo.
Réduction
Le nombre de rats utilisés dans notre projet est réduit à son minimum dans la limite de ce qui est requis. Une étude statistique prenant en compte les variabilités attendues a été réalisée pour justifier l'utilisation du nombre de rats tout en obtenant des résultats valides.
Raffinement
Les procédures d'imageries seront réalisées sous anesthésie générale, pour limiter le stress. Les procédures invasives seront limitées au maximum et réalisées avec une analgésie adaptée pour éviter toute douleur.
Choix des espèces
Nous avons choisi le rat pour des raisons proximité avec la physiologie humaine et d'échelle anatomique. En effet, si la technique ULM permet d'obtenir une anatomie des vaisseaux inégalée, le positionnement de la sonde d'imagerie ultrasonore se fait en utilisant des modes d'échographie conventionnels, et il faut pouvoir visualiser les organes de manière correcte avec une sonde qui n'autorise qu'une résolution de 300µm dans ce mode. Dans toute cette étude, des rats adultes (8 à 12 semaines) seront utilisés afin de s'assurer que l'imagerie sera effectuée sur des pancréas pleinement développés.
Endothélium, un nouvel acteur de la neuroplasticité.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
Rats : 1283
1 991 animaux non-humains, 708 souris et 1 283 rats, vont être utilisés et tués à l'issue, en majorité dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil. Ils sont soumis à un exercice imposé sur tapis roulant ou à une électrostimulation musculaire, puis, sous anesthésie, à une laparotomie, une thoracotomie, un prélèvement de sang intracardiaque et une perfusion transcardiaque qui provoque leur mort, avant décapitation et prélèvement du cerveau, des muscles et des vaisseaux. Le porteur affirme n'attendre aucune nuisance hormis l'inconfort de l'exercice imposé, et vise l'endothélium comme cible thérapeutique et l'électrostimulation comme alternative à l'exercice pour les personnes peu mobiles. Il indique qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne peut remplacer le modèle rongeur.
Objectifs
La neuroplasticité (capacité du cerveau à moduler le nombre et l’efficacité de ses synapses) est dépendante de l’activation des récepteurs TrkB (tropomyosin related kinase B) neuronaux par le BDNF (brain-derived neurotrophic factor). Alors qu’il est bien admis que la principale source cellulaire du BDNF est le neurone, nos récents travaux supportent l’hypothèse originale selon laquelle l’endothélium serait également un acteur clé de la neuroplasticité. En effet, nous avons montré que : -l’endothélium (périphérique ou cérébral) exprimait fortement BDNF -50% du BDNF cérébral correspondait à du BDNF endothélial -la synthèse endothéliale de BDNF était corrélée positivement à la production d’oxyde nitrique(NO) et qu’il existait un feedback positif entre productions endothéliales de NO et de BDNF. Enfin, les pathologies associées à une dysfonction endothéliale, connues pour affecter négativement la santé cérébrale, réduisent l’expression endothéliale et les taux cérébraux de BDNF. A l’opposé, l’exercice physique (EX), reconnu pour induire la neuroplasticité et améliorer les capacités cognitives, les augmente. De façon intéressante, bien que peu nombreux, de récents travaux montrent que l’électromyostimulation (EMS) reproduit les effets de l’EX sur la fonction endothéliale et les taux cérébraux de BDNF. Cette analogie entre EX et EMS pourrait s’expliquer par la capacité des muscles squelettiques à sécréter une hormone: l’irisine; l’inactivation de l’irisine circulante réduisant les bénéfices cognitifs de l’EX chez la souris Alzheimer. Mais quelle est la cible cellulaire de l’irisine circulante : le neurone ? la cellule endothéliale cérébrale ? Par ailleurs, alors que nous avons récemment démontré que les effets salutaires de l’EX sur la santé cérébrale pouvaient également s’expliquer par son impact positif sur le système cardiovasculaire (voie hémodynamique), à ce jour il n’existe que peu de données sur les effets de l’EMS sur le débit sanguin cérébral (DSC). Dans ce contexte, les objectifs sont : 1) de montrer que le BDNF endothélial est un acteur clé de la neuroplasticité grâce aux caractérisations biochimique et cognitive d’une souris génétiquement modifiée incapable d’exprimer BDNF au niveau endothélial (endoBDNF-/-), 2) d’explorer la connexion existante entre irisine musculaire et BDNF endothélial, 3) d’étudier le rôle du BDNF endothélial sur la cognition 4) de connaître les effets de l’EX et l’EMS sur les paramètres cérébro-vasculaires.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à tester, d’une part, l’hypothèse selon laquelle la cellule endothéliale est une composante majeure de la neuroplasticité et, d’autre part, de comprendre comment la contraction musculaire (induite via l’EX ou l’EMS) impacte la santé cérébrale via l’étude du BDNF, de l’irisine et plus largement de la cognition. La compréhension des mécanismes impliqués nous permettrait : - De définir la cellule endothéliale comme une cible thérapeutique prometteuse aisément accessible dans la lutte contre les maladies neuro-cardio-vasculaires. En effet, l’endothélium est impliqué dans bon nombre de pathologies, soit comme déterminant physiopathologique, soit comme sujet à des dommages collatéraux. - De définir l’EMS comme une alternative au protocole d’EX chez les personnes n’ayant pas la motivation ou la capacité physique permettant de réaliser des séances régulières. Le but ultime étant de préserver et améliorer la cognition et donc la santé cérébrale.
Procédures
Tous les prélèvements effectués sur nos animaux (n=1991) se feront sous anesthésie générale (aucun prélèvement sur animal vigile). L’administration des substances pharmacologiques (Procédure 4, n=688) sera réalisée par voie injectable (Intra-péritonéale ou sous-cutanée) sur des animaux vigiles (1 seule administration/animal). L’ensemble des animaux (708 souris + 1011 rats) inclus dans les procédures 1, 2 (EMS Chronique), 4 (Point 2 –Impact de l’EX ou l’EMS sur la cognition), 5 et 6 seront soumis aux interventions suivantes : -Anesthésie générale de l’animal -Laparotomie, thoracotomie -Prélèvement intracardiaque de sang (~2 ml/rat et prélèvement des structures cérébrales ou cerveau entier -Prélèvement des muscles squelettiques (soléaires et gastrocnémiens) -Prélèvement des vaisseaux (aorte thoracique et abdominale). Concernant les animaux inclus dans les procédures 3 (32 rats) et 4 (Point 1-Impact de l’EMS sur la FC, PA et DSC, 240 rats): -Anesthésie générale -Contrôle et maintien de la température rectale à 37.5/38.5°C jusqu’à la mise à mort -Cathétérisme de la veine du pénis pour administration d’héparine et d’agents vasopresseurs si la pression artérielle est inférieure à 60 mm Hg. Cathéter mis en place en moins d’une minute. Durée entre 60 et 90 minutes. - Cathétérisme de l’artère carotide commune gauche en vue de la mesure de la PA et des prélèvements sanguins (mesure des GDS). Cathéter mis en place en moins de 10 minutes. Durée entre 60 et 90 minutes. - Intubation trachéale, mise sous respiration assistée et curarisation. Intubation mise en place en moins de 5 minutes. Durée 60 et 90 minutes. - Placement de l’animal sur l’appareil stéréotaxique - Incision du crâne et trépanation à l’aide d’un fraisage doux. Durée 5-10 minutes. - Placement de la sonde doppler sur la dure mère. Durée 5-15 minutes. - Mesure du DSC. Durée 30 minutes. - Mise à mort par décapitation => prélèvement cerveau - Laparotomie, thoracotomie => prélèvement d’organes A noter également que l’administration des substances pharmacologiques (Procédure 4, n=688) sera réalisée en subchronique par voie injectable (Intra-péritonéale ou sous-cutanée).
Impact sur les animaux
Aucune nuisance, ni effet indésirable est attendu sur nos animaux, tout au plus un inconfort lié au caractère imposé de notre protocole d’EX sur tapis roulant (procédure 1). Par ailleurs, afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux, - Les actes chirurgicaux seront réalisés après prémédication à la buprénorphine (30 minutes avant induction de l’anesthésie afin d’en potentialiser ses effets) et sous anesthésie générale par du personnel statutaire qualifié et/ou par des étudiants en recherche préalablement formés. La profondeur de l’anesthésie sera contrôlée pour chaque animal afin d’éviter tout réveil pendant la chirurgie. - Les injections sous cutanées et intrapéritonéales seront réalisées avec des aiguilles 25G chez le rat et 27G chez la souris. - Le réveil des animaux anesthésiés sera réalisé en cage individuelle dans une salle de repos sous surveillance de l’expérimentateur et contrôle de la température corporelle. - Le stress des animaux dû à la nouveauté (expérimentateur, tapis roulant) sera prévenu par une phase préalable « d’habituation ». Dans la mesure du possible, les animaux d’une même expérience seront en contact avec un expérimentateur unique.
Devenir
L’intégralité des animaux inclus dans les 6 procédures seront mis à mort pour prélèvement des tissus (cerveau, muscles squelettiques, vaisseaux).
Remplacement
L’absence de méthodes substitutives (in vitro ou in silico) pour étudier : 1) l’influence des variations du flux sanguin (induites par l’EX ou l’EMS) sur la neuroplasticité et la cognition et, 2) l’étude des interactions entre les différents éléments intervenant dans la connexion muscle/cerveau, ne nous permet pas de remplacer le modèle rongeur (souris et rats).
Réduction
Une première approche nous permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés est de travailler avec des procédures standardisées - de la réception des animaux jusqu’à leur mise à mort. Ces procédures, disponibles au laboratoire sous forme de documents écrits précisant tous les détails pratiques, sont maitrisées par du personnel statutaire ; les souches d’animaux, leur âge et le nombre/groupe sont appropriés à la validation/invalidation de notre hypothèse. Par ailleurs, les expériences du projet tiennent compte des facteurs reconnus pour influencer la cognition (interaction sociale, poids corporel, prise de nourriture, cycle nycthéméral, hormones sexuelles). Une seconde approche est de soumettre les animaux d’un même groupe à 2 ou 3 procédures différentes. Concernant les analyses statistiques, nous utiliserons des tests adaptés aux petits échantillons et aux types de comparaison (multigroupes ou 2 groupes, analyses variable continue ou pas, mesures appariées ou pas). Les groupes à comparer sont déterminés avant de conduire les expériences et le nombre d’animaux inclus dans chaque groupe tient compte : - de l’obligation de réduire le nombre d’animaux utilisés - de la variabilité interindividuelle quant à la réponse des animaux - de la possibilité d’échec dans la réalisation de certains gestes chirurgicaux - de la nécessité de conduire une étude statistique de qualité Ce nombre sera raisonnablement compris entre 8 (pour la mesure des paramètres cérébro-vasculaires et les analyses biochimiques) et 16 (pour l’étude de la cognition), compromis entre limitation du nombre d’animaux et obtention d’une analyse statistique fiable.
Raffinement
Afin de raffiner au maximum notre projet, Avant l’expérimentation Les rats et souris seront respectivement hébergés au nombre de 5 et 10 par cage afin de maintenir une interaction sociale et demeureront avec les mêmes congénères tout au long des procédures afin de ne pas rompre la hiérarchie intra-cage. Afin de déceler toute souffrance physique ou psychologique conduisant à un inconfort, les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne. Par le biais d’une phase d’habituation (4/5 jours), les animaux seront entraînés à coopérer (renforcement positif) de manière à diminuer au maximum le stress de l’animal engendré par l’expérimentateur et/ou l’appareillage (tapis roulant). Pendant l’expérimentation La majorité des procédures utilisées nécessitera une anesthésie générale dont les effets seront potentialisés par une prémédication à la buprénorphine. Nos procédures seront pour la grande majorité « sans réveil », il n’en demeure pas moins qu’une vigilance particulière sera accordée aux soins pré- et per-opératoires. Nos procédures ne nécessiteront pas d’établir des points limites néanmoins, en ultime recours, nous prendrons les dispositions nécessaires afin de limiter toute souffrance animal par le biais d’une mise à mort par injection i.p. d’Euthasol. Après l’expérimentation Afin d’exploiter au mieux les résultats obtenus lors de notre expérimentation, une analyse statistique rigoureuse sera effectuée (cf point 3.3.6.2.).
Choix des espèces
Pour le Rat : -Forte analogie dans l’organisation des vaisseaux cérébraux homme/rat -Volume du cerveau et taille des vaisseaux appropriés aux techniques de dosages utilisées. Néanmoins, pour valider notre hypothèse selon laquelle l’endothélium est une source importante de BDNF cérébral, nous nous sommes orientés vers la fabrication et la caractérisation sur les plans cardiovasculaire et cérébral d’une souris génétiquement modifiée incapable de fabriquer du BDNF endothélial (endoBDNF -/-). Bien que les tailles du cerveau et des vaisseaux de souris soient plus petits, il n’en demeure pas moins que la morphologie du réseau vasculaire cérébral est hautement conservée entre rats et souris. La fabrication de la souris endoBDNF-/- a été financée par le Projet Structurant d’Envergure Région Bourgogne France Comté « BDNF cardiovasculaire et fonction cognitive » (106 364€) et sera valorisée par 3 équipes de recherche: INSERM U1093 CAPS(Dijon), EA4267 PEPITE(Besançon) et EA-481(Besançon). Les rats (Wistar) et les souris (C57BL/6J, endoBDNF-/- et littermates) seront utilisés au stade jeune adulte soit entre 7 et 9 semaines afin de s’affranchir des effets de l’âge sur le système cardiovasculaire et le système nerveux central.
Etude du rôle des macrophages dans le réveil des cellules de carcinomes mammaires dormantes chez la souris obèse
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Rendues obèses par un régime riche en graisse, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales mammaires sous anesthésie puis des injections intrapéritonéales trois à quatre fois par semaine, avant d'être tuées par dislocation cervicale pour prélever leurs glandes mammaires. Le porteur cherche à établir le rôle des macrophages dans le réveil de tumeurs dormantes et renvoie au conditionnel de nouvelles stratégies contre la récidive du cancer du sein. Il indique recourir déjà à des cultures organotypiques mais affirme qu'elles ne reproduisent pas la complexité de l'organe.
Objectifs
Les cancers du sein sont la première cause de décès liés au cancer dans le monde occidental chez la femme. Un challenge majeur dans le traitement des cancers du sein est leur récurrence, et cela même plusieurs années après rémission. Nous savons aujourd’hui que les cellules tumorales dormantes sont responsables de la récurrence du cancer mais les facteurs impliqués dans le réveil de ces cellules tumorales sont encore méconnus. L’obésité est un facteur de risque dans le développement et la récurrence du cancer du sein. Nos données in vitro démontrent que les macrophages induisent le réveil des cellules tumorales dormantes. Les macrophages sont connus pour s’accumuler dans le tissu adipeux, tissu présent dans la glande mammaire. Pour ces raisons, nous nous intéressons à l’implication des macrophages dans le réveil de cellules tumorales dormantes dans le tissu adipeux de la glande mammaire de souris obèses. Ce projet a donc pour objectif d’évaluer l’impact des macrophages dans le réveil des cellules tumorales dormantes in vivo. Nous voulons confirmer nos résultats chez la souris en utilisant le modèle de tumeur primaire dormante chez la souris obèse.
Bénéfices attendus
Un challenge majeur dans le traitement des cancers du sein est leur récurrence, et cela même plusieurs années après rémission. Les facteurs impliqués dans le réveil des cellules tumorales restent donc à identifier. La réalisation de ce projet va donc permettre d’identifier ces facteurs de récurrence du cancer du sein. En effet, nous avons mis en évidence, in vitro, que les macrophages peuvent induire le réveil de cellules tumorales dormantes. Notre modèle in vivo, nous permettra alors de confirmer ou non l’implication des macrophages dans le réveil tumoral. L’identification des macrophages comme facteurs induisant le réveil des cellules tumorales dormantes dans le tissu adipeux de la glande mammaire pourra déboucher vers de nouvelles stratégies thérapeutiques pour lutter dans la récurrence du cancer du sein.
Procédures
Procédure 1 : Pas d’injection. Pas d’anesthésie Procédure 2 - Injection dans la glande mammaire : 336 animaux, 1 fois/animal, durée 7 minutes sous anesthésie générale - Injection intrapéritonéale : 96 animaux, 3 fois/semaine/animal (luciférine + traitement), pendant ¨X¨ semaine. Le nombre de semaine sera défini en fonction de la procédure 1. - Injection intrapéritonéale : ¨192¨ animaux, 4 fois/semaine/animal (luciférine + traitement), pendant ¨X¨ semaine. Le nombre de semaine sera défini en fonction de la procédure 1. Procédure 3 - Injection dans la glande mammaire : 192 animaux, 1 fois/animal, durée 7 minutes sous anesthésie générale - Injection intrapéritonéale : 96 animaux, 3 fois/semaine/animal (luciférine + traitement), pendant ¨X¨ semaine. Le nombre de semaine sera défini en fonction de la procédure 1. - Injection intrapéritonéale : 96 animaux, 4 fois/semaine/animal (luciférine + traitement), pendant ¨X¨ semaine. Le nombre de semaine sera défini en fonction de la procédure 1. Procédure 4 - Injection dans la glande mammaire : 336 animaux, 1 fois/animal, durée 7 minutes sous anesthésie générale - Injection intrapéritonéale : 96 animaux, 3 fois/semaine/animal (luciférine + traitement), pendant ¨X¨ semaine. Le nombre de semaine sera défini en fonction de la procédure 1. - Injection intrapéritonéale : 192 animaux, 4 fois/semaine/animal (luciférine + traitement), pendant ¨X¨ semaine. Le nombre de semaine sera défini en fonction de la procédure 1. Procédure 5 - Injection dans la glande mammaire : 96 animaux, 1 fois/animal, durée 7 minutes sous anesthésie générale - Injection intrapéritonéale : 96 animaux, 3 fois/semaine/animal (luciférine + traitement), pendant ¨X¨ semaine. Le nombre de semaine sera défini en fonction de la procédure 1.
Impact sur les animaux
L’implantation de cellules tumorales pourra générer des tumeurs au niveau de la glande mammaire. En revanche, les souris seront suivies 3 fois par semaine avec mesure de la bioluminescence, du poids et du volume tumoral. Nous pourrons donc surveiller le développement tumoral. Aussi, l’implantation des cellules tumorales sera effectuée sous anesthésie générale et une attention particulière sera portée au réveil des souris ainsi qu’à l’aspect du site d’injection des cellules. Une rotation des sites d’injection en IP des drogues et de la luciférine permettra d’éviter tout problème au niveau de ces sites. Le suivi des souris permettra également de déceler tout problème de locomotion ou de souffrance potentiellement généré par l’éventuelle tumeur.
Devenir
A l’issue de toutes les procédures, les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale. Les glandes mammaires et des échantillons sanguins seront alors prélevés pour analyses.
Remplacement
De nombreuses publications ont décrit les cultures organotypiques comme une méthode de remplacement pour l’étude du développement métastatique. Elles sont déjà utilisées en routine au laboratoire et sont envisagées aussi souvent que possible, comme attesté par les publications du laboratoire. Ainsi, nous avons déjà développé au laboratoire plusieurs modèles in vitro qui nous ont permis de vérifier le rôle des macrophages dans le réveil des cellules tumorales. Cependant, ces cultures ne récapitulent pas toute la complexité de l’organe (matrice extracellulaire différente, et culture organotypique devenant un vrai challenge technique pour la culture de multiples types cellulaires), c’est pourquoi nous avons maintenant recours à des animaux.
Réduction
D’après la littérature, seules 45-50% des souris Balb/C sont sensibles au régime riche en graisse. Ainsi, nous prévoyons un nombre de souris plus conséquent afin d’obtenir un nombre suffisant de souris obèses. De plus, notre modèle in vitro développé au laboratoire a été réalisé sur des cellules tumorales dormantes issues de carcinome mammaire de souris Balb/c. Pour cette raison, nous devons utiliser des souris Balb/C dans notre modèle in vivo. Nos groupes expérimentaux sont composés de 24 animaux en accord avec la pénétrance du modèle d’obésité chez la souris Balb/C. De plus, seules des femelles seront utilisées étant donné le type de cancer étudié (cancer du sein).
Raffinement
Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées dans le respect de la réglementation européenne en cours afin de respecter le bien-être animal et de réduire au minimum le niveau de stress des animaux. Les animaux seront manipulés dans le plus grand calme et nous favoriserons une attitude des plus apaisantes pour leur manipulation. Les animaux sont hébergés en condition A1, en raison de 4 par cages, avec un rythme nycthéméral de 12h, l’eau et la nourriture sont données à volonté et pour le groupe à 60% de graisse, la nourriture sera remplacée trois fois par semaine. Le change des litières est hebdomadaire. Chaque cage est dotée d'un double enrichissement (standard à l'animalerie) : mouse house et carrés de coton. De plus, les cages d'expérimentation sont maintenues de manière séparée des élevages, permettant un suivi plus adapté. La période d’acclimatation avant manipulation sera de 5 jours au minimum. Le régime riche en graisse débutera donc après la période d’acclimatation. Le suivi des animaux sera évalué grâce à la grille de score. En cas de score supérieur à 9 (point limite atteint), les animaux seront alors immédiatement euthanasiés par dislocation cervicale. Les souris seront pesées 2 fois par semaine, le volume tumoral sera mesuré au moyen d’un pied à coulisse 3 fois par semaine et la bioluminescence sera également mesurée 1 fois par semaine. Aucun anti-inflammatoire ne pourra être donné aux souris puisque l’objectif de l’étude est de mieux caractériser le rôle de l’inflammation dans le réveil des cellules tumorales. Une attention toute particulière sera donc apportée à l’analyse de la douleur des souris (voir fiche de score). Aucun dérivé morphinique ne pourra être utilisé puisqu’il a été montré que leur administration à des souris diminuait la prise tumorale.
Choix des espèces
Nous souhaitons étudier le rôle des macrophages dans le réveil de cellules tumorales dormantes. Le modèle murin est un excellent modèle pour élucider ces mécanismes car il présente de grandes similitudes génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. Les procédures expérimentales seront réalisées sur des souris âgées d’au moins 8 semaines, âge à partir duquel la glande mammaire est mature/formée.
Etude in vivo de l’effet d’une supplémentation en vitamine D sur le coeur de rats mâles et femelles prédiabétiques sous régime riche en graisse et en sucre.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
72 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumis cinq mois à un régime riche en graisse et en sucre pour induire un état prédiabétique, ils passent des IRM cardiaques sous anesthésie, un test de tolérance au glucose et des prélèvements de sang à la queue, avant d'être tués par injection létale pour prélever leurs organes. Le porteur affirme vouloir tester la vitamine D comme protection du cœur, avec pour objectif déclaré de proposer un jour cette approche chez l'humain. Il indique qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne peut aujourd'hui remplacer le rat, qu'il juge proche de la physiologie cardiaque humaine.
Objectifs
Le but de ce projet de recherche est de proposer une approche thérapeutique simple et innovante afin de protéger le coeur prédiabétique mâle et femelle dans le but ultime de proposer cette approche thérapeutique à l'Homme. Plus précisément,, nous chercherons à mettre en évidence l’effet d’une supplémentation en vitamine D sur le développement des altérations cardiovasculaires précoces chez des animaux mâles et femelles prédiabétiques soumis à un régime riche en graisse et en sucre. Le prédiabète est un véritable enjeu de santé publique car au regard de sa durée longue et réversible, il offre une fenêtre thérapeutique très pertinente. Par ailleurs, la vitamine D a des effets importants sur le système cardiovasculaire en régulant le métabolisme du calcium, l’immunité et l’inflammation et pourrait exercer un effet protecteur sur les altérations cardiovasculaires précoces associées au prédiabète. Au laboratoire, nous avons acquis une solide expérience dans la caractérisation des atteintes cardiovasculaires induites lors du prédiabète et du diabète de type deux selon le sexe sur l’animal in vivo.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus permettront d’étudier l’effet de la supplémentation en Vitamine D sur le développement des altérations cardiovasculaires précoces chez des animaux mâles et femelles prédiabétiques soumis à un régime riche en graisse et en sucre dans le but ultime de proposer cette approche thérapeutique chez l’Homme.
Procédures
Nous utiliserons une approche multiparamétrique in vivo combinant les techniques d’imagerie (IRM) de résonance magnétique à une étude de l'homéostasie glucidique et à des analyses biochimiques sur différents tissus. Le modèle animal utilisé sera le rat soumis à un régime riche en graisse et en sucre (HFS) pendant 5 mois, qui mime une alimentation déséquilibrée retrouvée fréquemment dans les pays développés. Nous définirons 3 groupes mâles et femelles de 12 animaux : un groupe contrôle avec une alimentation normale, un groupe sous régime HFS et un groupe sous régime HFS supplémenté par la vitamine D pendant les deux derniers mois de régime. Pour l’ensemble du projet, le nombre maximum d’animaux sera de 36 mâles et 36 femelles, soit un total de 72 rats. Une pesée hebdomadaire et une mesure de la prise alimentaire seront faites toutes les semaines pendant les 5 mois de régime. Les altérations cardiovasculaires seront suivies de manière non invasive in vivo par IRM après 3, 4 et 5 mois de régime. Après 5 mois de régime, un test de tolérance au glucose et une mesure de l’insuline seront faits afin de vérifier l’état prédiabétique et le métabolisme glucidique des animaux. A la fin de l'étude, les animaux seront euthanasiés par injection léthale d'euthasol (400 mg/kg) et des tissus seront prélevés pour des analyses biochimiques.
Impact sur les animaux
Lors de l'IRM, les rats seront anesthésiés par un mélange d’isoflurane (2%) et d’oxygène (1 L/min) à l’aide d’une chambre d’induction et le bien-être animal sert assuré par le maintien des constantes vitales de l'animal. Pour le test de tolérance au glucose et la mesure de l'insuline à jeun ou l'anesthésie ne peut pas être réalisée,une compresse d'eau chaude sera placée sur la queue de l'animal afin de faciliter le prélèvement de la goutte de sang le plus rapidement possible. Afin d'éviter toute infection, la queue de l'animal sera désinfectée avant et après la procédure avec de la bétadine jaune. Les jours suivants, nous vérifierons la bonne cicatrisation de la queue de l'animal. A la fin de l'étude, les animaux seront euthanasiés par injection d'euthasol (400 mg/kg) et des tissus seront prélevés pour des analyses biochimiques.Tout le long du projet, le bien-être des animaux sera assuré par un hébergement en portoir ventilé par cage de 2 individus avec un enrichissement composé de matériel pour nicher et se cacher ainsi que des buches et des rondins pour ronger afin de satisfaire les besoins physiologiques des animaux. Les conditions de température, lumière et humidité des cages seront contrôlées. L'eau et la nourriture seront mises à disposition en qualité et quantité satisfaisantes. Tous les rats seront visités quotidiennement à la recherche de signes douloureux ou de comportement anormal par un personnel entraîné et compétent. Une grille d'évaluation de la douleur, mise en annexe du projet (annexe 2), nous permettra de calculer un score et d'agir en conséquence après avis vétérinaire.
Devenir
A la fin de l'étude, les animaux seront euthanasiés par une dose lethale d'euthasol (400 mg/kg) et différents tissus seront prélevés.
Remplacement
A l'heure actuelle, il n'existe aucune méthode de substitution in vitro et in silico pour étudier l'effet de la supplémentation en vitamine D sur les complications cardiovasculaires précoces associées au prédiabète selon le sexe. De nombreuses similitudes existent entre la physiologie cardiaque des rongeurs, particulièrement celle du rat, et celle de l'homme. Les modèles pathologiques chez les rongeurs sont utilisés au laboratoire depuis de nombreuses années et toutes les techniques d'imagerie de résonance magnétique dans ce projet ont été caractérisées au sein même du laboratoire.
Réduction
Notre approche expérimentale permettra de réduire de façon drastique le nombre d'animaux en accord avec la règle des 3R. En effet, les mêmes animaux seront utilisés pour les analyses décrites (examen par IRM, test de tolérance au glucose et mesure de l'insuline). A la fin de l'étude, les animaux seront euthanasiés par une dose lethale d'euthasol (400 mg/kg) et différents tissus seront prélevés pour des analyses biochimiques. Le nombre d'animaux dans ce projet est le minimun nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les groupes et a été déterminé à l'aide d'une analyse statistique utilisant le logiciel Statistica.
Raffinement
L'étude par IRM se fera sous anesthésie inhalée afin de réduire l'angoisse et la douleur. La température corporelle sera maintenue à 37°C pendant l'examen à l'aide d'une couverture chauffante et vérifiée avec une sonde rectale. A la fin de l'étude, les animaux seront euthanasiés par une dose lethale d'euthasol (400 mg/kg) et différents tissus seront prélevés. L'impact environnemental sera pris en compte par une phase d'acclimatation des animaux de quelques jours. Le bien-être des animaux sera assuré par un hébergement en portoir ventilé par cage de 2 individus avec un enrichissement composé de matériel pour nicher et se cacher ainsi que des buches et des rondins pour ronger afin de satisfaire les besoins physiologiques des animaux. Les conditions de température, lumière et humidité des cages seront contrôlées. L'eau et la nourriture seront mises à disposition en qualité et quantité satisfaisantes. Les animaux seront pesés une fois par semaine par les expérimentateurs pendant les 5 mois de régime. Les animaux seront aussi régulièrement manipulés par les expérimentateurs pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Tous les rats seront visités quotidiennement à la recherche de signes douloureux ou de comportement anormal par un personnel entraîné et compétent. Les points limites seront déterminés en fonction des observations définies par Morton et Griffiths (1985). Une grille d'évaluation de la douleur, mise en annexe du projet (annexe 2), nous permettra de calculer un score et d'agir en conséquence après avis vétérinaire.
Choix des espèces
Le modèle de rat nourri avec un régime HFS permet de développer un modèle de prédiabète reproduisant la même genèse que chez l’Homme et de suivre ces effets sur l’organisme, en particulier le cœur. Le modèle HFS a été décrit pour induire un état prédiabétique. Les rates soumises à ce régime présentent une altération de l’homéostasie glucidique, une dysfonction cardiaque précoce des trois mois de régime, ainsi qu’une sensibilité plus importante aux lésions d’ischémie-reperfusion caractérisée par une altération du métabolisme énergétique et de la fonction cardiaques, par comparaison aux rates contrôles sous-alimentation normale. Les animaux seront âges de 6 semaines à l’achat et de 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement des animaux.
Impact de la combinaison d’une exposition prénatale aux polluants atmosphériques et au stress sur le développement et le fonctionnement cérébral
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
210 souris vont être utilisées, 180 tuées à l'issue et 60 réutilisées comme souris visiteuses, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes sont exposées à une atmosphère reconstituant la pollution de Pékin, leurs descendants reçoivent une puce RFID, subissent trois contentions de 45 minutes puis des tests d'interactions sociales, de mémoire et d'anhédonie, cinq par groupe passant une imagerie cérébrale sous anesthésie. Le porteur indique viser des biomarqueurs et des conseils de prévention aux familles et aux décideurs, retombées renvoyées au conditionnel. Sur le remplacement, il affirme que le niveau d'intégration cognitif requis interdit les modélisations informatiques et les espèces autres que les mammifères.
Objectifs
La pollution atmosphérique est un problème majeur de santé publique dans les zones urbaines. Outre les conséquences directes de l'inhalation de polluants sur le système cardiorespiratoire et les décès prématurés, l'exposition prénatale à la pollution urbaine serait associée à une augmentation du risque de développer des troubles psychiatriques, comme l’autisme ou la schizophrénie. Les dommages cérébraux liés à la pollution ont principalement été étudiés chez l’homme au travers d’études épidémiologiques. Ces dernières sont souvent limitées par des facteurs de confusion, qui résultent de l’histoire personnelle de l’individu et de l’évaluation rétrospective de l’exposition aux polluants. En outre, elles ne permettent généralement pas d’évaluer comment ces polluants affectent le système nerveux central. Les modèles animaux apportent des solutions à ces limites. Ils permettent une maîtrise des conditions d’exposition et la reproductibilité des expériences. Notre projet propose ainsi d’évaluer l’impact de l’exposition prénatale à des polluants atmosphérique sur le développement cérébral et le comportement. Par ailleurs, la vulnérabilité aux troubles psychiatriques correspond à une sensibilité qui varie d’un individu à l’autre. Celle-ci est conférée par des facteurs génétiques ou environnementaux, rendant les individus plus sensibles à des facteurs externes comme le stress. Afin de tester si la vulnérabilité induite par une exposition prénatale à des polluants atmosphériques augmente la sensibilité au stress, des souris gestantes seront exposées au cours de leur dernière semaine de gestation à une atmosphère type de la ville de Pékin, dans laquelle les taux de polluants moyens enregistrés dépassent les seuils limites recommandés par l’Organisation Mondiale de la Santé. Chez la descendance des souris exposées, nous évaluerons l’impact d’une telle exposition sur le comportement des animaux et en particulier sur leurs interactions sociales, connues pour être altérées dans l’autisme et la schizophrénie. Afin de tester la sensibilité au stress, la moitié des animaux sera exposée avant les tests à un stress aigu et l’autre non. Sur ces deux groupes d’animaux, nous testerons les capacités cognitives et sociales. Nous étudierons également la structure et le fonctionnement cérébral. Notre projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs. Les souris seront exposées à la pollution dans le premier et le comportement des descendants sera étudié dans le second.
Bénéfices attendus
Des résultats préliminaires obtenus dans le cadre d’un précédent projet ont montré une diminution des interactions sociales chez des femelles adolescentes dont les mères avaient été exposées à la pollution atmosphérique de la ville de Pékin, mais aucune différence n’avait été observée pour les mâles. Des différences d’expression de plusieurs gènes chez ces mêmes souris femelles ont également été montrées alors qu’aucune différence significative n’a été observée chez les mâles. Cette étude nous permettra de voir si les différences d’interactions sociales observées chez les femelles exposées in utéro à la pollution atmosphérique sont associées à des modifications cérébrales qui pourraient servir de biomarqueurs d’une telle exposition chez l’homme. Elle nous permettra également d’évaluer les conséquences de la combinaison de deux facteurs d’exposition environnementaux sur les comportements cognitifs sociaux et non sociaux non seulement chez les femelles, mais également chez les mâles chez qui aucune différence n’a pu être observée jusqu'alors. Cette double exposition, proche des conditions écologiques rencontrées par l’homme au cours de sa vie, nous permettra d’établir des stratégies de communication auprès des décideurs publiques ou de prévention dans les familles de personnes avec des troubles psychiatriques en leur conseillant d'éviter de vivre dans des zones fortement exposées à la pollution.
Procédures
La moitié des femelles gestantes sera exposée à une pollution atmosphérique type, équivalente à celle rencontrée dans la ville de Pékin dans le premier établissement utilisateur. Dans le second établissement, la moitié des animaux étudiés sera soumis à trois stress de contention d'une durée de 45 minutes qui précédent les tests d’interactions sociales et le premier test de mémoire. Tous les animaux étudiés seront soumis à des tests de comportement mesurant les interaction sociales (1 fois 10 min), la cognition (test de mémoire, 1 fois 10min puis le lendemain 2 fois 10 min) et l'anhédonie (3 jours consécutifs). Cinq animaux par groupe seront anesthésiés pour être étudiés par imagerie cérébrale. A 12 mois, les animaux qui n'auront pas été étudiés par imagerie cérébrale seront soumis à un test de reconnaissance sociale (3 fois 10 min) et un test de locomotion et d'anxiété (1 fois 10min).
Impact sur les animaux
Une puce RFID sera injectée à tous les descendants des souris gestantes. La moitié de ces descendants sera exposée trois fois à un stress de contention pendant 45 minutes avant l'évaluation de leurs interactions sociales et de leur cognition. Avant les tests d'interactions sociales, les animaux seront isolés pendant 30 min. Les animaux seront isolés pendant les tests de cognition pour des sessions inférieures à 10 min. Les animaux étudiés pour l’imagerie cérébrale seront anesthésiés. Les animaux soumis à des stress de contention sont considérés impliqués dans une procédure de sévérité modérée. Les autres animaux subissent une procéure de sévérité légère.
Devenir
Tous les animaux d'étude, c'est-à-dire les descendants des mères exposées (N=120), seront mis à mort à la fin de la procédure pour étudier leur cerveau. Les mères (N=30) seront mises à mort après le sevrage pour étudier l'impact de l'exposition directe à la pollution sur leur cerveau. Les souris visiteuses pour les tests des interactions sociales (N=60) seront réutilisées dans d'autres projets.
Remplacement
Les objectifs de ce projet étant de déterminer l’impact de l’exposition prénatale à une atmosphère polluée sur le développement cérébral et le comportement, incluant des profils cognitifs individuels et des comportements intégratifs, le niveau d’analyse requis n’est envisageable que chez des animaux possédant un niveau d'intégration cognitif suffisant et ne peuvent donc être remplacés par des modélisations informatiques. Pour les mêmes raisons, ces expériences ne peuvent pas être conduites chez des espèces autres que les mammifères.
Réduction
Toutes les méthodes possibles sont utilisées pour limiter le nombre d’animaux et prendre en compte leur bien-être et leur potentielle souffrance. La réduction du nombre d’animaux sera liée au fait que les mêmes animaux seront étudiés par plusieurs tests de comportement (interactions sociales, cognition sociale et non sociale, anhédonie). Ces mêmes animaux seront également utilisés pour des analyses neuroanatomiques. Les tests statistiques nous permettent d'estimer que nous devons utiliser 15 animaux par groupe pour chaque condition expérimentale pour que le nombre d’animaux utilisés corresponde au minimum requis pour que les données soient scientifiquement interprétables.
Raffinement
Les animaux sont exposés in utéro à des atmosphères polluées (exposés) et non polluées (contrôles) en isolateurs dans des cages enrichies. Après leur exposition, les animaux seront transportés en groupes par un transporteur agréé en cages de transport. Lors du transport, les cages seront munies d'un enrichissement (papier permettant de réaliser des nids), de nourriture sous forme de pellet et d'eau sous forme de gelée. Tout au long des expériences les animaux seront maintenus en conditions standard comportant un enrichissement (cotons permettant de réaliser des nids, éléments de jeux tels que tunnels, bâton de bois, igloos). Afin de suivre leur évolution individuelle, ils seront identifiés à l’aide de puces RFID injectées en sous cutanés à la base du cou au moment de leur sevrage (P21) grâce à une procédure non invasive sans anesthésie ni chirurgie. Nous étudierons l’effet sur les deux sexes pour vérifier l’absence de différence entre les sexes. Les animaux seront observés tous les jours pour détecter toute manifestation de souffrance. Nous surveillerons particulièrement les changements de poids, l’apparence physique (poils très ébouriffés, posture anormale, yeux fermés) et le changement de comportement (vocalisations non-sollicitées, automutilation, animal très agité ou immobile, yeux fermés). En cas de signes de mal-être, la fréquence d’observation passera à 2 fois par jour. En cas de persistance au-delà de 48h, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
Les objectifs de ce projet étant de déterminer l’impact de l’exposition prénatale à une atmosphère polluée sur le développement cérébral et le comportement, incluant des profils cognitifs individuels et des comportements intégratifs, le niveau d’analyse requis n’est envisageable que chez des animaux possédant un niveau d'intégration cognitif suffisant qui ne peuvent être remplacés par des modélisations informatiques ou des espèces autres que les mammifères. Nous étudierons le comportement des animaux à partir de l'adolescence (à partir de 30 jours post-natal) et jusqu'à l’âge adulte (>P90), car c'est une période clé du développement cérébral pour des manifestations phénotypique caractéristiques des troubles du spectre autistique ou de la schizophrénie (troubles cognitifs, de la communication et des interactions sociales). Nous étudierons également les animaux au cours du vieillissement, car l'exposition précoce à la pollution atmosphériqu a été associée chez l'homme à l'apparition anticipée de marqueurs de vieillissement.