Recherche fondamentale

1 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'ablation du nerf vague, d'ablation ou de dénervation de la rate, puis, après trois semaines, des injections déclenchant une inflammation auto-immune de l'œil, suivie d'une imagerie quotidienne du fond d'œil sous anesthésie. Le porteur indique attendre une douleur post-opératoire et une inflammation oculaire réversible en 24 à 48 heures. Il affirme que ces mécanismes auto-immuns impliquent une interaction complexe de types cellulaires qui ne peut être étudiée qu'au sein d'un organisme entier.

Objectifs

Les maladies auto-immunes sont liées à l’activation du système immunitaire. De récentes avancées en neurosciences et en immunologie ont révélé que les réflexes neuronaux régulent le système immunitaire. L'activation du nerf vague atténue les maladies auto-immunes. Notre projet vise à étudier les mécanismes impliqués dans la régulation de la réponse autoimmune par le système nerveux via le nerf vague, en particulier dans l’uvéite une pathologie inflammatoire intraocculaire.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mieux comprendre le rôle du système nerveux dans le contrôle de la réponse autoimmune et permettra de mettre en évidence de potentielles cibles thérapeutiques chez l’Homme pour réguler l’inflammation en particulier dans l’œil.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie une seule fois : vagotomie (ablation du nerf vague) ou splénectomie (ablation de la rate) ou dénervation de la rate ou contrôle. Chacune des interventions dure 15 à 20 minutes par animal. Les animaux recevront des injections d’anesthésique et d’analgésie en pré et post opératoire. Après 3 semaines de récupération, les souris recevront sous anesthésie 1 fois 3 injections sous-cutanées pour induire une uvéite autoimmune expérimentale (EAU) (inflammation dans l’œil) active ou bien une injection intraveineuse de lymphocytes T pour induire une EAU passive. Chaque injection se fait sous anesthésie en moins d’une minute. La rétine sera évaluée par imagerie du fond d’œil tous les jours pendant 1 à 2 semaines et par Tomographie à Cohérence Optique 1 ou 2 fois par animal (actes non invasifs mais sous anesthésie volatile pour éviter tout mouvement de l’animal, durant environ 5 minute par animal). Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de parcours.

Impact sur les animaux

Pour les chirurgies : -Risque de mauvaise réaction à l’anesthésie (stress physique) -Stress thermique lié à l’anesthésie -Problème post-opératoire : lésion comme réouverture de la plaie (rare) et saignement (rare) -Douleur Pour les injections intraoculaires : -Risque d’inflammation localisée de l’œil réversible au bout de 24 à 48h après injection

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et que cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

Dans nos études nous nous intéressons aux mécanismes autoimmuns qui impliquent une interaction complexe de nombreux types cellulaires ne pouvant être étudiée qu’au sein d’un organisme entier car ne peut pas être reproduit en utilisant des cultures de cellules isolées provenant de différents tissus. Les études in vitro sur les animaux invertébrés ne permettent pas l’étude des signes cliniques de la pathologie de l’œil en particulier ; la souris est donc une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude.

Réduction

Nous prévoyons 1500 animaux pour réaliser cette étude. Nous avons limité au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables au regard de nos précédentes expériences d’autres projets de recherche (variabilité inter- animal/ inter - expériences). Le nombre de 10 animaux défini par groupe est le minimum requis pour obtenir des résultats interprétables et atteindre l’objectif scientifique défini dans ce projet, selon nos expériences antérieures.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe de 5 dans des cages ventilées avec enrichissement, alimentation et abreuvement à volonté. Les animaux en provenance de l’extérieur auront une période d'acclimatation de 5 jours avant expérimentation. Si nécessaire et en cas d'agressivité des mâles, les animaux seront séparés. Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation. Pour éviter toute souffrance ou détresse animale, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale lorsque nécessaire. Pour les expériences d’EAU (uvéite autoimmune expérimentale), des anesthésies gazeuses par inhalation seront établies pour chaque acte. La respiration de la souris sera surveillée et en cas de début de détresse respiratoire, le pourcentage d’anesthésique sera largement diminué jusqu’à la reprise d’une respiration normale. Il sera ensuite ajusté afin de n’être ni trop faible (réveil de la souris) ni trop fort (détresse respiratoire). Pour les chirurgies, les animaux bénéficieront d’une anesthésie. En prévention de la douleur, nous administrerons un analgésique le jour de la chirurgie ainsi que le lendemain. Un gel ophtalmologique est appliqué sur les yeux des animaux pour éviter l’assèchement de la cornée durant l'anesthésie. Application d’un antiseptique au niveau du champ opératoire. Pour éviter une hypothermie, l’opération se fait sur tapis chauffant à 37°C. Réveil en chambre thermostatée à 30°C. Les animaux ayant subi une chirurgie sont observés avec attention particulièrement les 3 premiers jours qui suivent la chirurgie par l’expérimentateur et par le personnel qualifié de l’animalerie. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Les animaux auront une période de récupération de 3 semaines entre la chirurgie et l’entrée en procédure d’induction d’uvéite.

Choix des espèces

Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour étudier la réponse inflammatoire participant de manière importante à la dégénérescence de la rétine. De plus, ce modèle offre l’avantage de multiples options pour les analyses. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines minimum à leur entrée dans la procédure expérimentale. C’est l’âge à partir duquel le système immunitaire et vasculaire de la souris est mature et donc à partir duquel elle est susceptible de développer la maladie.

8 babouins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis maintenus en vie. Quatre mères allaitantes subissent deux prélèvements de lait sous anesthésie, et leurs quatre nouveau-nés deux prélèvements de selles ou un écouvillon anal, chaque binôme mère-petit étant isolé de son groupe pendant 24 à 36 heures. Le porteur mentionne le stress de la capture, le risque de blessure du nouveau-né et les effets de l'anesthésie de la mère sur les soins au petit. Il présente le projet dans une perspective de médecine évolutive comparant le lait humain à celui d'autres primates, et affirme qu'il n'existe pas de banque d'échantillons de lait de primates non humains.

Objectifs

Les bénéfices de l’allaitement maternel pour la santé du nouveau-né sont aujourd’hui largement admis dans la communauté scientifique : ce type d’alimentation précoce permet notamment de protéger le nouveau-né des infections gastro-intestinales, des infections respiratoires et des affections allergiques. A long terme, l’allaitement maternel serait associé à une réduction des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, de l’obésité et du diabète. La compréhension des mécanismes protecteurs générés par l’allaitement maternel représente donc un enjeu de santé publique. La composition du lait revêt une grande importance dans le développement de l’enfant. Deux types de composant semblent être déterminants dans le lait humain : les saccharides et les lipides. Les saccharides jouent un rôle dans la constitution du microbiote intestinal par l’intermédiaire des HMO (Human Milk Oligosaccharride) tandis que les lipides permettraient de soutenir la croissance cérébrale de l’enfant. Les raisons pour lesquelles les HMO sont présents dans le lait maternel humain sont encore l’objet de nombreuses recherches et constituent l’un des objectifs de notre travail. Il existe plus de 200 HMO répartis en 13 familles. Au sein de ces 13 familles, on distingue les oligosaccharides de type I et II. L’activité prébiotique et antimicrobienne des HMO de type I suggèrent qu’ils jouent un rôle dans la protection du tube digestif contre le risque infectieux notamment par le fait qu’ils aient présélectionné la présence des bifidobactéries qui ont un rôle majeur dans la défense contre les bactéries pathogènes. La prédominance d’HMO de type I n’est pas observée chez les PNH mais les études sur le lait de PNH sont peu nombreuses. Nous souhaitons rechercher dans le lait maternel et les selles de juvéniles de PNH la présence de composants différents de l’Homme moderne. Pour apprécier ce qui fait la spécificité du lait humain, il faut rechercher ce qui le distingue des autres primates. Les saccharides et les lipides sont bien identifiés chez les humains modernes. Néanmoins, s’agit-il de spécificités propres aux humains ? Si oui, se sont-elles mises en place au cours de notre évolution, et à quel moment ? Ce travail de recherche est donc réalisé dans une perspective de médecine évolutive et a pour ambition de mieux comprendre l’origine des spécificités du lait des humains modernes.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons savoir si le comportement d’apprentissage de l’allaitement est effectivement une caractéristique propre à l’Homme, ou bien s’il est aussi présent chez d’autres primates et faisons l’hypothèse que la qualité de l’allaitement est corrélée à une amélioration de l’expérience maternelle. Ce travail a pour objectif d’améliorer la compréhension de la spécificité du lait humain dans une perspective de médecine évolutive. L’analyse des HMO et des lipides de babouins permettra de mieux comprendre quels lipides et quels HMO sont spécifiquement humains. C’est par une compréhension à une plus large échelle (celles de l’ordre des primates) qu’il sera possible d’appréhender toutes les spécificités du lait humain au sein de notre espèce, puis de saisir en quoi cette spécificité contribue à protéger l’état de santé du nouveau-né, et à long terme, celui de l’adulte.

Procédures

Les 4 mères allaitantes seront soumises à 2 prélèvements de lait maternel sous anesthésie (à J10-15 post partum et 3 mois post partum). Chaque anesthésie devrait durer entre 20 minutes et 1 heure maximum, le prélèvement devrait durer entre 5 et 20 minutes. Les 4 nouveaux nés seront soumis à 2 prélèvements de selles chacun (à J10-15 et 3 mois de vie). Ces prélèvements seront réalisés vigiles lors de l’anesthésie de la mère : soit le petit émet des selles naturellement et celle-ci sont collectées, soit un écouvillon des marges anales est réalisé en fin d’anesthésie de la mère s’il n’a pas fait de selles. Cet écouvillon est réalisé vigile, le petit étant accroché à sa mère la queue est juste relevée. Ces prélèvements seront réalisés en moins de 5 minutes. Les binômes d’animaux ne seront isolés de leur groupe d’origine que transitoirement (24h à 36h maximum).

Impact sur les animaux

Stress lors de la capture et risque de blessure du nouveau-né. Isolement transitoire du groupe d’origine (par binôme). Anesthésie de la mère. Réveil de la mère et effets de l’anesthésie sur les soins prodigués au nouveau né.

Devenir

Tous les animaux seront maintenus en vie car les prélèvements ne sont pas invasifs ni douloureux.

Remplacement

Il s’agit d’une étude comparative : par définition celle-ci compare des résultats obtenus chez l’humain à ceux obtenus chez d’autres espèces existantes. Il n’est pas possible d’utiliser cette approche expérimentale sans avoir recours à des animaux. De plus la lactation est un phénomène tissulaire complexe qui ne peut pas être étudié fonctionnellement sur des cellules en culture et il n’existe pas de banque d’échantillons de lait provenant de primates non humains. Enfin, nous allons rapprocher l’analyse du microbiote intestinal du nouveau-né de la composition du lait maternel, ce qui nécessite des prélèvements simultanés chez les deux individus.

Réduction

Les analyses statistiques demandent au moins n= 3, nous limitons donc le nombre d'individus sélectionné à 8 : 4 mères et 4 nouveaux-nés. Les 4 mères sont réutilisées de projets antérieurs. Etant donné le faible effectif considéré, nous choisirons de réaliser des tests de comparaison adaptés aux petits échantillons (test de Mann-Whitney, test de Wilcoxon)

Raffinement

Les animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires...), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises...). Ce programme est supervisé par le responsables du bien-être animal et validé par la structure en charge du bien-être animal. Concernant la capture, elle est toujours réalisée en privilégiant une méthode sans contention (ni chimique, ni physique). Elle consiste d’abord à isoler l’animal lors de son passage dans le tunnel de son hébergement. Une fois isolé dans le tunnel, l’animal est transféré dans une boite de transport accolée au tunnel puis transféré dans une zone d’isolement temporaire avec une cage à fond amovible. Les prélèvements de lait seront réalisés sous anesthésie. Pendant toute l’anesthésie les individus seront surveillés et monitorés par les vétérinaires. Lors de l’anesthésie les nouveaux-nés seront laissés accrochés à leurs mères afin de réduire le stress qui serait lié à la séparation. Les animaux seront réintroduits dans leurs groupes sociaux suivant la procédure validée par la structure du bien-être animal puis suivis quotidiennement pendant 1 semaine, une grille spécifique de suivi des nouveaux nés sera utilisée.

Choix des espèces

Les primates non humains peuvent par leur proximité phylogénétique avec les primates humains constituer un modèle approprié aux études sur l’évolution de l’Homme. Par leur proximité phylogénétique le lait maternel de primates non humains est ce qui se rapproche le plus du lait maternel humain. Les Papio anubis représentent une espèce idéale car ils ont un cycle reproductif rapide. De plus, cette espèce n’a pas encore fait l'objet d’investigation sur le profil glucidique (proportion et type de saccharides) et sur le profil lipidique du lait (proportion de triacylglycérides et de phospholipides, d’AGPI notamment DHA). L'étude nécessitant des échantillons de lait maternel et de selles de juvéniles, les animaux sélectionnés seront des adultes en âge de procréer avec leur descendance et plus précisément 4 femelles adultes allaitantes avec leur nouveau né.

58 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris Tau22, modifiées pour développer une pathologie de type Alzheimer, subissent une biopsie de la queue pour génotypage, une injection intracérébrale de vecteur de thérapie génique sous anesthésie, puis des tests de mémoire de reconnaissance d'objet et de labyrinthe en Y avant l'euthanasie et le prélèvement des tissus. Le porteur nomme les tests comportementaux et les qualifie de non invasifs, et indique que la chirurgie peut provoquer, rarement, infection ou convulsions. Il justifie l'euthanasie par le fait que ces animaux transgéniques ne peuvent être replacés ou relâchés.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est une pathologie qui se caractérise par des troubles de la mémoire et par une perte progressive des facultés cognitives. Le processus de la maladie débute avec l’accumulation d’agrégats toxiques dans le cerveau. En particulier, la mort des cellules nerveuses est due à une accumulation de protéines toxiques. À ce jour, les traitements sont donnés aux patients à des stades trop avancés de la maladie. Il est donc important de développer des approches thérapeutiques qui peuvent agir plus tôt dans le processus de la pathogenèse et en particulier qui peuvent favoriser l’élimination de ces agrégats toxiques. En ce sens, le projet vise à étudier l'action de la protéine «protectrice» dans la maladie d'Alzheimer. Des résultats préliminaires indiquent qu’un variant naturel de cette protéine en question s'est avérée très efficace pour éliminer les agrégats toxiques dans les cellules neuronales. Avec ce projet nous envisageons de démontrer que ce variant présent dans une partie de la population ralentit l’avancée de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet pourra démontrer pour le première fois, l'efficacité d’une protéine à dégrader des agrégats toxiques dans le cerveau de souris utilisé comme modèle de la maladie d’Alzheimer. Il pourra déboucher à terme sur des avancées thérapeutiques utiles pour l’homme.

Procédures

Les animaux Tau22 hétérozygotes auront été génotypés par PCR suite à une biopsie de la queue. Les animaux seront soumis à des anesthésies (1 fois pendant 30 min) puis à une procédure chirurgicale d’injection intracérébrale d’un vecteur de thérapie génique (1 fois, durée d’environ 25-30 minutes). A l’âge de 9 mois, ils seront soumis à des tests de comportements non invasifs afin de tester leur mémoire. Les différents tests seront réalisés une fois par animal et seront réalisés les uns à la suite des autres (test de reconnaissance de l’objet puis le Y-Maze), avec un temps de pause entre chaque d'au moins une semaine afin de limiter le stress éventuel des animaux. Aucun test comportemental réalisé ne peut être considéré comme invasif. Toutefois, une attention particulière sera accordée à chaque animal lors de chaque expérimentation. Les males seront testés en premier (ex en matinée) afin d’éviter toute attirance par le passage des femelles dans le support de test, ce qui pourrait biaiser l’interprétation. Les femelles du groupe seront ensuite testées dans l’après-midi qui suit le test des males. Il faudra compter 30 minutes / individu par test.

Impact sur les animaux

Une partie des animaux développera selon leur génotype des lésions histologiques qui entraînent des perturbations de la mémoire à partir de 6 à 9 mois. Les animaux de génotype mutant auront une moins bonne performance d’apprentissage. Les animaux subiront une chirurgie qui peut dans de très rare cas et malgré les mesures d’asepsie entraîner une infection au site chirurgical, avec des complications telles que douleur et inflammation. Il n’est pas attendu de problèmes neurologiques liés au modèle, ni aux injections dans le cerveau, néanmoins des troubles neurologiques (ataxie et convulsion) pourraient survenir de façon accidentelle suite à l’injection dans le cerveau. La manipulation des animaux pour les tests de comportement peut engendrer un stress. Les biopsies pour le génotypage entraîneront une douleur.

Devenir

Mort (tous les animaux). Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. En effet, ces animaux Tau22 hétérozygotes souffrent de la pathologie d’Alzheimer, une maladie qui est accompagnée de déficits de mémoire qui pourraient s’aggraver davantage avec l’âge. Les animaux seront donc mis à mort en fin de procédure (âgés de 9 mois) pour prélèvement des tissus désirés.

Remplacement

A l’heure actuelle il n’est pas possible de reproduire les déficits d’apprentissage retrouvés chez les patients Alzheimer sans recourir à l’expérimentation in vivo. Des premières expériences sur cultures cellulaires de type neuronales ont permis de démontrer l'effet bénéfique de la protéine étudiée sur la réduction des agrégats toxiques. Les expériences chez la souris seront le complément nécessaire de ce travail. Cette évaluation garantira l'efficacité et la sécurité avant de passer aux essais sur l'homme.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité au strict nécessaire par une gestion appropriée des plannings de reproduction et des accouplements réalisés afin de maximiser la production du génotype utile. Le nombre d'animaux qui sera utilisé pour évaluer le rôle de la protéine étudiée en tant que stimulateur de d’agrégats toxiques dans les neurones est un nombre utile pour cette tâche. Les procédures expérimentales ont été choisies pour obtenir des résultats statistiquement valides avec le plus petit nombre d'animaux, sans pour autant sacrifier la portée scientifique du projet. Pour atteindre cet objectif, nous travaillerons à augmenter la puissance statistique de nos expériences et en même temps à réduire au minimum les animaux utilisés au cours de l'étude en : 1) lorsque l'animal sera mis à mort, nous prélèverons le cerveau afin d'extrapoler toutes les informations et données possibles à partir du nombre minimum d'animaux. Bien que l'étude in vitro soit une stratégie valable pour réduire le nombre d'animaux, il est important de ne pas oublier les limites de cette approche. Si l'utilisation de cultures cellulaires peut donner des informations utiles d'un point de vue mécaniste, l'étude in vivo implique un animal dans son intégralité et peut donc fournir des informations imprévisibles (effets indésirables/inattendus) en ce qui concerne à une étude impliquant uniquement l'utilisation de cultures cellulaires. Toutes les procédures expérimentales seront menées par du personnel hautement qualifié dans un environnement contrôlé afin de minimiser les erreurs aléatoires. Le nombre d'animaux qui seront inclus dans chaque groupe a été défini sur la base de l'analyse statistique décrite dans la littérature et le nombre d'animaux nécessaires pour l'étude a été déterminé avec des outils statistiques. Enfin, notre collaborateur a procédé à la cryoconservation de cette lignée transgénique, ce qui permettra de ne pas maintenir les animaux qui n’entreront plus dans le cadre des expériences en cours pendant plus de 12 mois.

Raffinement

Les animaux seront mis à mort selon des méthodes conformes à la recommandation de la Commission européenne chaque fois que des souffrances sont visibles chez l'animal (déshydratation, impossibilité de mouvement). Afin d’éviter que l’animal se blesse, avant qu’il ne se réveille, nous couperons la pointe des griffes avec un petit ciseau ou coupe-griffe. À la fin de la chirurgie, les animaux seront réchauffés selon une méthode appropriée dans l’animalerie Ils seront surveillés périodiquement jusqu'à leur réveil. Dans les jours suivant l'intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés afin de vérifier la récupération complète des fonctions physiologiques de base (urine et nutrition). Au réveil complet et pendant les 12-20 heures suivantes (dans la mesure du possible dès leur réveil, dès que les animaux auront repris leur activitées physiologiques (urine, alimentation), afin d'éviter des dommages accidentels par les congénères, l'animal sera logé individuellement avec de la nourriture humide répartie uniformément dans la cage pour faciliter son accès. Apres cela, les souris seront remises dans leur cage pré-chirurgie.

Choix des espèces

La maladie d’Alzheimer (MA) est une pathologie qui apparaît tardivement, insidieusement, mais progressivement et irréversiblement. Elle va détruire petit à petit les neurones de l’hippocampe qui gèrent la mémoire. La lignée de souris utilisée dans cette étude reproduit ces caractéristiques de la maladie humaine. En particulier ces animaux, à 9 mois, subissent une perte de mémoire qui est accompagnée de la mort neuronale dans une région ciblée du cerveau. L’injection du vecteur pour l’expression de notre protéine d’intérêt sera réalisée à 3 mois, avant le développement des symptômes liés à l’âge, pour tester un effet protecteur de cette protéine. Choix de l’espèce : l’introduction de la protéine Tau mutée chez la souris constitue une approche directe afin de mimer la maladie d’Alzheimer et notamment la parte de mémoire liée à cette pathologie. Les génomes murins et humains étant relativement proches dans leur structure, la souris est l’animal de choix pour ce type d’approche.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour exprimer le récepteur humain ACE2, elles sont infectées par le SARS-CoV-2 par voie nasale ou intraveineuse, reçoivent des injections intrapéritonéales et subissent des prélèvements de sang au sinus rétro-orbital, pour étudier les atteintes vasculaires de la Covid-19. Le porteur indique que l'infection peut provoquer microthromboses, perte de poids de 10 à 20 pour cent et anomalies de comportement, les souris perdant plus de 20 pour cent de leur poids étant mises à mort. Il présente les retombées thérapeutiques comme des pistes et reconnaît utiliser en parallèle des cultures de cellules humaines, tout en affirmant que l'étude ne peut être menée sans administration du virus à l'animal vivant.

Objectifs

La COVID-19 est une maladie virale aiguë causée par le coronavirus de type 2 du syndrome aigu respiratoire sévère (SARS-CoV-2). Le premier site d'infection chez les patients atteints de la COVID-19 est l'appareil respiratoire. Le SARS-CoV-2 infecte les cellules de la muqueuse nasale en se liant à une enzyme appelée ACE2. Outre le poumon, une atteinte multi-organes a été décrite dans les formes graves de la COVID-19, témoignant d’une diffusion du virus dans l’ensemble de l’organisme. Les examens anatomiques après le décès des patients atteints de la COVID-19 ont mis en évidence une atteinte isolée ou prédominante des cellules endothéliales (cellules qui tapissent l’intérieur des vaisseaux en contact avec le sang). Cette atteinte se caractérise par l’apparition de petits caillots sanguins, perturbant l’apport sanguin dans les tissus en aval. Bien que mal comprises, ces observations impliquent fortement les cellules endothéliales dans les atteintes multi-organes sévères de la COVID-19. Plusieurs études scientifiques attestent de la pertinence et de l’intérêt des modèles rongeurs pour l’étude de l’infection SARS-CoV-2, la compréhension des mécanismes responsables de la COVID-19 et l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques. La souris n’est naturellement pas sensible à l’infection SARS-CoV-2 car l’ACE2 murine ne reconnait pas le SARS-CoV-2. Afin d’étudier l’infection SARS-CoV-2 chez la souris, un modèle murin de souris humanisée pour l’ACE2 humaine a été développé permettant d’exprimer l’ACE2 humaine en lieu et place de l’ACE2 murine dans un tissu que nous choisissons. Deux modèles de souris transgéniques ACE2 humanisées ont ainsi été générées : 1. une souris humanisée exprimant l’ACE2 humaine dans toutes les cellules de l’organisme et 2. une souris humanisée exprimant l’ACE2 humaine uniquement dans les cellules endothéliales vasculaires de la souris. En utilisant ces deux modèles, notre projet a pour objectifs : 1) d’établir les conditions expérimentales de l’infection au SARS-CoV-2 en utilisant des doses croissantes de virus à court terme, 2) de caractériser les atteintes des petits et gros vaisseaux par le SARS-CoV-2 à long terme, et 3) d’évaluer l’efficacité d’un traitement visant à diminuer les atteintes vasculaires liées à l’infection SARS-CoV-2 à long terme.

Bénéfices attendus

L’étude chez le rongeur des infections à SARS-CoV-2 est déterminante pour l’élaboration de stratégies de lutte contre la COVID-19 et de ses formes graves. Ce projet s’inscrit dans une démarche de sciences appliquées au domaine médical en lien avec les déclarations d’intérêt d’urgence et de priorité nationale du gouvernement et des organismes publiques de recherche en regard de la pandémie mondiale de la COVID-19. Ce travail offrira une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels l’infection SARS-CoV-2 altère la fonction endothéliale, conduit à une atteinte vasculaire multi-organes et offrira de nouvelles pistes de traitements pour lutter contre les atteintes vasculaires graves de l’infection SARS-CoV-2.

Procédures

Pour la réalisation des infections virales, les animaux seront anesthesiés sous anesthesie générale et soumis à des injections intranasales ou intraveineuses du SARS-CoV-2. Les administrations des molécules pharmacologiques à visée thérapeutique seront réalisées par voie intrapéritonéale chez la souris vigile. Les prélèvements sanguins seront réalisés au sinus rétroorbital sous anesthésie générale et collyre anesthésique. La durée de chaque intervention décrite est inférieure à 1 minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont les suivants : 1. Anesthésie à l'isoflurane pour l'infection SARS-CoV2 (variant français du Wuah, D614G ou variant Omicron B.1.1.529) = stress léger de la contention et de l'anesthésie (dont le reveil) 2. Administration du virus par voie intranasale = stress et inconfort légers de l'animal 3. Administration du virus par voie intraveineuse = stress et douleur légère de la piqure de l'aiguille 4. Prélèvement de sang au niveau du sinus rétro-orbital de l'animal anesthésié sous isoflurane = stress léger de la contention et de l'anesthésie (dont le réveil), douleur légère possible au reveil 5. Atteintes macro- et micro-vasculaire du SARS-CoV-2 = douleur legère à modérée notamment en cas de microthrombose vasculaire et d'altérations locales de l'apport sanguin pouvant conduire à une perte de poids (de 10 à 20%), une altération de l'apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé, paupière fermée, posture anormale) ou un comportement anormal (mobilité réduite, agressivité) de l'animal.

Devenir

La mise à mort des animaux à la fin de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques et moléculaires nécessaires pour atteindre les objectifs de notre étude.

Remplacement

L’étude de l’infection SARS-CoV-2 ne peut être menée sans avoir recours à l’administration du virus à l’animal vivant. De plus notre projet s’intéresse à l'évolution des atteintes tissulaires sur le long terme (2 mois post-infection) de la COVID-19 et aux variations de sensibilité de l’infection SARS-CoV-2 avec l’âge (souris jeunes vs âgées) qui ne peuvent être mimées in vitro. En revanche, des résultats préliminaires de notre laboratoire montrent que le récepteur ACE2 (porte d'entrée du virus dans l'organisme) est fortement exprimé à la surface des cellules endothéliales qui bordent l'intérieur des vaisseaux à l'échelle des petits et des gros vaisseaux chez la souris. La culture cellulaire de cellules endothéliales humaines restera un outil que nous utiliserons au cours de ce projet pour des tests viraux et fonctionnels préliminaires et complémentaires à l’utilisation des souris.

Réduction

Dans le but de suivre le principe des 3R et de réduire l’utilisation excessive d’animaux, le nombre d’animaux par groupe a été calculé sur la base de notre expérience acquise précédemment et de protocoles publiés. Un des enjeux est de pouvoir obtenir suffisamment de matériels biologiques pour réaliser l’ensemble des analyses prévues. Dans notre expérience, des groupes infectés de 6 animaux pour les études virologiques à court terme et de 10 animaux pour les études histologiques et moléculaires à long terme sont suffisants pour répondre à nos questions scientifiques. De le même façon, un nombre d’animaux de n=4 est amplement suffisant pour les groupes non infectés contrôles.

Raffinement

Pour minimiser le stress des animaux, l'inoculation intranasale ou intraveineuse du virus sera réalisée sur des souris anesthésiées. Après l'infection, une surveillance quotidienne effectuée par une personne compétente sur le projet nous permet de savoir si un animal souffre et ainsi de pouvoir envisager une mort anticipée. La mort anticipée sera envisagée sur l'animal a une perte de poids de plus de 20% et présente également une altération de son apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé, paupière fermée, posture anormale) et/ou un comportement anomal (mobilité réduite, agressivité). Dans notre expérience, passées les premières 72h post-infection, il est rare d’observer des signes de souffrance chez l’animal.

Choix des espèces

La souris a l’avantage indéniable de permettre l’utilisation de lignées génétiquement modifiées afin d'identifier les mécanismes responsables des effets délétères de l’infection SARS-CoV-2. Elle constitue également un outil essentiel pour la recherche par sa facilité de manipulation, sa petite taille et ses cycles de reproduction courts. Les souris transgéniques humanisées pour l'ACE2 humaine développées pour ce projet seront sensibles à l’infection SARS-CoV-2 du fait de l’expression du récepteur humain du SARS-CoV-2 et permettront de mieux comprendre les atteintes vasculaires multi-organes de l’infection SARS-CoV-2. Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris mâles agées de 6 semaines ou de 8 mois pour répondre à la question de l’influence de l’âge sur le risque accru d’atteintes vasculaires de l’infection SARS-CoV-2.

108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'un anti-inflammatoire et d'un inducteur de mutation, sont soumises à des tests d'effort sur tapis roulant jusqu'à l'épuisement et à des périodes d'isolement en cage métabolique pouvant provoquer perte de poids et détresse, pour étudier la fonte musculaire liée aux traitements anti-inflammatoires et au vieillissement. Le porteur reconnaît que l'isolement est stressant mais le juge obligatoire pour mesurer l'activité de chaque souris. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut créer des fibres musculaires adultes et conclut que l'étude ne peut être conduite qu'in vivo.

Objectifs

Le projet se propose de mettre en évidence les mécanismes cellulaires impliqués dans les pertes de masse et de fonctions musculaires induites par les traitements aux antiinflammatoires et le vieillissement ainsi que les mécanismes de protection induit par l’activité physique (endurance et résistance). Le muscle squelettique est composé de fibres à contraction lente, peu fortes et résistantes à la fatigue et des fibres de types rapide, très forte et très fatigables. Basés sur la littérature nous faisons l’hypothèse que : i) les fibres rapides sont plus sensibles à l’atrophie et résistantes à l’hypertrophie , ii) que la sédentarité est un facteur aggravant la perte de masse musculaire, iii) inversement, l’entraînement d’endurance protégerait le muscle de la perte de masse musculairet et favoriserait l’hypertrophie , iiii) une souris génétiquement modifiée qui possède des caractéristiques de souris entraînées va être moins vulnérable face à la perte de masse musculaire et plus sensible à l’hypertrophie induite par les efforts de force et de résistance. Nous proposons ensuite de décrire les mécanismes moléculaires . Nous étudierons également l’effet de l’activité et de la sédentarité exacerbée sur l’atrophie des fibres rapides et la mort des neurones moteurs au cours de la perte de masse musculaire liée à l'âge.

Bénéfices attendus

Ce projet aura pour but de mettre en évidence les mécanismes mis en jeu dans la prévention du déconditionnement musculaire induit par un traitement anti-inflammatoire très utilisé chez l’homme. En effet il est connu que le déconditionnement musculaire peut être un facteur d’aggravation de certaines pathologies, ainsi la compréhension des mécanismes de déconditionnement musculaire est de nos jours d’un intérêt socio-économique très important. C'est la raison pour laquelle ce projet est financé en partie par L'Assication Française contre les myopathies. D’autres parts ce projet permettra de mettre en évidence des mécanismes expliquant la mort spécifique des fibres musculaire de type II (permettant les contractions rapides) lors du vieillissement.

Procédures

Les souris subiront les injections de l'inducteur de la mutation génétique et de l'antiinflammatoire. Une contention courte sera effectuée lors de la mise en évidence du rapport de masse maigre/masse grasse par IRM. Les animaux seront soumis à un isolement durant leur entraînement et lors de l’analyse métabolique. L'analyse métabolique n’induit pas de douleur à l’animal, elle ne nécessite pas de médicamentation. Elle est non invasive pour l’animal et limite au maximum le stress de l’animal. Les animaux seront monitorés et pesés: 3 fois/ semaine (2 minutes/animal) lors de l'individualisation, puis 1 fois à l'entrée et à la sortie des cages calorimétriques. Leur composition corporelle analysée (3 minutes/animal) de manière non invasive 1 fois au début de l'individualisation puis à l'entrée et à la sortie des cages calorimétriques.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances vont être : le test de capacités fonctionnelles sur les tapis et l’isolement dans les cages métaboliques qui pourraient engendrer du stress chez les animaux, l’injection intra-péritonéale de l'anti-inflammatoire. Les effets indésirables pour le test d’activité sur tapis roulant peuvent être: l’épuisement de l’animal, une blessure à la patte. Les effets indésirables de l’isolement peuvent être: la perte de poids et la détresse. Les effets indésirables du traitement avec l'anti-inflammatoire sont les modifications de poids et de comportement, ces derniers seront vérifiés tous les jours lors du traitement à l'antiinflammatoire qui sera arrèté si un changement important de comportement est observé. Les animaux seront soumis à un isolement. L’analyse métabolique n’induit pas de douleur à l’animal, elle ne nécessite pas de médicamentation. Elle est non invasive pour l’animal et limite au maximum le stress de l’animal. Aucun prélèvement n'auront lieu sur animal vigile.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Nous avons besoin de réaliser des expériences dans un modèle de souris où un gène d’intérêt pour le contrôle génétique de l'expression des différents types de fibres musculaires a été invalidé. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude des effets dépendant du type de fibre musculaire. En effet aucun modèle in vitro à ce jour peut créer des fibres musculaires adultes compte tenu que la formations fibres sont dépendantes des autres cellules de l'organiqme.

Réduction

Les tests statistiques utilisés dans ce projet seront choisis afin de mettre en évidence les effets de l'activité par rapport à la sédentarité ou bien les effets de la modification génétique du type de fibres afin de contrer les effets des anti-inflammatoires. Ensuite chacun des sous groupes seront comparés deux à deux. Les différences seront considérées comme significatives pour une valeur de p

Raffinement

Les animaux isolés en cages métaboliques ou durant la période de 8 semaines d'entraînement auront pour enrichissement la présence de roues dans les cages. L'isolement est obligatoire pour notre expérience car nous devons être sûrs de mesurer l'activité de chaque souris. La période de familiarisation au tapis de course permettra réduire le stress des animaux lors des tests. Lors de l'exercice les souris seront en permanence sous la surveillance de l'expérimentateur qui arrêtera le tapis lorsque la souris se laisse emporter par le tapis trois fois de suite et ne peut plus le remonter. Le tapis sera arrêter si la souris semble gênée dans sa course et qu'elle semble s'être blessée à la patte. Par expérience avec ce tapis de course nous n'avons jamais vu de blessure, cependant dans le cas où cela arriverait elle sera soignée avec de la bétadine et recommencera le test une fois la blessure cicatrisée ou bien retirée du protocole. La déxaméthasone induit une perte de masse musculaire et donc une perte de poids qui est l'effet escompté. Les souris seront réunies par cages de 4 après l'activité pour le traitement à l'anti-inflammatoire afin de ne plus subir l'isolement car il n'est plus nécessaire pour ces expériences. L’enrichissement consistera à placer des nids végétaux, des maisonnettes et bâtonnets à ronger dans les cages. Le comportement général des animaux sera suivi.

Choix des espèces

L’atrophie musculaire induite par les antiinflammatoires et l'adaptation à l'exercice d'endurance (présentes chez l’homme) sont bien démontrées dans le modèle souris. La souris modifiée génétiquement , choisie pour cette étude, est connue pour mimer naturellement en partie les caractéristiques musculaires liées à un entraînement d'endurance. Leur utilisation nous permettra de mieux comprendre les effets de l'activité physique sur la réponse aux traitements aux antiinflammatoires. Les animaux sont utilisés au stade adulte (8 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. En effet, il a été démontré que chez la souris la structure musculaire adulte est observée dans les 7 à 8 semaines après la naissance. D'autre part, des souris âgées (24 mois) seront utilisées dans un deuxième temps. Il a été montré qu’à cet âge les mécanismes induisant le dysfonctionnement musculaire.