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Seconde administration de vecteur AAV pour pallier à une perte d’efficacité suite à une thérapie génique de la myopathie myotubulaire chez le rat
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1 224 rats vont être utilisé·es, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des injections intraveineuses d'un vecteur AAV et des prélèvements sanguins répétés à la veine mandibulaire ou caudale toutes les trois semaines jusqu'à l'euthanasie, pour tester une seconde administration de thérapie génique contre la myopathie myotubulaire. Le porteur indique que les mâles malades développent une faiblesse musculaire généralisée qui gêne leur déplacement et leur accès à la nourriture, et que tous les animaux sont euthanasiés pour prélever leurs tissus. Il affirme que le recours aux animaux est "indispensable" car les modèles cellulaires ne reproduisent pas la perte de force musculaire, et retient le rat pour sa réponse immunitaire jugée proche de celle de l'humain.
Objectifs
Il n’existe aucun traitement disponible pour la myopathie myotubulaire lié au chromosome X, une maladie congénitale sévère affectant les garçons et entrainant la mort prématurée avant un an. Cette maladie est due à des mutations dans le gène MTM1, codant pour la myotubularine. Sa déficience implique une diminution de la taille des muscles et une faiblesse musculaire généralisées entrainant une faiblesse respiratoire. Dans un essai clinique en cours, un vecteur AAV (dérivé d’un virus associé à un adénovirus), utilisé comme transporteur pour introduire le gène MTM1 dans les muscles des patients, est injecté par voie intraveineuse. L’espérance de vie étant faible, les patients doivent être traités dans les premiers mois voire premières années de vie. Leurs muscles vont alors se développer avec de nouvelles cellules qui n’auront pas été traitées par l’AAV. Il y a un risque de dilution de la protéine MTM1 et donc de diminution de l’efficacité de la thérapie dans le temps. Pour des raisons immunitaires, il n’est pas possible actuellement de réinjecter le même vecteur de thérapie génique. Récemment, nous avons identifié un nouveau vecteur AAV qui ne génère pas la même réponse immune que les AAV couramment utilisés pour traiter les maladies neuromusculaires en préclinique et clinique. Ce vecteur pourrait donc être utilisé pour une réinjection. Dans ce projet, nous testerons cette réinjection dans un modèle de rat de la myopathie myotubulaire qui reproduit avec fidélité les caractéristiques pathologiques que l’on retrouve chez l’Homme. Plusieurs associations de vecteurs AAV seront testées avec une première injection d’un vecteur dès l’apparition des premiers symptômes, puis une deuxième injection avec un autre vecteur à un stade plus tardif. Nous étudierons la réponse des anticorps et des cellules immunitaires suite à la première et à la deuxième injection. Nous évaluerons également la plus-value d’une ré-administration du gène MTM1 par rapport à une seule injection, dans le contexte d’une perte d’efficacité d’un premier traitement chez des rats malades de la myopathie myotubulaire.
Bénéfices attendus
Cette étude permettrait de proposer une solution à la perte d’efficacité d’un traitement dans le temps. En effet, la meilleure combinaison de deux vecteurs AAV permettrait de traiter les patients à un âge précoce avec un premier vecteur, et de réadministrer ce traitement avec un autre vecteur à un âge plus tardif si nécessaire, à l’adolescence par exemple. De plus, les bénéfices attendues dans ce projet pourraient s’étendre à d’autres pathologies neuromusculaires telles que la myopathie de Duchenne ou toute autre myopathie ou dystrophie touchant les muscles dans les premières années de vie. Si toutefois cette étude ne permettait pas de mettre en avant les bénéfices d’une ré-administration, ce travail permettrait de mieux comprendre les réponses immunes (production d’anticorps) générées par le vecteur nouvellement identifié, et proposer peut-être des alternatives pour réduire l’activation de ces anticorps qui empêchent l’efficacité d’une ré-injection d’AAV.
Procédures
Analyse sur animaux vivants anesthésiés avec injection intraveineuse: environ 20min par rats, 1 fois. Prélèvements de sang sur animaux vivants anesthésiés: environ 5 min par rats, 4 fois. Injections intraveineuses du traitement : environ 1 min par rat, 2 fois. Injection d’anesthésiques : environ 1min, 2 fois.
Impact sur les animaux
Les nuisances que ce modèle peut rencontrer sont liées au fait qu’il n’exprime pas la protéine myotubularine. Les mâles malades développeront une faiblesse musculaire généralisée, ce qui rendra difficile leur déplacement et l’accès à la nourriture située dans la partie supérieure des cages. Les vecteurs AAVs seront appliqués par injection intraveineuse (qui provoquent une douleur légère). Le sang, environ 500µL, sera prélevé à partir de la veine mandibulaire ou caudale en fonction du poids, à partir de 6 semaines, toutes les 3 semaines jusqu’à l’euthanasie. L’analyse de l’efficacité de la deuxième injection se fera en partie après injections de deux anesthésiques et les rats recevront une injection intra-péritonéale d’un produit nécessaire à l’analyse. Les animaux seront euthanasiés par surdosage de deux anesthésiques en intra-péritonéale.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de pouvoir prélever des tissus qui nous permettront de démontrer l’efficacité des traitements (état du muscle, présence de la protéine dans le muscle, non toxicité sur certains organes…).
Remplacement
L’utilisation d’animaux est indispensable pour faire des preuves de concepts thérapeutiques, car les modèles cellulaires de la maladie ne permettent pas d’étudier les défauts liés à la fonction du muscle (perte de force non mesurable sur des modèles cellulaires, pas de remplacement possible), et ne permettent pas non plus d’étudier la répartition d’un vecteur dans les différents organes et la réponse immunitaire générée par celui-ci. A l’opposé, le modèle de rat qui sera utilisé dans ce projet reproduit la pathologie musculaire avec fidélité, ce qui permet de mesurer dans le temps et de façon prédictive de la clinique (c’est-à-dire chez l’Homme) l’efficacité des traitements sur l’ensemble des tissus, la distribution du vecteur dans les différents organes et muscles, et la réponse immunitaire. A noter que la réponse des cellules immunitaires et la production d’anticorps suite au traitement avec un vecteur AAV est plus similaire à l’Homme chez le rat que chez la souris d’où l’utilisation de ce modèle plutôt que le modèle souris.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque étape de ce projet a été défini à partir de tests statistiques permettant de déterminer le nombre minimal d’animaux pour observer des différences entre les animaux traités à deux reprises et ceux traités une seule fois. Pour l’ensemble du projet, des groupes d’animaux servant de contrôles sont nécessaires (animal non traité, animal traité une seule fois); les actes exercés sur ces groupes ont été déterminés de façon à ce que certains groupes contrôles puissent servir de contrôle à différentes étapes du projet, ce qui réduit le nombre d’animaux total. De plus, si au cours de l’étude, certaines associations de vecteurs ne permettent pas d’obtenir un bénéfice suite à la deuxième injection, certains contrôles ou certaines étapes ne seront pas réalisés avec ces vecteurs. De même, si aucune association de vecteurs ne permet une ré-administration efficace à la première étape, le projet ne poursuivra pas.
Raffinement
Des observations attentives et des mesures de poids seront effectuées 3 fois par semaine en plus de l’observation quotidienne des animaux. Afin de réduire la souffrance et le stress des animaux, des points limites ont été établis. En cas de dégradation de l’état général de l’animal, des soins seront administrés : désinfection locale, pansement de plaies cutanées, soins dentaires (la coupe des dents peut s’avérer nécessaire s’ils ne peuvent pas ronger) et oculaires ou euthanasie sont parfois nécessaires. Des conditions d'hébergement particulières leur seront appliquées afin de garantir leur survie dans de bonnes conditions. Les animaux malades recevront un aliment spécifique, plus riche en nutriments, hydratant et posé au sol pour pallier aux éventuels problèmes moteurs. Les rats étant des animaux sociaux, un rat ne sera jamais seul dans sa cage. En cours de protocole, pour prévenir la douleur provoquée par le prélèvement sanguin par voie mandibulaire, les animaux seront anesthésiés avec un anesthésiant gazeux.
Choix des espèces
Les rats ont été choisis comme animaux modèles pour trois raisons : 1) La réponse immune cellulaire que l’on souhaite observer est plus similaire à l’Homme chez le rat que chez la souris d’où l’utilisation de cette espèce plutôt que l’espèce murine. Par exemple, les lymphocytes T ne vont pas interagir de la même façon avec l’antigène (antigène de l’AAV par exemple) entre le rat et la souris, alors qu’il y a peu de différence entre l’Homme et le rat. 2) Ces animaux peuvent être modifiés génétiquement afin de présenter la délétion du gène d’intérêt. Un modèle de rat de la myopathie myotubulaire a été caractérisé et reproduit avec fidélité les signes cliniques caractéristiques de la maladie humaine, ce qui permet d’évaluer l’efficacité thérapeutique des traitements. 3) La gestation étant de 3 semaines, les animaux nécessaires peuvent être obtenus rapidement. Les rats mâles seront utilisés entre 3 et 4 semaines pour qu’ils soient sevrés et euthanasiés à 15 semaines. Les symptômes de la maladie apparaissent dès la troisième semaine de vie chez les rats Mtm1-KO, la première injection d’AAV vise à corriger en partie les symptômes de la myopathie myotubulaire : les animaux mâles porteurs de la mutation seront donc utilisés après l’apparition des premiers symptômes, en s’assurant que les points limites ne soient pas atteints.
Analyse des conséquences de mutations dans des gènes impliqués dans la stabilité du génome chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
404 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour des défauts de réparation de l'ADN, elles reçoivent des injections d'un agent myéloablatif, le 5-fluoro-uracile, avant mise à mort pour prélèvement d'organes. Le projet étudie les conséquences de ces mutations sur l'instabilité du génome et le développement de cancers, avec des pistes annoncées pour les téloméropathies. Le porteur indique réaliser une partie des analyses sur fibroblastes prélevés, et affirme que le reste ne peut s'étudier qu'in vivo sur "le mammifère in toto".
Objectifs
L’information génétique nécessaire au bon fonctionnement des organismes vivants est contenue dans les molécules d’ADN qui forment les chromosomes. Les télomères représentent des structures particulières situées aux extrémités des chromosomes qui protègent ces derniers de la dégradation et de la fusion, source d'instabilité génomique. De nombreux facteurs participent à la protection des télomères. Par ailleurs l’ADN fait constamment l’objet de dommages introduits soit secondairement à des fonctions physiologiques telles que la réplication, soit à la suite d’exposition à des agents génotoxiques de l’environnement tels que les rayonnements. Ces dommages sont très efficacement réparés pour éviter l’altération de l’intégrité du génome. Les défauts de réparation de l’ADN et de protection des télomères, notamment dans certaines maladies génétiques, conduisent à diverses pathologies telles que les déficits immunitaires, les téloméropathies ou les cancers. Nous générons des modèles murins d’altération des processus de protection des télomères et de réparation de l’ADN afin d’apprécier les conséquences du défaut de ces processus dans certaines maladies génétiques et dans le développement des cancers afin d’entrevoir de nouvelles solutions thérapeutiques pour ces maladies.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'apporter de nombreuses informations originales et fondamentales sur les conséquences fonctionnelles de certaines de ces mutations dans la stabilité des télomères, l'intégrité du génome, et leurs implications dans les téloméropathies. Les résultats obtenus devraient permettre d'ouvrir des pistes à des approches thérapeutiques chez les patients atteints de téloméropathies causées par ces mutations.
Procédures
Des injections intrapéritonéales contenant du 5 fluoro-uracile (5FU), un produit myéolablatif, seront effectuées. A la dose utilisée de 5FU, il n'y a pas d'effet indésirable globale de cette drogue. Une létalité embryonnaire peut exister lors de la gestation des animaux homozygotes.
Impact sur les animaux
Les animaux, du fait d'un défaut potentiel de la stabilité du génome peuvent présenter un défaut immunohématologique. Cependant leur maintien dans une zone EOPS devrait les préserver d'infections opportunistes. Par ailleurs l'injection de l'agent myéloablatif génère une légère douleur lors de l'injection intrapéritonéale et provoque un stress et réduit le nombre de cellules souches hématopoiétiques.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure pour prélèvement d'organes et analyses phénotypiques
Remplacement
Les questions scientifiques que nous posons ne peuvent être étudiées qu’in vivo ou ex vivo, sur des organes prélevés sur des souris. Il s’agit ici d’études sur le développement du système hématopoïétique qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère in toto. En effet, le développement du système hématopoiétique des mammifères et son fonctionnement ultérieur sont de mieux en mieux caractérisés chez la souris et aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de ces processus dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part. Les organoïdes permettant d'étudier l'hématopoïèse et en particulier la lymphopoïèse ne sont pas actuellement disponibles. De même les approches in silico ne permettent pas d'étudier m'impact de mutations sur l'hématopoïèse et la lymphopoïèse. En revanche l'analyse de la réparation de l'ADN et de la stabilité des télomères sera en grande partie réalisée dans des fibroblastes embryonnaires des différentes lignées murines ce qui permettra d'utiliser un nombre limité d'animaux.
Réduction
En se basant sur des test statistiques, nous réduiront au maximum le nombre d'animaux utilisés pour obtenir les résultats escomptés. Les tests statistiques faits a priori utiliserons le calcul de puissance. Les tests statistiques faits a posterori seront réalisés à l'aide d'un test non-paramétrique . Par ailleurs, de nombreux tests seront réalisés sur des fibroblastes obtenus de souris, permettant une étude in vitro de nombreux paramètres et ainsi réduisant le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront observés de façon hebdomadaire par le personnel compétent de l'animalerie. Les cages disposent par ailleurs de matériel d'enrichissement (bouts de coton, tunnels colorés). Le maintien des animaux dans une zone EOPS devrait les préserver d'infections opportunistes. La mise à mort de l'animal sera réalisée en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites. Le scoring hebdomadaire est réalisé en plus de l'observatin quotitidenne règlementaire des animaux. Les injections intrapéritonélaes sont peu douloureuses et ne nécessitent pas d'analgésie.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement du système immunohématopoiëtique, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement de ce système entre les rongeurs et l’Homme. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce pour la réalisation de ce projet tels que des anticorps pour les immuno-marquages. Le phénotype dommageable affectant la survie (embryonnaire et postnatale) sera réalisé au moment du sevrage (3 semaines), le phénotype du système immunitaires sera réalisé à 8-10 semaines (période classique d’analyse pour laquelle le système immunitaire est pleinement fonctionnel), l'apparition de tumeur sera évaluée à 3 mois (les tumeurs surviennent généralement vers 6 mois, puisque nous voulons savoir s'il y a une accélération de l'apparition des tumeurs dans les modèles de souris double mutantes par un effet de synergie nous analyserons ces souris à 3 mois).
Entretien d’une lignée de souris dont le gène de la chromogranine A est floxé (ChgA-loxP); Génération et entretien d’une lignée de souris dont le gène ChgA est éliminé sous le contrôle du promoteur du gène du 26Rfa (26RFa-iCre/+)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
1 440 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ce projet se limite à produire et entretenir des lignées génétiquement modifiées, avec biopsie de la queue sous anesthésie pour génotypage et pose d'une puce sous-cutanée. Les souris de génotype "inadéquat" sont tuées après génotypage, et les couples reproducteurs le sont quand ils cessent de donner des portées. Le porteur relie cet élevage à l'étude d'une protéine liée à l'obésité et au diabète, présentés comme la pandémie de "diabesity".
Objectifs
L'obésité et le diabète de type II connaissent une progression significative et synchrone depuis 30 ans qui fait de la pandémie mondiale de "diabesity" un réel enjeu de santé publique. Des études récentes ont révélé que des neuropeptides connus pour jouer un rôle crucial dans le contrôle hypothalamique du comportement alimentaire sont aussi exprimés dans les îlots pancréatiques, suggérant que les neuropeptides hypothalamiques pourraient servir de lien entre l’homéostasie énergétique et glucidique. C’est le cas du 26RFa, neuropeptide hypothalamique identifié au sein de l'Unité comme le ligand endogène d’un récepteur humain orphelin, le GPR103. Des études récentes menées au sein du laboratoire révèlent que le 26RFa est un nouvel acteur de la régulation de la glycémie. Au sein de notre équipe, nous avons rapporté le rôle essentiel d'une protéine de la famille des chromogranines, la chromogranine A (CgA), dans la formation des granules de sécrétion, organites permettant le stockage et la sécrétion des neuropeptides. De manière intéressante, les souris dont le gène exprimant la CgA a été invalidé de manière globale sont hypertendues et obèses. Or la CgA est exprimée par de nombreuses populations de cellules nerveuses, et de récentes études préliminaires nous ont permis d'observer que les neurones 26RFa expriment également la CgA. Ainsi, la compréhension du rôle de cette chromogranine dans les mécanismes moléculaires de la sécrétion des neuropeptides tels que le 26RFa pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement du diabète de type II. Dans ce contexte, nous souhaitons héberger et reproduire des souris CgA-loxP obtenues de "GemPharmatech". L'entretien de cette lignée nous permettra d'invalider de manière ciblée le gène exprimant la CgA en la croisant avec la lignée 26RFa-iCRE/+ pour invalider la CgA dans les cellules exprimant le 26RFa. Ce croisement devrait nous permettre de caractériser l'impact de l'altération de la sécrétion de neuropeptides sur la régulation de l'homéostasie du glucose dans l'organisme.
Bénéfices attendus
L'expression de la CgA étant ubiquiste, l'invalidation globale du gène exprimant la CgA ne nous permet pas de discriminer le rôle central des rôles périphériques de la CgA quant au contrôle de l'homéostasie glucidique. Par ailleurs, la caractérisation du phénotype des souris issues des croisements (prise alimentaire, poids, glycémie, morphologie et capacité sécrétoire des neurones hypothalamiques) concourra à la compréhension du rôle de la CgA dans la sécrétion du 26RFa et son rôle dans l’homéostasie glucidique.
Procédures
Les animaux destinés à la reproduction subiront une biospsie caudale (prélèvement d'un bout de queue de 3 mm destiné au génotypage des animaux) sous anesthésie : un seul prélèvement, 5 minutes d'anesthésie. L’induction de l'anesthésie profonde se fait par voie aérienne dans une cage dite "à induction". Lors de cette anesthésie, les animaux seront identifiés à l'aide de puces stériles dédiées. La puce est placée en sous-cutané entre les omoplates de façon tangentielle à la courbe du dos et à l'aide de l'injecteur stérile à usage unique fourni avec la puce.
Impact sur les animaux
Les modèles de souris dont le gène ChgA a été invalidé de manière globale sont viables, mais présentent une hypertension et une obésité. L'invalidation ciblée du gène ChgA ne devrait pas induire de nuisance ou d’effet indésirable accentués chez les animaux. Les animaux destinés à la reproduction subiront une biospsie caudale sous anesthésie par voie aérienne dans une cage dite "à induction" (isoflurane). Lors de cette anesthésie, les animaux seront identifiés à l'aide d'une puce placée en sous-cutané. L’élevage et la reproduction devraient induire peu de stress et de souffrance.
Devenir
Une partie des animaux générés dans ce projet sera destinée à la reproduction et à l'entretien de la lignée CgA-loxP, et une autre partie des animaux sera destinée à la génération et à l'entretien d'une lignée dont le gène ChgA est éliminé sous le contrôle du promoteur du gène du 26RFa. Les animaux de génotype adéquat seront placés en accouplement tant que les couples donneront naissance à des portées à un rythme régulier et dans des conditions assurant le bien-être des animaux. Les couples âgés ne produisant plus de portées seront mis à mort selon les procédures précedemment décrites. Les animaux de génotype inadéquat donc inutilisables, seront mis à mort après le génotypage. La stratégie de croisement a été réfléchie afin de réduire le nombre d'animaux ne pouvant être utilisés en expérimentation.
Remplacement
L’étude de l'impact de l'invalidation ciblée du gène ChgA sur l'homéostasie glucidique n’est possible que dans un système intégré et nécessite donc l’utilisation de modèles animaux.
Réduction
La stratégie de reproduction choisie dans le cadre de ce projet vise à réduire le nombre d'animaux générés en choisissant de travailler sur les animaux homozygotes pour la construction CgA-loxP, plutôt qu'hétérozygotes. En effet, les règles de la génétique mendélienne indiquent que la probabilité d'obtenir des animaux de génotype adéquat est de 1/4 dans le cas de croisements d'animaux double hétérozygotes CgA-loxP. Le nombre d'animaux de génotype non adéquat, générés dans la descendance des croisements est ainsi divisé par deux.
Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Les animaux seront maintenus à cinq par cage (deux femelles et un mâle par cage pour les accouplements) pour éviter tout isolement social et leur environnement sera enrichi (présence de boules de coton pour construire un nid + dôme en plastique rouge sous lequel se réfugier). Pendant toute la durée du séjour, les animaux seront suivis quotidiennement, y compris week-ends et jours fériés, pour déceler tout signe de souffrance. Parmi ces signes, seront notamment relevés : perte de poids importante (20% du poids initial), posture « dos voûté », prostration, plaies, poil terne, vocalisations anormales, agressivité. Si l’un de ces signes ou combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal sera renforcé. Si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 24h, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et une mise à mort sera réalisée. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (générale) et la douleur au réveil sera traitée par des analgésiques. C’est le cas lors du prélèvement de biopsies caudales nécessaires au génotypage des animaux. Dans le cadre de la reproduction de lignées de souris, la mise bas peut s’avérer être une étape critique nécessitant une surveillance particulière. Pour réduire une éventuelle souffrance liée à la mise bas, les femelles seront suivies quotidiennement, y compris week-ends et jours fériés, pour déceler tout signe de gestation puis, lorsque la gestation sera avérée et le terme estimé sera proche, le suivi sera renforcé afin de détecter les signes de mise bas. La mise-bas en elle-même sera étroitement surveillée afin de vérifier que la naissance des petits se produit dans un délai normal (le processus de mise-bas dure en moyenne 2 heures chez la souris) et l’aide nécessaire sera apportée aux femelles en cas de difficultés au cours de la mise bas (temps de mise bas allongé au-delà de 4h, mise-bas non évolutive, premiers petits mort-nés ou mère présentant des signes de détresse…).
Choix des espèces
La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coûts d’entretien réduits, fortes performances reproductives. De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études de physiologie permettant une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes. La souris est également un modèle permettant des approches génétiques complexes, ce qui n'est pas le cas d’autres modèles mammifères. Ainsi, des souris de la lignée C57Bl/6J ont été utilisées afin de générer les animaux portant la construction transgénique CgA-floxP provenant de GemPharmatech (B6/JGpt-Chgaem1Cflox/Gpt). Cette dernière lignée (utilisation de souris à partir de 8 semaines de vie, âge de maturité sexuelle) sera alors croisée avec une lignée transgénique 26RFa-iCRE (même stade de développement et également obtenue à partir de souris de la lignée C57Bl/6J), détenue au sein de l'animalerie, soumise à un « Material Transfert Agreement » convenu entre le laboratoire d’origine et l’Inserm U1239.
Etude de l’efficacité d’un probiotique sur l’anxiété chez le chien
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
20 chiens vont être utilisé·es dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, dix-neuf étant ensuite réutilisés dans d'autres études et un seul proposé à l'adoption. Pendant six semaines, ils reçoivent un aliment additionné d'un probiotique, subissent quatre prises de sang et deux "défis comportementaux" consistant en un trajet en voiture en caisse de transport. L'objectif est commercial, faire autoriser ce probiotique comme additif alimentaire pour chiens sur le marché européen, une troisième étude étant exigée par les autorités. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'évaluer l'effet d'un aliment sur l'anxiété du chien.
Objectifs
Le projet a pour but d'évaluer le bénéfice d'un probiotique inclus dans un aliment complet sur l'anxiété chez le chien.
Bénéfices attendus
Il est attendu du projet que le probiotique évalué puisse faire l'objet d'une autorisation en tant qu'additif entrant dans la composition d'aliment pour chien sur le marché Européen. Le probiotique utilisé dans l’étude a un effet calmant pour les animaux anxieux et ainsi améliorer la qualité de vie des chiens.
Procédures
Pendant l'étude, les chiens recevront un aliment complet avec ajout d'un probiotique sous forme de poudre chaque jour pendant 6 semaines, soit 42 jours. Chaque chien subira 4 prises de sang (volume de 1mL / prise) par voie veineuse et 2 défis comportementaux réalisés à J43 et J106 de l'étude. Le défi comportemental prendra la forme d'un court trajet en voiture d'une durée de 10 minutes, en caisse de transport.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles seraient: défécation ou miction incontrôlée, comportements d’échappement intenses et persistants pouvant nuire à l’animal, et vomissements durant le trajet en voiture. Les nuisances possibles au moment des prélèvements sanguins sont: hématome, infection.
Devenir
Parmi les 20 chiens, 19 seront ré-utilisés dans d'autres études, et 1 chien ayant atteint l'âge requis sera proposé pour un placement via le programme d'adoption de l'animalerie.
Remplacement
Il n'existe pas de méthode alternative prouvée permettant d'évaluer l'impact de la consommation d'un aliment sur l'anxiété chez le chien. Par conséquent, il n'est pas possible de remplacer le recours à l'espèce animale étudiée dans ce projet.
Réduction
Sur la base de la variation constatée sur des études similaires réalisées précédemment, il a été déterminé qu'avec 20 chiens, nous serons en mesure de détecter une différence statistiquement significative de 10% dans les paramètres physiologiques étudiés.
Raffinement
Les chiens suivent un programme de socialisation individuelle régulière se composant d'activités d'éducation canine, de promenade en laisse et de sortie en parc. Ceci pour favoriser des interactions positives avec le personnel soignant et ceux appliquant les procédures expérimentales. Les animaux bénéficient quotidiennement d'accès à de larges enclos gazonnés où ils peuvent s'ébattre plusieurs heures par jour sous la supervision d'animaliers. Ils sont logés en box individuel par couple dont les dimensions sont très supérieures aux minima réglementaires. Les animaux sont suivis quotidiennement par du personnel soignant composé de vétérinaires, assistants vétérinaires et soigneurs animaliers, ainsi que de comportementalistes.
Choix des espèces
Le probiotique étudiée est destiné à l'espèce Canine, qui a déjà été évalué dans deux études précédentes. Les autorités sanitaires Européennes requierent qu'une troisièmé étude soit réalisée sur l'espèce animale concernée pour valider l'effet du probiotique étudié en tant qu'additif alimentaire. Les animaux seront au stade adulte considérant que l'ingrédient actif sera intégré en premier lieu dans des aliments pour chien adulte.
Dymorphisme sexuel associé à la maladie des petits vaisseaux et à l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection preservée
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
2 650 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. En surpoids ou diabétiques, elles subissent des injections intrapéritonéales répétées, une à deux chirurgies pour les castrer ou leur implanter une pompe, un test d'effort et une échocardiographie sous anesthésie. Le projet étudie le rôle des hormones sexuelles dans une insuffisance cardiaque touchant surtout les femmes ménopausées, avec des cibles thérapeutiques annoncées à long terme. Le porteur affirme que cette pathologie complexe ne peut s'étudier in vitro et requiert "un organisme vivant proche de l'homme".
Objectifs
L’insuffisance cardiaque dite « à fraction d’éjection préservée » représente la moitié des insuffisances cardiaques et sa prévalence est en constante augmentation compte tenu du vieillissement de la population et de l’explosion des facteurs de risques cardiovasculaires. Il s’agit d’une pathologie associée à une mortalité élevée et pour laquelle il n’existe pas de traitement efficace. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie ce qui est primordial pour identifier des cibles thérapeutiques. Plus précisément nous nous attacherons à mieux comprendre, d’une part le rôle de la maladie des petits vaisseaux qui est souvent associée à cette maladie et d’autre part le dimorphisme sexuel associé à cette maladie. En effet cette maladie touche surtout les femmes ménopausées suggérant un rôle des hormones sexuelles.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de mieux comprendre comment les hormones sexuelles interagissent avec les facteurs de risque cardiovasculaire pour protéger ou altérer le phénotype des petits vaisseaux et la fonction cardiaque. A plus long terme, il devrait permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques personnalisées pour les patients atteints d’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée. En effet, l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée est une maladie hétérogène possiblement induite par des mécanismes multiples.
Procédures
Les souris subiront 1 à 2 séries de 4 à 5 injections intrapéritonéales (chaque injection incluant la contention ne dure que quelques secondes), une à deux chirurgies de 10 minutes visant à les castrer ou à implanter une micro-pompe en sous cutané et un prélèvement sanguin inférieur à 50 µL dans la veine caudale. Finalement ces souris seront soumises à un test d'effort (12 minutes par jours pendant 3 jours habituation) puis 5 à 30 minutes pour le test à proprepemnt dit) et une anesthésie de 15 minutes pour subir une échocardiographie.
Impact sur les animaux
Ce projet utilisera des souris en surpoids ou diabétiques dont les nuisances sont comme chez l'homme, un surpoids, une polyurie et une polydipsie. D'autre part les animaux ressentiront des douleurs post-chirurgicales et un stress occasionné par des administrations intrapéritonéales répétées.
Devenir
Toutes les souris seront sacrifiées pour pouvoir faire des prélévements d'organes. Les géniteurs seront sacrifiés lorsque le nombre d'animaux nécessaires aux expérimentations aura été produit.
Remplacement
L‘insuffisance cardiaque est une pathologie complexe mettant en jeu des interactions de divers mécanismes, dont beaucoup restent inconnus, entre de nombreux types cellulaires locaux (cardiomyocytes, cellules endothéliales, péricytes notamment) et circulants (cellules hématopoïétiques diverses). Etudier l’ensemble de ces acteurs et plus encore leurs interactions ne peut pas à l'heure actuelle être réalisé uniquement par des tests in vitro. Le recours à un organisme vivant proche de l’homme est donc necessaire.
Réduction
Le nombre d'animaux a été calculé à l'aide d'un logiciel informatique: Pour avoir 90% de chance de mettre en évidence des différences significatives entre 2 groupes (concernant, la pression télédiastolique du ventricule gauche notamment), le nombre de souris par groupe et par analyse doit être 10. Il faut noter cependant que nous ne pourrons pas faire toutes les analyses sur une seule souris, il nous faudra donc 2 souris. Le nombre de souris par groupe sera donc 20. Ce chiffre est conforté par notre propre expérience et à celle de la communauté scientifique s'intéressant aux pathologies cardiovasculaires, 10 animaux par lot sont nécessaires pour obtenir des résultats exploitables statistiquement aussi bien pour les mesures de la fonction cardiaque et les analyses histologiques. Pour réduire le nombre d'animaux, aucune expérience déjà publiée ne sera reproduite. Les manipulations seront réalisées par du personnel technique entrainé de façon à réduire la variabilité des résultats donc le nombre d'animaux nécessaires. Les animaux des groupes "contrôles", traités de façon identiques, mais inclus dans différentes procédures seront dès que possible utilisé dans plusieurs "expériences ou procédure". Le nombre de souris nécessaires à la réalisation de ce projet sera ainsi réduit.
Raffinement
L’hébergement des animaux sera réalisé dans des conditions qui limiteront le stress et l’inconfort (animalerie agrée, personnels formés, cage de 3 à 6 animaux maximum en portoir ventilé avec libre accès à l’eau et à la nourriture ainsi qu’un environnement enrichi avec igloo cartonné et serpentins de papier à dérouler). La souffrance des animaux sera réduite par l'usage d'anesthésiques et d'antalgiques adaptés pour la réalisation des gestes douloureux et la mise en place de points limites. D'autre part, les animaux seront surveillés quotidiennement par le zootechnicien, le responsable du bien-être animal ou l'expérimentateur. Dès le début des expérimentations, une fiche de suivi « bien-être » sera créée. Le bien-être des animaux sera alors gradé ce qui permettra d'apporter dans les plus brefs délais la mesure adaptée à l'animal.
Choix des espèces
La souris est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale du réseau vasculaire a de forte ressemblance avec celui de l'homme. Par ailleurs, il existe dans cette espèce des individus présentant des mutations spontanées prédisposant au diabète de type 2 (facteur de risque cardiovasculaire). Des souris adultes âgées d'au moins 6 semaines seront utilisées, En effet, notre objectif n'est pas d'étudier des processus développementaux mais des processus physiopathologiques.
Effet de la consommation de farines produites à partir de graines de protéagineux et d’oléoprotéagineux enrichies en acides gras polyinsaturés sur le métabolisme lipidique et protéique musculaire du rat jeune
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
90 rats vont être utilisé·es, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Hébergés seuls pour contrôler leur alimentation, ce qui leur impose un stress chronique, ils sont nourris de farines d'oléoprotéagineux enrichies en oméga 3, pesés trois fois par semaine et placés quatre jours en cage métabolique, avant mise à mort pour prélever muscles et sang. L'objectif est nutritionnel et commercial, évaluer la digestibilité de protéines végétales pour développer des "ingrédients" destinés à l'alimentation humaine. Le porteur affirme que ces mesures ne peuvent être obtenues ni in vitro ni directement chez l'homme.
Objectifs
La croissance démographique mondiale pose la question de la disponibilité des ressources alimentaires et notamment des protéines. Une des solutions est d’augmenter les protéines végétales et de réduire les protéines animales dans la ration alimentaire. Toutefois, l'essor des protéines végétales nécessite une meilleure connaissance de leur valeur nutritionnelle, de leur cinétique de digestion et de leur biodisponibilité (capacité des protéines à fournir réellement tous les acides aminés nécessaires pour les synthèses protéiques corporelles). En effet, il est important d’étudier les qualités nutritionnelles des protéines végétales avant de pouvoir recommander leur consommation comme source protéique de substitution aux protéines animales. Et cela s’applique particulièrement aux protéines issues des oléo-protéagineux car elles sont encore peu étudiées pour l’alimentation humaine, malgré leur grand intérêt nutritionnel. En effet, ces sources alimentaires végétales, qui sont à la fois riches en acides gras indispensables (oméga 3) et en protéines (15 à 35 % de protéines dans le Colza et tournesol), pourraient être une option intéressante pour la définition de nouveaux aliments végétaux. Les farines, concentrats et isolats d’oléoprotéagineux disponibles commercialement proviennent des coproduits obtenus après extraction de l’huile (touteaux). Pour tester l’effet combiné de leurs protéines et de leurs acides gras oméga 3, il faudra rajouter des acides gras polyinsaturés aux matières protéiques végétales issues de tourteaux. Dans ce contexte, le projet vise à étudier la digestibilité de régimes riches en protéines végétales d’oléo-protéagineux enrichies avec des acides gras oméga 3, en comparaison avec un régime riche en protéines et étudier leur impact sur la digestibilité et la fonction et le métabolisme lipidiques et protéiques musculaires dans un modèle de rats jeunes.
Bénéfices attendus
L’une des solutions pour répondre au besoin accru en ressources alimentaires et notamment en protéines, est d’augmenter les protéines végétales et de réduire les protéines animales dans la ration alimentaire. Pourtant, il manque encore des preuves scientifiques qui permettent de considérer les protéines végétales comme source protéique de substitution aux protéines animales. Les études décrites dans la littérature portent majoritairement sur les protéines issues de graines de légumineuses (pois, lentilles), ou issues du soja mais peu s'intéressent à la valeur nutritionnelle des protéines provenant d’oléoprotéagineux tels que le colza ou le tournesol. De plus, aucune d'entre elles n’envisage un éventuel effet synergique des lipides et des protéines issues des oléoprotéagineux tant sur leur digestibilité que sur leurs effets santé. Les plantes oléoprotéagineuses offrent un double intérêt nutritionnel car elles apportent des protéines mais également des lipides, notamment des acides gras polyinsaturés qualifiés d'acides gras indispensables car le métabolisme de l'Homme et des animaux est inapte à les synthétiser. Seule l'alimentation est capable de fournir à l'organisme, ces acides gras indispensables à un certain nombre de fonctions physiologiques. Du fait de leur forte teneur en lipides, les plantes oléoprotéagineuses sont principalement cultivées pour la production d’huiles végétales. Les procédés d'obtention de l'huile conduisent à un coproduit appelé tourteau. A partir de ces tourteaux, des produits de transformations appelés farines, concentrats et isolats, sont disponibles lorsque certains procédés de transformation sont appliqués. Ces derniers contiennent des teneurs en matières grasses résiduelles et sont concentrés en d'autres nutriments, notamment en protéines. Le présent projet fournira des données scientifiques nouvelles qui permettront d'apprécier l'intérêt de sources végétales comme les oléoprotéagineux qui combinent les protéines et les lipides tant sur la valeur nutritionnelle des protéines que sur leur éventuels bénéfices santé, résultant d'une synergie entre le métabolisme des lipides et des protéines. Ce projet pourrait donc à terme permettre de développer à partir de ces matrices protéiques végétales issues d’oléo-protéagineux, des "ingrédients" riches en protéines végétales et enrichis ou non avec des acides gras polyinsaturés oméga 3, qui pourraient présenter un intérêt pour la santé et la nutrition humaine.
Procédures
L'ensemble des interventions décrites ci-après concernent l'ensemble des 90 rats. Les rats seront hébergés en cage individuelle pour contrôler précisément leur consommation alimentaire pendant toute la durée du protocole depuis leur arrivée à l’animalerie jusqu’à leur mise à mort soit 4 semaines plus 10 jours d'acclimation. Les 90 rats subiront peu d’interventions durant le protocole. La première consiste à les peser, 3 fois par semaine pendant toute la durée du protocole. Les pesées des pesées est de quelques secondes. La deuxième consiste à récupérer la totalité des fèces et de l’urine produits par les animaux afin de mesurer la digestibilité des protéines (=azote ingéré – azote excrété/azote ingéré). Les rats seront alors hébergés dans une cage métabolique conçue pour permettre cette récupération. La durée du passage sera réduite à son maximum (4 jours au total) sans compromettre les résultats du projet.
Impact sur les animaux
A leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront âgés de 4 semaines. A la fin du protocole expérimental, ils seront mis à mort à l’âge de 2 mois. Aucun effet indésirable particulier n’est attendu en lien avec les différents régimes et la mesure du poids réalisée de façon non invasive. Afin de mesurer précisément leur consommation alimentaire pendant toute la durée du protocole expérimental, les rats seront hébergés en cage individuelle. Cet hébergement individuel affectera le bien-être de ces animaux sociaux en induisant un stress chronique que nous chercherons à réduire en favorisant les contacts acoustiques, olfactifs et optiques avec leurs congénères et en fournissant un enrichissement adapté dans la cage. De plus, l’ensemble des rats sera soumis à un stress supplémentaire avec leur hébergement dans une cage métabolique au cours des 4 derniers jours du protocole.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir réaliser les analyses sur les différents tissus prélevés qui permettront de répondre aux objectifs du projet. En effet, le prélèvement des muscles squelettiques est nécessaire pour mesurer le niveau de synthèse protéique au sein de ce tissu. De même, l'ensemble du sang des animaux doit être prélevé pour pouvoir mesurer le statut inflammatoire des rats et réaliser leur bilan sanguin.
Remplacement
L'utilisation d'animaux dans ce projet est absolument nécessaire et ne peut être remplacée par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire à 2 ou 3 dimensions car ils ne présentent pas à ce jour les mêmes caractéristiques que celles observées chez le rat et l’homme. En effet, les cellules intestinales disponibles ne présentent pas les caractéristiques indispensables dans les phénomènes d’absorption des lipides par la muqueuse intestinale. De plus, ces systèmes ne permettent pas de mesurer simultanément la digestibilité des différentes sources de protéines (protéagineux ou oléoprotéagineux) enrichies avec des acides gras polyinsaturés oméga 3, le métabolisme protéique, lipidique et musculaire et le statut inflammatoire circulant. En l’état, ce projet ne peut pas non plus être mené directement chez l’Homme. En effet, actuellement, les tourteaux et farines issues de tourteaux de colza ou de tournesol disponibles commercialement ne sont destinés qu’à l’alimentation animale et ne peuvent pas être utilisés pour la consommation humaine. Il est à noter qu’avant de réaliser les régimes fournis ensuite aux rats les farines, concentrats ou isolats protéiques seront analysés d’un point de vue nutritionnel et microbiologique garantissant leur innocuité.
Réduction
Les résultats d’études antérieures menées sur des rats nourris avec des farines produites à partir d'autres végétaux (céréales) ont permis de réduire le nombre d’animaux utilisés à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Le nombre total de rats nécessaires à la réalisation de ce projet est 90. Pour comparer les résultats des différents paramètres mesurés, nous utiliserons des tests statistiques.
Raffinement
Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Les rats seront hébergés individuellement dans des cages adaptée à l'espèce. Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque rat, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Une grille d'évaluation définissant des points limites sera mise en place. Elle permettra d'identifier des points limites notables et des points limites graves. Si un animal présente 2 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum.
Choix des espèces
Le modèle rat est le modèle le plus utilisé dans les études de digestion et d’absorption et de métabolisme des lipides et des protéines, en vue d’une extrapolation chez l’homme. Ce modèle a l'avantage de posséder les mêmes systèmes digestif et enzymatiques que ceux observés chez l'Homme. D'autre part depuis près de 30 ans nous avons cumulés des données obtenues à partir de ce modèle, ce qui nous permet de poursuivre nos investigations sur la base de précédentes études mais aussi de mettre en regard nos données à celles d'autres travaux de recherche à l'international.
Evaluation de l’efficacité d’un traitement anticancéreux sur un modèle de tumeur mammaire humaine développée chez la souris immunodéprimée
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
720 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dont 540 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Immunodéprimées, elles reçoivent par chirurgie une greffe de tumeur mammaire humaine, puis jusqu'à dix-huit injections d'une molécule inhibitrice sur six semaines, avec suivi de la tumeur et prélèvements sanguins. L'objectif est de confirmer l'efficacité de ces molécules contre le cancer du sein triple négatif, avec un bénéfice pour les patientes annoncé à long terme. Le porteur affirme qu'après des tests sur cellules, la validation sur "organisme entier" est nécessaire.
Objectifs
Ce projet concerne l'inhibition d'une enzyme qui intervient dans le mécanisme de détoxification des cellules. Cette voie de détoxification est particulièrement utilisée par les cellules des tumeurs. L’augmentation de l’expression de cet enzyme a été reportée dans de nombreux cancers et est associée à la résistance aux traitements habituelles lors de rechutes. Le pourcentage du cancer du sein représente 33.5% de l’ensemble des nouveaux cas de cancer chez la femme. La grande diversité retrouvée dans le cancer du sein rend les traitements plus difficiles que sur d’autres formes de cancer du sein. Il constitue un problème clinique en raison de son pronostic relativement mauvais, de son comportement agressif, de sa capacité à métastaser et de l'absence de thérapies ciblées. Un nouveau traitement anticancéreux contre les cancers a été développé. Une première molécule a montré son efficacité sur la leucémie , le mélanome, le cancer du poumon ainsi que le cancer du sein. L’objectif de ce projet est d’étudier l’efficacité des molécules sur des souris greffées avec des cellules tumorales humaines au niveau des glandes mammaires afin de reproduire un modèle de cancer du sein in vivo.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet à court terme sont de confirmer l’efficacité de nos molécules inhibitrices sur la progression d’une tumeur de cancer du sein implantée chez la souris. Les bénéfices attendus, à long terme, sur la santé humaine sont d’améliorer la prise en charge des patientes et d’améliorer le pronostic lors de rechutes. Ce traitement, permettra d’envisager une thérapie ciblée plus efficace que les thérapies conventionnelles actuellement utilisées contre le cancer du sein triple négatif.
Procédures
injection de cellules tumorales dans la glande mammaire de la souris par chirurgie courte sous anesthésie gazeuse (1 fois, 10 minutes) Traitement des souris des molécules inhibitrices (3 fois par semaine pendant 6 semaines maximum / 18 injections maximum / 5 secondes par injection) Contention des souris lors de la mesure des tumeurs (2 fois par semaine). Un prélèvement de sang en cours d'étude dans la veine mandibulaire de la souris (1 fois). Un prélèvement final de sang réalisé sous anesthésie (1 fois).
Impact sur les animaux
Douleur liée à la chirurgie. Développement de la tumeurs. Gène liée à la tumeur .Douleur légère liée à l'injection. Douleur liée à la prise de sang (piqure d'aiguille). Stress lors de la contention. Douleur liée à l'apparition de métastase.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements dans le but de la analyser.
Remplacement
Avant de réaliser des études sur la souris, l’efficacité des molécules a été démontrée sur les cultures cellulaire de tumeur séléctionnées pour ce projet. Il est dorénavant nécessaire de confirmer ces résultats sur une tumeur développée dans un mammifère. En effet, la sensibilité des cellules tumorales aux traitements anticancéreux dépend fortement de son environnement. Par ailleurs, plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du traitement dans la tumeur nécessitent de travailler sur un organisme entier. Pour toutes ces raisons, nous devons effectuer les études d’efficacité chez la souris.
Réduction
La prise tumorale ayant un taux de réussite de 80%, nous avons réduit le nombre d'animaux à implanter en prenant en compte ce paramètre. L’étude pilote sera réalisée avec le minimum nous permettant d’apprécier la croissance tumorale. Pour les procédure où le traitement sera administré aux souris, la comparaison entre les différents groupes sera réalisée par un test statistique. le nombre d'animaux par groupe a été déterminé car il nous permet un compromis entre une puissance statistique suffisante et l’éthique animale. Une réduction du nombre d’animaux sera possible en fonction des résultats obtenus lors des premières études : - Suppression des doses non tolérées dans les études suivantes pour chacune des souches de souris. - Suppression des témoins négatif s’ils ne démontrent pas d’activité dans les premières études.
Raffinement
Après leur réception, les souris disposeront d’une période d’acclimatation de 7 jours. Lors de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés maximum 70 jours (10 semaines) après leur réception si aucun point limite n’a été atteint. Ce délai correspond à la durée maximale possible des études (1 semaine d’acclimatation + 3 semaines de prise de greffe + 6 semaines de traitement). Lors de la chirurgie, des antidouleurs sont donnés avant l'opération. l'animal a une anesthésie générale et locales. Un antidouleur est apporté dans l'eau de boisson pendant les 3 jours qui suivent l'opération. Les animaux étant identifiés, toute anomalie observée permettra de faire un suivi individuel. Ils seront pesés le jour de la première intervention (J7) puis au moins une fois par semaine (3 fois lors des traitements). En cas de perte de poids >10%, de la nourriture humide sera ajouté dans la cage. En cas de tumeur invalidante, de l'eau gélifiée et des croquettes seront ajoutées dans la cage pour faciliter l'accès à l'eau et à la nourriture. Les animaux seront répartis à raison de 5 ou 6 par cage (dépendant de la prise de la tumeur) afin de maintenir la sociabilité de l’animal. Une observation, 3 fois par semaine lors des traitements, permettra de détecter une souffrance ou l’atteinte d’un point limite.
Choix des espèces
La souris est l'un des seuls modèles d'animaux adaptés pour la réalisation de greffe de tumeur d'origine humaine. C'est un modèle reconnu dans la recherche contre le cancer. Les animaux seront utilisés à partir de 6 à 10 semaines jusqu’à 15-20 semaines. Ce choix est basé sur la bibliographie afin de favoriser la prise tumorale.
SIGNAL: INFECTION AU SARS-COV-2 DES NEURONES A GNRH, NEUROINFLAMMATION,VEILLISSEMENT ET CONSEQUENCES A LONG-TERME
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
348 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Génétiquement modifiées pour exprimer un récepteur humain, elles sont infectées par le SARS-CoV-2 par voie nasale, avec implantation de mini-pompes et prélèvements sanguins répétés, certaines lignées n'ayant qu'une espérance de vie de sept à douze jours après infection. Le projet étudie l'infection des neurones à GnRH et ses effets à long terme sur la reproduction et la cognition, y compris chez des femelles gestantes et leur descendance. Le porteur affirme que cette étude requiert "l'organisme entier" et juge ces souris "indispensables".
Objectifs
Depuis le début de la pandémie de COVID-19, les efforts collaboratifs des 5 équipes de recherche ont montré que le SARS-CoV-2 infecte et tue les neurones produisant l'hormone de libération des gonadotrophines (GnRH) dans le cerveau des patients adultes atteints de COVID-19. Ce phénomène entraîne une réduction spectaculaire de l'expression de la GnRH dans l'hypothalamus chez une proportion significative de patients. Ces neurones, connus pour être les maîtres régulateurs de la fonction de reproduction, pourraient également jouer des rôles clés dans le développement des fonctions cognitives et sensorielles, du métabolisme et du vieillissement cérébral et systémique. En outre, les neurones à GnRH foetaux, qui proviennent du nez, expriment plusieurs protéines qui leur confèrent une sensibilité à l'infection par le SARS-CoV-2. Ceci suggère qu'ils pourraient être vulnérables en cas de transmission materno-foetale/néonatale, et fait planer le risque d'une double pandémie d'infertilité et de déclin cognitif prématuré. Nous émettons l'hypothèse que l'infection des neurones à GnRH et d'autres populations de cellules cérébrales par le SARS-CoV-2 module l'expression des gènes de l'hôte, perturbe le neurodéveloppement et aggrave les changements liés à l'âge par des altérations inflammatoires et épigénétiques persistantes dans les cellules survivantes. Le projet utilise des tissus humains de patients COVID-19 et de sujets non-infectés, ainsi que des modèles cellulaires, et nécessite également l’utilisation de modèles animaux transgéniques afin de déterminer si et comment l'infection et la perte des neurones à GnRH conduit à des altérations pathologiques à long terme. Nous poursuivrons trois objectifs: 1) Déterminer si et comment l'infection par le SARS-CoV-2 module de manière différentielle le paysage de l'expression génétique des neurones à GnRH et d'autres cellules cérébrales infectées pour accélérer l'inflammation hypothalamique, le dysfonctionnement cognitif ou métabolique et la sénescence cérébrale 2) Explorer si l'infection des neurones à GnRH ou la perte d'expression de la GnRH dans le cerveau adulte ou foetal/néonatal a des effets à long terme sur l'axe reproducteur dans des modèles animaux 3) Vérifier si le remplacement de la GnRH de façon physiologique ou l'inversion des voies pathologiques compensera l'expression génique à long terme et les altérations fonctionnelles induites par l'infection du cerveau par le SARS-CoV-2.
Bénéfices attendus
Le projet apportera une meilleure compréhension des répercussions à long terme, jusqu'ici sous-estimées, de la neuroinvasion par le SARS-CoV-2 en termes d'intégrité et de fonction des cellules cérébrales. Il pourrait permettre d’identifier les mécanismes cérébraux qui sous-tendent les symptômes neurologiques de la COVID longue, et proposer des stratégies thérapeutiques viables et fondées sur les preuves pour inverser ou compenser ces mécanismes pathologiques. Les résultats du projet devraient contribuer à réduire le fardeau social, financier et sanitaire imposé par la COVID-19.
Procédures
LES INTERVENTIONS SERONT EFFECTUEES SUR ANIMAL ANESTHESIE ET CHAQUE INTERVENTION EST REALISEE 1 FOIS DANS LA VIE DE L'ANIMAL: - IMPLANTATION DE MINIPOMPE SOUS-CUTANEES AU NIVEAU DE LA PARTIE SUPERIEURE DU DOS, - INFECTION DES SOURIS PAR VOIE NASALE (SOURIS ADULTES GESTANTES OU NON). SEULS LES PRELEVEMENTS SANGUINS SERONT EFFECTUES SUR ANIMAL VIGILE. LES PRELEVEMENTS UNIQUES SERONT EFFECTUES AU NIVEAU DE LA VEINE MANDIBULAIRE 1 FOIS PAR MOIS PENDANT 6 MOIS (SUR L'ANIMAL ADULTE) OU A P12, P23 ET P30 (SUR SOURIS POST-NATALES); LES PRELEVEMENTS FREQUENTS SERONT EFFECTUES DANS LA VEINE LATERALE DE LA QUEUE 1 SEULE FOIS DANS LA VIE DE L'ANIMAL (3µL DE SANG TOUTES LES 6 MINUTES PENDANT 2H).
Impact sur les animaux
TOUTE MANIPULATION DES ANIMAUX PEUT PROVOQUER DU STRESS, DE LA FATIGUE ET DE L'INCONFORT ET DES MESURES DE RAFFINEMENT SERONT MISES EN PLACE POUR LES LIMITER AU MAXIMUM. EN PARTICULIER LES EXPERIENCES DE CHIRURGIE OU DE PRELEVEMENTS DE SANG PEUVENT PROVOQUER DES DOULEURS A COURT-TERME QUI SERONT LIMITEES PAR L'UTILISATION D'UN ANALGESIQUE (GEL DE CHLORHYDRATE DE PRAMOCAÏNE OU TRONOTHANE 1%). SEULS LES ANIMAUX INFECTES PAR LE VIRUS SARS-COV-2 DANS LA PROCEDURE 2 SUBIRONT UNE PERTE DE POIDS CONSEQUENTES ET SERONT SUIVIS DE TRES PRES; ILS SERONT SACRIFIES A 4 JOURS POST-INFECTION POUR LIMITER LA DUREE DE CET ETAT.
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés pour chaque procédure sera EUTHANASIE à terme même ceux qui servent de contrôles afin de récupérer le sang et les organes.
Remplacement
Les expériences prévues ont été planifiées en tenant compte de la règle des 3 R. L’étude des effets physiopathologiques de l’infection par SARS-CoV-2 et de l’efficacité des médicaments nécessitent l’utilisation d’organisme entier, et ne laissent pas la possibilité de remplacer les animaux utilisés par des systèmes cellulaires. En effet, suite à l’infection respiratoire, le système immunitaire s’active et conduit à une inflammation. Celle-ci se traduit par le recrutement et l’activation de nombreux types cellulaires et par la production de facteurs solubles (cytokines, chimiokines etc). Cette réaction est sous la dépendance d'un réseau complexe de cellules et de facteurs solubles qui ne peut pas être reproduite in vitro. Par ailleurs, les effets potentiellement bénéfiques du donneur de NO au cours de l’infection ne peuvent être réellement évalués qu’in vivo. Le modèle souris est pertinent pour ce type d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et homogène d’animaux par groupe sera utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique. LE NOMBRE D’ANIMAUX EST BASE SUR UN CALCUL STATISTIQUE QUI PREND EN COMPTE LE PARAMETRE ETUDIE ET DES EXPERIENCES PILOTES. POUR CELA, LA TAILLE MINIMALE DES GROUPES EXPERIMENTAUX A UTILISER A ETE DEFINI ; PUIS LA POSSIBILITE DE COLLECTER PLUSIEURS ECHANTILLONS/TISSUS CHEZ LES MEMES ANIMAUX CHAQUE FOIS QUE POSSIBLE A ETE PRISE EN COMPTE. CETTE UTILISATION MAXIMISE LES DONNEES OBTENUES A PARTIR DE CHAQUE ANIMAL, AFIN DE LIMITER OU D'EVITER L'UTILISATION SUBSEQUENTE D'ANIMAUX SUPPLEMENTAIRES, ET CE, SANS POUR AUTANT COMPROMETTRE LE BIEN-ETRE ANIMAL.
Raffinement
Le raffinement est obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, le recours à des procédures non invasives et non douloureuses, le suivi des signes cliniques et des points limites, le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, le suivi post anesthésie de l’état de santé des animaux ainsi que des soins adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux. Les personnes impliquées bénéficient d’une autorisation pour travailler sur des agents pathogènes de groupe 3. Différentes mesures sont prises pour réduire le stress, l’inconfort et la douleur. EN PARTICULIER, LES ANIMAUX SONT MANIPULES INDIVIDUELLEMENT, ET DANS LE CALME, AFIN DE LIMITER TOUT STRESS DES ANIMAUX NON MANIPULES. LES MANIPULATIONS S'EFFECTUENT A DISTANCE DES AUTRES ANIMAUX. UNE SURVEILLANCE QUOTIDIENNE EST EFFECTUEE AFIN DE S’ASSURER DE L’ETAT DES ANIMAUX.
Choix des espèces
La souris exprimant l’ACE2 humain génétiquement modifiée représente un modèle pertinent pour l’étude des réponses immunes et inflammatoires liées à l’infection par le SARS-CoV-2. AFIN D’ETUDIER LES CONSEQUENCES PATHOPHYSIOLOGIQUES DE LA PERTE DE CES NEURONES LORS DE LA COVID-19, NOUS UTILISERONS UN MODELE DE SOURIS TRANSGENIQUES DANS LESQUELLES L’ACE2 HUMAIN S’EXPRIMERA UNIQUEMENT DANS LES NEURONES A GNRH. L’ETUDE DU ROLE SPECIFIQUE DU CO-RECEPTEUR A LA NEUROPILIN-1 (NRP1) SPECIFIQUEMENT DANS LES NEURONES A GNRH REQUIERT L’UTILISATION DE SOURIS TRANSGENIQUES INFECTEES DE MANIERE GLOBALE PAR LE SARS-COV-2 ET QUI N’ONT PAS LE RECEPTEUR NRP1 DANS LES NEURONES A GNRH. CES SOURIS ONT UNE ESPERANCE DE VIE COURTE (7 A 12 JOURS POST-INFECTION) MAIS SONT INDISPENSABLES POUR DETERMINER LE ROLE DU CO-RECEPTEUR NRP1 DANS LA PERTE DE L’EXPRESSION DE LA GNRH. NOTRE TROISIEME OBJECTIF ETANT D’ETABLIR L’IMPACT DE L’INFECTION IN UTERO OU NEONATALE SUR LA MINIPUBERTE ET A LONG TERME SUR L’AXE REPRODUCTEUR, IL NECESSITE L’UTILISATION DE SOURIS FEMELLES GESTANTES INFECTEES PAR LE SARS-COV-2 ET D’ETUDIER LES EFFETS SUR LA DESCENDANCE A PLUS OU MOINS LONG-TERME.
Développement pharmaceutique d’une nouvelle thérapeutique de la maladie de Menkès (EU 1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
85 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère, 39 en gravité sévère. Les souriceaux mâles porteurs de la maladie de Menkès, dont l'espérance de vie ne dépasse pas trois à cinq semaines, reçoivent des injections sous-cutanées cinq jours sur sept et subissent sept tests neurocomportementaux jusqu'à J38. L'objectif est de développer un transporteur synthétique de cuivre contre cette maladie génétique mortelle de l'enfant. Le porteur affirme qu'aucune approche in vitro n'est possible puisque l'étude porte sur la survie et le comportement de l'animal malade.
Objectifs
La maladie de Menkès est une maladie rare causée par un déficit d’un transporteur cellulaire du cuivre (ATP7A) au niveau des barrières intestinales, placentaires et hémato-méningées. Les traitements actuels sont inefficaces et le devenir de ces enfants reste extrêmement pauvre causant alors des déficits multi systémiques et un décès dans les premières années de vie. Dans le contexte de cette maladie, l’obstacle du passage au niveau des barrières intestinales et hémato-méningées est responsable de la pathologie. Le développement et l’étude des nanoparticules ont montré qu’elles avaient une capacité de diffusion inter et intracellulaire augmentée grâce à leur faible taille (
Bénéfices attendus
Chez les animaux malades traités avec le Transporteur synthétique de cuivre : 1) Restauration des fonctions altérées 2) Restaurations des fonctions cognitives principales 3) Amélioration de la survie L'objectif de ce projet est de développer un médicament capable de soigner des enfants porteurs de la mutation et qui ont une espérance de vie très réduite.
Procédures
1/ Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 au cours de la gestation jusqu’à la mise bas - Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 à partir de J5 et ce jusqu’à la fin du protocole à J38 pour les mâles descendants et porteurs de la maladie. 2/ Tests neurocomportementaux au nombre de 7 allant de J3 à J38 pour les souris mâles malades.
Impact sur les animaux
Chez les animaux malades non traités avec le TSC : défauts de croissance et difficultés d'alimentation, risque de mort des animaux non traités par rupture/anévrismes aortiques. Chez les animaux malades traités avec le TSC, une toxicité liée au produit peut apparaitre mais cela n'a encore jamais été observé dans les études que nous menons depuis juillet 2020. Des études de recherche de toxicité in vitro sur cellules hépatocytaires ainsi que des études anatomopathologiques sur reins ont été effectués et n’ont montré aucune toxicité.
Devenir
L’ensemble des animaux du protocole (85 animaux) seront gardés en vie après chaque procédure et ce jusqu’à la fin du protocole (fixé à J56 d’âge) afin de suivre l’évolution des animaux malades en réponse au traitement médicamenteux. L’âge de survie des animaux mutants non traités ou traités avec un placebo est compris entre 3 et 5 semaines d’âge. En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et tous les organes d'intérêt seront rapidement prélevés et conditionnés afin de réaliser des analyses biochimiques, enzymologiques et anatomopathologiques.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative d’approche in vitro car le projet porte sur l’étude de l’allongement de la durée de vie et l’amélioration du comportement de l’animal porteur de la maladie de Menkès en fonction de la réponse au traitement.
Réduction
L’étude complète prévoit la génération de 13 animaux mâles par groupe pour tenir compte du taux de mortalité élevé liée à la pathologie touchant seulement les mâles, mais s’arrêtera dès que les tests comportementaux seront réalisés sur 10 souris par groupe : donc un minimum de 70 (maximum 85) souris de laboratoire, réparties en 7 groupes de 10 mâles dont 2 groupes de 10 souris saines (sauvages) et 5 groupes de 10 souris mutantes (hémizygotes) seront utilisés jusqu’à l’âge de 2 mois. Il s'agit du nombre d'animaux nécessaires pour mener à bien cette étude afin d’obtenir une puissance statistique suffisante.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales (2 procédures seront appliquées : la gestion de la lignée mutante qui présente un phénotype dommageable pour l’animal, l’injection du TSC en sous-cutanée répétée 5 fois par semaine avec 8 tests pour l’étude comportementale) auront lieu dans l’animalerie, dans un environnement sécurisant pour l’animal. Une démarche d’estimation et suppression de la douleur est mise en place : différents éléments cliniques sont évalués chez l’animal afin d’établir un score qui permet d’anticiper et d’éviter d’atteindre les points limites déterminés au préalable, et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, yeux et abdomen creux). En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et des organes prélevés pour permettre des analyses biochimiques, enzymologiques et anatomopathologiques.
Choix des espèces
La souris ATP7AMoblo est le seul modèle de mutation spontanée permettant l'étude de cette maladie génétique, et il mime parfaitement la pathologie car nous observons chez la souris les mêmes symptômes que ceux rencontrés chez l'homme. D’autre part, ce choix se justifie par la possibilité de faire le lien avec d’autres modèles transgéniques murins d’autres maladies métaboliques liées à des troubles du métabolisme des oligo-éléments. Nous focaliserons l’étude sur les souriceaux durant la lactation des souris mères et jusqu’au-delà du sevrage, à J56, correspondant à la fin du dernier test comportemental. En effet, durant cette période nous pourrons évaluer l’efficacité du traitement sur l’évolution de l’activité neurocomportementale des animaux en réponse au traitement médicamenteux.
Production de souris humanisées pour le système immunitaire : modèle d’étude pour l’immunobiologie, les pathologies humaines et l’évaluation de traitements.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
3 260 souris vont être utilisé·es, dont 2 960 réutilisées dans d'autres procédures, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent des cellules souches humaines après irradiation, puis des injections, gavages et prélèvements sanguins répétés jusqu'à huit fois, avec un suivi par imagerie. Il s'agit d'une plateforme produisant à la demande des souris "humanisées" pour le système immunitaire, fournies à des laboratoires pour tester vaccins et traitements. Le porteur présente ce modèle comme une alternative au primate non-humain et affirme qu'il est le "seul modèle d'hématopoïèse humaine expérimentale".
Objectifs
L’étude in vivo de la physiopathologie de nombreux pathogènes humains ainsi que l’analyse de l’activité et de l’innocuité des traitements et vaccins contre ces pathogènes ne peut être réalisé chez l’Homme pour des raisons éthiques. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces pathogènes dans un modèle expérimental, des modèles de souris humanisées pour le système immunitaire (souris HIS) ont été développés au cours des deux dernières décennies. Ces souris HIS sont des modèles in vivo précliniques qui permettent d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…). Dans ce projet, nous proposons de produire des souris HIS qui seront par la suite soit utilisées par des laboratoires de recherche dans le cadre de leurs projets de recherche sur les pathologies humaines et/ou de développement de nouveaux vaccins ou traitements. Dans ce projet, nous testerons l’activité de nouvelles immuno-modulateurs thérapeutiques ou de nouveaux vaccins afin de tester leur activité et/ou leur impact sur le système immunitaire humain.
Bénéfices attendus
Ces souris HIS générées dans ce projet permettront d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène de pathogènes humains mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…).
Procédures
irradiation (1 par animal, durée : quelques minutes) - prélèvement sanguin (1 à 8 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 2 à 4 semaines) - injection hydrodynamique (1 par animal, durée 7-8 secondes) - injection intra-péritonéale (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1jour à 1 mois) ) - injection intra-veineuse (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - injection intra-musculaire (1 à 3 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1semaine à 1 mois) - injection sous-cutanée (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) -administration dans eau de boisson (1 à 8 par animal, durée 24h à 1 mois, intervalle 1 jour à 1 mois) - administration par gavage (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - imagerie IVIS (2 à 10 par animal, durée 5min, intervalle entre 3 jours et 1 mois)
Impact sur les animaux
Immunodéficience : du fait de leur degré d’immunodéficience, ces animaux sont très sensibles aux infections. TSLP : Après irradiation les souris transgéniques pour TSLP peuvent développer avec l’âge des tumeurs d’origine murine. Après humanisation, ces souris peuvent développer des dermatites. L’apparition des signes cliniques est suivie régulièrement et des soins seront apportés en cas d’apparition de symptômes. Irradiation : de potentiels effets néfastes à long terme de l’irradiation, tels que le développement de tumeurs, pourraient apparaitre. Cependant, cette procédure est appliquée depuis de nombreuses années dans le laboratoire et il n’a été constaté des signes cliniques de ces effets néfastes que dans une minorité (5 mois). Injection Hydrodynamique : un risque de dyspnée peut arriver dans les 5-10 minutes après injection. Si une dyspnée est observée la souris sera mise à mort.
Devenir
Les animaux portant un système immunitaire humain générés dans une procédure pourront être inclus d'autres procédures du même projet (par exemple pour booster certaines cellules humaines, augmenter le nombre de cellules myeloides humaines, valider l’activité d’immuno-modulateurs) ou d'autres projets à la demande des utilisateurs de la plateforme). Les autres souris utilisées pour valider l’activité d’immuno-modulateurs seront mises à mort pour analyse des différents organes post-mortem.
Remplacement
Les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble, contre des tumeurs ou des pathogènes à tropisme exclusivement humain ni de prédire l’efficacité et l’innocuité de nouveaux vaccins ou traitements immunomodulateurs contre ces tumeurs ou pathogènes. Historiquement, le modèle de choix pour ces études est le primate non humain, le modèle de souris HIS est un modèle alternatif qui peut permettre de limiter le nombre d’études sur le primate non humain.
Réduction
Nous évaluons notre niveau de production de souris HIS à 380 souris la première année, 570 la deuxième année, 770 chaque année pour les 3 années suivantes, soit un total de 3260 souris sur 5 ans. Ces chiffres ont été calculés en tenant compte 1. du nombre d’opérateurs de la plateforme (facteur limitant la production la première année et qui passera de 2 à 4 FTE entre les années 1 et 3), 2. du nombre d’utilisateurs intéressés par les modèles développés par notre plateforme qui est estimé à 4 la première année, 6 la deuxième année et devrait se stabiliser à 8 par an à partir de la 3ème année. 3. du fait qu’environ 80% des animaux présenteront un niveau d’humanisation >10%, 4. du fait que la plateforme fournira en moyenne 75 souris humanisées par utilisateur et par an (15 pour étude pilote et 30 pour expérience principale, en comptant 1 étude pilote et 2 expériences principales /utilisateur/an).
Raffinement
La planification des expériences en amont et la concertation entre le personnel de la plateforme et les utilisateurs sont des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des études pilotes seront réalisées en amont des études principales. Enfin, l’état clinique (pelage, mouvement, activité, pâleur, signes de bagarres, apparition de tumeurs) des animaux sera suivi deux fois par semaine pour permettre la détection de signes de souffrance. En cas d’apparition de signes de souffrance, un analgésique pourra être administré aux souris. Si les signes de souffrance persistent, une mise à mort sera effectuée pour prévenir toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La souris humanisée présentant un système immunitaire humain (HIS) est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale. Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris HIS sont générées par injection de cellules souches isolées dans des souriceaux nouveau-nés de moins de 9 jours car les nouveaux nés sont plus permissifs à la greffe dans les premiers jours de vie. Le contrôle qualité par vérification du niveau d’humanisation dans le sang sera réalisé à l’âge adulte entre 8 et 12 semaines. Ce nombre de semaines correspond au temps minimum nécessaire au développement du système immunitaire humain dans une souris à partir de cellules souches hématopoïétiques. Les souris HIS seront ensuite utilisées entre 12 et 25 semaines de vie. Cet intervalle d’âge correspond à la période pendant laquelle le système immunitaire humain est le plus stable chez la souris.
Effet des endozépines sur l’anxiété et l’homéostasie glucidique et énergétique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
658 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère, 208 en gravité sévère. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique, des instillations intranasales une à deux fois par jour pendant quinze jours, des prélèvements sanguins répétés six fois en une heure, deux tests d'anxiété et un séjour en cage métabolique. Le porteur teste un peptide coupe-faim contre l'obésité, en vérifiant d'abord qu'il ne provoque pas d'effet anxiogène, avant un "éventuel transfert en clinique humaine". Il affirme qu'aucun modèle ne peut se substituer à l'animal pour cette étude.
Objectifs
L’obésité est un problème majeur de santé publique à forte prévalence dans les pays industrialisés. Les dernières données recueillies en France montrent en effet que 32% des adultes sont en surpoids et que 15% sont obèses. En marge des traitements diététiques et d’accompagnement de première intention et des solutions instrumentales ultimes comme la chirurgie bariatrique, l’arsenal thérapeutique actuel est d’autant plus réduit que des médicaments sont retirés du marché en raison de leurs effets secondaires marqués. Il est maintenant bien établi que certains neuropeptides jouent un rôle clé dans le contrôle de la prise de nourriture. Dans ce contexte, il a été démontré que l’administration intracérébroventriculaire d’une faible dose de l’octadécaneuropeptide ODN et intranasale d’un de ses analogues entraînent une forte diminution de la prise alimentaire, sans aucune autre manifestation comportementale, et qu’ils jouent donc un rôle clé dans la régulation centrale de l’homéostasie énergétique. Notre travail s’oriente vers la validation des effets d’une instillation intranasale unique ou répétée de peptide sur le comportement alimentaire chez la souris vigile normalement alimentées ou en régime hypercalorique, avant un éventuel transfert en clinique humaine. Au préalable, nous devons vérifier que l’administration d’une faible dose de peptide chez la souris n’entraine pas d’effet anxiogène comme attendu et rapporté dans la littérature. Aucun modèle ne peut se substituer à l’utilisation d’un animal dans cette étude. Le projet est constitué de 3 procédures et les données expérimentales seront recueillies chez les animaux vigiles à différents temps post-administration et une fois euthanasiés pour une quantification de gènes cibles.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude devraient permettre l’obtention d’avancées significatives dans la recherche fondamentale et translationnelle du système endozépinergique. Tout d’abord, cette étude clarifiera le rôle joué par le récepteur de l’ODN dans les effets anorexigènes du peptide. Elle délimitera aussi la fenêtre thérapeutique en termes de dose à administrée pour s’affranchir d’un effet anxiogène indésirable éventuel et enfin, elle confirmera que la voie intranasale est particulièrement bien adaptée pour traiter nos animaux.
Procédures
Au cours du projet, certains animaux seront soumis à : -une chirurgie stéréotaxique qui constitue l’acte de chirurgie expérimentale majeur (30 min). -une instillation intranasale sous contention 1 fois ou 2 fois par jour pendant 15 jours (2 min/instillation). -une injection intrapéritonéale unique (2 min). -un prélèvement sanguin caudale (3 min) répété 6 fois en 1 heure. -deux tests d’anxiété de 5 et 10 min espacés d’une semaine. -un hébergement en cage métabolique de vie normale (21 jours).
Impact sur les animaux
A priori, nous n’attendons pas de manifestations indésirables majeures chez les animaux utilisés dans l’ensemble de cette étude. Nous porterons néanmoins une attention particulière (surveillance accrue) à la douleur des animaux canulés ou prélevés (sang), et aux stress des groupes contrôle positif du contingent engagé dans les tests d’anxiété et ceux qui perdront du poids. Les traitements n’induiront ni douleur, ni inflammation, ni changement du comportement autre ceux anticipés, considérés et maitrisés qui pourraient nuire au bien-être des animaux. Les effets mesurés chez les animaux sont transitoires et les traitements aigus suffisamment espacés (1 semaine) pour permettre une récupération totale des animaux et s’affranchir d’effets indésirables cumulatifs.
Devenir
Tous les animaux reçoivent un traitement pharmacologique aigu ou chronique et peuvent difficilement être réaffectés à d’autres protocoles. De plus, les expérimentions se déroulant dans une zone dédiée, les animaux ne peuvent pas retourner dans la zone d’élevage et être utilisés comme animaux reproducteurs. Pour l’ensemble de ces raisons tous les animaux sont euthanasiés rapidement après la fin des procédures.
Remplacement
Le projet scientifique vise à étendre la compréhension de la régulation de l’homéostasie énergétique pour envisager de nouveaux traitements contre l'obésité et le diabète. Dans la mesure où aucun modèle de substitution permettant de mener à bien ces différents objectifs physiologiques et pharmacologiques n’est actuellement disponible et devant la complexité des mécanismes mis en jeu et leur interconnexion, l’ensemble de l’étude sera réalisé in vivo chez la souris. De plus, de nombreux modèles de souris ont déjà été développés afin de mieux appréhender l’origine des dérèglements centraux de l’homéostasie énergétique et proposer de nouvelles alternatives thérapeutiques.
Réduction
En accord avec des expériences antérieures et pour limiter le nombre d’animaux utilisés, les études sont conduites sur des lots de 10 souris par condition de traitement. Le dispositif de cages métaboliques étant paramétré autour de 8 cages de vie normale, l’effectif sera à ce titre diminué d’autant. Ces effectifs nous assurent d’obtenir des données statistiquement comparables. Les deux tests d’anxiété sont réalisés sur les mêmes animaux à une semaine d’intervalle et après randomisation des animaux. De même, le test de tolérance au glucose est mené sur les mêmes animaux randomisés que ceux ayant subis le test de sensibilité à l’insuline, une semaine plus tard afin de garantir la normalisation de la glycémie basale. Un certain nombre de groupes expérimentaux ont été prévus mais ne seront inclus dans l’étude qu’en cas de besoin.
Raffinement
Les souris sont élevées et maintenues en cage standard conformément à la réglementation avec un enrichissement du milieu de vie constitué de nids en copeau de peuplier. Les expériences sont menées dans une pièce adjacente de la zone d’hébergement. Par ailleurs, les animaux sont surveillés pendant et après toute la durée du protocole et leur score quotidien confronté à la grille de score préalablement détaillée incluant des points limites adaptés.
Choix des espèces
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré (in vivo sur animal entier) peut nous permettre de comprendre, de façon globale, la contribution du système endozépinergique dans l’homéostasie énergétique et comment il peut être instrumentalisé pour rééquilibrer les dysfonctions liées aux pathologies associées. La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie (taille et coûts d’entretien réduits, bonne performances reproductives). De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques de l’altération du comportement alimentaire car elle est relativement sensible à une modification de son régime alimentaire. Afin de mener à bien nos objectifs, nous effectuerons nos expériences sur des souris adultes âgées de 6 à 10 semaines. En effet, à cet âge les souris ont terminé leur croissance longitudinale et la prise de poids est minimale après cette période.
Rôle du facteur de croissance des nerfs dans l’inflammation associée à l’hypertension artérielle pulmonaire idiopathique chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
280 rats vont être utilisé·es, tous tués à l'issue sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte de la monocrotaline pour déclencher une hypertension artérielle pulmonaire, puis un anticorps anti-NGF, avant des mesures échographiques et de pression cardiaque sous anesthésie. Le porteur veut confirmer que bloquer le facteur de croissance NGF freine la maladie, avec des retombées thérapeutiques annoncées à terme. Il soutient que la maladie induite reste peu douloureuse faute d'effort imposé aux rats, et affirme que ces interactions complexes ne peuvent être reproduites in vitro.
Objectifs
L’hypertension artérielle pulmonaire ou HTAP est une maladie grave qui touche les artères pulmonaires conduisant le sang du cœur vers les poumons pour y être réoxygéné. Dans cette maladie, la pression augmente de manière anormale dans ces artères, et le cœur doit alors travailler plus fort pour envoyer le sang dans ces artères. A force de travailler plus, il finit par fonctionner mal, entrainant le décès des patients. Aucun médicament actuellement sur le marché ne permet de guérir cette maladie, et il faut donc essayer de développer des nouveaux médicaments plus efficaces. Nous pensons que développer un médicament qui bloquerait le facteur de croissance des nerfs NGF pourrait avoir un grand intérêt dans cette maladie. En effet, nos expériences sur cultures de cellules humaines suggèrent que le NGF participe à l’inflammation présente dans l’HTAP. Le NGF pourrait notamment attirer des cellules inflammatoires à proximité des artères pulmonaires, et ces cellules inflammatoires libèreraient alors des substances qui contribuent aux altérations de ces artères pulmonaires qu’on observe dans la maladie. Nous souhaitons à présent valider cette hypothèse dans un modèle plus intégré d’HTAP, en utilisant le modèle monocrotaline (MCT). Ce modèle d’HTAP chez le rat est classiquement utilisé dans la littérature et déjà en place au laboratoire. L’utilisation de ce modèle est nécessaire car nous ne pouvons pas modéliser en culture les interactions complexes qui existent entre les cellules inflammatoires et les cellules des artères pulmonaires, afin de déterminer quel est le rôle du NGF dans ces interactions. Ainsi, ce projet va nous permettre de traiter les rats avec un anticorps qui bloque le NGF et voir si ce traitement empêche le développement de la maladie, en modifiant l’inflammation et ses conséquences sur les artères pulmonaires.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de déterminer les conséquences du blocage in vivo du NGF sur le développement de l’HTAP, et en particulier sur sa composante inflammatoire. Ainsi, l’effet d’un traitement à l’aide d’anticorps bloquants anti-NGF sera évalué sur l’élévation des pressions ventriculaires droites et de la pression artérielle pulmonaire, sur le débit cardiaque et sur l’hypertrophie ventriculaire droite pour apprécier les effets bénéfiques sur les paramètres qui définissent l’HTAP. Puis l’effet de ce traitement sera évalué ex vivo sur l’infiltration des monocytes et leur activation dans le poumon, sur la sécrétion de substances inflammatoires et leurs conséquences sur les artères pulmonaires. Les résultats obtenus dans ce modèle nous permettront ainsi de mieux comprendre le rôle physiopathologique du NGF dans l’inflammation associée à l’HTAP, et ainsi de contribuer à confirmer que le NGF est une nouvelle cible thérapeutique d’intérêt dans cette pathologie.
Procédures
Dans la 1ère partie de la procédure, les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales. Ils en recevront au maximum 6 sur la durée totale du protocole (28 jours), réparties de la manière suivante : Jour 0 (Anticorps), Jour 1 (solvant ou monocrotaline), Jour 8 (Anticorps), Jour 15 (Anticorps) et Jour 22 (Anticorps). Les volumes injectés sont faibles à chaque injection (200 ou 500µl) et la durée d’injection est très courte (quelques secondes par animal). 240 animaux seront concernés par ces injections (groupes 3 à 14). Dans la 2ème partie de la procédure, les animaux seront soumis à des mesures in vivo, sous anesthésie gazeuse et analgésie complémentaire, afin de réaliser des mesures échographiques (durée : une dizaine de minutes par animal), puis des mesures de débit cardiaque et de pressions ventriculaires droites et artérielles pulmonaires (durée : une vingtaine de minutes par animal). L’ensemble des animaux seront concernés par ces mesures, soit 280 animaux.
Impact sur les animaux
L’injection intrapéritonéale est peu douloureuse lorsqu’elle est bien réalisée. Les injections de monocrotaline, de son solvant seul, des anticorps non pertinents ou des anticorps bloquants anti-NGF n’est pas décrite comme provoquant des douleurs post-injection dans la littérature. Toutefois, les signes cliniques de souffrance seront surveillés quotidiennement pendant la suite du protocole. Concernant le développement de la maladie en elle-même, chez l’homme, l’HTAP n’induit pas de souffrances élevées mais plutôt une gêne respiratoire exacerbée lors d’un effort. Etant donné que les animaux ne seront pas soumis à l’effort, la souffrance est considérée comme légère dans ce type de protocole d’induction d’une maladie.
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux, toujours sous anesthésie gazeuse, seront euthanasiés (sans réveil) et les expérimentations suivantes auront lieu sur tissus prélevés après euthanasie.
Remplacement
Ce projet a pour but d’identifier des mécanismes in vivo pour valider la pertinence des résultats obtenus in vitro. En effet, nous recherchons à identifier un lien entre NGF, monocytes, IL-1b et altérations des artères pulmonaires. Nous avons réalisé des expériences in vitro qui nous ont permis notamment de montrer que le NGF stimule la libération d’une substance inflammatoire qui induit in vitro différents effets sur les cellules artérielles pulmonaires humaines en culture. Pour montrer que le blocage du NGF et de ce mécanisme conduit à des effets bénéfiques sur le développement de l’HTAP, ce projet nécessite à présent l’utilisation d’animaux pour modéliser cette pathologie in vivo (pathologie impossible à modéliser in vitro de manière complète pour le moment) et pour valider l’utilisation d’anticorps bloquants anti-NGF comme traitement possible de l’HTAP.
Réduction
L’estimation du nombre d’animaux à utiliser est basée sur les analyses des études déjà menées au laboratoire sur ce même modèle compte-tenu de la taille requise des échantillons pour une analyse statistique pertinente dans ce type de recherche. De plus, cette estimation tient également compte des données de la bibliographie et du fournisseur qui décrivent un effet variable de la monocrotaline en fonction des lots commandés. Pour optimiser le nombre d’animaux utilisés : (1) le plan d’expériences a été optimisé afin de pouvoir réaliser les expériences in vivo et ex vivo sur les mêmes animaux et afin d’utiliser les deux poumons de chaque animal (utilisation par exemple du poumon gauche pour les expériences de contraction et utilisation du poumon droit pour l’étude de l’expression de différentes protéines d’intérêt) (2) parallèlement à ce protocole, des études continueront à être réalisées sur des cellules d’artères pulmonaires humaines en culture afin d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans les effets observés. Ainsi, nous optimiserons l’utilisation des animaux et les remplacerons par des cellules humaines autant que possible. Au final, cette démarche nous a conduit à un protocole utilisant 14 groupes comptant chacun 20 animaux, soit un total de 280 animaux (140 mâles et 140 femelles, puisque nous souhaitons également explorer les différences éventuelles des effets observés en fonction du sexe). Ce nombre sera réduit si les résultats obtenus sont statistiquement significatifs (ou résolument non significatifs) avant la fin de la totalité des séries prévues. Les expérimentations sont planifiées pour obtenir un maximum de résultats expérimentaux sur un nombre d’animaux le plus faible possible (mesures échographiques, de débit cardiaque et de pression artérielle pulmonaire puis expériences ex vivo ultérieures après euthanasie réalisées sur les mêmes animaux, une seule procédure).
Raffinement
À leur arrivée, les animaux sont hébergés en cages collectives, pourvues d’enrichissement du milieu (litière : copeaux de peuplier ; enrichissement : papier tressé, morceaux de bois, tunnels et maisons en carton). 2 à 3 animaux seront hébergés dans chaque cage. La nourriture et l’eau seront données à volonté, et le change effectué une fois par semaine (cage, litière, biberon). Un suivi quotidien (week-ends, vacances et jours fériés inclus) des animaux sera effectué par le personnel de l’animalerie pour prévenir tout inconfort, souffrance ou comportement anormal des animaux. Au moment de cette procédure expérimentale, les animaux seront observés et cette surveillance portera sur le suivi du poids des animaux, sur leur apparence, et sur des paramètres comportementaux (mobilité, interaction avec ses congénères, peur, agression, vocalisation, automutilation, activité diminuée ou augmentée, prostration). Une feuille de suivi des animaux, sur laquelle sont précisées les conduites à tenir en cas de problème de santé de l’animal, sera complétée. L’expérience des personnels de l’animalerie nous garantit un bon suivi des animaux. Si le suivi du poids fait apparaitre une perte de poids des animaux supérieure à 5% par rapport à leur poids initial, une mise à disposition de nourriture humidifiée posée directement au fond de la cage sera effectuée, jusqu’à ce qu’une amélioration de l’état de l’animal soit observée. Les animaux seront sacrifiés en cas de perte de 20% de poids par rapport à leur poids initial, ou si l’animal perd 10% de son poids par rapport à la dernière pesée. En cas de détection de signe de douleur, dans un premier temps, une administration d’antalgique sera réalisée, et l’animal en souffrance sera alors surveillé toutes les demi-heures pendant deux heures. En cas de souffrance ou de détresse persistante au-delà de cette période malgré l’administration d’antalgique, une procédure d’euthanasie sera mise en œuvre.
Choix des espèces
Le rat est une espèce classiquement utilisée pour le développement de modèles d’hypertension pulmonaire. De plus, le laboratoire utilise cette espèce depuis plusieurs années, et dispose donc de nombreuses données sur lesquelles s’appuie le présent projet. Le modèle monocrotaline est le modèle que nous souhaitons utiliser dans cette DAP pour compléter des expériences déjà réalisées avec ce modèle. Le choix du rat est d’autant plus justifié par le fait que le modèle monocrotaline ne fonctionne pas chez la souris. En effet, pour être active et induire le développement d’une hypertension pulmonaire, la monocrotaline doit être métabolisée en un dérivé, appelé monocrotaline pyrrole, par des enzymes présentes dans le foie. Or ces enzymes nécessaires à cette réaction n’existent pas chez la souris. Ce modèle monocrotaline ne fonctionne donc pas chez la souris, et nécessite forcément l’utilisation du rat. Nous utiliserons des rats jeunes de 200g. Le protocole utilisé se déroule sur 4 semaines et les données de la littérature ainsi que les résultats précédents obtenus au laboratoire préconisent d’utiliser des rats de ce poids pour ce type de protocole. En effet, au-delà de 200g en début de protocole, l’injection de monocrotaline est décrite comme moins efficace pour entraîner le développement d’une hypertension artérielle pulmonaire.