Recherche fondamentale

6 720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est irradiée puis reçoit une greffe de moelle osseuse, toutes reçoivent une injection de cellules tumorales sous la peau et, pour certaines, des chimiothérapies ou immunothérapies pendant plusieurs mois, la tumeur pouvant se nécroser et s'ulcérer. Le projet étudie comment la cellule cancéreuse échappe au système immunitaire, la pertinence clinique d'inhibiteurs étant annoncée comme un espoir. Le porteur affirme que les études in vitro ne reproduisent pas les voies d'un modèle intégré et que le remplacement n'est "pas applicable".

Objectifs

La cellule tumorale a besoin de s'adapter rapidement à un environnement dynamique, parfois hostile, afin de continuer à se multiplier et à survivre. Notre système immunitaire est initialement capable de reconnaître une cellule cancéreuse et de l’éliminer. Toutefois la cellule cancéreuse est capable de s’adapter et de devenir invisible afin de ne pas être éliminée par ce système de défense. Un des mécanismes impliqués dans l’adaptation rapide de la cellule cancéreuse, permet la production de protéines spécifiques qui rendront la cellule cancéreuse invisible au système immunitaire. Une des nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement du cancer consiste à utiliser des molécules qui inhibent la production des protéines. Etudier ce mécanisme d’adaptation de la cellule cancéreuse qui empêche le système immunitaire d’être efficace et définir l’impact des inhibiteurs de ce mécanisme sur le développement de la tumeur et les propriétés des cellules cancéreuses et immunitaires sont les objectifs principaux de ce projet.

Bénéfices attendus

La dynamique d’interaction entre les cellules cancéreuses et immunitaires font intervenir des mécanismes d’adaptation rapide qui impliquent la production de protéines spécifiques. Analyser cette dynamique au niveau de la production des protéines est particulièrement innovant et important car il existe des études pré-cliniques montrant l'intérêt d'utiliser des inhibiteurs de la production des protéines dans le traitement de certains cancers. Alors que nous comprenons de mieux en mieux comment ces inhibiteurs affectent la cellule tumorale, peu d’études portent sur les effets de ces inhibiteurs dans la réponse immunitaire anti-tumorale. Enfin, la pertinence clinique de l'utilisation de ces inhibiteurs sera évaluée au regard des thérapies conventionnelles, d’autres thérapies ciblées et immunothérapies utilisées en clinique, en espérant définir de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Certaines souris seront irradiées. Dans les 24 heures suivant l'irradiation, les souris seront anesthésiées puis recevront de la moelle osseuse par voie intraveineuse (injection dans la veine retro-orbitale). 6 semaines après l’irradiation, ces souris seront anesthésiées afin de réaliser un prélèvement de sang et d’analyser la reconstitution de la moëlle osseuse. Toutes les souris recevront une injection sous-cutanée de cellules tumorales et les tumeurs seront mesurées au minimum 3 fois par semaines pendant 3 à 22 semaines en fonction du modèle de tumeur. Certaines souris recevront un traitement (Chimiothérapie conventionnelle, thérapie ciblée, immunothérapie) dès que le volume tumoral atteint 50 mm3. Ce traitement sera administrés per os ou par voie intrapéritonéale. La fréquence des traitements dépend de leur nature et s’étend de 5 fois par semaine à tous les 21 jours et ce pendant 21 à 154 jours selon le modèle de tumeurs.

Impact sur les animaux

Le modèle syngénique de tumeurs sous-cutanées chez la souris qui consiste à injecter des cellules tumorales murines de même fond génétique que les souris réceptrices immunocompétentes, est communément utilisé pour l’évaluation de l’efficacité d’une thérapie dans de nombreux types de cancers. Au cours du développement de la tumeur sous-cutanée, aucune nuisance ni effet indésirable n’est observé chez la souris. Si toutefois les tumeurs grossissent très rapidement, il peut arriver qu’elles se nécrosent au centre et commencent à s’ulcérer ou à saigner. Dans ce cas, c’est un point limite et les souris seront sacrifiées. Aussi, la santé des souris et l’aspect des tumeurs seront surveillés 3 fois par semaine après injection des cellules tumorales puis tous les jours lorsque l’on se rapproche de la taille tumorale maximale. La chimiothérapie conventionnelle est bien tolérée chez la souris, les effets secondaires sont faibles et les plus fréquents sont des diarrhées. Les effets indésirables les plus fréquents associés à l’immunothérapie sont d’ordre cutanés (rash, prurit dans 15 à 25% des cas) ou gastro-intestinaux (diarrhées dans 15 à 30% des cas), dans les deux cas ces atteintes sont bénignes et réversibles dès l’arrêt du traitement. Ces effets indésirables sont les mêmes dans le cas de traitements avec des inhibiteurs de la voie des MAPK. Une photosensibilité cutanée est également souvent observée dans le cas de traitements avec certains inhibiteurs de cette voie de signalisation. Aucun effet indésirable n’a été reporté dans le cas de traitements des tumeurs chez la souris avec des inhibiteurs de la traduction. Il est important de noter que les effets indésirables observés en monothérapie sont les mêmes que ceux observés en thérapie combinée.

Devenir

18 lots de souris (soit 432 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses. 90 lots de souris (soit 2160 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs afin de tester l’efficacité de différents traitements anti-cancéreux tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses. 6 lots de souris chimères hématopoïétiques (soit 144 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses. 30 lots de souris chimères hématopoïétiques (soit 720 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs afin de tester l’efficacité de différents traitements anti-cancéreux tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.

Remplacement

Ce projet fait suite à des nombreuses expériences réalisées in vitro dans des modèles cellulaires. Malheureusement le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne reproduiraient pas l’ensemble des voies impliquées dans des modèles physiopathologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine et l’évaluation de l’efficacité des traitements pour cette pathologie.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux. Les résultats préliminaires ont permis de valider que des lots de 8-10 souris selon les paramètres à évaluer permettent d’acquérir des données fiables.

Raffinement

Les animaux ont une semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Les animaux seront suivis au minimum 3 fois par semaine dès l’initiation du modèle. Un animal sera euthanasié s’il présente un des points limites d’arrêt de la procédure, que nous aurons définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal.

Choix des espèces

Nous disposons de souris knockout (KO) présentant des altérations de la voie des MAPK. Ces souris immunocompétentes seront utilisées pour générer des modèles syngéniques de tumeurs sous-cutanées. Ces modèles sont communément utilisés pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement tumoral et pour évaluer l’efficacité des thérapies anti-cancéreuses car ils reproduisent la complexité des tumeurs observées chez l’homme. Nous réaliserons des chimères hématopoïétiques qui présenteront des altérations de la voie des MAPK uniquement dans les lymphocytes B et T. La comparaison des résultats obtenus dans les deux modèles, KO total vs. chimères, permettra d’établir si l’impact des altérations de la voie des MAPK sur la croissance tumorale, le phénotype et la réponse aux traitements est extrinsèque et/ou intrinsèque aux lymphocytes. Enfin des altérations de la voie des MAPK seront réalisées uniquement dans les lymphocytes T CD4 ou T CD8 ayant un récepteur permettant la reconnaissance spécifique d'antigène présent à la surface des cellules cancéreuses.

4 022 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant six mois un régime riche en gras et en sucre, des gavages et injections quotidiens pouvant atteindre 210 gestes, une coupure de la queue pour les prises de sang et un isolement en cage individuelle que le porteur décrit comme stressant. L'objet est de comprendre le rôle du microbiote intestinal dans le diabète et la stéatose, avec des pistes thérapeutiques annoncées pour une "préoccupation majeure de santé publique". Le porteur affirme qu'aucun système in vitro ne simule le lien entre microbiote, intestin et organes, et juge le recours aux souris "nécessaire".

Objectifs

Le tube digestif est un milieu complexe dans lequel coexistent des cellules de l’hôte, une grande diversité de microorganismes (constituant le microbiote) et des molécules provenant de l’alimentation. Les bactéries et les produits qu’elle sécrètent y jouent un rôle crucial pour la bonne santé de l’hôte. Ainsi un déséquilibre de la diversité de microorganismes a été montré chez les patients atteints de maladies métaboliques comme le diabète ou stéatose hépatique non alcoolique. Notre travail de recherche vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales dans des conditions physiologiques (individus sains) et pathologiques (individus malades). Des travaux suggèrent que certaines bactéries du tube digestif et produits bactériens sont responsables de dérèglements métaboliques chez l’hôte. L’objectif de ce projet est d’explorer les mécanismes, d’identifier le rôle des bactéries et les cellules associées impliquées dans ces dérèglements dans trois modèles murins de maladies métaboliques (prédiabète, diabète et stéatose hépatique non alcoolique).

Bénéfices attendus

Les maladies métaboliques sont une préoccupation majeure de santé publique et leur incidence est en constante augmentation. Les maladies métaboliques sont associées à un régime alimentaire déséquilibré et à l’obésité. De nombreux travaux étudiant l’obésité témoignent d’une perturbation du microbiote intestinal et d’une augmentation des réponses inflammatoires dans les intestins ou dans les organes périphériques, associées à une dérégulation métabolique de l’hôte. Malgré la prise en charge thérapeutique des patients obèses, la persistance de l’inflammation et d’une perturbation du microbiote conduisent souvent à un retour de la maladie au cours de la vie de l’individu. Il apparait alors aujourd’hui essentiel d’identifier les mécanismes impliqués pour proposer des solutions permettant le dépistage et le traitement des maladies métaboliques. Ce projet amènera une meilleure compréhension de l’implication du microbiote dans la réponse inflammatoire liée à l’obésité et de ses effets sur les maladies métaboliques comme le diabète et la stéatose et ainsi proposer de nouvelles voies thérapeutiques permettant le traitement et la prévention de ces maladies.

Procédures

Pendant une durée maximale de 30 semaines, les souris recevront un régime alimentaire riche en gras, en sucre ou en cholestérol susceptible de moduler leur ingestion quotidienne et leur prise de poids. Les souris seront soumises à des injections (quelques secondes) ou des gavages (quelques secondes) quotidiens pour une période comprise entre 12 et 30 semaines soit 210 au maximum. Deux gavages et 1 injection seront aussi réalisés en fin de protocole au cours de deux tests qui seront espacés d’une semaine chacun, ainsi qu’une petite coupure à l’extrémité de la queue (1 seconde) et massage (quelques secondes). Nous effectuerons 2 collectes de fèces lors de l‘émission naturelle en début et fin de protocole. La durée maximale de la collecte est estimée à 30 min maximum. Un prélèvement de sang de la joue sera réalisé une fois sur animaux vigiles en fin de procédure avant l’euthanasie. Ce prélèvement dure 15 à 20 secondes.

Impact sur les animaux

Pour étudier l’impact du microbiote qui est différent entre les individus et suivre la prise alimentaire qui est une donnée essentielle à nos études, les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré. Les prélèvements fécaux (émission naturelle de fèces par la souris en début et en fin de protocole) et pesées des animaux (une fois par semaine) seront réalisées sur tous les animaux dans des pots de récolte ou de pesée, ce qui entraine un stress léger. Les animaux seront soumis à des gavages et des injections quotidiens tout au long du protocole. Bien que chaque action engendre un stress léger et de très courte durée (moins de 10 secondes), cette répétition de gestes engendre un stress requalifié de léger à modéré. La procédure de prélèvement de sang nécessaire à la lecture de la glycémie (OGTT, IPGTT) et l’insulinémie (ITT) présente une douleur légère car il est réalisé via une petite coupure au niveau de la queue réalisée une seule fois par l'expérimentateur lors du premier prélèvement du test. . Par la suite un simple massage permet de prélever du sang sans avoir à recouper la queue. L'état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l'expérience. Ces trois tests nécessitent une mise à jeun de 6 heures. Afin d’éviter une période de jeûne trop drastique lors de ces tests, ceux-ci ne seront pas réalisés durant la phase nocturne mais en phase diurne. Un délai minimum d’une semaine séparera deux tests (OGTT/IPGTT/ITT). Les bactéries (pro-ALPK1) et molécules (ADP-H, agonistes et antagonistes) administrées n’ont pas d’effet indésirable connu chez les animaux. Pour les souris soumises aux régimes riches en graisse, la prise de poids associée à ces régimes sur la durée d’exposition n’affecte pas leur mobilité.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure pour le prélèvement de leurs organes et tissus utilisés pour des analyses nécessaires à ce projet.

Remplacement

Il n’existe aujourd’hui pas de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler un système digestif en lien avec le microbiote, l’inflammation intestinale, les tissus périphériques (foie, tissus adipeux) et la régulation de la glycémie. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données sur les bactéries du microbiote intestinal en lien avec les données biologiques obtenues à partir des différents tissus.

Réduction

Le choix des molécules et bactéries testées dans ce projet l’ont été préalablement sur des systèmes cellulaires in vitro. Ainsi, nous avons sélectionné les bactéries et molécules les plus intéressantes et les plus activatrices pour réduire le nombre de molécules et bactéries à tester in vivo. Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental, car d’après les études déjà menées au laboratoire, ce nombre apparait nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés. Nous allons tester 2 bactéries ou molécules en même temps ce qui permettra de diminuer le nombre de contrôles entrant dans le protocole expérimental. Chaque lignée de souris provient d’élevages indépendants.

Raffinement

Les souris bénéficieront d’un enrichissement avec du papier pour réaliser des nids et une maison en propylène rouge pour permettre aux souris de faire ce nid et se cacher. Elles auront également un bâton à ronger. Afin de palier au stress induit par l’isolement, les cages seront en plexiglass transparentes et mises côte à côte pour permettre les interactions visuelles, sonores et olfactives entre les animaux. Ces enrichissements permettent d'assouvir au mieux les comportements naturels de l'animal. Les animaux seront observés chaque jour (surveillance visuelle) et plus précisément deux fois par semaine au moment de la prise alimentaire quantifiée (par pesée de l’aliment) et de la prise de poids des animaux. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole et euthanasié. Les souris dormant le jour, nous réaliserons les mises à jeun pendant la journée afin de limiter la sensation de faim.

Choix des espèces

Les animaux auront 8 semaines au début de la procédure, âge auquel le système immunitaire est mature et le microbiote intestinal stabilisé. Le modèle souris est largement étudié dans les recherches sur les maladies métaboliques, ce qui permet l’accès à de nombreuses données physiologiques et metaboliques. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal. De plus, les délétions de gènes spécifiques dans un type de cellules donné sont uniquement présent dans ce modèle.

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris immunodéprimées reçoivent une greffe de cellules de cancer du sein humain dans la glande mammaire, puis une injection d'un peptide radiomarqué et une imagerie sous anesthésie, avant une ponction cardiaque qui les tue. L'objectif est de vérifier où se fixe ce traceur dans l'organisme, première étape avant une éventuelle application diagnostique ou thérapeutique laissée au conditionnel. Le porteur affirme que les résultats in vitro ne suffisent pas et juge le recours à des souris porteuses de tumeurs "indispensable".

Objectifs

Le ciblage de récepteurs de neuropeptides par des médicaments radiopharmaceutiques connait un réel engouement aujourd’hui pour l’imagerie et la thérapie des cancers. Il a été montré une forte expression du récepteur Y5 au neuropeptide Y dans 11 lignées cellulaires tumorales (dont le sein, ovaire, colon, prostate) quel que soit le grade et le phénotype. Un programme de recherche a été établi visant à caractériser le récepteur Y5 dans diverses lignées cellulaires tumorales humaines et à développer le premier agent de ciblage utilisable en imagerie nucléaire et en thérapie. Un premier analogue du NPY spécifique du récepteur Y5 pouvant être radiomarqué avec des radiométaux (nom de code du composé : tg3) a été développé. Les résultats in vitro obtenus jusqu’à présent démontrent la bonne affinité du composé pour le récepteur. Le présent projet de recherche préclinique vise à tester in vivo ce peptide radiomarqué à des fins diagnostiques sur des modèles murins de cancers du sein exprimant ces récepteurs Y5.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une avancée en recherche préclinique sur la thématique des radiothéranostiques (diagnostiques et thérapeutiques). Si ce premier analogue du neuropeptide Y donne de bons résultats in vivo en imagerie TEP, nous pourrons envisager une étude thérapeutique plus poussée (TRT : Targeted Radiotherapy) en utilisant ce même ligand radiomarqué avec un radionucléide thérapeutique.

Procédures

- xénogreffes orthotopiques de cellules tumorales (cancer du sein) dans les glandes mammaires sous anesthésie gazeuse (durée 10min) pour les 24 souris balb/c nude - 1 Injection intraveineuse au niveau de la queue contenant les radiotraceurs sous anesthésie gazeuse pour les 36 souris (durée 5 min) - 1 imagerie pour la moitié des effectifs (soit 18 souris) sous anesthésie gazeuse (durée 35 min) - 1 ponction cardiaque terminale pour les 36 souris sous anesthésie gazeuse 3% (durée 5min)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues seront : 1) l'inoculation des tumeurs au niveau des glandes mammaires pouvant engendrer un stress 2) une pousse de tumeur trop importante ou une nécrose potentielle de la tumeur peut entrainer une gêne localisée 3) les anesthésies répétées pour la mise en place du modèle et pour l'imagerie peuvent impactées la souris. 4) la mise à mort en fin d'étude.

Devenir

A la fin de la procédure, les 36 souris seront mises à mort. Le sang et les organes seront prélevés pour un comptage radioactif et analyses immunohistochimiques ultérieures.

Remplacement

Les résultats in vitro ne sont pas suffisants pour valider le devenir de l’analogue radiomarqué in vivo. L’utilisation de modèles animaux porteurs de tumeurs avec une forte expression du récepteur Y5 est indispensable pour déterminer la faisabilité d’un ciblage oncologique du peptide tg3.

Réduction

Les expérimentations ont été conçues afin d’utiliser le moins d’animaux possibles. Pour l'étude du peptide tg3 radiomarqué avec un radioisotope dédié au diagnostic TEP, il est nécessaire de visualiser leur biodistribution in vivo et d’identifier les organes présentant une forte expression des récepteurs Y5. Deux modèles murins de cancers du sein dont la présence du récepteur Y5 a été validée in vitro seront étudiés. Une étude préliminaire sur des souris saines (sans tumeur) permettra la comparaison de fixation du radiopeptide sur les différents organes. Pour chaque groupe, le ligand spécifique du récepteur Y5 est comparé à un peptide similaire dont la fixation à Y5 est nulle. Pour cette étude de validation de la biodistribution du radiopeptide, un t-test sera réalisé avec un nombre minimum de 6 souris par condition. Ce nombre permet de prendre en compte une pousse tumorale hétérogène.

Raffinement

Les souris sont placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour/nuit 12h/12h, enrichissement des cages) au sein d’une animalerie de recherche agréée. Les animaux sont nourris ad libitum et toute manipulation invasive sera précédée d’une anesthésie générale sous isoflurane 2%. Nous avons choisi des points limites clés qui permettent de prévenir une détérioration de l’état clinique générale de l’animal dans le but d’éviter une quelconque souffrance. Les points limites sélectionnés sont les suivants : perte de poids supérieure à 20%, déshydratation, immobilité de plus de 1h (signe d’une douleur aigüe), ulcération et limitation de la taille de la tumeur.

Choix des espèces

Le modèle souris est communément utilisée en oncologie. La Balb/c nude est une souris d’une souche consanguine immunodéprimée et sans poil qui en fait l’un des meilleurs modèles pour la greffe orthotopique de tumeur humaine au niveau de la glande mammaire. La souris Balb/c sera utilisée pour l’étude de biodistribution sans tumeur puisqu’elle présente le même fond génétique que la Balb/c nude. Les souris seront réceptionnées à 8 semaines et mises en quarantaines pendant 2 semaines. Les xénogreffes seront initiées à 10 semaines de développement. A ce stade, la souris est une jeune adulte. Les prises de greffe sont plus homogènes sur des individus jeunes. La pousse tumorale dure entre 2 et 4 semaines (volume minimum de 150 mm3). Les études in vivo par imagerie TEP suivi des biodistributions de l'analogue tg3 radiomarqué et de sa version "scrambled" sur les souris xénogreffées peuvent être réalisées. Pour les souris Balb/c, les biodistributions des peptides radiomarqués seront réalisées entre 12 et 14 semaines de développement pour pouvoir être comparables aux souris xénogreffées.

2 178 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une plaie cutanée dans le dos sous anesthésie, puis des injections quotidiennes d'anticorps et de molécules activant ou inactivant leurs fibres nerveuses sensorielles, avant le prélèvement des ganglions nerveux, de la moelle osseuse et de la peau. L'objet est de décrire le dialogue entre nerfs sensoriels et cellules immunitaires pendant la cicatrisation, avec des retombées pour les grands brûlés renvoyées au conditionnel. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne peut se substituer à la souris, qu'il juge "incontournable".

Objectifs

En Europe, plus d’1,5 millions de personnes sont aujourd’hui traitées pour des lésions graves de peau (brûlures, coupures, ulcères). Dans la majorité des cas, ces lésions sont associées à une douleur chronique, une immobilité, une possible défiguration et très souvent des infections, pouvant entraîner des complications médicales graves, voire la mort…Les blessures ne guérissent pas car la couche profonde de la peau, le derme, ne se régénère pas. Le derme est une structure essentielle car il permet d’apporter les nutriments et l’oxygène nécessaire au bon fonctionnement de la peau. Il sert également de support mécanique à l’épiderme et aux structures annexes de la peau : les follicules pileux, les glandes sudoripares, ou encore les vaisseaux sanguins. Les stratégies mises en place pour régénérer le derme fonctionnel ainsi que ses appendices sont un enjeux sociétal majeur. En effet, la régénération dermique permettrait de rétablir la qualité de vie des patients. On sait aujourd’hui que l’innervation et les cellules immunitaires jouent un rôle important dans le maintien de l’intégrité de la peau, en condition physiologique. Cependant, leurs interactions n’ont pas été étudiées dans un contexte lésionnel. Nous proposons, dans ce projet, d’étudier le dialogue entre les cellules nerveuses de la peau et les cellules immunitaires après une lésion de la peau. Nos études préliminaires montrent qu’une dénervation est néfaste pour la réparation tissulaire. C’est pourquoi nous souhaitons désormais étudier de manière plus approfondie comment les cellules nerveuses contrôlent exactement l’arrivée de cellules immunitaires dans la peau pour améliorer la régénération. L’ensemble de ce travail va permettre de comprendre comment améliorer la régénération de la peau et devrait à terme permettre le développement des traitements qui pourraient bénéficier à des millions de patients souffrant de lésions cutanées graves telles que les brûlures et les traumatismes cutanés.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait mettre en évidence pour la première fois les dialogues entre nocicepteurs et cellules immunitaires au cours de la régénération cutanée. Cela pourrait etre bénéfique pour des milliers de patients souffrant de brulures graves ou de lésions traumatiques importantes.

Procédures

Lésion cutanée sous anesthésie gazeuse (Environ 30 minutes) : 1 par animal Injection : anticorps bloquant, 1 fois par jour par animal Injection: différentes sondes, 1 fois par jour par animal Injection de molécules permettant l'activation ou l'inactivation des fibres nerveuses sensorielles deds souris transgéniques: 1 fois par jour par animal Injection sérum physiologique et anti-inflammatoire: 15 min avant la chirurgie puis 24h après chirurgie, 1 fois par jour par animal (Toutes les injections se feront également sous anesthésie gazeuses flash ( 1 min / animal))

Impact sur les animaux

La lésion cutanée effectuée est locale (peau du dos) et transitoire. Généralement, la lésion est totalement fermée (ré-épithélisation) après 12-14 jours. Aucune infection n’a été reportée. En revanche, il est important de noter que les souris peuvent avoir une mobilité réduite pendant 48 à 72h et avoir des difficultés à se suspendre sur les grilles qui contiennent les croquettes. C'est pourquoi nous placerons des croquettes hulidifiées au sol, ainsi que de l'hydrogel. De plus, les souris recevront deux doses de metacam afin de réduire la douleur associée à cet acte chirurgical. Les différents produits injectés ne sont pas douloureux; cependant les souris seront anesthésiées pour recevoir ces injections car la préhension des souris ne sera pas possible en raison de la lésion. L'injection des produits se fera donc sous anesthésie et les injections des différents produits se feront lors d'une seule (et flash) anesthésie par jour.

Devenir

A l'issue de toutes les procédures les animaux seront sacrifiés afin de prélever les organes, majoritairement les ganglions de la racine dorsale, la moelle osseuse et la peau afin d'étudier les intercations entre les cellules immunitaires, les fibroblastes et les neurones sensorielles.

Remplacement

Ce projet vise à étudier les dialogues entre nocicepteurs et les neutrophiles au cours des processus de cicatrisation cutané. Il n'existe à ce jour aucun modèle cellulaire ou explant in vitro qui pourrait se substituer à l'utilisation d'un modèle animal. En effet, les nocicepteurs ayant leur corps cellulaire (Dorsal Root ganglion, moelle épinière) à distance de leur terminaison nerveuse (peau), leur étude ne peut se faire que sur des modèles animaux. De ce fait, les modèles de souris sont des éléments clés et incontournables pour étudier les dialogues entre Nocicepteurs-Neutrophiles-fibroblastes, in vivo. Les neuropeptides ou cytokines identifiées dans les processus de réparation tissulaire, seront testées sur des modèles d'explants de peaux humaines.

Réduction

L'expérience du porteur du projet dans l'étude nous permet d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle (12 souris par groupe et par temps pour les experiences de scRNA seq, ou 4 souris par goupe / temps / conditions pour l'immunofluorescence, par exemple). Les expériences qui seront réalisées, in vivo, ont été conçues de façon à n’utiliser que le nombre strictement minimum de souris nécessaire à l’obtention de données validées statistiquement (nombre déterminé sur la base de la littérature et de l'expérience des porteurs du projet dans les expériences réalisées).

Raffinement

Moins de 0,5% de mort ont été reportés par le porteur du projet au cours de ces processus de lésion de la peau. Lors de la mise en place des procédures expérimentales l’état clinique des animaux sera surveillé tous les jours. Après lésion cutanée, les souris seront monitorées deux fois par jour pendant les 24 premières heures, puis tous les deux jours jusqu'à ré épithélisation. De l’hydrogel sera placé dans le compartiment inférieur de la cage. De plus, nous analyserons les paramètres suivants : poids, température, signes extérieurs de stress tels que le comportement, la prostration ou l’aspect du pelage (poils luisant ou bien collé et gras etc). Si lors d’une procédure expérimentale nous détectons une perte de poids importante ou bien un comportement apathique, les animaux seront alors euthanasiés.

Choix des espèces

Afin d'étudier les interactions entre les nocicepteurs et les neutrophiles, nous avons besoin d'utiliser des outils transgéniques permettant de suivre les nocicepteurs / neutrophiles ainsi que des outils permettant une inhibition des nocicepteurs. Pour cela, l'espece animale la plus adaptée est la souris. En effet, de nombreuses souris transgéniques sont d'ores et deja disponibles (dans le laboratoire) pour la modulation des nocicepteurs (activation, inhibition et depletion). Ainsi, la souris nous semble être la meilleure espèce animale pour étudier les interactions entre nocicepteurs / neutrophiles et fibroblastes au cours de la cicatrisation cutanée. Enfin, il a été montré que ce modele particulier de lésion se rapprochait le plus de mode de cicatrisation chez l'homme - en comparaison avec le simple modèle de punch de 8 mm ou 12 mm, qui cicatrise par contraction. Les animaux seront utilisés à l'age adolescent et adulte (30-35 jours après la naissance). Dans ce modèle, la régénération n'a été étuddiée qu'entre 28 et 35 jours après la lésion. Des données non publiées - à ce jour - tendent à montrer que la régénération du tissus cutanné diminue à partir de 6 mois d'âge.

3 020 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une ou plusieurs chirurgies cérébrales et l'implantation de cathéters, puis s'auto-administrent de la cocaïne ou de l'alcool pendant plusieurs mois, certains selon des protocoles conçus pour induire une consommation de type addiction. Le porteur veut cartographier les circuits reliant contexte social et prise de drogue, et annonce des retombées thérapeutiques et pour les politiques de réduction des risques, formulées au conditionnel. Sur le remplacement, il affirme que l'étude d'un comportement volontaire exige un "organisme vivant entier" et conclut que le rat est un "modèle de choix, ne pouvant être remplacé".

Objectifs

La consommation d'alcool ou la cocaïne se fait souvent en soirées, en contexte social. Cependant le rôle de ce contexte social n'est pas bien déterminé. Chez le rat comme l'humain, la présence d'un congénère diminue la consommation de cocaïne. Cette réduction est plus importante si le congénère est inconnu ou naïf à la cocaïne. A l'inverse, la présence d'un congénère augmente la consommation d'alcool. Le contexte social a donc un effet opposé selon la drogue consommée et le type de congénère présent. Au niveau neurobiologique, lorsque l'activité des neurones du noyau subthalamique (NST) est modulée, l'effet de la présence d'un congénère est diminué. Dans ce projet nous étudierons le substrat neurobiologique de ces effets étendu aux réseaux impliquant le NST. Notre hypothèse est que les structures limbiques (Cortex préfrontal, l'insula et l'amygdale) connectées au NST sont impliquées dans la modulation de la consommation de drogue induite par le contexte social. L'objectif est de caractériser les substrats cérébraux responsables de l'influence du contexte social lors de prise de drogues et de comprendre les différences potentielles en fonction du sexe et de la drogue. Nous étudierons, chez le mâle et la femelle, la contribution des voies cortico-NST, insula-NST ou amygdalo-NST quand les animaux ont pour récompense : 1) la cocaïne, 2) l'alcool ou 3) l'accès à un congénère. Pour cela, les rats consommeront volontairement de la cocaïne ou de l'alcool. Le rat, libre de ses mouvements, devra appuyer sur un levier afin d'obtenir de la drogue. Le rat consommera soit seul, soit en contexte social: - en présence d'un congénère dont l'identité variera - avec la diffusion de vocalises ultrasoniques de différents types, modalité principale de communication des rats. Tout d'abord l'activité neuronale des voies étudiées sera mesurée pour confirmer leur implication dans le comportement de consommation de drogue en contexte social. Puis l'activité de ces voies sera manipulée afin de déterminer leur rôle. Ce travail conduira a une meilleure compréhension des susbtrats neurobiologiques de l'influence du contexte social sur la consommation de drogue. En déterminant les substrats biologiques pertinents, il sera possible d'élaborer des thérapies chirurgicales voire pharmacologiques. De plus, l'étude du contexte social permettra de déterminer son rôle dans la consommation de drogue et d'améliorer l'accompagnement des consommateurs voire réduire les risques de consommation.

Bénéfices attendus

La consommation de drogue a généralement lieu en contexte social, lors de soirée ou de fête comme pour l'alcool. Ainsi la présence d’autres individus, consommateurs ou non, amis ou étrangers, influence notre consommation. Actuellement chez l’animal, l’addiction est étudiée avec le protocole d’auto-administration de drogue. Le rat notamment, s’auto-administre l’ensemble des agents toxicologiques consommés par l’humain dans ce protocole. Dans celui-ci, le rat est vigil et libre de ses mouvements, et a accès à un levier. Ce n’est que lors de l’appui volontaire du rat sur ce levier, qu’une dose de drogue lui est délivrée. Néanmoins peu d’études scientifiques s’intéressent à l’influence contexte social et la présence de congénère sur la consommation de drogue. Il a été montré que chez l’humain comme chez le rat, la consommation de cocaïne diminuait en présence d’un congénère, tandis que celle d’alcool augmente dans ces mêmes conditions. Les rats ont ainsi des comportements proches de celui des humains lors de consommations de drogue en présence d’un congénère. Ainsi la présence d’un congénère rat permet une approche plus écologique et plus réaliste de la consommation de drogue chez l'humain. De plus, il est nécessaire de déterminer les substrats neurobiologiques responsables de ces effets. Le but de ce projet est de découvrir quels sont les substrats cérébraux pour mieux comprendre les processus émotionnels en lien avec la prise de drogue, notamment l’effet du contexte social, qui peut être protecteur ou non en fonction de la drogue consommée. En plus d’améliorer les modèles animaux d’addiction en implémentant le contexte de consommation, ce projet génèrera des résultats à fort impact translationnel. En effet, les résultats peuvent soutenir ou pas les politiques de réduction des risques de consommation qui suggèrent le développement de salles de consommation par exemple. Ce projet apportera également de nouvelles perspectives sur la physiopathologie de l’addiction et devrait confirmer le potentiel thérapeutique de la manipulation du NST dans cette pathologie et ses effets secondaires potentiels. De plus, il permettra aussi de mettre en évidence le rôle du NST dans les comportements sociaux, ce qui pourrait lui donner un autre intérêt dans le contexte de recherche des bases neurales de certains troubles de la cognition sociale tels que celui du spectre autistique.

Procédures

L'ensemble des animaux de ce projet seront soumis au moins une fois à un acte chirurgical, réalisé sous anesthésie générale. Afin d’enregistrer ou de moduler l’activité cérébrale, nous réalisons des chirurgies cérébrales. Les animaux sont sous anthésie générale. Chirurgies : -1670 animaux seront soumis à un seul acte (1670 chirugie cérébrales (durée:1h30), -1350 animaux seront soumis à deux actes (30 qui auront 2 chirurgies cérébrales (durée:1h et 10h), espacés d'au moins 3 semaines), 1320 chirurgie cérébrales (durée: 2h30)et implantation cathéter pour l’auto-administration de cocaïne (durée:1h) ). Dans les approches comportementales: -1320 animaux s’auto-administreront la cocaïne quotidiennement durant 2-3 mois (sessions de 2h (consommation récréative) ou sessions de 6h durant 20 jours (protocole permettant d’induire une consommation de type « addiction »). -1320 animaux s’auto-administreront l’alcool quotidiennement durant 3 à 5 mois (sessions de 1h (consommation récréative) ou sessions de 14h durant 1 mois et demi tous les 48h (protocole d’accès intermittent à l’alcool pour induire une consommation de type « addiction »)). -330 animaux travailleront pour obtenir une récompense sociale (une interaction avec un autre rat à travers un grillage) quotidiennement durant 1 à 2 mois (sessions de 2h ou sessions de 6h (Protocole de ratio progressif, l’animal doit fournir de plus en plus d’appui pour une même récompense)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont les conséquences ‘classiques’ à court terme des interventions chirurgicales. Dans les jours suivant l’opération, les animaux peuvent perdre un peu de poids, présenter une activité réduite. Dans le cas de l’implantation de fibres optiques, les animaux peuvent ressentir une gêne due au poids du chapeau protecteur fait en ciment dentaire. Plus rarement, les animaux peuvent présenter un saignement au niveau des cicatrices. Les animaux sont suivis quotidiennement les jours suivant l’opération afin d’anticiper et de soulager une nuisance potentielle. En général, ces nuisances s’estompent en 2-3 jours. Les animaux sont isolés durant cette période. Un autre type de nuisance, pouvant engendrer du stress, est l’appariement fait entre les animaux de façon aléatoire à la réception des individus. Lorsque l’alimentation devient contrôlée (les animaux ne sont pas restreints, mais pas en accès libre), un sujet très dominant peut empêcher son partenaire de cage de s’alimenter correctement. Enfin, les matériaux utilisés pour fabriquer et maintenir les cathéters, ou fibres optiques, peuvent parfois provoquer des ‘bagarres’ entre partenaires de cage. En effet, les éléments en plastique, plus ou moins mous, les constituant, peuvent être ‘rongés’ par l’un des rats, provoquant ainsi une gêne et/ou un stress chez l’autre individu. Enfin, suivant les sessions d’auto-administration les animaux présentent une hyperactivité marquée, qui s’estompe en moins d’une heure (la dose i.v. de cocaïne est faible, tout comme la quantité d’alcool). Les symptômes de manque (perte de poids, agressivité…) sont rares, car les animaux ont accès tous les jours à la drogue.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort après les études comportementales afin de vérifier que les injections des virus et implantations de fibres optiques aient été réalisées correctement. Cela est nécessaire afin de confirmer que les effets observés sur les comportements des rats soient liés aux structures cérébrales ciblées.

Remplacement

Ce projet a pour but d'étudier les substrats cérébraux dans une pathologie précise : la consommation de drogue. Or, en France, il est interdit de fournir des drogues d’abus dans le cadre d’expérimentation humaine. De plus, le recours à des méthodes invasives exclut de fait les études chez le sujet humain. Pour l’étude d’un comportement, il est nécessaire d’utiliser un organisme vivant entier. La consommation de drogue, pathologique ou non, repose sur la consommation volontaire de l’individu. Ainsi l'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l’individu soit vigil et libre de ses mouvements. Les modèles animaux de consommation de drogue reposent sur les protocoles d’auto-administration. Dans celui-ci le rongeur a accès à un levier. Lorsqu’il appuie dessus, une dose de drogue lui est délivrée. Ainsi c’est le rongeur lui-même qui décide du nombre de doses qu’il reçoit, il s’autorégule. Il est alors possible d’étudier son comportement volontaire de consommation de drogue. Le rat est un animal curieux ce qui facilite significativement l’apprentissage de l’association appuie sur le levier égale une récompense/drogue et il s'auto-administre l'ensemble des agents toxicologiques consommés par l’humain . De plus, dans ce projet, nous étudions le rôle du contexte social. Or, le rat est un animal sociable, vivant en communauté dans un système hiérarchisé. C’est un bon modèle d’étude du comportement social. Ainsi, le rat est donc un modèle de choix, ne pouvant être remplacé pour ce genre d’étude.

Réduction

Dans l’optique de ne pas utiliser d’animaux plus que nécessaire, nous réaliserons les vérifications des techniques de modulations de l'activité cérébrale avant les tests comportementaux. De plus le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statisique. Ensuite nous analyserons régulièrement les données expérimentales issues des approches comportementales. Après obtention d’un effet robuste pour une condition donnée, nous cesserons de tester cette condition expérimentale. Nos conditions expérimentales étant nombreuses (6 conditions différentes possibles, voir annexe1), chaque animal en réalisera 2 afin de diminuer le nombre d’animaux nécessaire. Il y a donc 3 contextes sociaux à réalisés. Afin de diminuer le nombre de congénères nécessaire, des rats d’autres projets seront réutilisés après l’approbation de la Structure du bien-être Animal (SBEA) de notre établissement. Les rats n’ayant jamais été exposés une drogue pourront être réutilisés dans d’autres projets n’impliquant pas l’étude du contexte social, avec l’accord de la SBEA de notre établissement.

Raffinement

Lors des chirurgies, les animaux seront sous anesthésie générale et sous antidouleur. La gestion de la douleur pendant et après les procédures douloureuses et les expérimentations est toujours prise en compte par des personnels compétents et sera améliorée si l’animal présente des signes de souffrance de l’animal (grimace faciale, prostration, poils hérissés, absence de toilettage, dos courbé…) par l'administration d’antidouleurs spécifiques. L'état de santé général de tous les animaux de l'étude est suivi quotidiennement, ce qui nous permet de réagir chaque jour et de manière appropriée en cas de besoin. En addition, une fiche de score du bien-être complété au moins une fois semaine permettra l’évaluation du bien-être de l’animal. En cas de souffrance (prostration, poils hérissés, absence de toilettage, dos courbé…) et/ou de perte importante de poids (15%), l’animal sera isolé et aura accès illimité à une nourriture enrichie en glucose. Un traitement antidouleur pourra être administré si besoin. L’animal sera replacé avec son partenaire de cage dès reprise de poids et comportement normal afin de limiter l’isolement au maximum. En ce qui concerne l’habitat, les animaux sont hébergés par pair. Les cages sont enrichies grâce à la présence d’objets divers et variés (bâtonnets en bois, petits tunnels...) avec un roulement toutes les semaines pour diversifier au maximum l’environnements des animaux.

Choix des espèces

Le rat est un modèle animal de choix pour l'étude de l'addiction. En effet, les modèles comportementaux de référence sont connus et maîtrisés, et il existe de nombreux tests comportementaux permettant de tester les différents symptômes de la pathologie. Par ailleurs, l'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l'animal soit vigil et libre de ses mouvements. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, puisqu'il s'auto-administre l'ensemble des agents toxicologiques consommés par l’humain. De plus le rat est un animal social dont le comportement présente des similitudes avec celui de l’humain, avec mise en place d’un système hiérarchique et organisé, communication visuelle, olfactive, auditive et tactile. C’est un bon modèle d’étude du comportement social. Afin d'améliorer la précision de nos chirurgies, et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous réaliserons nos expériences chez des rast adultes (>7-8 semaines) (environ 380g), un stade du développement cérébral en adéquation avec notre question scientifique.

Âgés d'un jour, des ratons éveillés reçoivent une injection d'un vecteur viral dans la veine jugulaire, qui peut provoquer une insuffisance cardiaque dans les semaines suivantes, et leur manipulation peut conduire la mère à les rejeter ou à les mutiler. 206 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, avec deux à quatre mois de régime riche en graisse, des gavages de glucose, des injections d'insuline et sept prises de sang par test de tolérance, à 20 et 60 jours. Le porteur écrit que certains rats ne supportent pas l'anesthésie des échocardiographies et "ne peuvent être réanimés", puis que les rats "se réveillent dès l'arrêt" de cette anesthésie. Tous sont mis à mort à la fin de l'étude pour des prélèvements post-mortem.

Objectifs

La fibrillation atriale (FA) est l'arythmie la plus fréquente en pratique clinique. Sa prévalence augmente avec le vieillissement et la sédentarisation accrue de la population, faisant craindre une véritable épidémie dans les 50 prochaines années. Un remodelage atrial et électrique est observé, favorisant l'apparition d'arythmies cardiaques. Par ailleurs, des études ont montré une association entre abondance du tissu adipeux épicardique et le risque de FA. Les maladies métaboliques comme l'obésité sont donc des facteurs de risque de la FA. Lors de la FA, le remodelage observé au niveau macroscopique (dilatation des cavités ventriculaires et atriales) se répercute au niveau cellulaire avec une désorganisation de la structure des cardiomyocytes. Ce remodelage cellulaire aura pour conséquence la perturbation des domaines membranaires caractéristiques du cardiomyocyte, lesquels sont nécessaires à une conduction optimale du potentiel d'action cardiaque (anisotropie cardiaque). La protéine CASK (Calcium Calmodulin Serine threonine kinase) est une protéine essentielle au développement et à la mise en place de la polarité cellulaire dans le système nerveux. Nous nous sommes donc intéressés au rôle de CASK dans la différenciation du cardiomyocyte, cellule qui acquiert sa polarité après la naissance.

Bénéfices attendus

Les projets portant sur la compréhesion du développement des cardiomyocytes et l'impact des pathologies métaboliques sur l'organisation des domaines membranaires en eux-mêmes permettrons de cibler le rôle de protéines partenaire du canal sodique comme CASK dans la survenue de pathologie structurales et électriques. Ces avancées seront amenées à permettre de développer des cibles thérapeutiques dans le traitement de différentes arythmies et cardiomyopthies.

Procédures

Les animaux seront soumis à 6 types d'interventions différentes. Ceux-ci sont d'abord mis sous régime riche en graisse, 4 mois pour les rates servant à la reproduction (2 mois anté et post-natal des ratons), et 2 mois pour les rats issus des portés. Afin de valider le modèle de rat obésogénique, des mesures métaboliques seront nécessaires. Celles-ci commencent par le gavage de glucose, qui est une procédure très rapide (quelques secondes). Un gavage sera réalisé à deux stades : 20 jours et 60 jours de développement pour tester la tolérance au glucose. Par la suite, le test de tolérance à l'insuline sera réalisé à partir d'une injection d'insuline : l'injection se fera à 2 stades de développement (20 jours et 60 jours) et dure quelques secondes. Le prélèvement d'une goutte de sang à la queue est effectué sur les animaux vigiles afin de mesurer l'évolution de la glycémie. Cet acte qui ne dure que quelques secondes est répété 7 fois pour un test de tolérance au glucose et à l'insuline. Les animaux seront soumis 2 fois à un test de tolérance au glucose et 2 fois à un test de tolérance à l'insuline, à 20 jours et 60 jours. Afin de valider l'implication de notre protéine d'intérêt CASK, son expression est modifiée par injection d'un vecteur viral dans la veine jugulaire des animaux vigiles. Les rats reçoivent une injection unique 1 jour après la naissance, qui est très rapide (quelques secondes).

Impact sur les animaux

L'obésité peut conduire à des difficultés de déplacement, un changement cutané et du pelage. L'injection du vecteur viral peut engendrer dans les semaines qui suivent une insuffisance cardiaque, en particulier lors du stress des manipulations. Les injections au stade nouveau-né et donc la manipulation des ratons par un tiers peut engendrer le refus de la mère de reprendre le petit dans la portée, tout comme des cas de mutilations. Il arrive également que des animaux ne supportent pas l'anésthésie lors des échocardiographies et ne peuvent être réanimés, et ce malgré l'intubation.

Devenir

A l'issu de cette étude, tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements post-mortem.

Remplacement

Les projets ont pour but de comprendre l'importance de l'organisation fonctionnelle du cardiomyocyte sur la fonction cardiaque, et en quoi un régime riche en graisse peu directement l'impacter. Comme nous travaillons à l'échelle de l'organisme, il est nécessaire d'utiliser un modèle expérimental proche de la pathologie ciblée dans notre étude. Toutefois, certaines études seront réalisées in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux pour notre étude (n=206) est déterminé à la suite des études antérieures, relativement similaires dans la forme. Les paramètres échocardiographiques et métaboliques seront étudiés sur les mêmes lots d'animaux afin de réduire le nombre d'animaux nécessaire à cette stratégie expérimentale. La taille de nos groupes expérimentaux est également déterminante au regard de la puissance statistique nécessaire à la réalisation de comparaisons entre groupes. Ceux-ci requièrent un minimum de 10 animaux par groupes pour être relativements fiables et robustes.

Raffinement

Les rates arrivent à l'animalerie et sont soumises à un temps d'acclimatation de 7 jours avant le début du régime. Les rats servants à la reproduction sont soumis au même temps d'acclimatation avant le début de la reproduction. Afin de prévenir le risque de rejet et mutilation par la mère après manipulation par l'expérimentateur, la contention des ratons est réalisée avec des gants préalablements frottés contre la litière de la cage au moment de l'injection. Les portées sont à une par cage, et ce jusqu'au moment du sevrage, c'est à dire 3 semaines après la naissance. Les rats sont ensuite séparés par sexe et laissés 2 par cage lorsqu'ils ont atteint l'âge adulte. Les cages sont aggrémentées avec du matériel d'enrichissement (jouets cartonnés, baton de bois, sciure de bois, ouate). Les animaux sont surveillés tous les jours par le personnel compétent de l'animalerie. Lors des enregistrements par échographie, les animaux reçoivent une anésthésie gazeuse légère pour les maintenir immobiles. Les animaux se réveillent dès l'arrêt de l'anéthésie. La surveillance par les techniciens de l'animalerie est accrue pendant une semaine après anésthésie. Toutes les évaluations de fonction et prélèvements réalisés (prélèvement de sang) sont indolores. Une anésthésie locale est utilisée pour les injections et prélèvements de sang. Un analgésique est également administré en cas de douleur. Les points limites sont différents en fonction de l'âge du rat: - Avant sevrage: mise à l'écart du reste de la portée, refus de la rate d'alimenter le petit donc perte de poids, deshydratation, prostré dans un coin de la cage, mutilation. - Après sevrage: Perte de poids de plus de 20%, deshydratation, poil hirsute, pelade, comportement inhabituel.

Choix des espèces

Le rat est l'animal le plus approprié pour nos études. Il permet de garantir l'homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications cardiaques dans un espace de temps raisonnable. Comme nous n'utilisons pas la technologie des transgènes, nous pouvons nous permettre un modèle rat, chez qui les études écho-cardiographiques sont plus simples. Par ailleurs, l'isolement de cardiomyocytes nécessaire aux études d'électrophysiologie est le plus fiable et mis au point chez le rat. Les stades de développement utilisés pour notre étude sont nécessaires : - Afin d'étudier la mise en place des domaines membranaires du CM, qui se fait en post-natale (d'où les stades J1, J5, J20 et J60). - Afin d'étudier le rôle de la protéine CASK sur le développement myocardique (d'où l'injection à J1).