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Physiopathologies des maladies neurodégénératives
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Macaques rhésus : 78
156 primates, 78 macaques à longue queue et 78 macaques rhésus, vont être utilisé·es, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une à deux chirurgies cérébrales, des IRM sous anesthésie tous les six mois, des prélèvements de liquide céphalorachidien mensuels et des prises de sang tous les quinze jours, avant une mise à mort par perfusion intracardiaque. Le projet crée des modèles de maladies neurodégénératives comme Alzheimer et Parkinson, dont les retombées thérapeutiques restent une perspective. Le porteur affirme qu'aucun modèle in silico n'est valide et justifie le recours au primate par sa "proximité avec l'homme".
Objectifs
De nos jours dans le monde environ 36 millions de personnes sont atteintes de démences, dont 25 millions pour la maladie d’Alzheimer et 6 millions pour la maladie de Parkinson. En raison du vieillissement progressif de la population et de l'absence de traitement, le nombre de personnes souffrant de maladies neurodégénératives augmente considérablement et devrait croître de manière régulière dans les années à venir. Qu'elles soient génétiques ou acquises, leurs mécanismes d’initiation liés à des causes multifactorielles sont mal connus. Ainsi, il est nécessaire de créer et maîtriser des modèles le plus proche possible de la réalité pathologique. L’étude proposée ici permettra aux travers de différents modèles de primates non-humains de maladies neurodégénératives, d’étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de l’initiation et de l’installation des différentes pathologies afin de définir des nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les maladies neurodégénératives sont une cause majeure d’invalidité, de dépendance, d’institutionnalisation et d’hospitalisation. Elles ont un impact très important sur la qualité de vie des personnes atteintes ainsi que sur celle de leurs proches et de leurs aidants, et touchent ainsi une part importante de la population. Les traitements actuellement disponibles sont à visée symptomatique et d’efficacité relative. Mieux comprendre les mécanismes à l’origine de ces pathologies c’est trouver les traitements de demain.
Procédures
Une chirurgie (2 heures environ), ou deux maximum, espacées de 1 mois. Imagerie : IRM sur animal anesthésié, avant la chirurgie, 48 heures après et tous les 6 mois. La durée de l'IRM est de 1h30 à 2h. Prélèvements sanguins de quelques minutes tous les 15 jours sur animaux vigiles en contention légère. Prélèvements de liquide céphalorachidien de l'ordre de 5 minutes une fois par mois sous anesthésie légère.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie ou aux prélèvements biologiques. Pour la chirurgie : stress de l’anesthésie, hypothermie, douleur post opératoire possible et infection au niveau des points de sutures. Pour l’imagerie : anesthésie. Pour les prélèvements liquide céphalorachidien (LCR) et sang : stress de l’anesthésie pour le LCR et de la contention (légère et rapide) pour le sang.
Devenir
Les animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque aux temps expérimentaux définis. Le cerveau et éventuellement d’autres tissus seront alors prélevés puis mis à disposition pour réaliser les analyses post-mortem.
Remplacement
Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du PNH car il n’existe pas de modèles mathématiques ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier les processus neurodégénératifs. Nous recherchons à travers l’utilisation des modèles animaux complexes et intégrés à mimer la pathologie humaine, impossible à trouver dans des modèles cellulaires. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme) pour étudier les mécanismes impliqués dans ces processus est une étape nécessaire à la découverte de nouvelles voies thérapeutiques
Réduction
Nos modèles sont générés sur un plateau de haute technicité (cadre stéréotaxique, Imagerie, stabulation) nous permettant la manipulation des animaux dans les meilleures conditions (chirurgie, déplacement…) et une grande reproductibilité dans les différents modèles ce qui limite le nombre d'animaux. Les prélèvements cérébraux réalisés à chaque fin d’étude sont destinés de prime abord aux études histologiques visant à identifier des marqueurs pour déterminer de nouveaux traitements, et servent également à renforcer notre banque de tissus (cérébrothèque) afin de proposer à la communauté scientifique des tissus de PNH et ainsi réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Les chirurgies sont faites sous anesthésie générale et avec une couverture antalgique permettant de réduire le plus possible les douleurs ressenties, et des dispositifs de raffinement (monitoring cardiaque et respiratoire, maintien de la température corporelle, asepsie). Le suivi des animaux est quotidien, assurée par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’état des animaux est observé et quantifié selon des critères objectifs permettant d’établir des scores de bien-être et de déterminer des points limites à partir desquels les actions adaptées sont menées (des massages, le maintien de l’animal au chaud à l’aide d’une couverture, la modification de la nature et le change plus régulier de la litière, l’augmentation de la fréquence des pesées, le gavage avec des complément alimentaire, lait enrichi et jus sont quelques outils dont nous disposons en dehors de la sphère médicamenteuse pour améliorer l’état de santé de nos animaux).. . Les volumes de prélèvements de sang comme de LCR sont adapté au poids de l’animal, Les prélèvements de LCR sont faits sur animaux sédatés. Les prélèvements de sang sont réalisés sur animaux vigiles avec une légère contention. L’apparition d’hématome au point de prélèvement est surveillée. L’échelle de bien être est là aussi utilisée pour estimer la gêne occasionnée par ce geste. Les animaux seront hébergés ensemble, dans une structure spécialement agrée pour l’hébergement et l’utilisation des PNH en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce (volière, nourriture variée, « jouet », fond sonore, etc.).
Choix des espèces
Ces modèles ont déjà été réalisés et validés chez les rongeurs (rats, souris), comme base d’étude des maladies neurodégénératives, mais la proximité d’espèce avec l’homme en fera toujours un modèle de choix, surtout dans la détermination de marqueurs prédictifs. Les maladies neurodégénératives sont des maladies chroniques progressives qui touchent le système nerveux central. Leur fréquence augmente avec l'âge chez l’homme. Afin d’être au plus près de cet état, dans ce projet, les animaux utilisés seront donc adultes.
Modélisation du syndrome neurodéveloppemental Okur-Chung et de son phénotype analogue à celui de l’autisme chez la souris-AMENDEMENT 2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 408 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un groupe de 384 subit une chirurgie stéréotaxique du cerveau, les autres reçoivent jusqu'à cinq médicaments et enchaînent jusqu'à cinq batteries de tests comportementaux, avant une perfusion transcardiaque. L'objectif est de valider un nouveau modèle murin d'un trouble neurodéveloppemental rangé dans le spectre de l'autisme, les pistes thérapeutiques étant renvoyées à de futures études. Le porteur affirme qu'aucune méthode ne reproduit "la complexité du cerveau", ce qui rendrait le modèle animal "indispensable".
Objectifs
Récemment, plusieurs cas de mutations dans un gène codant pour une kinase ont été liés de manière causale a des troubles neurodéveloppementaux. Ces maladies sont caractérisées par un retard de développement, une déficience intellectuelle et d’autres anomalies comportementales qui font la font entrer dans les troubles du spectre autistique. Notre objectif est de valider un nouveau modèle expérimental d'un trouble neurodéveloppemental chez la souris. Nous rechercherons d’éventuelles anomalies comportementales s’apparentant aux symptômes de la pathologie. Des études biochimiques seront ensuite réalisées sur les tissus cérébraux de souris issus de ces souris pour tenter d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués. Ces études devraient permettre d’améliorer les connaissances sur cette pathologie dans le but de développer des thérapies pour aider les patients du spectre de l'autisme. Ce projet mettra en jeu des procédures d’administration de substances pharmacologiques avant évaluation des conséquences biochimique et comportementales (fonctions motrices, cognitives, émotionnelles et sociales), suivi par perfusion transcardiaque pour analyse du tissue. Cette étude qui nécessite une approche comportementale n’est possible qu’à l’échelle de l’organisme entier et ne peut être reproduite in vitro ni ex vivo. Ce projet s’effectuera dans le respect de la règle des 3R, en veillant au bien-être des animaux et en limitant leur douleur. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons estimé la taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace des résultats grâce aux données collectées au cours d’expériences précédentes. Les animaux seront observés quotidiennement et évalués à l’aide de points limites bien définis. En conclusion, notre travail vise à identifier les déficits neurobiologiques et comportementaux qui sont présents dans un modèle murin d'un trouble neurodéveloppemental, permettant de futures études thérapeutiques de ce syndrome. Ce projet apportera des données anatomiques, biochimiques et fonctionnelles cruciales pour appréhender les mécanismes mis en jeu dans le spectre de l'autisme et pourrait ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.
Bénéfices attendus
En conclusion, notre travail vise à identifier les déficits comportementaux dans un nouveau modèle expérimental d'un trouble neurodéveloppemental permettant de futures études thérapeutiques. Ce projet apportera des données anatomiques, biochimiques et fonctionnelles cruciales pour appréhender les mécanismes mis en jeu dans le spectre de l'autisme et pourrait ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.
Procédures
Au total, 1408 animaux sur 3 ans seront utilisés et subiront une batterie de tests comportementaux. Parmi les 8 groupes expérimentaux différents, un groupe (384 animaux) subira une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie complète (durée de 20 minutes) et avec un traitement analgésique avant et jusqu'à 2 jours après la chirurgie. Aucun effet indésirable n'est attendu sur la base de notre expérience. Les autres animaux (1024) subiront des tests comportementaux jusqu'à 5 paradigmes différents, les tests étant espacés d'au moins une semaine entre chaque paradigme. Au total, 5 médicaments différents (dont 4 en aigue, par injection i.p, et un chroniquement pendant 3 semaines, administré dans l'eau à boire) seront administrés à des animaux éveillés. Aucun de ces médicaments n'ést préjudiciable au bien-être de l'animal. Une prise de sang sera effectuée au niveau de la veine caudal, à l'aide d'un tube capillaire, via une légère incision à l'extrémité de la queue, poirtant un faible risque d'hémorragie.
Impact sur les animaux
La chirurgie stéréotaxique de la souris est réalisée sous anesthésie générale et, normalement, tous les animaux survivent à cette procédure sans nécessiter de soins analgésiques prolongés. Neanmoins, des protocoles de soins pré et post opératoires sont mis en place pour éviter la sensation de douleur. Certains des tests comportementaux ont un impact modérément stressant sur les souris, mais nous surveillons régulièrement le bien-être des souris, leur poids, leur toilettage et leur comportement social, et nous n'avons pas constaté d'effets néfastes durables dans les expériences réalisées précédemment.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience. Nous utiliserons le tissu cérébral pour des analyses biochimiques et d'imagerie
Remplacement
A l’heure actuelle, il n'existe pas de méthode de remplacement permettant de reproduire la complexité du cerveau, ce qui rend l’utilisation d’un modèle animal indispensable à la réalisation de ce projet.
Réduction
La taille de chaque groupe sera de 16 animaux par condition expérimentale. Nous avons précédemment utilisé cette taille de cohorte pour des expériences comparables et avons atteint de différences significatives dans nos expériences (p
Raffinement
Pour éviter toute souffrance, les procédures de chirurgie se feront sous analgésie et anesthesie générale. Les souris seront observées régulièrement et une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. Tout signe de douleur, souffrance, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé avec des analgésiques. Les souris seront logés à raison de 5 compagnons (frères, soeurs) par cage dans un environnement enrichi.
Choix des espèces
L’espèce souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux. Les souris présentent un système nerveux suffisamment développé pour permettre une extrapolation des résultats à l’espèce humaine. De plus, les modèles transgéniques utilisés dans ce projet ont été créés chez la souris. Animaux seront utilisés au stades infantiles (2 semaines), juvéniles (4 semaines) et adultes (12 semaines). Tous les animaux seront testés dans das tests comportementaux entre 3 et 6 mois, pour définir les phénotypes chez la souris adulte.
Rôle et mécanisme d’action de la chromogranine A dans la régulation de la sécrétion de neuropeptides hypothalamiques impliqués dans le contrôle de l’homéostasie glucidique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
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306 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 234 sous anesthésie sans réveil. Elles subissent des injections intrapéritonéales, des prélèvements sanguins caudaux répétés six à dix fois, des mises à jeun de seize heures et des tests de tolérance au glucose, à l'insuline et au pyruvate, avant une perfusion intracardiaque terminale. Le porteur étudie le rôle de la chromogranine A dans la sécrétion de neuropeptides hypothalamiques réglant la glycémie. Les retombées contre l'obésité et le diabète, présentés comme la pandémie de "diabesity", restent lointaines, et il affirme qu'une telle approche "très intégrée" n'est possible que sur "l'animal entier".
Objectifs
Les systèmes neuropeptidergiques hypothalamiques sont récemment apparus comme des liens couplant l’équilibre énergétique et l'homéostasie du glucose. Un dysfonctionnement de l'un de ces systèmes pourrait ainsi jouer un rôle majeur dans le développement de pathologies telles que l'obésité et le diabète. En effet, l'obésité est fréquemment associée au diabète de type II, et leur progression significative et synchrone depuis 30 ans fait de la pandémie mondiale de "diabesity" un véritable enjeu de santé publique. Au sein de notre Unité, le système peptidergique 26RFa/GPR103 a été identifié et démontré comme étant impliqué dans le contrôle du comportement alimentaire de par son important effet orexigène. De plus l’expression du 26RFa est augmentée chez les animaux obèses, suggérant qu’il pourrait jouer un rôle dans le développement et le maintien de l'obésité. Le 26RFa possède par ailleurs un robuste effet anti-hyperglycémiant central, conséquence de sa capacité à relayer l’action centrale de l’insuline. Au sein de notre équipe, nous avons rapporté le rôle essentiel de la protéine chromogranine A (CgA) dans la formation des granules de sécrétion, organites permettant le stockage et la sécrétion des neuropeptides. De manière intéressante, les souris dont le gène exprimant la CgA a été invalidé de manière globale sont hypertendues et obèses. Par ailleurs, nous avons observé récemment que les neurones 26RFa expriment d'autres neuropeptides ainsi que la CgA. Sur la base de ces données, nous proposons dans le présent projet d’étudier le rôle de la CgA dans les mécanismes moléculaires de la sécrétion des neurones 26RFa en analysant l’impact de la modulation de l'expression de la CgA dans les neurones 26RFa sur la sécrétion du système peptidergique 26RFa, la régulation centrale de l’homéostasie du glucose et le déclenchement de l’obésité et du diabète.
Bénéfices attendus
L’administration centrale de 26RFa a permis une première évaluation de l’effet du 26RFa central dans la régulation de l’homéostasie glucidique par le cerveau. Il a notamment été observé que le 26RFa exerce un puissant effet anti-hyperglycémiant lorsqu’il est administré en intra-cérébro-ventriculaire. Néanmoins, le rôle précis des différentes sous-population de neurones à 26RFa dans la régulation de la glycémie et les mécanismes d’action mis en jeu restent inconnus. De plus, l’interaction du système neuropeptidergique 26RFa/GPR103 avec d’autres systèmes neuropeptidergiques hypothalamiques reste également à l’étude. Nos données récentes montrant la colocalisation du 26RFa et des orexines dans les mêmes neurones de l’aire hypothalamique latérale suggèrent néanmoins que ces deux systèmes pourraient être impliqués ensemble et interagir au sein de l’hypothalamus latéral, pour réguler la glycémie. Ainsi, la caractérisation des différentes populations de granules de sécrétion, en terme de contenu en neuropeptides et granines, au sein des neurones 26RFa devrait permettre une meilleure compréhension de la capacité sécrétoire de ces neurones. Ces données, associées à l'invalidation de l'expression de la CgA au sein de cette population neuronale permettront de caractériser les rôles respectifs de ces neuropeptides dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique et des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-tendant leur action.
Procédures
Les animaux seront soumis à divers types d'expérimentations et de prélèvements soit en condition vigile, soit sous anesthésie. Les injections intra-péritonéales durent 3sec, avec procédure globale : contention+injection ip 15-20 sec. La perfusion intra-cardiaque dure moins de 7 min ; l'anesthésie induite : 5 min, renouvelée si nécessaire. Les animaux subiront des prélèvements sanguins caudaux d'un volume total de l'ordre de 40 μL par expérimentation. Les expérimentations sont répétées 6 à 10 fois avec une semaine de repos minimum entre chacune d'entre elles. - mesure de glycémie : mise à jeun de 16h, puis prélèvements sanguins caudaux (2 prélèvements de 1 sec chacun et de 2µl, toutes les 15 min, 9 fois entre T0 et T120 min). - test de tolérance au glucose : prélèvements sanguins idem + injection intra-péritonéale de 200µl de glucose à T0 (2g/kg poids corporel) - tolérance à l’insuline : mise à jeun de 6h, puis prélèvements sanguins idem + injection intra-péritonéale de 225µl d’insuline à T0 (0,75UI/kg poids corporel). - test de tolérance au pyruvate : mise à jeun pendant 16h, puis prélèvements sanguins idem + injection intra-péritonéale de 200µl de pyruvate à T0 (2g/kg poids corporel). - test de sécrétion d’insuline : mise à jeun pendant 16h, puis prélèvements sanguins caudaux de 10-15µl à T0, T15, T30 et T60 min après injection intra-péritonéale de 200µl de glucose à T0 (2g/kg poids corporel). L'hébergement en cage de calorimétrie indirecte permettra d'évaluer les paramètres métaboliques des animaux : 7 jours d’habituation en cage mimant la cage de calorimétrie indirecte, puis séjour de 7j en cage de calorimétrie indirecte avec 96h de mesures contrôles (prise alimentaire, hydrique, consommation d’O2, production de CO2, déplacements), puis 24h en condition de jeune puis 48h en condition de renutrition.
Impact sur les animaux
Les tests physiologiques auxquels seront soumis les animaux peuvent avoir un impact léger à modéré selon les procédures. Des signes de souffrance peuvent être observés : dégradation de l'état général de l’animal avec modifications de l’apparence physique externe (plaies, mauvais aspect du pelage, poil hérissé, dos voûté), et/ou changements du comportement (prostration, léthargie, agressivité inhabituelle lors des manipulations, vocalises), perte de poids importante.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux ne peuvent être réutilisés dans de nouvelles expérimentations sans compromettre les résultats et sont mis à mort.
Remplacement
Cette étude a l’avantage d’aborder, en parallèle, l’étude neuroanatomique de la chromogranine A (CgA) et de sa fonction régulatrice du système peptidergique 26RFa. Elle permettra la compréhension du rôle de la CgA dans la sécrétion de 26RFa, plus particulièrement par les neurones hypothalamiques, et ainsi la compréhension de la régulation centrale de l'homéostasie glucidique, en condition physiologique. Une telle approche, très intégrée, n’est rendue possible que par les études in vivo.
Réduction
Compte tenu de la variabilité inter-individuelle des processus physiologiques étudiés, nous utiliserons des lots de 12 souris par condition de traitement. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement analysables. De plus, une partie des tests physiologiques prévus pour évaluer l’homéostasie glucidique sera réalisée successivement sur une même souris et chaque souris sera son propre contrôle afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Chaque nouveau test sera débuté lorsque les animaux auront bénéficié d’une période de rétablissement minimum d’une semaine qui permet aux animaux de reconstituer leur volume sanguin après les prélèvements effectués lors du test précédent et de stabiliser leur poids corporel. Pour les groupes dédiés au prélèvement des explants hypothalamiques ou cérébraux, les groupes de souris pourront être réduits à 10 animaux.
Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Les animaux reproducteurs seront maintenus à trois par cage pour éviter tout isolement social et leur environnement sera enrichi (présence de matériel pour construire un nid + dôme en plastique rouge pour s'y réfugier). Pendant toute la durée du séjour, les animaux seront suivis quotidiennement pour déceler tout signe de souffrance. Parmi ces signes, seront notamment relevés : perte de poids importante (20% du poids initial), posture « dos voûté », prostration, plaies, poil terne, vocalisations anormales, agressivité. Si l’un de ces signes ou combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal sera renforcé. Si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 24h, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et une mise à mort sera réalisée. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale) et la douleur au réveil sera traitée par injection intra-péritonéale d'analgésiques, répétée après 4 heures si nécessaire.
Choix des espèces
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre de façon globale, le rôle de la CgA dans la sécrétion des neuropeptides par les neurones 26RFa et la régulation hypothalamique de l’homéostasie glucidique. La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coût d’entretien réduits, fortes performances reproductives. Il s’agit d’un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison de nos données avec celles d’autres équipes. De plus, la souris permet des approches génétiques et chémogénétiques complexes n’existant pas chez d’autres modèles mammifères. Au cours de cette étude, la physiologie adulte sera étudiée. Les souris seront donc âgées d’au moins 8 semaines lors des expérimentations.
Elevage avec Identification et génotypage invasifs
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 3000
72 000 souris et 3 000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, les animaux dont le génotype ne présente pas d'intérêt étant tués et les autres gardés en vie pour d'autres protocoles. Nouveau-nés ou adultes maintenus en contention, ils reçoivent un tatouage puis une biopsie de la queue ou de l'oreille pour identification et génotypage. Le porteur décrit une douleur légère et brève, avec dans de rares cas une hémorragie à la queue ou le rejet du nouveau-né par sa mère. Il affirme que les prélèvements non invasifs par écouvillon salivaire ou follicule pileux ne permettent pas un génotypage fiable avant sevrage, ce qui justifierait ces biopsies.
Objectifs
L'objectif de cette demande est d'identifier et de génotyper l'ensemble des animaux génétiquement altérés produits dans l'Etablissement Utilisateur(EU) pour répondre aux besoins des chercheurs des deux instituts de Neurosciences. Les 23 équipes emploient une centaine de lignées qui sont couvertes en expérimentation par actuellement 88 autorisations de projets. Pour ce faire, sur les nouveau-nés, deux gestes techniques invasifs sont réalisés succéssivement: un tatouage digital selon un code de numérotion enregistré dans les procédures de l'EU suivi d'une biopsie de queue et sur les animaux adultes seul le prélèvement de la biopsie d'oreille est réalisé. Ces procédures sont réalisées sur animal vigile agé de 6 à 12 jours pour les nouveau-nés et sur animal adulte. Cette identification et génotypage se justifient par la nécessité de: -sélectionner les animaux d'intérêt pour l'expérimentation (inclus dans d'autres demandes d'autorisation de projets si des procédures le justifient -sélectionner et vérifier le génotype des géniteurs permettant l'amplification et l'entretien des colonies -sélectionner les animaux pour la formation, le maintien des compétences et les prélèvements d'organes ou des tissus pour des études ex-vivo hors champ d'application. Les animaux dont le génotype n'est pas d'intérêt pour les expérimentations déclarées, les activités d'élevage, la formation ou les prélèvements seront mis à mort selon une méthode réglementaire.
Bénéfices attendus
La procédure d'identification et de génotypage est nécessaire pour la sélection des animaux d'intéret dans les projets de recherche. L'identification par tatouage permet: -d'identifier individuelement ou par lot les animaux -de manière permanente sur le long terme -de ne pas mutilier les animaux sur leurs pattes pour garder une motricité fine -d'éviter un recours à l'anesthésie. Le génotypage par biopsie de l'extrémité de la queue ou d'oreille permet: -l'obtention de resultats fiables grâce à une quantité et une qualité du matériel génétique obtenu pour réaction d'amplication d'ADN -de minimiser les risques de contaminations entre échantillons grâce aux procédures de prélèvement compatible avec les contraintes sanitaires nécessaire au maintien du statut EOOPS (Exempt d'opportunistes et d'organismes pathogènes spécifiques) ciblé -d'éviter le recours à l'anesthésie
Procédures
Tatouage et prélèvement de biopsie de queues sur animal nouveau-né vigile ou d'oreille sur animal adulte vigile: un seul prelevement /animal et la procédure dure de 2 à 3min/animal
Impact sur les animaux
Les gestes réalisés provoquent une douleur légère et de court durée. L'animal est maintenu en contention pendant les actes ce qui est une source de stress qui sera minimisé par l'expérience des expérimentateurs. Dans de très rares cas, certains effets indésirables supplémentaires peuvent survenir: -une légère hémorragie à la queue -le rejet du nouveau-né par la mère
Devenir
Une mise à mort des animaux est réalisée si leur génotype n'est pas d'intérêt ou gardé en vie pour une utilisation continue couverte par les autorisations de projets.
Remplacement
A ce jour, les prélèvements non invasifs à base d'écouvillons salivaires ou de follicules pileux ne permettent pas de procéder au génotypage de façon fiable en prenant en compte les techniques de génotypage robotisées, des procédures de prélèvements en condition stérile et la nécessité d'obtenir des résultats avant sevrage pour la gestion des élevages et la production des animaux expérimentaux. Un doute sur les résultats de génotypage conduirait à la nécessité de procéder à un nouveau prélèvement sur des animaux plus âgés et donc plus sensibles à la douleur. Chaque erreur qui conduirait à l'accouplement d'animaux n'ayant pas les caractéristiques attendues engendrerait: -une augmentation du nombre d'animaux produits inutilement -la naissance d'animaux avec des phénotypes potentiellement délétères -l'utilisation d'animaux génétiquement sans interet dans des projets expérimentaux induisant des résultats érronés et non exploitables
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d'autres moyens aussi efficaces nous permettant de sélectionner les animaux transgéniques. Les plans d'élevage mis en place en concertation avec le porteur de projet visent à réduire autant que possible le nombre d'animaux générés et donc d'animaux à identifier et génotyper. Dans la mesure du possible, nous favorisons l'utilisation des animaux au génotype non d'intéret dans d'autres projets ou des formations afin de ne pas élever ces animaux à ces seules fins et de réduire le nombre d'animaux produits par l'EU. Nous pouvons également utiliser ces animaux comme congénère de compagnie pour éviter les animaux isolés.
Raffinement
Les actes d'identification et de génotypage sont réalisés par un personnel expérimenté, formé par tutorat. La parfaite maitrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l'inconfort et le stress ressentis par l'animal. Ces identifications et prélèvements de biopsies sont réalisés avec du matériel et des instruments stériles et appropriés permettant un geste rapide et précis dans le respect des conditions d'aseptie établies dans l'EU. La procédure est réalisée sous PSM et est limitée dans le temps (2-3min/animal) pour limiter le temps de séparation des nouveaux-nés de leur mère et la contention des animaux. Une mise à mort est décidée si la queue de l'animal présente un saignement non maitrisé dans l'heure suivant la réalisation de la biopsie sinon il est réalisé à reception des résultats de génotypage ou à P14 si les animaux nés ne seront pas utilisés.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de celle de l'homme ce qui permet une extrapolation des résultats à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle moléculaire ou comportementale. Le rat est lui couramment utilisée dans des études de comportement et de neurogénèse adulte ce qui a permis de constituer des bases de données importantes pour guider la conception des protocoles expérimentaux et d'obtenir une bonne réplicabilité des expériences. Que soit la souris ou le rat, ces espèces de rongeurs sont des espèces qui permettent une obtention aisée de modèles génétiquement altérés par différentes méthodes et donc créer des modèles murins de pathologies neurologiques bien caractérisés. Pour la grande majorité, les animaux sont identifiés entre 6 et 12 jours post natal. A cet age les animaux sont aisément manipulable, le cartilage est souple et les groupes sociaux sont stables. Toutes fois, certaines procedures exigent un génotypage précoce entre la naissance et 5 jours : ces stades de développement sont ceux où les cellules expriment le mieux leur potentiel de différenciation et de survie en culture; cultures primaires de neurones hippocampiques et cultures organotypiques de tranches de cerveaux sur nouveaux nés. Pour les animaux adultes qui sont les géniteurs lors de l'introduction d'une lignée ou bien des vérifications sur animal adulte demandées par le chercheur, c'est un autre prélèvement qui est utilisé pour le génotypage: biopsie d'oreille.
Analyse comparée des protocoles d’administration de la FENM et de la Mémantine sur les paramètres comportementaux, biochimiques et physiologiques dans différents modèles murins de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
636 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans un ventricule cérébral sous anesthésie, des injections répétées et une pompe implantée sous la peau, puis passent des tests de mémoire dont un évitement passif où un stimulus électrique est appliqué sur les pattes. Le porteur présente les injections comme peu douloureuses et évoque un léger stress lors des tests. Il affirme que les modèles murins transgéniques développant progressivement la maladie d'Alzheimer sont les plus performants pour analyser les propriétés d'une molécule.
Objectifs
Ce projet de thèse a pour but de documenter de façon exhaustive la stratégie clinique qui sera sélectionnée pour le développement de la FENM dans la MA
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de préciser les effets pharmacologiques in vivo d'un candidat médicament et apporter des informations importantes avant le développement clinique de cette molécule de nouvelle génération potentiellement efficace pour modifier de façon durable le décours de la maladie, car neuroprotectrice.
Procédures
Une injection intracérébroventriculaire sera réalisée sous anesthésié gazeuse (durée 3 min). Injections intrapéritonéales pendant 7 jours (moins d'une minute). Les souris auront sous anesthésie une incision cutanée pour la pose de la pompe qui délivre le composé en continu (durée 5 min). Les capacités de mémorisation sont analysés avec des tests de comportement qui dure 8 min pour l'alternance spontanée, deux fois 10 min pour la reconnaissance d'objets, 90 et 60 secondes pour la mémoire spatiale et 2 fois 3 secondes pour le test d'évitement passif.
Impact sur les animaux
les procédures d’injections seront peu douloureuses avec une administration par voie intra péritonéale et par diffusion sous cutanée grâce au pompe Alzet. L'injection dans le ventricule se fait sous anesthésie gazeuse. Un léger stress est présent lors des tests de mémoire . un stimulus aversif sera administré au niveau des pattes de la souris. Les animaux ont la possibilité de remonter sur la plate-forme pour échapper au stimulus.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin du projet pour prélèvement et analyse des effets du traitement sur le cerveau
Remplacement
Les modèles précliniques d’étude des mécanismes complexes de neurodégénération dans la maladie d’Alzheimer les plus performants sont des modèles murins et plus particulièrement des modèles murins transgéniques développant la pathologie progressivement après plusieurs mois de vie. Les propriétés neuroprotectrices de la FENM seront analysées en administration chronique sur un modèle transgénique de la maladie d’Alzheimer, les souris APPSwe/PS1dE9 ainsi qu'un modèle pharmacologique d'injection de peptide amyloïde‐ß[25‐35] oligomérisé.
Réduction
Les molécules sont administrées dans une gamme de doses réduite (généralement 0.003 - 0.3 - 1 - 3 mg/Kg en fonction des résultats antérieurs). Les animaux sont testés sur des tests comportementaux adaptés au paramètre à mesurer. Les analyses statistiques sont optimisées aux données générées de façon à limiter le nombre d'animaux par groupe (12 souris/groupe). Ce nombre de 12 souris par groupe a été déterminé de façon empirique mais a été depuis confirmé en analysant nos données antérieures à l'aide de logiciel statistiques.
Raffinement
Les animaux seront reçus une semaine avant le début de l'expérimentation et gardés en groupe de 8-10 individus par grande cage. Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des maisons en cartons et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie gazeuse. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Après les tests comportementaux les animaux sont directement remis dans la cage d’origine à l’écart du test de comportement afin de retrouver leur environnement sécurisant. Les traitements pharmacologiques envisagés ont déjà été utilisés et ne sont pas à l’origine de douleur visible ou de détresse. Mais un examen quotidien sera fait. Les animaux seront retirés de l'étude si les points limite sont atteints.
Choix des espèces
Les souris C57BL/6 mâles seront utilisées pour différencier l'effet des deux modes d'administrations (bolus VS infusion). Ces souris témoins sont le fond génétique des souris transgéniques APPPS1 utilisées pour la suite de l'étude, il est donc important de travailler avec le même fond génétique pour ce projet. Les souris APPPS1 seront par la suite utilisées pour tester l'efficacité des composés aux doses efficaces en bolus VS infusion. Cette lignée développe la pathologie progressivement avec des altérations comportementales dès 9 mois et qui sont très marquées à 12 mois d'âge. Les dépôts amyloïdes, la neuroinflammation, la gliose et le stress oxydant apparaissent même plus tôt, dès 6 mois, c'est donc un très bon modèle expérimental pour refléter les symptômes de la maladie d'Alzheimer. Les souris C57/BL6 seront utilisées à l'âge de 3 mois qui correspond à l'âge adulte, puis à l'âge de 10 mois pour faire une comparaison avec nos souris transgénique traitées. les souris APPS1 à l'âge de 3 mois afin de visualiser si la FENM a un effet neuroprotecteur avant l'apparition des premiers signes de la pathologie, 6 mois afin de visualiser un effet neuroprotecteur sur le comportement de ces souris, puis 10 mois afin de vérifier un potentiel effet curratif de la FENM, lorsque les lésions histpathologiques de la MA sont iréversibles.
Exploration de la dysfonction endothéliale et de ses complications vasculaires chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
5 274 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie opérée sans réveil. Sur les unes, les expérimentateurs prélèvent des vaisseaux sous anesthésie profonde, sur d'autres ils pratiquent des chirurgies de la patte avec pose de cathéter pour perfuser des composés et mesurer la réponse des vaisseaux. Le porteur signale peur, stress, hypothermie et douleur liés aux manipulations et aux actes chirurgicaux. Il reconnaît qu'aucun modèle in vitro ne remplace complètement un organisme vivant et annonce des études sur cellules humaines pour limiter le nombre d'animaux.
Objectifs
Ce projet vise à déterminer l'impact de l'activité de certains récepteurs situés sur l'endothélium des vaisseaux qui pourraient être une cible thérapeutique pour la prise en charge des pathologies cardiovasculaires. Nous resoumettons le projet au regard des résultats obtenus. La mise à jour porte sur l'ajout des nouvelles lignées de souris ainsi que le besoin de réaliser de nouvelles procédures expérimentales. Ces ajouts tiennent compte de la règle des 3R. Le projet scientifique avait été antérieurement évalué positivement par l'ANR (Agence Nationale de la Recherche). Ce projet permettra de nouvelles avancées dans la compréhension des mécanismes de la dysfonction endothéliale qui contribuent au développement des anomalies de l'arbre vasculaire et en particulier de l'athérome. Il fournira de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de cette pathologie.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de la recherche fondamentale, ce projet permet de caractériser au niveau de l'endothélium des vaisseaux, le rôle de certains récepteurs ou cibles dans le bon fonctionnement du vaisseau (état contractile nécessaire au déplacement du sang). Il permet aussi d'évaluer la contribution de ces cibles dans les modifications observées de la paroi des vaisseaux (remodelage vasculaire) au cours des variations de débit sanguin et de pression de perfusion. Sur ce terrain, il sera aussi étudié leur contribution dans le développement des lésions d'athérome au cours d'un régime gras déséquilibré. Des travaux publiés sur des cellules endothéliales en culture, montrent que l'activation de ces récepteurs favorise la production de composés/médiateurs par la cellule jouant un rôle protecteur contre les mécanismes pro-inflammatoires et pro-athérogènes. Sur ces avancées, il est attendu d'observer une amélioration des paramètres vasculaires (amélioration de la réponse vasodilatatrice, diminution des lesions sur les parois) et métaboliques (diminution de l'inflammation, amélioration du diabète,et de la lipidémie) chez les animaux recevant des composés à l'étude capables d'activer ces récepteurs. Il est aussi attendu l'absence d'amélioration voire une aggravation de la maladie (développement de lésions d'athérome, diminution de la lumière du vaisseau par développement de la paroi) chez les animaux transgéniques invalidés pour les récepteurs ou cibles moléculaires d'intérêt. Ce projet permet aussi dans le cadre de la recherche translationnelle de pré-établir des données expérimentales de sécurité et aussi d'étude des effets potentiels dans l'organisme pour la mise au point de futurs médicaments.
Procédures
Nous avons estimé un besoin de 5274 animaux dans le projet de recherche. Afin d’étudier les propriétés vasodilatatrices de nouvelles molécules synthétisées ainsi que, leurs effets sur les cellules constitutives de la paroi du vaisseau, des vaisseaux seront prélevés sur les animaux au cours d’une anesthésie profonde induite par l’administration dans l’abdomen (une piqûre) d’un mélange anesthésique (durée : quelques secondes). La durée du prélèvement est estimée à 10 minutes (1664 animaux sont concernés). D’autres animaux subiront des actes de chirurgie (décrits ci-dessous) sous anesthésie profonde réalisés par l’administration dans l’abdomen (une piqûre) d’un mélange anesthésique (durée: quelques secondes). Ils recevront aussi un analgésique puissant par voie sous – cutané (une piqûre) afin de réduire la douleur en pré-ou post-opératoire. Parmi, les chirurgies, des animaux subiront une chirurgie sur la patte arrière de durée estimée à 45 minutes, afin d’étudier, par la suite, chez l’animal vigile, la réponse vasodilatatrice du vaisseau au cours de la perfusion de composés administrés par le biais du cathéter préimplanté dans la patte arrière (640 animaux). D’autres subiront un acte chirurgical au niveau du cou d’une durée estimée de 10 minutes, au cours duquel une lésion vasculaire (brûlure) sera opérée en surface du vaisseau (1408 animaux) afin d’étudier par la suite chez l’animal vigile, la cicatrisation/régénération du vaisseau. D’autres animaux subiront une chirurgie du cou afin de réaliser une ligature sur des vaisseaux du cou pour d’étudier sur ces modèles vigiles, les effets protecteurs des composés sur la paroi du vaisseau. Le temps mis pour effectuer une ligature sur des vaisseaux du cou est estimé à 15 minutes sous anesthésie profonde (1472 animaux). Enfin, un étude de pharmacocinétique sera effectuée sur les composés à l’étude afin de connaître l’évolution des concentrations circulantes dans le temps. Les composés seront administrés à l’animal vigile à la suite d’une injection dans l’abdomen (une piqûre, durée de l’administration, de quelques secondes) et le devenir ou la concentration circulante de ces composés, sera établie au cours du temps dans le sang de l’animal. Le sang sera prélevé 5 fois à la queue et la durée du prélèvement à chaque fois (ou temps) est estimée à 1minute (90 souris vigiles).
Impact sur les animaux
Les expérimentations prévues peuvent induire des nuisances ou effets indésirables sur les animaux. La peur et le stress sont des nuisances qui peuvent survenir lors de la manipulation des animaux, leur isolement dans certaines procédures, ou lors de l'administration d'un produit anesthésiant avant un acte chirurgical. Une nuisance de l'anesthésie est d'induire une hypothermie, une sensation de fatigue en période de réveil, une petite douleur au point d'injection. D'autres nuisances possibles, sont la sensation de fatigue, la douleur ou de la fièvre qui peuvent être observées au cours des actes chirurgicaux où l'expérimentateur pose à demeurre une cathéter intraveineux ou une sonde à ultrasons de mesure du débit sanguin. Les actes chirurgicaux portés sur les vaisseaux du cou (carotides) peuvent induire au réveil, une douleur locale gênant les mouvements de la tête en particulier pour la prise alimentaire. L'animal peut aussi ressentir au réveil, de la fatigue et développer une fièvre.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés. Ceci est nécessaire afin de prélever les tissus et organes à des fins d'histologie ou d'autres analyses. Ces examens donnent des informations complémentaires aux données mesurées sur l'animal vivant. Ils permettent de comprendre les mécanismes biologiques mis en jeu dans un tissu ou organe, le développement des lésions au cours du temps, et, les cellules impliquées. Ces prélèvements permettent aussi de réduire le nombre d'animaux dans les expérimentations.
Remplacement
Bien qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer complètement un organisme vivant, des études in vitro sur des lignées de cellules endothéliales humaines sont prévues pour comprendre les réactions biochmiques immédiates à l'échelle de la cellule et limiter dans la mesure du possible l'utilisation des animaux à cette fin (réduire). Les animaux sont prévus dans ce projet, pour explorer dans le temps, et dans un organisme vivant, les effets biologiques des molécules administrées sur les paramètres cardiovasculaires et métaboliques. C'est pourquoi, ils ne peuvent être substitués par d'autres modèles d'étude.
Réduction
1/Plusieurs données peuvent être obtenues avec un même animal : tests de tolérance au glucose, prélèvements de tissus, prélèvement de plasma pour étude des lipoprotéines (profils) prélèvement de foie ,... 2/ Une réflexion biostatique est réalisée en amont de la procédure/expérience, pour limiter le nombre d'animaux. Cette réflexion implique la recherche bibliographique et l'examen de travaux similaires avec le nombre d'animaux nécessaires pour démontrer une différence statistiquement significative. Elle implique aussi l'utilisation d'un logiciel de statistique pour estimer sur la base de précédents travaux effectués ou en cours de réalisation, le nombre d'animaux nécessaires pour chaque expérimentation à venir. 3/La formation et l'encadrement des expérimentateurs dans les procédures permet d'optimiser l'obtention de mesures/données fiables et interprétables sur un faible nombre d'animaux. 4/ Les animaux seront utilisés dans les expériences/procédures jugées indispensables en fonction de l'avancée du projet.
Raffinement
Pour optimiser l'expérimentation, la fiabilité des résultats, des mesures visant à réduire, voire supprimer la douleur, le stress et améliorer le bien-être des animaux seront mises en place : - les animaux seront élevés et hébergés dans une animalerie agréée - les moyens pour limiter le stress aux animaux sont appliqués: enrichissement des cages, animaux invités à coopérer dans les actes non invasifs et non douloureux (exemple: test de tolérance au glucose), expériences réalisées dans une pièce calme en présence d'un faible nombre d'expérimentateurs - les expérimentateurs seront encadrés dans les protocoles par un sénior et rompus aux procédures expérimentales ce qui permet de limiter le stress et la douleur - en cas de transport de l'animal, un transporteur agrée pour transport d'animaux sera réquisitionné - des points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure seront établis - dans la mesure du possible et en fonction de la statistique, les animaux prévus dans les mesures invasives seront réduits - des soins adéquats seront prévus avant, pendant et après l’opération (des anesthésiques et des analgésiques seront utilisés pour réduire /supprimer la douleur) - la réduction de la durée de certaines études (surtout toxicologiques) - la mise en place de procédures d’euthanasie appropriées.
Choix des espèces
Nous souhaitons d'utiliser la souris pour plusieurs raisons: Nous disposons d'une grande expertise de l'utilisation de cet animal (manipulation, procédures chirugicales, expérimentations spécifiques). Nous disposons aussi d'outils d'exploration des effets vasculaires des molécules étudiées appliqués aux vaisseaux de souris. Dans la littérature, les effets vasculaires de l'apoA-I sont pour beaucoup décrits avec les souris (sauvages et transgéniques) ce qui constitue une base pour notre recherche. Des souris transgéniques, porteuses de mutations sur des gènes qui nous interessent, sont disponibles, et, nous permettent de réaliser le projet.Les souris sont utilisées à partir de 8 semaine de vie. A cet âge, elles pourront débuter le régime gras, ce qui est classique dans les études explorant la mise en place de l'athérome au cours du développement de l'animal. Le régime gras sera maintenu sur 30 à 40 semaines maximum. Les différentes explorations sont prévues sur des animaux âgés de 8 semaines à 50 semaines maximum.
Développement d’un traitement innovant de la drépanocytose
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
486 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Porteuses d'une drépanocytose, elles reçoivent des injections sous anesthésie et, pour une partie, sont placées trois heures dans une atmosphère appauvrie en oxygène afin de déclencher des crises d'occlusion des vaisseaux, avant une mise à mort sans réveil. Le porteur reconnaît que ces crises provoquent douleur, perte de poids et baisse de mobilité, atténuées par un antidouleur puissant. Il affirme que la complexité des crises vaso-occlusives ne peut être reproduite in vitro et que seule cette souris génétiquement modifiée reproduit fidèlement la maladie.
Objectifs
L’un des projets de recherche de notre unité de recherche consiste à développer un nouveau traitement contre la drépanocytose, une maladie génétique du sang qui touche les globules rouges et qui est associée à des complications récurrentes, graves et parfois mortelles. De plus, l’espérance de vie des patients drépanocytaires est réduite. Actuellement, cette maladie ne peut pas être guérie et elle se traite très difficilement. Ceci souligne le besoin pour les patients de pouvoir bénéficier de nouveaux traitements plus efficaces, ou qui pourraient être utilisés en combinaison avec les médicaments déjà existants, pour augmenter leur efficacité. Dans ce projet, nous nous proposons de démontrer l’efficacité de plusieurs médicaments que nous avons avons développés au laboratoire. Nous souhaitons également déterminer comment, et à quelle dose, devront être pris ces potentiels médicaments, lors de futures études cliniques chez les patients drépanocytaires. La drépanocytose étant une maladie particulièrement complexe, nous devrons tester nos molécules chez des souris drépanocytaires, qui sont les seuls animaux disponibles qui reproduisent fidèlement la maladie chez l'Homme. Si les résultats obtenus chez la souris sont convaincants, nous poursuivrons ensuite les tests de ce médicament potentiel, chez l'Homme.
Bénéfices attendus
Si nos résultats sont positifs, ce projet pourrait clairement avoir un bénéfice pour la qualité de vie et l'espérance des patients drépanocytaires. Nous avons, d'ailleurs, obtenu un financement par une entreprise pharmaceutique qui est intéressée pour développer nos médicaments et les tester chez les patients.
Procédures
Une partie des souris utilisées (drépanocytaires ou non) seront injectées (pendant une durée d’1 minute chacune), sous anesthésie générale, puis au maximum 2 prélèvements de sang (durée de 30 s chacun) seront réalisés sous anesthésie générale. Les souris seront immédiatement mises à mort, sans retour à la conscience, après le dernier prélèvement de sang. Pour une des interventions cherchant à déclencher des occlusions des vaisseaux chez les souris drépanocytaires, celles-ci seront injectées 2 fois (pendant une durée d’1 minute chacune), sous anesthésie générale, puis seront placées, ou non, dans des conditions dans lesquelles l'oxygène de l'air sera diminué (de 21 à 8%), pendant 3 h, et enfin replacées à l'air ambiant pendant 1 h. Toutes les souris seront ensuite immédiatement anesthésiées (anesthésie générale), le sang sera prélevé (durée d’1 minute), et les souris euthanasiées. Finalement, les organes (foie, reins, cœur, poumons, rate) seront prélevés. Pour l’autre intervention cherchant à déclencher des occlusions des vaisseaux chez les souris drépanocytaires, celles-ci seront injectées 3 fois (pendant une durée d’1 minute chacune), sous anesthésie générale, et 3 h après la dernière injection, toutes les souris seront immédiatement anesthésiées (anesthésie générale), et le sang sera prélevé (durée d’1 minute). Les souris seront finalement euthanasiées et les organes (foie, reins, cœur, poumons, rate) seront prélevés.
Impact sur les animaux
Les souris drépanocytaires développent une maladie similaire à la drépanocytose humaine, avec en particulier une anémie chronique, mais sans effet majeur chez des souris jeunes (< 10 semaines), qui ont été choisies pour notre projet. Au cours de leur 10 semaines de vie, les souris drépanocytaires pourront développer des "crises vaso-occlusives" (comme les patients), engendrant pendant quelques jours une douleur, une perte de poids, une inactivité/mobilité réduite, et un comportement anormal. Ces crises sont transitoires, mais seront soulagées avec l'administration d'un anti-douleurs puissant. De même, quand nous induirons les crises vaso-occlusives chez les souris drépanocytaires, ceci engendrera une douleur d'une durée au maximum égale à la durée de l'intervention (3-4 h), ainsi qu'une inactivité/mobilité réduite, et un comportement anormal. Cette douleur sera prise en charge par administration préventive d'un anti-douleur puissant, avant le déclenchement de la crise. Dans ce projet, d'autres nuisances sont attendues pour les souris drépanocytaires ou non drépanocytaires, et sont liées à la préhension/contention des animaux, aux injections (introduction d'une aiguille sous anesthésie), ainsi qu’au prélèvement final de sang, à la perfusion intracardiaque, au prélèvement d’organes, et au sacrifice (tous sous anesthésie).
Devenir
Toutes les souris utilisées dans ce projet seront systématiquement euthanasiées en fin d'expériences. En effet, des analyses post-mortem sur des organes seront nécessaires pour certaines expériences. Pour le reste des expériences, les souris drépanocytaires (génétiquement modifiées), ou non drépanocytaires, ne pourront être ré-utilisées ou replacées car elles auront été injectées avec des molécules expérimentales dont les effets à long terme ne sont pas connus.
Remplacement
Les crises vaso-occlusives (CVOs) chez les patients drépanocytaires sont très complexes. Les cellules constituant les vaisseaux sanguins, mais également de nombreux types de cellules sanguines différentes, sont impliquées dans les mécanismes qui déclenchent ces crises. Ce système complexe ne peut à l'heure actuelle être remplacé par des systèmes in vitro, étant données les interactions multiples qui existent entre toutes ces cellules. L'évaluation de l'efficacité de nouveaux traitements dans la drépanocytose nécessite donc le recours à un modèle animal de cette maladie, et la souris est le seul modèle animal de drépanocytose actuellement disponible.
Réduction
Le but de notre projet est de déterminer si nos molécules pourraient être utilisées chez les patients drépanocytaires, avec des injections les moins fréquentes possibles, et si oui, à quelle dose. Dans un premier temps, nous partirons d'un dose classiquement utilisée en thérapeutique pour d'autres maladies, et nous évaluerons quelles molécules restent détectables dans le sang 96 h après l'injection, à cette dose. Seules les molécules respectant ce critère seront étudiées plus en détail dans ce projet, ce qui permettra de limiter le nombre de molécules testées, et donc le nombre de souris utilisées. Ces molécules seront ensuite testées pour savoir si elles sont efficaces pour limiter l’ampleur des crises vaso-occlusives chez des souris drépanocytaires. Pour répondre à cette question, le nombre de souris à utiliser pour obtenir des résultats robustes a été déterminé en nous basant sur des expériences similaires qui nous ont ensuite permis d’utiliser des logiciels de statistiques spécifiques pour estimer ce nombre. Au total, 360 souris devront ainsi être utilisées, mais uniquement si toutes les molécules répondent à nos critères initiaux. De plus, le maximum d’organes seront prélevés pour ne pas avoir à recommencer les expériences ultérieurement, sur de nouvelles souris. Il est aussi prévu, en fin de nos expériences, de prélever une quantité de sang suffisante pour pouvoir répéter les analyses sur le sang, sans avoir à recommencer les expériences ultérieurement, sur de nouvelles souris.
Raffinement
Pour le bien-être des animaux, un enrichissement est prévu dans les cages. Les souris seront hébergées dans des cages adaptées aux rongeurs, avec un nombre d’individus par cage compris entre 3 et 5 (pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de disputes ou de stress engendrés par une population trop importante). Toute injection ou tout prélèvement sera effectué sous anesthésie générale. Lors des modèles d'induction des crises vaso-occlusives (CVOs) chez les souris drépanocytaires, qui sont douloureuses, les animaux resteront sous la surveillance continuelle de l'expérimentateur, et tout changement de comportement et d’apparence physique, ainsi que des signes de douleur, seront recherchés. Si ces changements et ces signes sont trop importants, l’animal sera euthanasié et l’expérience sera interrompue pour cet animal. Surtout, un médicament anti-douleur très puissant sera administré aux souris, en prévention, avant de déclencher la CVO. Il est également possible que les souris drépanocytaires élevées dans notre animalerie développent spontanément une CVO douloureuse, en raison de leur maladie. C’est pourquoi ces souris drépanocytaires seront quotidiennement surveillées, y compris pendant leur hérbergement, et elles seront traitées par un anti-douleur très puissant quand des signes évoquant des COVs seront constatés.
Choix des espèces
Seule cette espèce possède un modèle génétiquement modifié mimant la drépanocytose, et qui reproduit de façon fidèle les manifestations cliniques de la maladie. Des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines maximum seront utilisées, car les souris drépanocytaires développent ensuite des atteintes d’organes sévères au cours du vieillissement.
Repenser la nutrition protéique pour la santé, le bien-être et la robustesse du poussin à croissance rapide ou lente – optimisation de l’apport protéique les premiers jours de vie
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
384 poulets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit une prise de sang au sinus occipital sur animal vigile, puis est mis à mort à cinq, dix ou vingt jours pour analyser sa composition corporelle selon le taux de protéines de son aliment. Le porteur présente le prélèvement comme rapide et sans risque s'il est réalisé par du personnel habilité. Il affirme qu'aucun test in vitro ou in silico ne représente la complexité de la digestion, l'étude portant sur l'espèce cible elle-même.
Objectifs
La nutrition du jeune poussin est délicate du fait du passage d’une alimentation d’origine maternelle à une alimentation d’origine exogène, alors qu’elle contribue de manière importante à sa robustesse en renforçant sa santé digestive. Les apports protéiques pourraient probablement être réduits dans les premiers jours de vie et l’usage de matières premières protéiques locales souvent riches en fibres pourrait être facilité en période de croissance par une alimentation néonatale adaptée. L’objectif général du projet est de proposer des stratégies nutritionnelles précoces du poussin afin de renforcer sa santé et son bien-être, et d’améliorer l’usage de sources de protéines diversifiées et locales. La première étape, qui fait l’objet de cette demande, vise à optimiser l’apport protéique pendant les premiers jours de vie. Nous chercherons dans une deuxième étape à améliorer l’équilibre en acides aminés et évaluer l’impact de la supplémentation en acides aminés fonctionnels, et dans une troisième étape à raffiner les besoins en protéines et en acides aminés en fonction de certaines caractéristiques du régime.
Bénéfices attendus
L’objectif étant d’affiner la connaissance des besoins protéiques pour ajuster et/ou équilibrer les apports sur la phase de démarrage (premiers jours de vie), l’intérêt scientifique de ce projet réside en premier lieu dans l’approche expérimentale fine d’une période du développement de l’animal qui est relativement peu étudiée. La connaissance des besoins nutritionnels du jeune a été expérimentée mais jamais, à notre connaissance, sous l’angle complémentaire des performances zootechniques et des biomarqueurs en lien avec la robustesse, la santé et le bien-être des animaux. Au niveau opérationnel, les attendus sont de : mieux appréhender les besoins du jeune (incluant la période ≤ 7 jours) pour réduire les apports en protéines et équilibrer les acides aminés de manière à éviter l’excédent protéique pouvant fragiliser la santé digestive, et à terme, proposer des stratégies nutritionnelles précoces permettant de renforcer la santé des animaux tout en favorisant l’usage de matières premières locales protéiques sur toute la période d’élevage.
Procédures
Une prise de sang au sinus occipital sera effectuée sur animaux vigiles. Les animaux prélevés ne seront pas les mêmes à chaque date. Il n’y aura donc qu’une prise de sang par animal qui ne durera que quelques secondes.
Impact sur les animaux
La technique de prélèvement de sang utilisée est rapide (quelques secondes) et approuvée depuis de nombreuses années. Elle ne présente pas de risques pour l'animal si elle est réalisée par du personnel habilité.
Devenir
Suite à la procédure de prise de sang, les animaux seront mis à mort pour des découpes anatomiques, à J5 et à J10 pour l’essai 1 et à J10 et à J20 pour l’essai 2, ceci afin de caractériser leur composition corporelle en fonction du taux protéique de leur aliment.
Remplacement
La connaissance des besoins nutritionnels du jeune poussin sera expérimentée sous l’angle original et complémentaire des performances zootechniques et des biomarqueurs en lien avec la robustesse, la santé et le bien-être des animaux. Aucun test in vitro ou in silico n'est capable de représenter la complexité des mécanismes physiologiques de digestion et de métabolisme. Les analyses se feront directement sur l’espèce cible (poule domestique)
Réduction
Au total, 384 animaux seront prélevés (sang) sur l’ensemble des 2 essais (essai génotype à croissance rapide et génotype à croissance lente). Le nombre d’animaux expérimentaux choisi pour chacun des 2 essais est nécessaire et suffisant pour pouvoir tirer des conclusions significatives en tenant compte 1) de nos expériences précédentes en intégrant la variabilité interindividuelle attendue en termes de poids, composition corporelle, statut métabolique et robustesse tout au long de l’expérimentation (cf ci-dessous), et de 2) de la réalisation, à différents jours de la phase de démarrage, de prélèvements (sang) suivis de mise à mort pour découpe anatomique. Nous cherchons à mettre en évidence des variations possibles de la baisse du taux protéique du régime (dose-réponse avec 6 régimes) sur les performances de croissance. L’unité statistique pour les analyser sera le compartiment. Huit compartiments par groupe sont nécessaires et suffisants pour détecter des différences de consommation d’aliment et d’indice de consommation entre régimes d’après des travaux publiés en 2017 sur la baisse de protéines chez les poulets en fin de période d’élevage. Ces paramètres seront analysés statistiquement pour comparer les différents traitements, et utilisés pour modéliser la croissance des animaux. L’unité statistique pour les dosages sanguins sera l’animal. Un effectif de 16 animaux par régime et par âge au prélèvement (2 par compartiment , par régime et par âge au prélèvement), soit 192 animaux par essai, est nécessaire et suffisant pour pouvoir tirer des conclusions significatives en tenant compte de nos expériences précédentes et de la variabilité interindividuelle attendue des paramètres sanguins mesurés : utilisation des résultats d’un projet précédent et des avancées méthodologiques rapportées dans un article publié en 2021. Un test statistique permettra de comparer les groupes.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans un bâtiment d’élevage standard, au sol dans des compartiments où ils resteront en groupe. La taille du compartiment est suffisante pour permettre aux poussins de se déplacer avec une zone de repos significative en plus de l’espace mangeoire et abreuvement. Les animaux auront à disposition plusieurs enrichissements leur permettant de grimper et de se cacher. Le suivi des performances sera fréquent avec des mesures tous les 2 ou 3 jours sur la période étudiée. Toute manifestation de symptômes persistants tels que « animal prostré » plus de 24 h et ayant cessé de s’alimenter et de s’abreuver, entrainera le retrait de l’animal de l’expérimentation. Les prises de sang seront effectuées dans un lieu à part des espaces d’hébergement.
Choix des espèces
Le poulet de chair a été choisi comme modèle car c’est l’espèce agronomique cible du projet. Les œufs embryonnés de souches à croissance rapide (essai 1) ou lente (essai 2) seront mis en incubation au couvoir de l’établissement expérimentateur puis les animaux sont élevés jusqu’à 10 jours (essai 1, poulets standards) ou 20 jours (essai 2, poulets à croissance lente).
Etude de la formation de la cardiomyopathie atrial associée à la réponse immuno-inflammatoire dans le modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 70
Nourries quatre mois d'un régime enrichi en graisse, des souris sont prélevées d'une goutte de sang à la queue huit fois en deux heures, éveillées et chacune isolée dans une cage, puis examinées sous anesthésie par échocardiographie. D'autres souris et des rats subissent une chirurgie cardiaque destinée à installer une insuffisance cardiaque, et d'autres souris encore sont irradiées puis reçoivent le lendemain des cellules de moelle osseuse de souris donneuses. Au total, 1 370 souris et 70 rats, soit 1 440 rongeurs, vont être utilisés, la déclaration en comptant 1 100 en souffrance modérée et 340 en souffrance sévère. Le porteur cite comme effets possibles des difficultés à se déplacer et à s'alimenter, des douleurs après l'opération, des arrêts cardiaques et un affaiblissement après l'irradiation. Tous seront tués à la fin des actes, pour les prélèvements et les analyses.
Objectifs
La fibrillation atriale est l’arythmie la plus fréquente en pratique clinique. Sa prévalence augmente avec le vieillissement de la population faisant craindre une épidémie dans les 50 prochaines années. La cardiomyopathie atriale définie une déformation du myocarde atrial, un remodelage du tissu et une désorganisation de la hiérarchie du tissu. A l’échelle fonctionnelle, les conductions électriques sont anormales et favorisent les troubles du rythme (arythmie). Récemment, il a été décrit une accumulation de tissu gras à l'épicarde de l'oreillette. Les maladies métaboliques comme l’obésité sont des facteurs de risques de la fibrillation atriale, dans lesquels ce tissu gras épicardique semble dégénérer et libérer des facteurs qui diffusent librement dans le myocarde. Une infiltration de cellules immunes est observée, perturbant l’environnement homéostasique. Quiescent dans le cœur sain, l’épicarde atrial est réactivé en réponse à un stress, et devient une source de progéniteurs capables de se différencier en myofibroblastes et en adipocytes. Un stress de l'environnement réactive les progéniteurs et induit une transformation de ces cellules en adipocytes qui composent le tissu gras. Aujourd'hui, rien n’est connu sur les échanges et l'impact des cellules inflammatoires avec les progéniteurs. Les objectifs sont d'identifier les cellules immunitaires infiltrées et de comprendre leur rôle.
Bénéfices attendus
Les projets portant sur la compréhension du changement de structure et de fonction de l'oreillette dans le contexte de l'obésité et de l'insuffisance cardiaque permettront de cibler le rôle de l'inflammation et ses conséquences dans le développement précoce des troubles du rythme atrial.
Procédures
Procédure souris obèses : les souris seront mises sous régime enrichie en graisse pendant 4 mois. Elles seront soumises à une prise d'une goutte de sang répétée 8 fois en 2 heures pour tester l'évolution de syndromes métaboliques. Pour cela, les animaux sont vigiles, isolés les uns des autres dans 1 cage. Lors du prélèvement à la queue, chaque souris est posée tranquillement sur la grille, sans contention et le prélèvement d’une goutte de sang est effectuée en quelques secondes. Des mesures cardiaques seront effectuées par un monitoring adapté (échocardiographie) qui dure 5 minutes par animal et des tests de troubles de rythme qui dure 5 minutes par animal seront aussi réalisés. Durant toute la procédure, les animaux seront anesthésiés. Procédure, insuffisance cardiaque : les souris et les rats subiront une chirurgie cardiaque, sous anesthésie avec un anesthésiant et une injection de combiné de deux analgésiques pour respecter le bien-être animal. La durée de l'intervention est de 10-15 minutes. Puis, des mesures échocardiographies sous anesthésie seront réalisées, la durée est de 5minutes par animal. Procédure irradiation : les souris receveuses, seront irradiées, la durée est de 5 minutes par animal. Le lendemain elles sont transplantées avec des cellules issues de la moelle osseuse de souris donneuses.
Impact sur les animaux
L'obésité peut conduire à des difficultés de déplacement, un changement cutané et du pelage mais également à une obésité, un diabète. L'insuffisance cardiaque engendre des difficultés de déplacement et d'alimentation les 1ers jours et des arrêts cardiaques. La chirurgie peut conduire à des risques anesthésiques (détresse respiratoire, hypothermie, arrêt cardio-respiratoire) mais aussi à des douleurs post-opératoires ou encore à un risque infectieux. L’irradiation peut également induire un affaiblissement général en plus du risque infectieux accru.
Devenir
La totalité des animaux seront euthanasiés à la fin des actes pour réalisation des prélèvements et analyses.
Remplacement
Les projets ont pour but de comprendre l’influence du métabolisme et de l'immunité sur l’activité cardiaque et le remodelage atrial. Comme nous travaillons sur les modifications à l’échelle de l’organisme, il est nécessaire d’utiliser un modèle expérimental proche de la pathologie ciblée dans notre étude. Toutefois, des biopsies de tissu provenant d'études antérieures seront utilisées pour ne pas reproduire les expériences. Des lignées de cellules seront aussi utilisées.
Réduction
La taille des effectifs est établie avec un calcul de puissance en amont et par la suite des analyses seront effectuées en plus du nombre d'animaux. Les lots d'animaux d'expérimentation sont 1370 souris + 70 rats = 1440 animaux
Raffinement
Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux sont en cage par 5 avec du matériel d'enrichissement. Les souris rendues obèses seront surveillée quotidiennement, des tests de glycémie seront réalisés pour surveiller l'obésité et le diabète. La prise de poids est effectuée de manière hebdomadaire. Les points limites sont évalués par un personnel compétent, notamment sur l'aspect du pelage, le comportement et la mobilité. Dans le projet de l’insuffisance cardiaque, les animaux sont en cage par 5. Le jour de la chirurgie, ils sont anesthésiés puis rasés sur le thorax et désinfectés avec un antiseptique dermique. Une dose d'analgésique sera injectée en sous cutané chez l’animal 30 minutes avant la procédure chirurgicale et 30 minutes avant la fin de la procédure. La 1ère semaine, les animaux seront nourris avec de la bouillie et l'apport d'eau sera facilité. Les souris seront surveillées quotidiennement et la prise de poids sera évaluée de manière hebdomadaire. Les points limites seront évalués quotidiennement par un personnel compétent et formé. Le comportement, la mobilité, la prise de poids, l'aspect du visage, l'aspect de la cicatrice seront des critères évalués quotidiennement par un scoring. Dans le projet de l’irradiation, les souris seront surveillées quotidiennement, une attention particulière sera effectuée sur la consommation de l’eau dans lequel un antibiotique sera ajouté pour contrôler la fragilité à l’infection. Une alimentation directement dans la cage pour faciliter l’hydratation en post-irradiation avec de la nourriture molle sera employée.
Choix des espèces
La souris est l’animal le plus approprié pour nos études concernant la réponse systémique dans le développement des arythmies cardiaques. Il s'agit du seul modèle dans lequel ont été générées des lignées déficientes pour l’expression de gènes d'intérêt. La souris permet de garantir l’homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications cardiaques dans un espace de temps raisonnable. La souris est l'espèce pour laquelle la technologie de transgénèse est la plus fiable et la mieux établie. Le rat est l'animal le plus approprié pour nos études concernant l'isolement de cellules progénitrices de l"épicarde. Le modèle d'insuffisance cardiaque permet d'augmentere le nombre de cellules progénitrices in situ, de les isoler et de travailler par la suite in vitro. Souris et rats adultes de 8 semaines à 12 semaines d’âge. Ce stade de développement corrobore avec le début de l’âge adulte, un stade qui correspond au début du développement des maladies cardiovasculaires chez l’homme.
Exposition chronique aux additifs et contaminants alimentaires inorganiques de la vie in utero à l’âge adulte: impact d’un challenge LPS sur la réponse du système immunitaire intestinal et systémique et l’homéostasie de la barrière intestinale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 344 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Exposées dès la vie intra-utérine à des additifs alimentaires ou à des pesticides contenant des nanoparticules, elles reçoivent ensuite une injection de toxine bactérienne qui peut perturber leur état général. Le porteur signale un stress lié aux manipulations, à la contention et à l'injection. Il affirme que le recours à l'animal est "nécessaire" pour obtenir cette exposition chronique dès l'utérus et qu'aucun modèle alternatif ne reproduit les interactions entre microbiote, intestin et réponse immunitaire.
Objectifs
Ce projet fait suite à un projet précédant qui a permis de montrer une perturbation du fonctionnement du système immunitaire intestinal et extra-intestinal lors d'une exposition à des nanoparticules (TiO2 et SiO2) avec notamment une altération des réponses fonctionnelles des cellules immunitaires. Pour déterminer si cela pourrait conduire à une perturbation de la réponse immunitaire à un challenge infectieux in vivo, nous étudierons la réponse de souris soumises à une infection à une toxine bactérienne lipopolysaccharidique (appelée LPS) après qu'elles aient été exposées de façon chronique à des additifs alimentaires ou à des contaminants de type pesticide contenant des nanoparticules.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de mettre en évidence l’impact d'additifs et de contaminants de type pesticide sur les défenses immunitaires dirigées contre une infection de type bactérien. Il apportera des données utilisables pour l'évaluation des risques pour la santé humaine et animale dans l'utilisation de ces additifs et contaminants. Cet impact pourra être pris en compte par les instances règlementaires afin de réguler l'exposition humaine aux nanoparticules inorganiques.
Procédures
Les animaux seront exposés aux additifs alimentaires ou aux contaminants de type pesticide contenant des nanoparticules à des doses encandrant l'exposition humaine. Puis, ils seront exposés au maximum 6 h à une toxine bactérienne délivrée par injection unique nécessitant une contention de quelques secondes des animaux.
Impact sur les animaux
La mise en oeuvre de nos procédures pourra générer du stress. Il sera atténué par l'habituation des animaux aux manipulations hebdomadaires (suivi de poids, observations). Ensuite, la contention et l'injection de toxine peut engendrer un court stress. La toxine peut perturber l'état général des animaux qui seront sous surveillance constante jusqu'à la fin de l'expérimentation.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux seront euthanasiés afin d'effectuer des prélèvements permettant d'étudier la réponse immunitaire contre la toxine bactérienne.
Remplacement
Le projet étudie les effets des nanomatériaux alimentaires contenus dans des contaminants de type pesticide sur la réponse à une infection après une période d’exposition périnatale et jusqu'à l'âge adulte,. L’utilisation du modèle animal est nécessaire afin d’avoir cette exposition chronique dès la vie in utero. De plus, l’étude portera sur les interactions microbiote-intestin et intestin-réponse immunitaire et aucun modèle alternatif ne permet de recréer toutes ces interactions. Du fait de ces 2 raisons majeures, le recours à l'animal est donc nécessaire.
Réduction
Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en collectifs (5 ou 3 par cages selon l'expérimentation) dans des cages contenant des abris et les femelles gestantes seront isolées (1 par cage) avec un enrichissement des cages (dispositifs de nidification en papier absorbant) afin d'améliorer leur bien-être. Les individus présentant une détérioration de l'état général (poil piqué, dos vouté, difficulté de mobilité, agressivité extrême) et/ou une perte de poids significative seront écartés de l'étude et des soins adaptés leur seront donnés. L'exposition à la toxine bactérienne peut perturber l'état général des animaux qui seront observés en continu jusqu'à leur euthanasie
Choix des espèces
La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier le microbiote et l’intestin. Nous travaillerons avec la lignée C57bl/6J car nous avons déjà des résultats préliminaires concernant l’exposition des adultes aux additifs alimentaires. Les souris mâles et femelles seront utilisées à l’âge adulte pour mimer une exposition périnatale et chronique à long terme.
Corrélats corticaux de l’activité oscillatoire du noyau subthalamique chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
410 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, la plupart dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et quatre-vingt-dix opérés sans réveil. Ils subissent une chirurgie de quatre à six heures pour implanter des électrodes dans un noyau profond du cerveau, une partie recevant aussi un cathéter, afin d'étudier la recherche compulsive de cocaïne et ses marqueurs électriques. Le porteur évoque une gêne liée au bloc de ciment dentaire fixé sur la tête, une perte de poids et un isolement des animaux après l'opération. Il mentionne des tests comportementaux "connus et maîtrisés" sans les détailler, et affirme que l'étude de la consommation exige un animal vigile et libre de ses mouvements, jugeant le rat irremplaçable.
Objectifs
L’un des enjeux actuels de la recherche sur les addictions est de comprendre pourquoi seuls quelques usagers (15-20 %) développent des comportements de recherche/consommation pathologiques. Dès lors, identifier les individus les plus vulnérables représenterait une avancée critique en termes de politique de prévention et de prise en charge, mais de tels biomarqueurs prédictifs de l’addiction n’ont jusqu’alors pas été caractérisés chez l’homme. Nos résultats récents obtenus chez le rat indiquent que l’activité électrique oscillatoire du noyau subthalamique (NST) pourrait prédire la future émergence de la recherche compulsive de cocaïne. Toutefois, la position profonde de ce noyau, nécessitant d’y implanter des électrodes d’enregistrement, attenue le potentiel translationnel de ce biomarqueur. Il est donc nécessaire de trouver des corrélats corticaux qui refléteraient l’activité du NST, permettant ainsi d’effectuer des enregistrements non-invasifs. L’objectif du projet est de rechercher un équivalent de ces activités oscillatoires en surface, au niveau des cortex moteur et préfrontal chez le rat et de confirmer son caractère prédictif sur l’émergence de la recherche compulsive de drogue.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est de déterminer s’il existe au niveau cortical un corrélat de l’activité pathologique du NST, qui permet d’identifier les futurs individus compulsifs. La caractérisation d’un tel marqueur en ‘surface’ aura de fortes répercussions translationnelles, puisqu’il permettrait de détecter les individus vulnérables à l’addiction, de manière non-invasives, avant l’apparition de comportements pathologiques de recherche et de consommation de drogues.
Procédures
L'ensemble des animaux de ce projet sera soumis au moins une fois à un acte chirurgical (4-6h). 90 animaux seront soumis à un seul acte chirurgical (implantation d'électrodes) dans le cadre d'une procédure sans réveil. 280 animaux subiront deux actes chrirurgicaux (cathéter puis implantation d'électrodes, 90-120minutes) dans le cadre d'une procédure avec réveil
Impact sur les animaux
* Durant les jours suivant l’opération, les animaux peuvent perdre un peu de poids, présenter une activité réduite. L’implantation d’électrodes peut aussi engendrer une gêne initiale, due au poids du chapeau protecteur fait en ciment dentaire. Plus rarement, les animaux peuvent présenter un saignement au niveau des cicatrices. Les animaux sont suivis quotidiennement les jours suivant l’opération afin d’anticiper et de soulager une nuisance potentielle. En général, ces nuisances s’estompent en 2-3 jours. Les animaux sont isolés durant cette période.
Devenir
A l'issue de l'ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort, et leur cerveau sera prélevé pour études histologiques ou investigations électrophysiologiques
Remplacement
Ce projet a pour but d'étudier l'état fonctionnel d'un réseau cérébral dans une pathologie précise. L'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l'animal soit vigil et libre de ses mouvements. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, ne pouvant être remplacé pour ce genre d’étude.
Réduction
Nous utilisons le calcul de puissance lors de la planification des expériences : ce calcul permet de fixer un effectif tel que l’on ait 80% chances de vérifier notre hypothèse pour un seuil de significativité́ inferieur à 5%. Ce calcul nécessite de connaitre au préalable la taille de l’effet et la variabilité́ des mesures, ce qui n’est pas toujours possible. Il convient également de prendre en compte les aléas inhérents à ce type d’étude, tels que le risque d’infection, de cathéter bouché et/ ou de mauvais placements des électrodes, qui peuvent nous amener à exclure certains individus de l’étude. Ainsi, dans l’optique de limiter le nombre d’animaux à un strict minimum ne pas utiliser d’animaux plus que nécessaire, nous analyserons régulièrement les données expérimentales. Nous effectuerons des tests de puissance statistique a posteriori afin de calculer la robustesse statistique (puissance >0,8 pour un p < 0,05) de nos résultats. Après obtention d’un effet robuste pour une condition donnée, nous cesserons de tester cette condition expérimentale.
Raffinement
Suivant la chirurgie et pour le reste de l’expérience, les animaux seront hébergés seul, afin de limiter d’éventuelles bagarres entre congénères qui pourraient dégrader le matériel d’enregistrement préalablement implanté. Les animaux auront un accès ad libitum à l'eau. La nourriture sera contrôlée afin de garder les animaux motivés. Les cages sont enrichies grâce à la présence d'objets divers et variés (bâtonnets en bois, rouleau en carton…changés régulièrement afin de diversifier au maximum l'environnement des animaux). Nos expériences impliquent un contact quotidien avec les animaux (flush des cathéters, protocoles comportementaux…), facilitant ainsi le suivi individuel des animaux, nous permettant de réagir immédiatement et de manière appropriée en cas de besoin. En cas de signes de souffrance (prostration, poils hérissés, absence de toilettage, dos courbé...) et/ou de perte importante de poids, l’animal aura un accès ad libitum à une nourriture enrichie et un traitement antidouleur pourra être administré si besoin (méloxicam 0,5mg/kg, 0,25ml, sc). La gestion de la douleur pendant et après les procédures douloureuses et les expérimentations est réalisée par des personnels compétents. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Le rat est un modèle animal de choix pour l'étude de l'addiction. En effet, les modèles comportementaux de référence sont connus et maîtrisés, et il existe de nombreux tests comportementaux permettant de tester les différents symptômes de la pathologie. Par ailleurs, l'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l'animal soit vigil et libre de ses mouvements. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, puisqu'il s'auto-administre l'ensemble des agents toxicologiques consommés par l'homme. Des rats adultes (9-10 semaines, environ 300-350g), un stade du développement cérébral en adéquation avec notre question scientifique, seront utilisés.
Rôle des points de contrôle immunologique associés à la sénescence dans la régulation de l’infiltration et l’activation des cellules de l’immunité innée
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dépourvues de poils, elles reçoivent des injections sous la peau et dans l'abdomen sous anesthésie gazeuse pour étudier comment le système immunitaire réagit aux cellules vieillissantes dites sénescentes. Le porteur qualifie les nuisances de légères, entre gêne liée à l'absence de poils, douleur d'injection et inconfort de la sédation. Il annonce que bloquer un sucre présent à la surface des cellules sénescentes pourrait relancer leur élimination par l'immunité, piste renvoyée à un stade ultérieur.
Objectifs
Ce projet fait partie d'une étude plus globale visant à comprendre comment le système immunitaire, c’est à dire l’ensemble de nos globules blancs, réagit face à des cellules âgées. Au cours du vieillissement, certaines de nos cellules rentrent dans un état dit de sénescence ou les cellules sont toujours vivantes mais incapables de se dupliquer et présentent un fort pouvoir inflammatoire. Il est proposé que ces cellules sénescentes s’accumulent avec l’âge et soient responsables de nombreuses maladies liées à l’âge et du cancer. Ce projet est basé sur une première étude démontrant un lien entre la surexpression d’un sucre particulier à la surface des cellules sénescentes et leur échappement au système immunitaire. L’objectif du projet est de déterminer si le blocage de ce sucre pourrait favoriser la réactivation des cellules immunitaires et donc l’élimination des cellules âgées. L’interaction et le dialogue entre les cellules sénescentes et les cellules immunitaires seront étudiés. La finalité de ce projet pourrait permettre de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre le vieillissement pathologique en ciblant spécifiquement des molécules de surface associées aux cellules sénescentes. Cette approche pourrait être utile pour les patients dans de nombreuses maladies liées à l’âge incluant le cancer.
Bénéfices attendus
Par cette étude on s’attend à mieux comprendre comment le système immunitaire et les cellules sénescentes interagissent au cours du vieillissement. Plus largement, nous espérons mieux comprendre comment les cellules sénescentes s’accumulent dans nos tissus avec l’âge et comment elles modulent leur immunosurveillance. Notre projet pourra contribuer à terme au développement de solutions thérapeutiques contre les maladies liées à l’âge (maladie d’Alzheimer, fibrose pulmonaire, artériosclérose etc…) et le cancer et à l’augmentation de l’espérance de vie en bonne santé.
Procédures
-Anesthésie gazeuse (2 minute 30 après induction) - 2 injections sous cutanées (en une fois, bilatérale pour tous les animaux, environ 1 min 30 par souris) sous anesthésie gazeuse et simultanément 1 injection intra péritonéale (1 fois pour tous les animaux ; environ 30 sec par souris) -2 administrations par injections intra péritonéales (2 fois par animal, 1 fois à J2 et 1 dois à J4) sur animal vigile (pour tous les animaux) (environ 2 min par souris)
Impact sur les animaux
Nos souris présentent une perte de poils totale provoquant potentiellement une gêne légère et subiront des injections sous-cutanées de produit non-irritant (2 injections/animal pour l’ensemble des animaux prévus) générant une douleur légère. La sédation par anesthésique gazeux (pendant environ 1 min 30 après induction à 2%) pendant quelques minutes est également source d’un léger inconfort.
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés à la fin des procédures car nous devons faire des analyses sur leurs tissus et leurs cellules.
Remplacement
Nous avons déjà observé dans des études précédentes que les cellules âgées dites sénescentes qui s’accumulent avec le vieillissement présentent des capacités inflammatoires très puissantes. Ces cellules sénescentes seraient à l’origine de nombreuses maladies liées à l’âge, y compris le cancer. Ceci serait possible par une capacité à modifier l’activité des cellules immunitaires innées, c’est-à-dire nos globules blancs qui jouent un rôle essentiel dans la surveillance de nos tissus. En exprimant à leur surface un sucre ayant un potentiel immunosuppresseur, les cellules âgées sont capables de bloquer complètement la fonction de nos globules blancs appelé NK ou cellules tueuses naturelles. Cette inhibition favorise l’apparition de fibrose pulmonaire ou de cancer avec l’âge. Nous souhaitons maintenant étudier l’interaction de ces cellules avec le système immunitaire global et plus précisément comment les cellules sénescentes arrivent à recruter localement les globules blancs et les bloquer dans leur fonction. Il n’existe malheureusement pas de bon modèle in vitro pour cela, la sénescence et le système immunitaire étant un processus intégré impliquant une communication intra- et inter- cellulaire et tissulaire, ce projet nécessite une étude à l’échelle de l’organisme entier. Dés que les mécanismes seront identifiés, nous remplacerons les expériences chez l’animal par des expériences de co-cultures in vitro.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d’animaux, une étude exhaustive de la littérature a été menée avant d'initier ce projet pour s'assurer de la non-reproduction de résultats déjà publiés. Une étude statistique prévisionnelle nous permet également de prédire le nombre minimal d’animaux à inclure dans chaque groupe. Nous avons calculé précisément la grandeur de l’effectif (nombre d’animaux par groupe) nécessaire pour notre étude en fonction de l’estimation des effets biologiques attendus. Ainsi, nous avons pu réduire les groupes d’animaux au minimum possible tout en maintenant une puissance statistique nécessaire à la validation des résultats. Enfin, la maîtrise du protocole expérimental permet d’éviter les problèmes techniques et la perte d’animaux non désirée et donc de réduire au maximum la gêne et le nombre d’animaux nécessaires
Raffinement
Ces expériences ont été raffinées en tenant compte du bien-être animal et ainsi réduire à un niveau minimum le stress, la douleur, la souffrance, l’angoisse ou l’inconfort potentiel. Pour cela, nous utiliserons une série de mesures : -un double enrichissement (des maisons en coton et des bâtons à ronger) -séparation des cages d'expérimentation et d’élevage -suivi quotidien des animaux en expérimentation -injections sous anesthésie - analyses cellulaires sophistiquées après l’euthanasie des souris pour obtenir un maximum de résultats avec le minimum d’échantillons et d’animaux - une grille de score avec un score maximum et une liste de points limites adapté au modèle entrainant l'euthanasie immédiate. L’ensemble de ces mesures de raffinement vise à assurer le bien-être des animaux, éviter toute souffrance inutile et assurer des résultats scientifiques de qualité pour éviter tout reproduction expérimentale inutile liée à un défaut de design expérimental.
Choix des espèces
Nous utilisons un type spécial de souris comme modèle pour notre recherche car elle partage des similitudes avec les humains et a une durée de vie relativement courte. Chez la souris, nous pouvons étudier en détail comment les tissus se réparent et comment leur physiologie change. Cela nous aide à comprendre les différentes étapes des événements biologiques. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 12 semaines. Ceci correspond à des animaux matures, pleinement formés et avec un système immunitaire innée fonctionnel. Ce modèle de souris est le meilleur choix car il nous permet d'étudier tous les processus impliqués dans les maladies liées à l'âge simultanément. Nous pouvons simultanément examiner les cellules immunitaires, les cellules sénescentes, la progression des maladies et l'expression d'une molécule spécifique appelée ganglioside. En utilisant ce modèle de souris, nous pouvons obtenir des informations précieuses sur les mécanismes des maladies liées à l'âge, ce qui pourrait nous aider à développer de meilleurs traitements et à améliorer la santé humaine