Recherche fondamentale

3 696 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles gestantes reçoivent par voie intraveineuse un composé qui simule une infection virale pour déclencher une activation immunitaire, puis la descendance est mise à mort après sevrage pour prélèvements. Le porteur qualifie les modèles animaux de "puissants et indispensables" et signale une perte d'appétit et de poids transitoire ainsi qu'un comportement altéré dans les 24 heures suivant l'injection. Il affirme que les interactions entre système immunitaire, cellules gliales et neurones au cours du développement ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Objectifs

L’activation du système immunitaire au cours de la grossesse (activation immunitaire maternelle), par exemple par des virus communs comme le virus de la grippe, est un facteur de risque pour plusieurs troubles psychiatriques et neurologiques, en particulier l’autisme et la schizophrénie. Les animaux utilisés à des fins scientifiques sont des modèles puissants et indispensables pour étudier les liens entre activation immunitaire maternelle et altérations du développement cérébral chez la descendance. Les rongeurs dont la mère a reçu pendant la gestation un composé qui induit une activation immunitaire maternelle en simulant une infection virale, présentent des altérations des neurones qui sécrètent la dopamine. La dopamine est un neurotransmetteur notamment impliqué dans la physiopathologie de la schizophrénie. Cependant les mécanismes responsables des dysfonctions de ces neurones sont inconnus. Dans ce projet, nous tenterons d’identifier les mécanismes responsables des dysfonctions des neurones qui sécrètent la dopamine dans un modèle d’activation immunitaire maternelle chez la souris.

Bénéfices attendus

Parmi les pathologies dont le risque est augmenté par l’activation immunitaire maternelle, la schizophrénie est une pathologie très courante (500 000 à 600 000 patients en France) directement associée à des altérations des neurones qui sécrètent la dopamine. Ainsi, preque tous les traitements pharmacologiques de la schizophrénie disponibles actuellement sont basés sur l’inhibition d’une molécule sur laquelle se fixe la dopamine. Ces thérapies traitent principalement les symptômes positifs (par exemple, les hallucinations et les délires) et la réponse aux médicaments antipsychotiques existants est très variable, avec environ 30 pour 100 des patients classés comme résistants au traitement. Le ciblage des voies de la dopamine dans la schizophrénie est issu de découvertes fortuites et n’est pas fondé sur une compréhension fine des dysfonctions sous-jacentes. Notre projet permettra de comprendre le lien entre un facteur de risque identifié de la schizophrénie (l’activation immunitaire chez la mère), des altérations des cellules immunitaires du cerveau (les cellules gliales), et les dysfonctions du système de la dopamine.

Procédures

Femelles gestantes vigiles : Une Injection de solution par voie intraveineuse (5 minutes). Femelles lactantes vigiles : Traitement antibiotique dans l’eau de boisson pendant 15 jours Puis après sevrage de la descendance : euthanasie selon une méthode réglementaire ou une chirurgie sans réveil permettant les prélèvements et analyses ultérieurs.

Impact sur les animaux

L’injection du composé mimant un virus induit une activation immunitaire, corrélée à une perte de poids d’environ 1 à 2 pour cent du poids total par rapport au poids des animaux témoins deux jours après l’injection, qui reflète une perte d’appétit liée à l’inflammation transitoire. Un stress transitoire est aussi attendu lors de la contention au moment de l’injection. Pendant la période transitoire d’activation immunitaire (c’est-à-dire dans les 24h après injection), il est attendu que les souris présentent un comportement modérément altéré, avec prise de nourriture amoindrie. Cependant, cette perte de poids ne persiste pas : dès le troisième jour après l’injection, les poids des souris ayant reçu le composé et celui des souris ayant reçu l’injection contrôle redeviennent similaires.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés selon des méthodes réglementaires pour des expériences de physiologie et de biochimie, ou après sevrage de la progéniture. Ces souris ne peuvent entrer dans de nouveaux protocoles d’expériences puisqu’elles ont reçu des injections dans le cadre du projet.

Remplacement

L’étude d’un système intégré, requis pour la modélisation des altérations du cerveau associées à des pathologies psychiatriques, nécessite d’avoir recours à des animaux. En particulier, les interactions complexes au cours du développement postnatal entre système immunitaire d’une part, cellules gliales et neurones dans le cerveau d’autre part, ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre de souris incluses dans le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats significatifs et reproductibles. Le nombre total d’animaux impliqués est de 3696.

Raffinement

Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux de 5 individus maximums et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront exclus du protocole. Dans tous les protocoles, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux utilisés par la mise en place de période d’accoutumance et l’emploi d’anesthésiants et antalgiques adaptés. L’évaluation de la souffrance sera basée sur un suivi quotidien (attitude corporelle, aspect du pelage, poids corporel) de sorte à administrer un traitement anti-inflammatoire/antalgique supplémentaire, ou sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites établis. L’animalerie est maintenue à une température constante entre 20 et 24 degrés avec un éclairage circadien (8 h / 20 h). Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et disposent d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis.

Choix des espèces

Le choix de l'espèce Mus musculus (souris) repose en premier lieu sur l’anatomie du cerveau de souris qui est très bien caractérisée, ainsi que sur le fait que les grandes étapes de développement du cerveau, les systèmes de neurotransmission et la répartition et la fonction des aires cérébrales sont bien conservés entre souris et être humain. Ces paramètres sont importants dans le contexte de l’étude de mécanismes impliqués dans des pathologies humaines. Les souris gestantes recevant une injection sont de jeunes adultes (8-15 semaines). Les souris soumises aux expériences pour l’étude du développement neuronal postnatal sont des souris juvéniles ou jeunes adultes (jour postnatal 15 à 100). Trois stades de développement seront étudiés : pic du turnover des synapses dans le cerveau en développement chez la souris juvénile ; stade adolescent auquel des changements résultant d’un changement du turnover des synapses se manifeste ; stade adulte pour étudier les conséquences à long terme.

186 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les expérimentateurs greffent des cellules tumorales dans le cerveau, laissent croître une tumeur cérébrale suivie par une grille de points limites, puis pratiquent des séances d'IRM sous anesthésie jusqu'à deux heures et demie avant une mise à mort par perfusion intracardiaque. Le porteur décrit une douleur modérée liée à la croissance de la tumeur et une douleur légère liée à l'IRM. Il affirme s'être assuré de "l'inexistence d'approches alternatives in vitro" capables de reproduire le dialogue entre cellules tumorales et vaisseaux cérébraux.

Objectifs

L’agressivité du glioblastome, une tumeur cérébrale de haut grade chez l’homme, est liée à la présence de cellules cancéreuses souches et à leur résistance aux traitements. Ces cellules souches cancéreuses sont situées dans une niche où elles établissent des interactions privilégiées avec les cellules environnantes, notamment les cellules vasculaires. Des données précédentes de notre laboratoire ont permis de montrer que bloquer la communication entre cellules cancéreuses souches et les cellules vasculaires réduit la progression tumorale in vitro et in vivo chez la souris. Des études récentes sur cellules in vitro suggèrent que la communication entre cellules cancéreuses souches et cellules vasculaires dépend pour partie de l’expression de facteurs d’adhésion et par partie de la signalisation calcique. Il est nécessaire de valider ces résultats dans un modèle expérimental in vivo qui reproduit au mieux les conditions pathologiques. L'objectif de ce projet est de caractériser in vivo, par imagerie, les conséquences de ces mécanismes moléculaires identifiés in vitro. Dans un second temps, nous souhaitons évaluer d'une stratégie thérapeutique anti-tumorale prenant appui sur ces mécanismes moléculaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre la communication entre cellules cancéreuses souches et cellules vasculaires et il permettra d'explorer comment la modulation pharmacologique de ces voies de communication favorise la régression tumorale. Cette étude devrait permettre de déterminer si le blocage de la communication entre les cellules tumorales et leur environnement réduit la progression des glioblastomes multiformes, des tumeurs cérébrales incurables chez l'homme (survie médiane actuelle de 15 mois).

Procédures

- greffe intracrânienne de cellules tumorales (sous anesthésie) (animalerie 1) - croissance d'une tumeur intracérébrale (suivi par grille de points limites spécifiques, animaleries 1 et 2) - IRM (sous anesthésie, durée 2h30 maximum, animalerie 2) - administration de médicaments au maximum une fois par jour pendant moins de 14 jours (animaleries 1 et 2) - euthanasie par perfusion intracardiaque sous anesthésie très profonde (animaleries 1 et 2)

Impact sur les animaux

- La greffe intracrânienne de cellules tumorales, conduite sous anesthésie, engendre une douleur modérée - La procédure expérimentale d'IRM, qui sera utilisée pour caractériser la tumeur, engendre une douleur légère et est conduite sous anesthésie. La phase terminale est réalisée sous anesthésie profonde (procédures sans réveil) - la croissance tumorale engendre une douleur modérée et fait l'objet d'un suivi et d'une grille de points limites particulière.

Devenir

Le tissu cérébral des animaux utilisés dans ce projet est analysé par histologie pour mettre en correspondance les analyses à l'échelle cellulaire et les observations réalisées dans les images in vivo. Pour réaliser ces analyses, tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Nous nous sommes assurés de l'inexistence d'approches alternatives in vitro qui pourraient être utilisées pour reproduire l'interaction entre cellules tumorales et cellules vasculaires cérébrales. Cette recherche n'a pas identifié de solution in vitro alternative pour notre étude. En effet les méthodes in vitro basées sur la culture cellulaire ne présentent pas les systèmes de communication multicellulaires nécessaires pour ce projet.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats : au final 20 animaux par groupe et 9 groupes sont prévus, pour un total de 180 souris sur 5 ans. Pour obtenir ces 20 animaux par groupe, nous avons pris en compte i) les problèmes d'implantation/croissance tumorale (15 pourcent), ii) les problèmes lors de l'imagerie (20 pourcent, principalement du au mouvement, risque à compter deux fois puisque l'imagerie est faite avant et après traitement sur chaque animal). Des groupes de 12 animaux complets (i.e. avec toutes les données IRM avant et après) seront suffisant pour obtenir une démonstration statistique. Ce chiffre a été obtenu suite aux calculs effectués dans G-Power (www.gpower.hhu.de) pour un size-effect de 1.25. Pour obtenir ces 12 animaux, et en considérant le risque maximal (12x1.15x1.2x1.2), 20 animaux seront donc commandés par groupe. De plus 6 souris servirtont à la mise au point la procédure d'implantation tumorale.

Raffinement

L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur (critères pris en compte : prostration, renfoncement des yeux, arrêt du nettoyage du pelage). Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance (notamment, suppression de la douleur grâce à l’administration d’antalgiques). L'environnement sera enrichi selon le programme mis en place par l’animalerie. Suite au transport, qui sera réalisé part un transporteur agréé, les animaux auront une semaine d'acclimatation avant le début des expériences.

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. En effet, le cerveau de souris permet une analyse neuroanatomique de haute résolution concernant les réseaux cellulaires et vasculaires. Sa taille est compatible avec la microdissection d’aires cérébrales d’intérêt permettant des analyses biochimiques ou moléculaires. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Les animaux seront adultes, pour travailler sur un cerveau mature et stable.

1 260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les expérimentateurs greffent des cellules cancéreuses de côlon sous la peau, administrent chaque jour un composé par gavage puis des anticorps par injection dans l'abdomen, et suivent la croissance de la tumeur. Le porteur reconnaît que les tumeurs peuvent se développer vite et générer inconfort, perte de mobilité, malnutrition ou déshydratation. Il indique réaliser des essais in vitro quand c'est possible mais conclut qu'étudier l'interaction entre les molécules et le système immunitaire dans son ensemble impose le recours à la souris.

Objectifs

Le carcinome colorectal est le deuxième type de cancer avec le plus haut taux de mortalité dans les pays développés. La résection chirurgicale est actuellement le traitement de choix. Cependant, environ 30 % des patients avec un envahissement ganglionnaire développent une récidive locale ou des métastases à distance dans les 5 ans suivant la chirurgie et meurent de la maladie. Les travaux des dernières années ont formellement établi le lien entre croissance tumorale et qualité de la réponse immunitaire. L’immunothérapie, par inhibiteurs de point de contrôle immunitaires (ICI), a révolutionné la prise en charge des patients atteints de certains cancers très avancés ou métastatiques. Au lieu de cibler directement les cellules cancéreuses comme c’est le cas de la chimiothérapie, des thérapies ciblées ou de la radiothérapie, les inhibiteurs de point de contrôle immunitaires ciblent le système immunitaire du malade, dont ils lèvent les freins pour que certaines cellules du système immunitaire puissent détruire les cellules cancéreuses. Malheureusement ces traitements ont des limites. Ainsi, face à la résistance des traitements actuels proposés, l’intérêt des inhibiteurs de l’enzyme NADPH Oxydase 1 (NOX1) pour ces types de cancers est une voie de traitement envisagé. En effet, l'expression de cette enzyme dans les cellules cancéreuses favorise la croissance tumorale et l'apparition des métastases dans plusieurs cancers, dont le cancer du colon. Il a été montré que l'inhibition de l’enzyme NADPH Oxydase 1 module la composition des cellules immunitaires associées aux tumeurs dans le cancer colorectal en favorisant le recrutement de cellules immunitaires/inflammatoires et ainsi la diminution de la croissance tumorale. L’inhibition de l’enzyme NADPH Oxydase 1 est donc une nouvelle stratégie thérapeutique potentielle pour traiter le cancer du colon en particulier en association avec les inhibiteurs de point de contrôle immunitaires tel que l’anti-PD1.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus dans ce modèle pourraient fournir une alternative de traitement chez les patients souffrant de cancers qui ne répondent aujourd'hui pas bien aux immunothérapies et dont les récidives sont importantes.

Procédures

Après une semaine d’acclimatation, l’injection des cellules cancéreuses de colon se fait en sous la peau (en bas du dos) sous anesthésie gazeuse (1 minute maximum). Le premier jour de traitement, les animaux sont pesés avant l’administration quotidienne de véhicule (contrôles) ou de composé par voie orale avec une sonde de gavage adaptée (10 secondes, 10 mL/kg maximum). Les animaux seront pesés deux fois par semaine pour que le volume administré soit représentatif de l’évolution de leur poids corporel. Le traitement par voie orale permettra de fortement contrôler la dose administrée aux souris en fonction de leur poids individuel. 4 jours après le début du traitement, les souris reçoivent une injection d’anticorps contrôles ou d'anticorps thérapeutique (10 secondes) en intra-péritonéal, puis deux fois tous les deux jours (3 doses au total) ou deux fois par semaine durant toute l’étude en fonction du composé testé. La croissance et la taille tumorale seront surveillées tout au long de l'expérience (mesures deux fois par semaine, 10 secondes) comparées entre les souris traitées et les témoins non traités, révélant un potentiel effet global du composé sur la prolifération des cellules cancéreuses.

Impact sur les animaux

Les deux actes principaux effectués au cours de l’étude sur les animaux sont : - Le traitement par voie orale - Les injections : sous la peau de cellules cancéreuses et les intra-péritonéales pour les traitements avec anticorps et/ou le contrôle Des nuisances peuvent être induites par l’administration des produits pharmaceutiques et les effets potentiellement toxiques de ces composés. Les tumeurs sont généralement bien tolérées mais elles peuvent aussi se développer très vite et générer un inconfort ainsi qu'une perte de mobilité. Cette perturbation de la locomotion peut induire une malnutrition ou une déshydratation.

Devenir

Le prélèvement de la tumeur, des organes et la quantité de sang nécessaire aux analyses justifient la mise à mort des animaux.

Remplacement

Les progrès de la technologie permettent en permanence le remplacement des animaux par d'autres modèles dans la science expérimentale. Ces évolutions sont évidemment souhaitables et, chaque fois que possible, nous réalisons des essais in vitro appropriés pour identifier les composés actifs présentant le plus grand potentiel d'application thérapeutique. Cependant, nous étudions les effets des molécules qui interagissent avec le stroma tumoral et l'effet que cela a sur différents axes du système immunitaire murin, en vue du traitement des maladies humaines. Ces interactions se produisent entre différents tissus et organes et sont également susceptibles d'être influencées par la présence de tumeurs en croissance et, en tant que telles, elles ne peuvent pas encore être reproduites in vitro nécessitant d'effectuer des recherches in vivo.

Réduction

Un composé de l’entreprise a déjà été testé dans ce modèle de cancer chez la souris. Nous ciblerons dans ce projet plus spécifiquement la NADPH Oxydase 1 (NOX1) avec des molécules adéquates issues de nouveaux projets, aux propriétés optimisées. Nous avons utilisé les données de croissance tumorale décrites dans la littérature avec ce modèle pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des différences significatives dans la croissance tumorale entre les groupes témoins et traités. Lorsque les tumeurs seront récoltées, l’échantillon sera optimisé pour répondre aux questions posées. Les tests statistiques qui seront utilisés nous permettront de démontrer l’efficacité de nos molécules par rapport à un contrôle ou encore un potentiel effet-dose.

Raffinement

Les composés testés seront administrés par voie orale. Cette technique est rapide et nécessite une contention courte. Un volume maximal de 10mL/kg leur sera administré. Après réception des animaux, ils seront placés dans des cages où des carrés de ouate seront mis à leur disposition pour la construction de leur nid. Un dôme rouge au minimum sera aussi présent afin que les animaux puissent se cacher. Leur comportement de rongeur sera encouragé par la présence d’un bâton de bois dur par animal. La nourriture et l’eau seront en libre accès tout au long de l’étude. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière obscurité (12h - 12h), d’une température (20 - 24°C) et d’une hygrométrie (45 - 65%) contrôlés en permanence. Les animaux seront monitorés à chaque traitement (tous les jours) pour la surveillance de signes cliniques éventuels et vérifier l'absence de souffrance. En fonction de leur évaluation, les mesures à prendre sont définies avec notre vétérinaire désigné. Le vétérinaire pourra être contacté en cas de besoin afin d'adapter au mieux les soins, par exemple si les observations ne correspondent pas à des signes attendus et que la procédure de soins n'est alors pas arrétée. La mort n'est pas une limite acceptable et tout signe clinique ou ensemble de signes grave et non soignable, tout signe de souffrance non supprimable, ou correspondant aux points limites définis, menera à l'euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

L’espèce animale la plus couramment utilisée comme modèle en oncologie est la souris. Sa petite taille, sa grande fécondité en font un animal de choix pour les laboratoires. De plus, le développement de nombreuses souches a permis d’obtenir des lots d’animaux génétiquement très similaires, facilitant ainsi les études comparatives. Les modèles murins ont notamment permis de déterminer les grands principes de la chimiothérapie Nous utiliserons donc des souris de 8 à 10 semaines. Ces animaux ne nécessitent pas d’ajuster des doses ou de prendre des dispositions particulières liées au jeune âge ou au contraire à l’âge avancé.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles boivent pendant 90 jours une eau chargée en nanoplastiques de polystyrène, la moitié recevant en plus une alimentation riche en sucre et en graisse, avec mises à jeun répétées, gavages et prises de sang à la queue. Le porteur signale le stress lié à la contention, au gavage et à l'isolement en cage individuelle pour recueillir les fèces. Il affirme qu'aucun modèle alternatif ne permet d'étudier la toxicité intestinale sous stress nutritionnel ni la communication entre intestin et foie, ce qui justifierait le recours à la souris.

Objectifs

Après une exposition orale, le tractus gastro-intestinal est la première barrière physique et biologique contre les contaminants environnementaux. Les nanoparticules de plastique (NPL) sont des polymères organiques synthétiques de taille inférieure à 1 micromètre. Ils peuvent être composés de polyéthylène (PE), polystyrène (PS), polypropylène (PP), polychlorure de vinyle (PVC), polyuréthane (PUR) et polyéthylène téréphtalate (PET). Les NPL auxquels nous sommes exposés via l'alimentation ou l’environnement ont été très peu étudiés dans un contexte toxicologique ciblant la sphère digestive. Les connaissances sur les interrelations entre l’ingestion de nanoplastiques et la modulation de la fonction barrière de l’intestin (épithélium/mucus/microbiote) sont peu nombreuses, l’essentiel des travaux décrits à ce jour ont été réalisé en utilisant des organismes marins comme modèle d’étude. Les seules études chez les mammifères ont très récemment été décrites chez la souris. Elles ont, par ailleurs, été réalisées avec des modèles NPL commerciaux dont le processus de synthèse et la présence d’additifs sont méconnues. Les résultats obtenus confortent toutefois l’hypothèse d’une altération des fonctions gastro-intestinales, avec une modulation de la sécrétion de mucus, des dommages sur la barrière épithéliale et l’établissement d’un déséquilibre de la flore intestinale sur ce modèle. En outre, la fonction barrière intestinale peut être fragilisée chez des sujets sains nourris avec un régime gras et sucré de type occidental qui présentent notamment une perméabilité intestinale accrue. En plus des effets connus de ce type d'alimentation, la fragilisation de la fonction barrière n’est malheureusement pas assez prise en compte dans les diverses études toxicologiques alors qu’une partie importante de la population consomme ce type d'alimentation. Ce projet a donc pour but d’étudier les effets d'une exposition orale à des NPL modèles traçables, synthétisés sans additifs et ayant une surface imitant chimiquement celle des débris ayant séjournés dans l’environnement (particules vieillies). L’objectif est de caractériser leur effet sur la sphère digestive et hépatique sur une barrière intacte ou fragilisée par l'alimentation pour détecter une potentialisation/synergie d’effets délétères.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de cette étude contribueront à l’évaluation de la toxicité intestinale des particules nanoplastiques présentes dans l’alimentation de la population. De plus, cette étude mimant l’exposition au plastique dans un contexte d’une alimentation « occidentale », permet également d’évaluer les conséquences des particules sur un système digestif fragilisé. Sur le long terme, cette étude participe à l’évaluation de la sécurité des aliments contenants de nanoparticules plastiques et aide les législateurs à faire évoluer l’utilisation du plastique dans le domaine de l’alimentation.

Procédures

Lors de l'exposition subchronique, tous les animaux de ce projet reçoivent le traitement à tester dans l’eau de boisson pendant 90 jours et la moitié des animaux reçoit une alimentation riche en sucre et en graisse. Les animaux sont mis à jeun pendant 4 à 6 h, gavés et du sang est prélevé à la queue pour effectuer les différentes mesures (glycémie et perméabilité intestinale) en début et en fin d'exposition. Chaque mise à jeun est séparée d’une semaine minimum de récupération. Le gavage sera fait d’un geste expert et très rapide (10 secondes) avec une sonde métallique à bout arrondi adaptée à la taille de la souris. Les animaux sont ensuite anesthésiés via une injection en intra-péritonéale qui est un geste maitrisé par les expérimentateurs et d'une durée de 10 secondes, et ensuite euthanasiés pour effectuer les prélèvements nécessaires.

Impact sur les animaux

Le gavage lors des tests de tolérance au glucose et des mesures de perméabilité intestinale peut engendrer un stress dû à la contention de l’animal et un inconfort dû à l’introduction de la sonde dans l’œsophage. La prise de sang au niveau de la queue lors des tests de tolérance au glucose et des mesures de perméabilité intestinale peut engendrer un stress chez les animaux. La mise à jeun des animaux avant les mesures de perméabilité et des tests de tolérance au glucose peut engendrer un stress chez les animaux. Lors du prélèvement de fèces, un stress dû à la mise en cage individuelle des animaux peut également être engendré.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure pour réaliser des prélèvements destinés à des dosages biochimiques et des analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet nécessite des modèles impliquant la prise en compte de la barrière intestinale, la flore intestinale et de l’impact de l’alimentation dans toute sa diversité. Ainsi, seule une approche faisant appel à un modèle animal nous permettra d'explorer la complexité des interactions entre les nanoplastiques de polystyrène et les différents acteurs de la barrière intestinale (épithélium/mucus/microbiote) fragilisée ou non par une alimentation occidentale, et des conséquences/interrelations avec la fonction hépatique. Aucun modèle alternatif ne permet d’étudier la toxicité sous stress nutritionnel. Aucun modèle alternatif ne permet d’étudier la communication inter-organe (axe intestin-foie).

Réduction

La procédure 1 permet de choisir le modèle de nanoplastiques de polystyrène le plus pertinent en testant 2 modèles de nanoplastiques marqués différemment (marqueur fluorescent ou métallique). Cette étude pilote permettra de réduire le nombre d’animaux en choisissant le meilleur modèle de nanoplastique au préalable et de mettre au point les techniques de détection. Les expérimentations sont basées sur la comparaison de 4 groupes. Les effectifs seront déterminés et vos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux seront hébergés collectivement au calme dans des conditions normalisées et suivis quotidiennement pour leur apporter tous les soins nécessaires. Leur milieu sera enrichi en buchettes de peuplier pour satisfaire leur besoin de ronger ainsi que de coton. Après une période 7 jours de repos pour qu’ils récupèrent du transport et s’habituent à leur nouvel environnement, ils seront manipulés régulièrement pour être habitués à la contention afin d’être pesés (1 fois par semaine), gavés et pour la prise de sang (4 fois sur la durée totale de l’exposition lors des tests de tolérance au glucose et des mesures de perméabilité). Le jour de l’expérimentation (10 à 15 jours après l’arrivée) les souris seront exposées aux particules via l’eau de boisson afin de limiter leur stress. Toutes les mesures ont été prises pour réduire l’inconfort (période d’acclimatation, habituation) et prévenir toute douleur ou anxiété susceptible d’être subie par les animaux (détection de toute anomalie ou apparition de mal être). Une période de récupération de minimum 1 semaine sera respectée entre la mesure de la perméabilité intestinale et le test de tolérance au glucose afin de minimiser le stress des animaux. L’état général des animaux et le comportement sera contrôlé quotidiennement et la prise de poids sera suivie afin de pouvoir déceler tous les signes anormaux de comportement, de souffrance et d’inconfort. Si une perte de poids supérieure à 10% de son poids initial, posture particulière dans la cage comme la prostration, les poils hérissés, la vocalisation sont observés alors l’animal sera retiré de l’étude et le cas échéant euthanasié si son état est jugé critique par la vétérinaire référente. Afin de suivre l'état général des animaux, des fiches d'observations seront mise en place pour uniformiser le suivi.

Choix des espèces

La souris C57BL/6 J (mâle et femelle) est la souche pour laquelle les outils ont été développés et adaptés au laboratoire et représente un modèle pertinent pour étudier la physiopathologie digestive. Les souris mâles et femelles utilisées seront âgées de 6 semaines à la réception, afin d'une part de faire des observations sur des souris adultes, et d'autre part de pouvoir comparer notre étude à la littérature existante.

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une lésion de la moelle épinière est induite chirurgicalement chez chaque animal sous anesthésie, suivie d'injections quotidiennes pendant 10 à 30 jours, pour étudier la réparation de la myéline et une piste thérapeutique contre la sclérose en plaques. Le porteur indique des nuisances liées à la chirurgie, hypothermie, hémorragie et douleurs post-opératoires, avec un point limite à 20 % de perte de poids. Toutes les souris sont euthanasiées pour des prélèvements post-mortem, le porteur décrivant le recours à l'animal comme "indispensable" pour valider les résultats obtenus sur cellules.

Objectifs

L’objectif de notre projet est d’identifier et déchiffrer de nouveaux mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la formation de la gaine de myéline autour des cellules nerveuses du système nerveux central (SNC) et périphérique, en condition physiologique et pathologique. Ce projet vise à étudier le rôle d’un récepteur membranaire, impliqué dans plusieurs mécanismes cellulaires, dans le contrôle de la synthèse de la gaine de myéline du système nerveux central et périphérique au cours du développement et à l’âge adulte, chez la souris. Dans un second temps, ce projet nous permettra aussi de montrer que ce récepteur est une nouvelle cible thérapeutique favorisant la réparation des gaines de myéline du SNC, chez la souris. La validation de cette cible ainsi que des composés sélectionnés sont des études très prometteuses, qui pourraient permettre de repositionner ces molécules actuellement utilisées dans d’autres pathologies, pour le traitement de maladies de la myéline.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’identifier de nouveaux mécanismes régulant la formation de la gaine de myéline autour des cellules nerveuses, lors du développement normal et dans des conditions pathologiques. Notre projet de sélection et de repositionnement de molécules thérapeutiques nous a permis de sélectionner 3 molécules avec un fort potentiel thérapeutique qui seront validées grâce à l’utilisation d’un modèle murin de lésions de la myéline, présentant des similitudes avec les lésions observées chez les patients. A terme, ces études permettront d'améliorer le traitement des lésions de la myéline chez les patients et de démontrer un rôle de ce récepteur dans les lésions de la sclérose en plaques.

Procédures

Nous utiliserons des souris afin de déterminer le rôle d’un récepteur membranaire qui semble impliqué dans le processus de myélinisation du système nerveux. Dans l’objectif d’étudier son rôle, au cours du développement et au cours du processus de réparation de lésions de la myéline, nous induirons de petites lésions de la moelle épinière chez la souris (une lésion par animal, sous anesthésie générale). L’analyse de ces lésions à différents temps permettra d’analyser l’impact de la protéine étudiée sur les différentes étapes du processus de réparation des lésions de la myéline. Nous utiliserons 560 animaux dans cette procédure expérimentale. La durée totale et maximale de cette procédure chirurgicale est de 30 minutes par animal et 30 jours post-chirurgie. Pour le groupe des souris inductibles, une injection d’un produit est nécessaire avant l’induction de la lésion (1X par jour pendant 5 jours par i.p. d’environ 5sec). Le groupe des souris sauvages recevra après la lésion une des molécules sélectionnées ou le véhicule seul (1X par jour par voie i.p, durée d’environ 5sec, ou par voie PO durée d’environ 5sec, pendant 10 à 30 jours). Pour la poursuite de l’étude, et pour tous les animaux, il est nécessaire d’obtenir des échantillons biologiques dans un état le plus proche possible de l’état physiologique. Cela implique d’éviter et de prévenir toute dégradation post-mortem.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont majoritairement liées à la chirurgie : hypothermie, hémorragie, risque anesthésique, douleurs post-opératoires. Un stress peut aussi être observé chez l’animal à cause de la contention quotidienne et de l’injection d’un produit. Il est notamment possible d’observer l’apparition d’hématomes dus à l’injection répétée de ce produit.

Devenir

Les prélèvements et analyses seront réalisés en post-mortem ; cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

Comprendre le rôle d’un récepteur, exprimé par la cellule responsable de la formation de la gaine de myéline, dans le système nerveux central, nécessite l’interaction de plusieurs types cellulaires et un environnement spécifique en fonction du stade du développement. Ainsi, le recours à l’utilisation d’un modèle animal est indispensable afin de valider nos résultats déjà obtenus par des modèles cellulaires en dehors de l’organisme dans l’objectif de comprendre comment l’activité de ce récepteur impacte la myélinisation et la remyélinisation. Concernant la partie validation thérapeutique, une analyse bio-informatique et l’utilisation de lignées de cellules, nous ont permis de réduire notre liste de composés à tester et par conséquent le nombre d’animaux à inclure dans notre étude. Nos résultats préliminaires suggèrent un fort potentiel de remyélinisation des 3 molécules sélectionnées, actuellement en phase clinique dans d’autres pathologies.

Réduction

Le nombre d’animaux est limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement exploitables. Nous prévoyons l’utilisation de 560 souris qui vont subir une procédure expérimentale modérée : - 280 pour notre procédure de démyélinisation focale afin d’évaluer l’effet régénératif dans les souris transgéniques. - 280 pour notre procédure de de démyélinisation focale afin d’évaluer la régénération de la myéline après traitement par des molécules pharmacologiques sélectionnées. Certaines variations expérimentales pouvant être observées dans ces deux modèles, le nombre d’animaux de chaque groupe est le minimum requis pour obtenir des données statistiquement significatives.

Raffinement

Les conditions d’hébergement (température, hygrométrie, éclairage, bruit et espace) et les conditions d’enrichissements de l’environnement (maison et matériel papier-coton), d’alimentation et de soins quand nécessaires seront parfaitement contrôlées (directive européenne 2010/63/UE). Pour éviter toute souffrance aux animaux durant les procédures, ils seront sous anesthésie et analgésie pendant toutes les interventions quand cela s’avérera nécessaire. Les animaux seront suivis régulièrement par les utilisateurs ainsi que par notre vétérinaire désigné. Ils seront stabulés en portoirs ventilés et dans des conditions de température et d’hygrométrie définies par les normes européennes (soit 22°C +/-2° pour la température et entre 45 et 65% d’hygrométrie). De plus, ils seront hébergés dans un environnement enrichi : animaux hébergés en groupe, nid en coton. Une alimentation adaptée est proposée aux animaux en croisement pour couvrir les besoins de la gestation et de l’allaitement. -Une période minimale de 7 jours d'acclimatation est respectée. - Plusieurs points limites visant à réduire la souffrance et/ou la détresse de l'animal sont respectés : - Apparence et position anormale : dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le côté, hypothermie au cours de la chirurgie (la température de l’animal étant monitorée durant l’acte) - Comportements anormaux : agressivité soudaine, abattement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit, réduction de la mobilité - Perte de poids rapide ou progressive de 20 % (poids de référence pris le jour de la chirurgie) réalisée par pesée tous les jours pendant 5 jours puis 2 fois par semaine avant l'euthanasie - État de choc, léthargie, immobilité - Difficultés respiratoires. L'euthanasie de l'animal sera réalisée si l’on observe l’un de ces critères. Le vétérinaire désigné sera consulté en cas de complications ou effets indésirables constatés lors des procédures ou après celles-ci : présence de signes cliniques d’infection (ex: prostration, suppuration) afin de mettre en place les actions nécessaires.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix puisqu’en tant que mammifère, ses processus physiologiques se rapprochent de ceux décrits chez l’homme. Afin de comprendre le rôle d’un récepteur membranaire du facteur de croissance vasculaire dans la régulation de la myélinisation en condition physiologique et pathologique, il est nécessaire de réaliser des études in vivo, intégrant l’ensemble des interactions entre les différents types cellulaires et leurs environnements. Chez l’homme adulte, quand la gaine de myéline est endommagée ou détruite, un mécanisme de réparation se met en place afin de régénérer une nouvelle gaine de myéline afin de protéger les neurones de la dégénérescence. L’utilisation de modèles animaux, au stade équivalent (souris adulte), reproduisant certains aspects des pathologies démyélinisantes comme la sclérose en plaques, est indispensable pour évaluer la fonction de ce récepteur membranaire en contexte pathologique. Il existe aussi un ensemble d’outils (anticorps, lignées transgéniques permettant de tracer le devenir des cellules gliales) qui ont été développés principalement chez la souris. L’utilisation de la souris pour l’étude de ce récepteur au cours du développement du système nerveux et dans des conditions pathologiques est donc indispensable pour étudier le rôle de ce récepteur et identifier de nouvelles cibles d’intérêt thérapeutique pour le traitement des pathologies de la myéline. Nous utiliserons des animaux des deux sexes afin d’éviter tout biais potentiellement lié au sexe dans notre étude.

340 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie transférée vivante vers un autre site pour expérimentation. Le projet déclare la création et l'élevage d'une lignée à phénotype dommageable qui développe spontanément des polypes intestinaux, pour étudier le cancer colorectal. Le porteur indique que les individus présentent après cinq mois des signes d'anémie, une perte de poids et des prolapsus, et qu'ils sont utilisés avant cet âge. Sur les 340 souris, 220 sont dédiées à l'élevage et à la maintenance de la lignée et 120 forment des cohortes transférées vers un autre site dans le cadre d'une "utilisation continue", le porteur affirmant qu'il n'existe "aucun modèle de substitution".

Objectifs

Nous souhaitons comprendre la séquence des événements impliqués dans les premières phases de l’initiation tumorale, impliquant l’utilisation de souris développant des lésions adénomateuses précoces de l'intestin. Cette saisine vise uniquement à déclarer la création et l'élevage de cette lignée. Cette lignée de souris combinera 3 modifications génétiques, permettant de comprendre comment l'inactivation d'un gène requis pour l'activation du système immunitaire peut diminuer le développement de polypes intestinaux.

Bénéfices attendus

Nous attendons de ce projet la génération de modèles d'études inédits, permettant de comprendre comment certaines cellules épithéliales peuvent participer à la mise en place d'un environnement propice à la tumorigenèse intestinale, ouvrant ainsi la voie à de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Aucune intervention invasive hors des actes à des fins d'élevages ainsi que dans le cadre de la prise en charge d'un phénotype dommageable.

Impact sur les animaux

Les animaux possédant l'un des 3 gènes modifiés vont développer, au cours de leur vie, des polypes intestinaux de manière spontanée. L'expérience acquise sur cette lignée montre que les individus ne présentent que peu ou pas de d'effets indésirables durant les 4 premiers mois de leur vie. A termes, à partir de 5 mois d'âge, les nuisances peuvent être les suivantes: signe d'anémie, perte de poids, et, de manière plus tardive, apparition de prolapsus.

Devenir

Les individus seront utilisés uniquement à des fins d'élevages avant 5 mois (220 au total), afin de générer des cohortes qui seront utilisées sur un autre site (120). Les animaux générés dans le cadre de cet élévage seront par la suite transférés sur un autre site pour expérimentation (cadre d'une utilisation continue).

Remplacement

Les questions posées dans le cadre de ce projet (séquence des événements impliqués dans les premières phases de l’initiation tumorale) impliquent l’utilisation de modèles murins reflétant au mieux la physiologie d’un point de vue intégrée. Il est en effet crucial pour nous de comprendre quelles sont les interactions entre les différentes populations cellulaires, les différents compartiments tissulaires ainsi que le microbiote intestinal. Il n’existe à ce jour aucun modèle de substitution, et l’utilisation de souris reste la seule alternative à notre problématique.

Réduction

Sur la base de nos données acquises lors d'un précédent projet, des cohortes expérimetales de 20 souris contrôle et 20 souris test seront requises pour réaliser 3 expériences indépendantes, portant le nombre d'animaux à produire à des fins expérimentales à 120 (40 x 3). Il faut ajouter à ce nombre les individus nécessaires pour la création de la lignée et son maintien (110), et anticiper d'éventuels croisements requis pour la suite de nos projets (110) . Ainsi, nous déclarons un total de 340 souris a utiliser dans le cadre de ce projet.

Raffinement

La principale stratégie de raffinement consistera à utiliser les animaux le plus précocement possible, jusqu'à 5 mois maximum, phase durant laquelle les individus ne présentent pas d'effets délétères majeurs. Des critères d'évaluations et des points limites visant à détecter les premiers signes avant-coureurs de l'évolution de l'état des souris seront mis en place lors de l’élevage.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour notre projet, puisque disposant d’un appareil digestif et d'un système immunitaire présentant de nombreuses similitudes avec l’homme. L'un des gènes modifié utilisé dans ce projet mime la perte de fonction du gène le plus fréquemment muté dans le cancer colorectal humain. Ce modèle de souris transgéniques sera donc utilisé pour nous permettre de tester au mieux nos hypothèses. Les animaux dédiés à la maintenance et l’amplification des colonies seront utilisés entre 8 et 22 semaines, âge auquel les souris ne présentent pas d'effets indésirables drastiques.