Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
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Fonction et potentiel thérapeutique des neutrophiles dans la maladie de Charcot
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
590 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, dans deux modèles de la maladie de Charcot. Elles reçoivent des anticorps par voie intraveineuse et des prises de sang, sont suivies par des tests de motricité et de coordination, puis subissent une ponction intracardiaque sous dose létale d'anesthésique pour prélever le système nerveux. Le porteur indique que l'un des modèles perd progressivement sa masse musculaire jusqu'à des difficultés à se déplacer et que la maladie y est fatale, tout en affirmant que les souris ne montrent pas de signes de douleur. Il présente le recours à l'animal comme "indispensable" et le seul à reproduire les interactions entre système immunitaire et système nerveux.
Objectifs
La maladie de Charcot est une maladie neurodégénérative incurable, fatale, causée par la perte des neurones moteurs localisés dans le cerveau et la moelle épinière et qui sont responsables de la contraction des muscles volontaires. La maladie de Charcot touche environ 7000 patients en France. La maladie débute généralement entre 50 et 70 ans par une faiblesse musculaire, évoluant rapidement vers une paralysie généralisée des membres et une insuffisance respiratoire qui conduit au décès dans les 2 à 3 ans suivant l'apparition des symptômes. Malgré l'explosion des connaissances sur les processus pathologiques centrés autour du neurone moteur, d’autres faisceaux d’évidences suggèrent que la maladie met en jeu le système immunitaire. Le système immunitaire comprend de nombreux médiateurs de l’inflammation, un processus qui peut influencer les maladies neurodégénératives comme la maladie de Charcot. Les neutrophiles représentent une population de globules blancs très abondante dans le sang et la première barrière de défense de l’organisme contre les infections bactériennes. Ils ont récemment été montrés comme jouant un rôle dans la maladie d’Alzheimer. En revanche leur rôle dans la maladie de Charcot demeure inconnu. Notre objectif est de comprendre la fonction des neutrophiles dans la maladie et d’évaluer leur potentiel comme cible thérapeutique. A cette fin, nous aborderons cette problématique par une description précise des défauts de cette population de cellules immunitaires au cours du temps. Notre dernier objectif est d’évaluer une approche d’immunothérapie visant sélectivement les neutrophiles. Le but de ce projet est donc de fournir un nouvel éclairage sur la maladie en mettant en évidence la contribution d’un nouveau type cellulaire du système immunitaire et offrir de nouvelles perspectives.
Bénéfices attendus
Identifier de nouveaux acteurs cellulaires qui contribuent à la dégénérescence des neurones moteurs dans la maladie de Charcot permet d’avoir une vue plus complète de la maladie et proposer ainsi de nouvelles pistes thérapeutiques. Les bénéfices de cette étude présentent donc un potentiel clinique. Ce projet propose de faire progresser nos connaissances scientifiques sur cette pathologie qui est particulièrement complexe. Notre connaissance encore incomplète de la pathologie explique pour une grande part les nombreux échecs thérapeutiques rencontrés chez les patients jusqu’à présent. Notre projet propose d’explorer une population de cellules du système immunitaire. Facile d’accès en terme thérapeutique, le système immunitaire facilite ainsi le développement des thérapies. Notre projet explore une approche d’anticorps thérapeutiques qui a un fort potentiel clinique comme l’illustre l’efficacité des anticorps médicaments dans la sclérose en plaque par exemple. L’utilisation de deux modèles différents de la maladie est un point fort de cette étude en mimant l’hétérogénéité clinique de la maladie de Charcot. Le bénéfice de notre approche est clairement identifiable de par la robustesse et la reproductibilité de nos résultats et potentielles applications dans deux modèles différents. La valorisation de ce projet se traduira par des publications dans des journaux internationaux à comité de lecture et potentiellement un/des dépôts de brevet.
Procédures
Le projet implique de délivrer des anticorps thérapeutiques dans la circulation sanguine des souris et de réaliser des prélèvements sanguins. Ces procédures réalisées sur animaux vigiles sont rapides (1-2 min maximum) et n’occasionnent que le stress de la contention et celle d’une piqure. Afin de suivre l’évolution des capacités motrices des souris atteintes de la maladie de Charcot, les animaux seront suivis par des tests comportementaux simples, non invasifs, ne nécessitant pas de déprivation de nourriture. Deux tests comportementaux moteurs seront ici utilisés pour définir les capacités motrices et les propriétés de coordination motrice. Chaque test prend moins de 5 min par souris. Notre étudions le rôle de certaines populations de globules blancs dans la pathologie et leur potentiel thérapeutique. Nous avons besoin de réaliser des études d’histologie du système nerveux et de cytométrie du système immunitaire. A cette fin, une préparation des tissus est nécessaire avant de procéder à la biopsie. Nous procédons donc à une perfusion ou ponction intra-cardiaques sur des animaux anesthésiés ayant reçu une dose léthale d’anesthésique/analgésique. Cette procédure prend moins de 5 min par animal. Des souris pourront se trouver hébergées individuellement, dans un environnement enrichie amplifié pour une durée de 21 jours.
Impact sur les animaux
La maladie de Charcot est une maladie paralysante incurable dont l’issue est inexorablement fatale. Les modèles souris que nous utilisons ont été très bien caractérisés dans de nombreuses publications, ce qui nous assure une optimisation de la règle des 3Rs. Le trait commun de la pathologie chez ces deux lignées de souris est la diminution des capacités motrices. Ces modèles présentent une atteinte motrice variable, un début et une progression de la maladie différents. Les modèles de la maladie de Charcot ont été particulièrement bien décrits quant au tableau et à la chronologie clinique de la pathologie. Un des modèles présentent une réduction progressive de la masse musculaire commençant par les membres inférieurs. Cette amyotrophie se traduit par une perte de poids et des difficultés déambulatoires. Le deuxième modèle perd très lentement ses capacités à effectuer une tache motrice et présente une posture anormale (dandinement) qui est stable pour suivre un déclin normal lié à l’âge et à la prise poids. Ce modèle présente une atteinte motrice plus légère qui n’est pas associée à une espérance de vie plus courte. Les souris, comme c’est le cas chez les patients, ne présentent pas de signes de douleurs. Notre objectif est d’améliorer les symptômes moteurs par des anticorps thérapeutiques. L’administration d’anticorps thérapeutiques dans la circulation est une approche peu invasive, maitrisée et standardisée. Les animaux qui rentrent dans l’évaluation thérapeutique sont impliqués dans du comportement moteur consistant à évaluer de façon non-invasive, non-douloureuse, très peu contraignante et de courte durée la capacité à effectuer une activité motrice simple.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour répondre à deux nécessités du projet : 1) prélever des tissus afin d’étudier les liens entre système immunitaire et système nerveux central et déterminer les paramètres histologiques en liens avec des caractéristiques cliniques et un effet thérapeutique. L’autre nécessité est liée à la pathologie elle-même, qui est fatale chez l’homme et également dans un des modèles murins utilisé ici, et rentre dans le cadre de l’étude de l’approche thérapeutique sur l’espérance de vie des souris qui auront reçu ou non le traitement.
Remplacement
La maladie de Charcot est une maladie fatale et incurable qui se caractérise par une perte des neurones qui contrôlent l’activité des muscles squelettiques. L’utilisation de souris mimant la pathologie humaine est le seul système intégrant la complexité des interactions entre le système immunitaire et le système nerveux. Une telle interaction qui se met en place durant des mois et qui implique d’autres cellules autres que le neurone moteur, ne peut pas être mimée in vitro. Seul les modèles expérimentaux mammifères présentent la complexité des interactions entre les cellules du système immunitaire et les cellules du système nerveux, et les barrières physiologiques comme les méninges. Cependant, afin d’explorer les mécanismes impliqués dans l’interactions neutrophiles et neurones moteurs, nous développons des systèmes de cultures in vitro entre neutrophiles et neurones moteurs. Notre objectif étant également de développer une thérapie utilisant des anticorps ciblant cette population de globules blancs, l’utilisation des modèles animaux de la maladie de Charcot est également indispensable. La validation d’une approche thérapeutique qui intervient dans la complexité de cette communication entre système immunitaire et système nerveux requiert un modèle physiologique complet que seul l’animal offre. Le modèle vivant demeure donc une étape requise pour tout transfert thérapeutique potentiel vers la clinique.
Réduction
Nous avons donc déterminé pour une durée du projet de 4 années, un nombre total de 590 souris. Le nombre de souris est déterminé en suivant scrupuleusement les recommandations internationales et les études qui définissent les tailles optimales des cohortes de souris modèles de la maladie. Nous suivons donc un traitement statistique qui permet de réduire le nombre d’animaux et limiter les faux-positifs. Nous nous référons aux études réalisées sur les effets de taille de groupe sur la puissance et la fiabilité des tests statistiques. Pour un premier modèle de la SLA chaque cohorte est composée de 24 souris pour le comportement et 8 souris pour les études histopathologiques, de séquençage et de cytométrie. Pour le second modèle, chaque cohorte est composée de 14 souris pour le comportement et 8 souris pour les études histopathologique, de séquençage et de cytométrie. Afin de minimiser le nombre d’animaux, ceux qui ont servi à la reproduction sont inclus dans les cohortes expérimentales. Nous utilisons également des cohortes mixtes male et femelle, réduisant ainsi le nombre d’animaux euthanasiés au sevrage. Notre projet inclut également une étude in vitro qui permet donc de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Une connaissance extensive de ces deux modèles de la maladie de Charcot permet de connaître et donc anticiper les différentes étapes de la maladie et donc d’optimiser l’expérimentation. Une surveillance régulière est mise en place et assurée par les expérimentateurs et nous travaillons étroitement avec la structure du bien-être animal. Les conditions d’élevage qui incluent des copeaux dans les litières, igloo, lanières de papier craft et du coton vierge pour faire un nid végétal contribue à améliorer le bien-être des animaux en créant un microenvironnement propice au repos. Les points limites sont définis par le suivi régulier du poids des souris et leur capacité à effectuer une tache motrice reflexe simple. Pour chaque modèle animal de la maladie de Charcot un arbre décisionnel spécifique est défini et suivi par les expérimentateurs associés au projet. De plus une surveillance visuelle quotidienne est effectuée par les zootechniciens. L’administration d’anticorps thérapeutiques est réalisée avec un anesthésique appliqué localement et les animaux sont suivis régulièrement après chaque injection. Toute anomalie indépendante de la pathologie comme des signes d’angoisse, de détresse, de douleur ou d’infection est signalée afin d’apporter une réponse rapide et adaptée. Une grille d’évaluation définie par la structure du bien-être animal nous permet de suivre les animaux ainsi identifiés et de prendre rapidement des mesures adaptées.
Choix des espèces
Les lignées transgéniques modèles de la maladie de Charcot récapitulent l’hétérogénéité clinique de la pathologie et renforce la validité et valorisation des résultats: début précoce/tardif, progression lente/rapide, traits cliniques, électrophysiologiques et histopathologiques spécifiques de la maladie. L’exploration des propriétés phénotypiques et génétiques des neutrophiles au cours de la maladie ainsi que le protocole d’immunothérapie que nous proposons requiert une expérimentation sur les modèles murins de la pathologie. Notre étude a en effet pour objectif d’amener au plus proche de la clinique une stratégie d’immunothérapie. La complexité des interactions entre le système immunitaire et le système nerveux requiert un modèle à la physiologie complexe qui se rapproche de celui de l’homme. Les modèles de la maladie de Charcot qui sont utilisés récapitulent les principales étapes de la maladie. Nous utiliserons 2 modèles différents qui permettent de représenter l’hétérogénéité clinique et génétique de la maladie. Afin de suivre la maladie nous utiliserons les lignées à trois stades significatifs. L’âge de chaque stade étant différent en fonction du modèle. Nous utiliserons les souris 1) au stade précédent les premiers signes moteurs, c’est le stade asymptomatique. 2) Le stade de début de la maladie ou les premiers signes moteurs sont quantifiables. 3) Un stade ou la maladie est installée, qui est le stade symptomatique. L’espérance de vie des souris est également étudiée dans une procédure thérapeutique.
Rôle du microbiote intestinal sur le phénotype mastocytaire des souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour étudier le rôle du microbiote intestinal dans le développement de certaines cellules immunitaires. Elles reçoivent des gavages quotidiens d'antibiotiques et de laxatif pendant une semaine pour supprimer leur microbiote, puis une partie subit des gavages de bactéries, avant mise à mort pour prélever les intestins. Le porteur qualifie le gavage répété de source de stress et l'antibiothérapie de sans effet comportemental majeur. Il présente les souris comme des modèles "incontournables" faute de modèle cellulaire satisfaisant.
Objectifs
Au sein du laboratoire, des données préliminaires d'analyses génétiques décèlent deux populations de mastocytes au sein de l'organisme : les mastocytes muqueux et les mastocytes connectifs. Les mastocytes connectifs se développent en période prénatale (dans le fœtus), indépendamment du microbiote tandis que les mastocytes muqueux n'apparaissent que plus tardivement (après la naissance) et colonisent des endroits particulièrement riches en microbiote ; à savoir le tractus digestif et les poumons. De plus, notre étude sur des souris Germ-Free (nées exemptes de microbiote) montre une baisse du nombre de mastocytes muqueux par rapport à des souris contrôles avec microbiote. Nous émettons donc l'hypothèse que le microbiote joue un rôle dans le développement et le maintien de cette population de mastocytes muqueux au sein de l'organisme. Les objectifs de ce projet sont donc de 1) déterminer si la perte du microbiote intestinal, à l'âge adulte, altère le nombre/phénotype/localisation des mastocytes muqueux, 2) savoir s'il existe une fenêtre temporelle critique en post-natal durant laquelle le microbiote jouerait un rôle crucial dans le développement des mastocytes muqueux et leur survie au sein de l'intestin et à terme 3) définir les voies de signalisation entre le microbiote et les mastocytes, si elles existent, grâce à des modèles de souris génétiquement modifiées.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait de mettre en évidence, s'il existe, un rôle du microbiote dans le développement des mastocytes, plus précisément les mastocytes muqueux et/ou un rôle de celui-ci dans le maintien de cette population au sein de leur niche intestinale. Dans un deuxième temps, ce projet permettra de mettre en lumière une potentielle fenêtre temporelle durant laquelle le microbiote exerce son rôle. Pour finir, si une interaction microbiote - mastocyte existe, ce projet permettra aussi de décrire les voies de signalisation sous-jacentes.
Procédures
Les animaux seront soumis uniquement à des gavages d'antibiotiques et de polyéthylène glycol à hauteur de 7 fois par semaine (5 jours d'antibiotiques + 1 jour de polyéthylène glycol deux fois) pendant une semaine seulement dans le but de dépléter leur microbiote intestinal. Par la suite, 1500 d'entre eux seront soumis à un deuxième protocole de gavage par des souches bactériennes, 3 fois par semaine pendant une semaine. Chaque gavage représente une manipulation brève, d'environ 10 secondes afin de limiter le stress de l'animal. Entre les deux procédures, les souris ne subiront aucune autre intervention pour une durée de deux semaines.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de nos expériences, les manipulations ainsi que le gavage a répétition peuvent entrainer un stress chez les animaux. L'antibiothérapie en elle-même n'induit en revanche aucun changement comportemental majeur connu à ce jour dans la littérature.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes, majoritairement les intestins et évaluer leur phénotype mastocytaire par FACS et imagerie confocale.
Remplacement
Ce projet vise à étudier le rôle du microbiote dans le maintien des différentes populations de mastocytes présentes au niveau intestinal. Il n’existe pas à ce jour de modèle cellulaire satisfaisant qui puisse rendre compte de ce phénomène. De ce fait, les modèles de souris sont des éléments clés et incontournables pour étudier l'impact du microbiote sur les phénotype mastocytaire, in vivo.
Réduction
L’expérience du porteur du projet sur les mastocytes et des collaborateurs sur le microbiote nous permet d’anticiper et optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous effectuerons l’analyse sur un nombre total de 1560 souris sur une période de 3 ans avec 10 souris par groupe et par condition. Les expériences qui seront réalisées ont été conçues de façon à n’utiliser que le nombre strictement minimum de souris nécessaire à l’obtention de données validées statistiquement (nombres déterminés sur la base de la littérature et de l’expérience des porteurs du projet dans les expériences réalisées, pour des tests statistiques de type Mann Whitney ou test-t non appariés pour la comparaison de deux moyennes, ou de type ANOVA à deux facteurs avec post test de type Bonferoni pour l’analyse de données à deux variables.
Raffinement
Lors de la mise en place des procédures expérimentales l’état clinique des animaux sera surveillé tous les jours. Nous analyserons divers paramètres de manière quotidienne (1 fois par jour) : poids, température et signes extérieurs de stress afin de s'assurer du bien-être des animaux. La surveillance des fèces sera notamment mise en place lors de l'administration du polyéthylène glycol pendant les 48 heures suivant l'administration.
Choix des espèces
La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines. En effet, la physiologie des différents organes chez la souris présente de nombreuses similarités avec celle des organes humains. L’organisation du microbiote intestinal de la souris, qui nous intéresse dans le cadre de ce projet, est similaire à celle chez l’Homme avec une forte concentration au niveau des parties intestinales basses. Tout comme chez l’Homme, l’antibiothérapie a été largement démontrée comme impactant la flore intestinale de ces animaux et est largement utilisée par la communauté scientifique comme outil de déplétion du microbiote. La moitié des animaux seront utilisés entre 8 et 16 semaines ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature. Les souris restantes seront, elles, utilisées entre 2 et 8 semaines post-naissance afin d'évaluer la fenêtre temporelle durant laquelle le microbiote jouerait un rôle dans le développement des mastocytes muqueux.
Comparaison de l’efficacité thérapeutique d’approches de radiothérapie chez des modèles sous-cutanés dérivés de patients
- Recherche fondamentale
- Oncologie
960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un fragment de tumeur de patient est implanté sous la peau du flanc par incision chirurgicale, puis les animaux reçoivent des injections et une irradiation ciblée de la tumeur, pour comparer deux approches de radiothérapie interne à la radiothérapie externe dans des cancers du pancréas et de l'ovaire. Le porteur décrit des douleurs aux points d'injection et une mise à mort dès une perte de poids de 20 % ou une tumeur dépassant 1 500 mm³. Les bénéfices pour les patients sont rattachés à un "transfert clinique" envisagé avec un industriel à l'issue de l'étude.
Objectifs
Les cancers pancréatiques et ovariens souffrent aujourd'hui de mauvais prognostics liés à un diagnostique tardif et d’options thérapeutiques très limitées. Ce projet a pour objectif d’évaluer deux approches de radiothérapie interne vectorisée établies au sein de l'équipe porteuse du projet dans des modèles dérivés de patient de cancer pancréatique et ovarien greffés chez des souris pour mimer au plus près ces cancers. Nous comparerons ces nouvelles approches thérapeutiques à la radiothérapie externe conventionellement appliquée pour le traitement de ces cancers. Nous souhaitons in fine démontrer les bénéfices des approches de radiothérapie interne vectorisée par rapport à la radiothérapie externe pour envisager le transfert clinique de nos approches.
Bénéfices attendus
La validation de l'efficacité thérapeutique de ces approches à fort potentiel de transfert clinique pourrait apporter une option de thérapie ciblée pour les 14’000 et 5'320 patients atteints de cancers pancréatiques et ovariens diagnostiqués chaque année en France. Une translation clinique est envisagée à la fin de cette étude avec le soutien d'un industriel.
Procédures
-injection en sous-cutanée via une seringue de 1 mL montée avec une aiguille 25 G avec contention de l'animal (30 sec/animal) -anesthésie de l’animal à l’isoflurane (4% pour l’induction puis 2% pour le maintien) (3 min/animal) - incision de 0.3 à 0.8 cm avec un ciseau stérile sur le flanc gauche de l'animal (30 sec/animal) - création d'un tunnel sous cutané avec une pince fermée (30 sec/animal) - insertion d'un fragment de tumeur d’environ 30 mm3 à l’aide de pinces dans l’incision au fond du tunnel (1 minute/animal). - fermeture de l’incision à l’aide de 1 ou 2 points fil de chirurgie 6.0 non-résorbable (1 minute/animal) - acquistion scanner + tomographie par emission de positrion (15-35 minutes/animal) - injection par voie intraveineuse (veine caudale) via une seringue de 1 mL montée avec une aiguille 25 G avec contention de l'animal (1 min/animal) - injection intrapéritonéale via une seringue de 1 mL montée avec une aiguille 25 G avec contention de l'animal (1 min/animal) - irradiation de la zone tumorale 1x1cm avec un irradiateur XenX (Xstrahl) sur animal anesthésié.
Impact sur les animaux
Effets indésirables direct: - douleur associée à une injection sous-cutanée - douleur associée à une injection intrapéritonéale - douleur associée à une injection intraveineuse - douleur associée à une implantation d'un fragment tumoral sous-cutané. Effets indérisables indirect conséquence des produits injectés: - croissance tumorale - perte de poids.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés selon une méthode adaptée pour l'animal (non anxiogène, indolore, perte de connaissance instantanée), pour l'expérimentateur (sans danger, sans risque de choc émotionnel), pour l'expérience (pas de modification des tissus nécessaire à l'expérimentation).
Remplacement
Ils n’existent pas de modèles in vitro et in silico reproduisant la complexité du milieu tumoral et permettant de déterminer la biodistribution et l'efficacité thérapeutique d’un radiopharmaceutique tout en considérant l'accumulation et la toxicité au niveau des tissus sains.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en conservant une puissance statistique suffisante pour le traitement du résultat. L’évaluation de la pharmacologie de radiopharmaceutiques nous contraint à l’utilisation de plusieurs groupes contrôles. Néanmoins, le suivi par une technique d’imagerie non invasive (tomographie par emission de positron) couplé à la tomodensitométrie pour définir le meilleur modèle vivo pour les approches de radiothérapie, nous permet de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les protocoles expérimentaux puisqu’il n’y a pas de sacrifices à chaque temps d’imagerie. La taille des différents groupes de cette étude a été défini avec l'aide de biostatisticiens pour fournir une puissance suffisante sur la base de l'analyse de nos résultats préliminaires. Les résultats de cette étude seront analysés en collaboration avec une équipe de biostatistique.
Raffinement
L'environnement des animaux est stable et contrôlé (air ambiant, température, humidité, luminosité). L'hébergement est enrichi d’accessoires permettant l'expression de certains comportements naturels par l'animal et participant ainsi à leur bien-être. Une alimentation et de l'eau mis à disposition des animaux. Les animaux sont hébergés en groupes restreints (n=5). Une surveillance sanitaire trimestrielle permet de s'assurer de l'absence de pathogène et d'agent pathogène opportunistique, assurant ainsi la bonne santé des animaux. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les mêmes membres du personnel. Les signes de douleur, souffrance, angoisse, changement de comportement ou d’aspect physique seront classés et rapportés selon la fiche de suivi clinique. Tout score ≥ 6 conduira au sacrifice de l’animal. De manière plus spécifique, les points limites pour ce protocole sont : - une perte de poids supérieure à 20% du poids initial - un volume tumoral > 1500 mm3. Ces points limites ont été établis lors d'expérimentations préliminaires afin de prévenir une dégradation de l'état général des animaux (e.g. perte de poids, réduction de la consommation alimentaire, déshydratation). L’utilisation de produits anesthésiques et analgésiques permettra de réduire ou supprimer la douleur de l'animal.
Choix des espèces
Le modèle murin est particulièrement adapté pour ces expérimentations puisqu'il possède des mécanismes d'absorption, de métabolisme et d'élimination très proche de l'homme. Age 6-8 semaines, animal adulte. Les cancers pancréatiques et ovariens étant dominants dans la population adulte, les animaux utilisés seront donc en âge adulte. Le sexe femelle est nécessaire pour les cancers ovariens.
Étude de l’impact du biallélisme Tlr7 sur l’immunité humorale protectrice lors de la vaccination contre la grippe H1N1 chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
349 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester si un gène du chromosome X explique la réponse immunitaire plus forte des femelles à la grippe. Des femelles portant une ou deux copies du gène TLR7, et leur descendance, reçoivent un vaccin ou une injection de virus grippal H1N1 sous anesthésie, avec des prises de sang répétées. Le porteur indique attendre les signes classiques de la grippe, perte de poids, perte de motricité, douleur et incapacité à s'alimenter, avant mise à mort pour prélèvement. Il affirme qu'une expérimentation sur animal est "nécessaire" après les travaux in vitro du projet.
Objectifs
La nature et la force de la réponse immunitaire varient entre les femmes et les hommes, ce qui entraîne des différences fondées sur le sexe dans la prévalence, la susceptibilité et les symptômes associés aux maladies infectieuses . Certains gènes du chromosome X (dont le gène appelé TLR7) constituent une ligne de défense essentielle contre les virus à ARN (dont les virus influenza, responsables de la grippe). Les femelles mammifères (XX) ont 2 copies actives du gène TLR7 par cellule, alors que les mâles (XY) n’en ont qu’une. Il a été démontré (chez la souris comme dans l’espèce humaine) que les femelles présentent des réponses immunitaires à l'infection grippale et à la vaccination supérieures à celles des mâles. Nous allons étudier la réponse immunitaire suite à une vaccination grippe ou à une injection de virus grippal chez des souris femelles ayant une ou deux copies du gène TLR7, afin d’étudier la qualité de la réponse immunitaire chez ces femelles ainsi que chez leur descendance.
Bénéfices attendus
Nous allons développer et valider de nouveaux outils génétiques chez la souris pour suivre les cellules immunitaires au cours de la réponse à la vaccination ou à l’infection par des virus de la grippe afin de déterminer si les différences de réponse immunitaires entre mâles et femelles passe bien par le gène TLR7. Globalement, notre projet fournira de nouvelles connaissances sur la nature des mécanismes responsables de la prédominance féminine dans l'immunité induite par TLR7, et pourrait ouvrir des voies pour le développement de nouvelles stratégies vaccinales contre les virus de la grippe et plus généralement contre les virus à ARN.
Procédures
prises de sang (sous anésthésie, entre 1 et 8 par procédure (de 15 jours), durée de l'anesthésie 10 minutes) ; pesées (animaux vigiles, 1 à 2 par jour selon les procédures, durée 30 secondes); injections de vaccin ou serum (sous anesthésie, entre 1 et 2 par procédure (de 15 jours), durée de l'anesthésie 10 minutes) ; injection de virus (sous anesthésie, 1 par procédure (de 15 jours), durée de l'anesthésie 10 minutes); anesthésie/euthanasie finale en fin de procédure
Impact sur les animaux
Nous attendons les signes cliniques classiques des infections Influenza A chez la souris : perte de poids, perte de motricité, douleur, incapacité à s’alimenter
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés. ce sont des souris d’élevage, transgéniques, voire infectées par du virus influenza, ce qui requiert une euthanasie systématique en fin de procédure
Remplacement
Afin d’étudier l’effet du nombre de copie du gène TLR7 sur la réponse immunitaire humorale face à une infection virale, une expérimentation animale est nécessaire après les études in vitro (correspondant aux autres workpackages du projet)
Réduction
Des études statistiques seront utilisées dans cette étude afin de justifier la pertinence de nos résultats. Tenant compte de l’expérience des membres du projet ainsi que des données de la littérature, le nombre de souris nécessaire par groupe expérimental pour que nos résultats soient pertinents est déterminé de la façon suivante : 3 souris par groupe et/ou jour post infection pour les autopsies, 5 souris pour un suivi clinique de 14 jours, et 5 souris contrôles non infectées).
Raffinement
Le suivi des animaux sera effectué 1 fois par jour pendant la durée de la procédure, et 2 fois par jour au pic de l’infection. Les animaux seront euthanasiés dès qu’un des points limites sera atteint. Pour les prises de sang et injections (de serum (voie IP), de vaccin (voie IP) ou de virus (voie IN), les souris seront anesthésiées en utilisant le poste d'anesthésie gazeuse (isoflurane).
Choix des espèces
Les souris sont classiquement utilisées pour étudier la réponse immunitaire lors d’infection au virus Influenza. Par ailleurs, nous allons utiliser une lignée murine transgénique produite par notre partenaire dans le projet, et son équivalent sauvage - animaux adultes pour étudier la réponse immunitaire d’animaux en âge de reproduction, et pour obtenir une descendance. - souriceaux pour étudier l’effet des anticorps maternels contre une infection influenza chez la descendance
Etude de l’environnement inflammatoire cérébral post-radiothérapie : suivi par microdialyse sur rat porteur de glioblastome (EU porteur; EU 1/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
64 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une tumeur cérébrale humaine est implantée dans leur cerveau, puis une sonde de microdialyse qui ressort du crâne et y reste jusqu'à la mise à mort, des prélèvements de liquide cérébral étant réalisés sur l'animal conscient et maintenu en contention entre le 11e et le 17e jour. Ils subissent aussi radiothérapie et imagerie sous anesthésie, la mise à mort survenant dès un point limite ou au plus tard à 90 jours. Le porteur présente la microdialyse comme un moyen de réduire le nombre d'animaux et affirme que le remplacement n'est "clairement pas possible".
Objectifs
Les tumeurs cérébrales appelée glioblastomes sont les tumeurs du cerveau les plus fréquentes et sont généralement agressives. En clinique, actuellement le protocole de traitement de ces tumeurs cérébrales commence par une ablation chirurgicale, suivie de séances de radiothérapie et de chimiothérapie. En effet, dans la plupart des cas, l’ablation chirurgicale ne permet que de retirer partiellement la masse tumorale. Les cellules cancéreuses restantes après chirurgie sont ensuite traitées par radiothérapie et chimiothérapie. Ce projet se place dans le contexte clinique de traitement des tumeurs cérébrales, et plus particulièrement sur l’amélioration de l’efficacité du traitement par radiothérapie grâce à l’utilisation de nouvelles molécules. Dans ce projet nous chercherons à évaluer le potentiel thérapeutique d'un médicament innovant (en cours de développement clinique), en association avec la radiothérapie, sur un modèle de tumeur cérébrale humaine implantée chez l'animal. L’objectif du projet étant d'étudier la réponse immunitaire après traitement par ce médicament innovant en association avec la radiothérapie. Pour cela nous utiliserons une technique qui permet un dosage répété des molécules présentent dans l'environnement de la tumeur sans réaliser de biopsie du cerveau. Au cours d'une chirurgie nous plaçons une sonde dans la tumeur cérébrale de l'animal; celle-ci nous permettra de mesurer la réponse immunitaire durant plusieurs jours. Cette technique permet de réduire considérablement le nombre d'animaux comparé aux techniques traditionnellement utilisées qui necessiteraient la mise à mort de l'animal pour chaque point de mesure. Pour le suivi de l'évolution de la masse tumorale des différents traitements, nous utiliserons des techniques d’imagerie non invasive permettant notamment de réduire les souffrances de l’animal et de réitérer nos observations dans le temps sur un même animal.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de mieux appréhender les mécanismes d’action du médicament innovant pour le traitement du glioblastome. La technique de mesure utilisée permettra, par l'intermédiaire d'une sonde implantée dans le tissu cérébral, d'obtenir des échantillons de façon dynamique tout en gardant l’animal en vie. Ces échantillons nous permettront un suivi au cours du temps de la réponse immunitaire après traitement du médicament innovant et de la radiothérapie.
Procédures
Implantation dans le cerveau des animaux de tumeurs cérébrales humaines, cette chirurgie dure environ 1h. Implantation d'une sonde de microdialyse : durée de la chirurgie environ 1h30 ; présence de la sonde qui ressort au niveau du crâne et qui reste présente à partir du moment de son implantation jusqu'à la mise à mort de l'animal. Prélèvement de liquide cérébral sur animal vigile hébergé en cage individuelle spécifique au mode de prélèvement. Cette méthode de prélévement sera réalisée du jour 11 au jour 17 sur l'animal conscient; l'hébergement en cage individuelle spécifique au mode de prélèvement induit une restriction des déplacements de l'animal. Protocole de radiothérapie et imagerie pour le suivi de l'évolution de la tumeur sur animal anesthésié
Impact sur les animaux
Implantation au niveau du cerveau de cellules tumorales d'origine humaine : chirurgie classée modérée car seule l’incision de la peau du crane peut provoquer une souffrance à l’animal. Nous utiliserons un analgésique local pour limiter la souffrance des animaux. Implantation de la sonde : chirurgie opératoire classée sévère mais utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux. Hébergement en cage individuelle après l’implantation de la sonde (pour éviter que les animaux ne se rongent la partie visible de celle-ci) pouvant conduire à un stress des animaux (limitation des interactions sociales directes) mais atténuation de cet effet indésirable en accolant les cages les unes aux autres qui sont de surcroit transparentes. Cages d’hébergements adaptées au mode de prélèvement avec système de contention. Radiothérapie et imagerie sur l’animal : transport de l'animal jusqu’à la plateforme d'imagerie et de radiothérapie ; afin d’éviter toute nuisance à l’animal, le transport est réalisé en cages filtrées dans un sac de transport isotherme (pour le maintien d’une température optimale, des bouillottes chauffantes sont placées sous les cages si nécessaire). Les procédures de radiothérapie ou d’imagerie sont réalisées sur l’animal anesthésié. L'imagerie est un examen non invasif , il ne produit aucune forme de douleur.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. La mise à mort est réalisée dès l’apparition d’un point limite (altération des déplacements et/ou perte de poids) ou en cas d'efficacité du traiement au maximum 90 jours après le début des expérimentations.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement de tumeurs cérébrales et les effets du traitement par radiothérapie avec ou sans médicament innovant, dépendent de phénomènes biologiques complexes. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé que sur un modèle animal.
Réduction
La technique utilisée est une méthode permettant le recueil du liquide cérébral et de ses composants sans avoir à mettre à mort les animaux. Elle offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux dans la mesure où les prélèvements peuvent être réitérés au cours du temps. Nous n’avons pas de réelle idée des variations attendues entre les différents groupes d'animaux, il est donc compliqué de définir un nombre d’animaux précis nécessaire pour une obtenir une solide étude statistique mais 8 animaux par groupe semble tout à fait pertinent.
Raffinement
Les deux procèdures chirurgicales seront effectuées sous anesthésie gazeuse afin de limiter le stress de l'animal et de permettre un réveil rapide. Une attention toute particulière sera portée aux animaux d'une part après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) mais d'autre part lors de la chirurgie d'implantation de la sonde (analgésie avec réitération, mise en cage individuelle, pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie). Une vigilance accrue sera accordée au moment des prélèvements intracérébraux, en effet les animaux seront régulièrement observés pour vérifier que le comportement des animaux n’est pas altéré par le mode de prélèvement et les contraintes de contention. L'atteinte d'un point limite décrit précédemment dans le descriptif des procédures conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux sur le site d’imagerie, notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées : l’anesthésie gazeuse étant rapidement réversible. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger.
Choix des espèces
Dans les études menées en cancérologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. En outre, le choix de cette espèce se justifie par la taille du cerveau plus importante permettant une implantation de la tumeur et de la sonde de prélèvement plus précise mais également par la nécessité d’obtenir de volumes de prélèvement suffisamment importants. De plus la taille du cerveau de rat offre une meilleur résolution pour l’imagerie. Des rats âgés de 6-8 semaines sont utilisés, à un stade où la taille et la forme du crâne correspond à celle d'un atlas permettant de cartographier le cerveau de rat.
Rôle du transporteur des monocarboxylates 2 (MCT2) dans un modèle murin de démyélinisation du système nerveux central
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
510 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier le rôle d'un transporteur dans la formation de la myéline. Une partie reçoit cinq injections de tamoxifène puis subit une lésion chirurgicale de la moelle épinière sous anesthésie, l'autre, âgée de cinq jours, reçoit les injections avant d'être tuée à divers stades du développement. Le porteur signale des douleurs post-opératoires, un risque d'hémorragie et d'hypothermie et des hématomes liés aux injections répétées, avant prélèvement des tissus. Il présente les modèles murins comme "indispensables" au motif que les cultures et les invertébrés ne reproduisent pas la myélinisation.
Objectifs
Notre projet vise à mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le contrôle de la formation de la gaine de myéline qui protège les neurones dans le système nerveux central. Dans des conditions pathologiques, la formation d’une nouvelle myéline, processus appelé remyélinisation, est importante pour protéger les fibres nerveuses d’une dégénérescence et pour restaurer la conduction rapide de l’influx nerveux. La myélinisation et la remyélinisation sont des processus contrôlés par de nombreux facteurs et signaux, qui sont souvent altérés dans plusieurs maladies comme la sclérose en plaques. Notre hypothèse est que le lactate, via son transporteur, est une source énergétique importante pour la myélinisation et de la remyélinisation. L’objectif de notre projet est de déchiffrer le rôle de ce transporteur dans le processus de la myélinisation dans des conditions physiologiques et pathologiques afin de développer de nouvelles stratégies de thérapie régénérative pour les pathologies de la myéline. L’étude sera menée sur des souris portant des modifications génétiques qui perturbent le fonctionnement de ce transporteur ainsi que sur des souris contrôles. L’étude nous permettra de mieux comprendre l’implication de ce transporteur ainsi que son rôle dans la réparation des lésions de la myéline.
Bénéfices attendus
Il est nécessaire afin de mieux comprendre les mécanismes pathologiques dans les maladies demyélinisantes du système nerveux central, telle que la sclérose en plaques pour laquelle les thérapies régénératives sont encore limitées. Nos recherches pourraient ainsi contribuer au développement des nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Nous utiliserons des souris afin de déterminer le rôle d’une protéine qui semble impliquée dans le processus de myélinisation du système nerveux central. Pour cela nous réaliserons une étude du processus de réparation des lésions de la myéline ainsi qu’une étude au cours du développement du système nerveux central de la souris. Nous allons (objectif 1) réaliser 5 injections de tamoxifène (une injection par jour durant 5 jours ; volume injecté déterminé par pesée quotidienne de l’animal), puis 48h après la dernière injection, nous induirons une lésion de la moelle épinière, sous anesthésie générale et analgésie (une lésion par animal). Cette opération dure 20-30 minutes par souris. Nous utiliserons 210 animaux pour cette étude. La durée totale de la procédure sera au maximum de 30 jours. Après euthanasie des animaux, on procèdera à la récupération des tissus d’intérêt en vue de leurs analyses. Pour l’étude de cette protéine au cours du développement (objectif 2), nous utiliserons 300 animaux. Les animaux, âgés de 5 jours, recevront 5 injections de tamoxifène (une injection par jour durant 5 jours ; chaque injection durant environ 15 secondes). Ils seront ensuite euthanasiés à différents temps expérimentaux afin d’analyser l’impact de la délétion de cette protéine sur la myélinisation.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont majoritairement liées à la chirurgie (lésions démyélinisantes): hypothermie, hémorragie, risque anesthésique, douleurs post-opératoires. Un stress peut aussi être observé chez l’animal à cause de la contention quotidienne et de l’injection d’un produit. Il est notamment possible d’observer l’apparition d’hématomes dus à l’injection répétée de ce produit.
Devenir
Les prélévements et analyses seront réalisés en post-mortem ; cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Les études in vitro et sur animaux invertébrés ne permettent pas l’étude de processus biologiques complexes comme le processus de myélinisation au cours du développement ou la réparation des lésions de la myéline. Le rongeur est donc l’une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude car il présente un système nerveux myélinisé comme chez l’Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux est limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement significatives. Nous prévoyons l’utilisation de 210 animaux pour la procédure de démyélinisation focale afin d’évaluer la remyélinisation et 180 animaux pour réaliser l’étude développementale. Lors de l’étude étude développementale le génotypage des animaux ne pouvant être réalisé avant leur utilisation ; la génération des lots expérimentaux nécessitera l’utilisation de 300 animaux. Soit un total de 510 animaux sur ce projet.
Raffinement
Les conditions d’hébergement (température, hygrométrie, éclairage, bruit et espace) et les conditions d’enrichissements de l’environnement (maison et matériel papier-coton, animaux hébergés en groupe), d’alimentation et de soins quand nécessaire (directive européenne 2010/63/UE) seront contrôlées. Pour éviter toute souffrance aux animaux durant les procédures, ils seront sous analgésie pendant toutes les interventions quand cela s’avérera nécessaire. Durant la procédure de chirurgie, les animaux seront placés sous anesthésie. Les points limites sont ceux définis en amont. Les animaux seront suivis régulièrement par les utilisateurs ainsi que par notre vétérinaire désigné. L’euthanasie de l’animal sera réalisée si l’on observe l’un de ces critères absolus.
Choix des espèces
Pour comprendre le rôle d’une protéine d’intérêt dans la réparation de lésions de la myéline, il est nécessaire de réaliser des études in vivo en condition physiologique. L’utilisation de modèles murins, reproduisant certains aspects des pathologies de la myéline chez l’homme, est donc indispensable pour évaluer la fonction de notre protéine en contexte pathologique et pour identifier de nouvelles cibles d’intérêt thérapeutique. Les animaux utilisés seront âgés de 12 semaines, afin d’avoir atteint une maturité suffisante du système nerveux central (jeunes adultes). De plus, à cet âge, la chirurgie est facilitée par la relative faible masse musculaire des animaux.
Impact d’un stress chronique léger sur la fréquence des transferts de gènes au sein du microbiote intestinal
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
12 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, sans mise à mort prévue, les animaux étant réutilisés ensuite. Elles reçoivent par gavage une dose de bactéries non pathogènes, puis sont soumises à un protocole de stress chronique léger pour tester si le stress de l'hôte augmente les transferts de gènes de résistance aux antibiotiques entre bactéries du microbiote intestinal. Le porteur qualifie les nuisances de légères et l'effectif de douze individus de suffisant. Il affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas la complexité du microbiote et que le remplacement n'est "pas possible".
Objectifs
Le microbiote intestinal est un écosystème microbien complexe dont l'équilibre sont entretenus par un afflux constant de micro-organismes. Sa composition est affectée à la fois par des facteurs intrinsèques tels que la génétique de l'hôte, et des facteurs extrinsèques comme les médicaments ou l'alimentation. De récents travaux, ont également montré que le stress de l’hôte, aigu ou chronique, pouvait avoir des effets profonds sur la composition et l'organisation du microbiote intestinal. Ces modulations peuvent être la conséquence soit de l'action directe des médiateurs du stress libérés dans la lumière intestinale sur les bactéries in situ, soit des modifications de la physiologie intestinale induite par le stress. Le microbiote intestinal est par ailleurs un réservoir majeur de gènes de résistance aux antibiotiques (ARG) dont la dissémination pourrait également être influencée lors d’un stress de l’hôte. En effet, le microbiote intestinal représente un milieu extrêmement propice aux transferts de gènes (notamment des gènes de résistance aux antibiotiques) entre bactéries. En cas d’un stress de l’hôte, les bactéries constituant le microbiote vont se retrouver au contact de concentrations croissantes de marqueurs de stress (noradrénaline, glucocorticoïdes) provoquant des modifications de croissance et de virulence de certaines espèces. De plus, des données in vitro ont démontré que la noradrénaline stimulait le transfert d’un gène d’une souche clinique de Salmonella enterica Typhimurium vers un Escherichia coli. Cet effet est inhibé par l’ajout dans le milieu de culture d’antagonistes des récepteurs adrénergiques. L’ensemble de ces observations suggère que le stress de l’hôte pourrait impacter la fréquence des transferts de gènes dans l’intestin, notamment des ARG, dans un contexte mondial préoccupant quant à l’expansion considérable des bactéries multi-résistantes. A l’heure actuelle, cette observation n’a pas été confirmée in vivo et nous souhaitons explorer cette hypothèse et caractériser l’impact du stress sur la fréquence des transferts de gène de résistance entre les bactéries du microbiote.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus ici permettront de conclure quant à la nature de l’effet d’un stress chronique vis-à-vis des transferts de gènes bactériens (HGT) au sein du microbiote. Ces résultats seront donc tout à fait novateurs. Ces données permettront d’apporter un éclairage sur le rôle des facteurs liés au stress dans l’adaptation et l’évolution de l’écosystème digestif et notamment la mobilisation des gènes de résistance aux antibiotiques au sein du réservoir intestinal, ouvrant ainsi de nouvelles pistes de réflexion quant à la lutte contre la résistance aux antibiotiques. Dans le cas où une stimulation de ces transferts est observée, nous envisagerons de caractériser ultérieurement les voies impliquées dans ces phénomènes.
Procédures
Les animaux recevront une seule administration par gavage. Cette procedure dure 2 secondes par animaux.
Impact sur les animaux
Les souris recevront par voie orale une dose de bactéries donneuses non pathogène. Ce mode d'administration peut générer un léger stress.
Devenir
Les souris de cette étude seront soumises à un léger stress et pourront donc être réutilisées.
Remplacement
Les données in vitro de la littérature montrent un lien entre des molécules telles que les glucocorticoïdes, induites par le stress chronique, sur le transfert de gènes dans une souche bactérienne précise. Néanmoins, ces expériences ne prennent pas en compte la complexité du microbiote intestinal. De plus, le protocole d’induction du stress chronique léger comprend un ensemble de facteurs sociaux et environnementaux plus proche de la réalité physiologique que les modèles in vitro. Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est donc pas possible dans ce contexte. En effet, les effets du stress chronique léger dépendent d’interactions cellulaires, de processus physiologiques et de l’état de l’être vivant. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé que par l’utilisation de modèles in vivo.
Réduction
, la force de l’effet, estimée sur la base de précédents travaux réalisés au laboratoire a été trouvée très importante. Ainsi, pour un seuil de significativité établi à 0.05 et une puissance statistique attendue de 0.80), 6 souris par groupe, seront nécessaires pour valider l’implantation de la souche.
Raffinement
Les cages seront munies d’éléments d’enrichissement (buchettes, sizzlenet), permettant d’offrir aux animaux la possibilité d’évoluer en espaces clos, type de milieu préférentiel chez des rongeurs. L’état des animaux sera évalué quotidiennement par observation de tout comportement pouvant suggérer la présence de mal être chez les animaux de cette étude. Des points limites stricts et spécifiques du projet seront appliqués dans cette étude.
Choix des espèces
De plus, les expériences précédentes du laboratoire sur le transfert de gènes d’une bactérie donneuse au microbiote intestinal ont été optimisées sur le modèle murin de 8 semaines.
Etude des mécanismes d’infections à Escherichia coli productrices de shigatoxines chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier le pouvoir pathogène de bactéries E. coli productrices de shigatoxines. Après un jeûne hydrique, elles reçoivent une à deux inoculations orales de bactéries puis subissent prélèvements de fèces, prises de sang et injections, le groupe infecté par des bactéries pathogènes développant faiblesse, diarrhée et déshydratation. Le porteur décrit des points limites et une mise à mort pour prélever les organes, et indique que le projet est financé par l'Argentine, où le syndrome hémolytique et urémique est le plus fréquent. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune alternative n'est "suffisamment sophistiquée" pour simuler un organisme à plusieurs organes.
Objectifs
Certaines bactéries, appelées STEC, produisent des toxines particulières, qui leur confèrent la capacité à provoquer des infections chez l’homme. Les symptômes liés à ces infections vont de la diarrhée bénigne à des symptômes très graves : hémorragie intestinale, syndrome hémolytique et urémique (SHU). Les principaux modes d’infection sont la consommation d’aliments contaminés, la transmission interhumaine, le contact avec des animaux porteurs. Les infections à STEC constituent un problème majeur en raison de l’extrême sévérité possible des symptômes. Le SHU est la principale cause d’insuffisance rénale aiguë chez l’enfant de moins de 3 ans. La mortalité est de 3-5% et plus d’un tiers des malades ont des séquelles rénales à long terme. L’Argentine a l’incidence la plus élevée au monde de ce syndrome. Comprendre les mécanismes impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC est indispensable pour évaluer le risque pour la santé publique lié à ces bactéries. La toxine produite par les STEC est une protéine formée non par la bactérie mais par un virus qui infecte cette bactérie (phage). Expérimentalement, chez la souris, une STEC infectée par le phage est pathogène. A l’inverse, les STEC chez lesquelles le phage a été éliminé ne sont plus pathogènes. Lorsque les bactéries infectées par le phage se trouvent dans un organisme de mammifère et qu’un stress est induit, les phages sont libérés par la bactérie, peuvent atteindre les organes-cibles (ex : le rein), et produire la toxine qui induit des dommages. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes impliqués dans les infections causées par les bactéries STEC.
Bénéfices attendus
Les bénéfices obtenus sont une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC, en particulier dans la production de la toxine dans l’organisme. L’utilisation de souris dépourvues de microbiote intestinal (axéniques) permettra de s’affranchir des interférences avec les bactéries de ce microbiote à deux niveaux : en évitant la transmission possible du phage à des bactéries du microbiote intestinal ; en évitant un « effet barrière » du microbiote intestinal à l’égard des STEC, qui affaiblirait leur pouvoir pathogène. Les infections à STEC constituent un problème majeur de santé publique en raison de l’extrême sévérité de certains symptômes. La forme la plus grave, le syndrome hémolytique et urémique (SHU), est la principale cause d’insuffisance rénale aiguë chez l’enfant de moins de 3 ans. Si la dialyse a permis de réduire la mortalité, celle-ci reste non négligeable (3-5%) et beaucoup de ces jeunes malades conservent des séquelles rénales à long terme. Comprendre les mécanismes impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC est indispensable pour évaluer le risque pour la santé publique, en particulier lors d’infection par des denrées alimentaires contaminées. Cette évaluation est très importante pour l’Argentine, qui a l’incidence de SHU la plus élevée au monde chez l’enfant, ce qui explique que le présent projet soit financé par ce pays.
Procédures
En début de procédure, les souris sont soumises à un jeûne hydrique de 4 heures, suivi d’une inoculation par voie orale. Les souris ont au maximum 2 inoculations orales à 30 min ou 24 heures d’intervalle. Puis des prélèvements de fèces sont effectués quotidiennement pendant 7 jours. Les animaux auront un prélèvement de sang qui dure 30 secondes environ. Les animaux recevront deux injections qui dureront moins de 30 secondes. Des organes et du sang seront prélevés après analgésie et anesthésie profonde (sans réveil).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues chez les groupes recevant les bactéries sans phage sont réduites. L’inoculation par voie orale sera effectuée à l’aide d’une sonde souple, peu traumatisante, par du personnel très expérimenté, chez des souris préalablement habituées à être prises en main par le manipulateur. Les injections seront également réalisées par du personnel très expérimenté. Les nuisances attendues dans le groupe recevant les bactéries avec phage, donc pathogènes, sont : faiblesse ; possible diarrhée ; possible déshydratation consécutive à la diarrhée et aggravée par la difficulté des souris à s’abreuver du fait de leur faiblesse. Des contre-mesures seront mises en place : ramequins d’aliment gélifié déposés sur la litière pour leur permettre alimentation et abreuvement sans effort physique ; surveillance 3 fois par jour pour détecter l’apparition de symptômes. Des points limites ont été identifiés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. Ceci est nécessaire pour l’obtention des organes et tissus sur lesquels seront pratiquées différentes analyses.
Remplacement
L’analyse des mécanismes du pouvoir pathogène des STEC, qui se traduit par l’envahissement de différents organes par une toxine, n’est actuellement possible que chez des animaux vivants. Il n’existe en effet pas d’alternative suffisamment sophistiquée pour simuler un être constitué de plusieurs organes interagissant entre eux par de multiples voies.
Réduction
L’expérience argentine dans le domaine étudié permet de considérer que 10 souris par groupe sont un effectif suffisant pour comparer des résultats d’immunohistochimie de manière robuste entre groupes. Nous utiliserons donc 10 souris par groupe dans tous les groupes. Dans les groupes inoculés avec la bactérie pathogène, la survenue d’un syndrome infectieux pourra amener à mettre à mort des souris de manière anticipée, si les points limites définis à l’avance sont atteints. Les analyses de tissus seront tentées sur ces animaux. Mais, si l’euthanasie est trop précoce, les résultats pourraient ne pas être comparables à ceux des groupes témoins. Nous prévoyons donc 30 souris supplémentaires, qui seront utilisées si nécessaires. Au total, nous prévoyons d’utiliser 110+30=140 souris.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux de 5 individus par cages, sur une litière de copeaux. Croquettes de nourriture de formulation standard et eau seront distribuées à volonté. Un enrichissement de milieu sera apporté : papier à déchiqueter, buchettes à ronger, tunnel dans lequel se cacher et hamac dans lequel se percher. Cet enrichissement est similaire à celui dont auront préalablement bénéficié les souris dans les cages d’élevage, elles y seront donc habituées. De plus, des ramequins d’aliment gélifié de formulation standard seront déposés sur la litière. Ce raffinement permettra aux souris de pouvoir s’alimenter plus facilement en cas de faiblesse et fatigue. De plus, du sérum physiologique stérile à 37°C pourra être injecté aux souris si elles montrent des signes de déshydratation. Les animaux seront visités 3 fois par jour après l’inoculation bactérienne pour détecter au plus vite de possibles symptômes et décider d’une euthanasie anticipée si les points limites sont atteints. Les bactéries seront administrées par voie orale à l’aide d’une sonde souple, peu traumatisante, par du personnel très expérimenté, chez des souris préalablement habituées à être prises en main par le manipulateur. Toutes les injections seront effectuées par du personnel expérimenté. Préalablement à l’euthanasie des souris, de puissants antalgiques et analgésiques seront administrés.
Choix des espèces
La souris est un modèle établi pour l’étude du pouvoir pathogène des STEC, avec une pertinence démontrée pour la situation humaine. Nous utiliserons des jeunes souris de 3 semaines (semaine suivant le sevrage). Chez l’être humain, les infections à STEC touchent principalement les très jeunes enfants. Nous utilisons en part égale des souris mâles et femelles car la maladie touche indifféremment les deux sexes.
Benefices de l’enrichissement physique chez les poissons en élevage
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
720 loups de mer d'élevage vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 600 réutilisés ensuite et 120 tués pour des prélèvements. Ils subissent quatre biométries mensuelles et un marquage électronique sous anesthésie, un test de prise de risque de 24 heures et des présentations d'objet nouveau, avant qu'une partie soit soumise à un stress de confinement et de simulation de chasse. Le projet compare des bassins avec et sans enrichissement physique pour évaluer croissance, comportement et niveau de stress, dans une visée d'aquaculture. Le porteur présente le bien-être des poissons comme l'objet de l'étude tout en la rattachant à la production piscicole, et affirme que le remplacement est "impossible" pour mesurer l'adaptation in vivo.
Objectifs
Ce projet s'inscrit dans un plus vaste projet visant à développer des méthodes innovantes qui permettront d'améliorer le bien-être des poissons en élevages expérimentaux proches des conditions de production en vu d'une possible application ultérieure par les professionels de l'aquaculture. Des poissons marins (Dicentrarchus labrax) en phase de prégrossissement (dans leur deuxième année d'âge) seront élevés avec ou sans enrichissement physique. Ce projet se propose de tester si l'utilisation d'enrichissement environnemental dans les bassins d'élevage permet de 1) diminuer la réponse aux facteurs de stress et 2) d'améliorer le niveau de bien-être, la croissance et l'état corporel.
Bénéfices attendus
Les données (croissance, comportement) seront intégrées avec les données de physiologie (principalement axe du stress) pour révéler les effets bénéfiques de l’enrichissement. Les résultats soutiendront l'aquaculture durable, en permettant la mise en place de programmes d’enrichissement de l’environnement inexistants à ce jour.
Procédures
Dans cette procédure les animaux seront soumis à quatre biométries mensuelles sous anesthésie (durée de manipulation < 2 min par individu), un marquage électronique sous anesthésie (
Impact sur les animaux
Les nuisances et les effets indésirables sont a priori limités: le marquage avec PIT Tag est bref et équivalent à une piqûre intramusculaire. Les évaluations comportementales sont toutes faites par vidéo dans les bassins d'élevage i.e. pas de manipulations des animaux en dehors des quatre biométries sous anesthésie. Les conditions d'élevage en captivité ont été optimisées pour cette espèce.
Devenir
A la fin de la procédure 1, 120 individus seront euthanasiés afin de prélévements; les 600 individus restant seront replacés en bassin d'élevage.
Remplacement
Le remplacement est impossible pour ces recherches qui impliquent la mesure in-vivo du comportement d'adaptation à l'enrichissement environnemental physique chez l’espèce d’intérêt aquacole, Dicentrarchus labrax.
Réduction
Pour constituer une preuve de concept des effets bénéfiques un nombre suffisant d'individus a été choisi afin d’obtenir des interactions sociales entre les individus (le bar est un animal grégaire) et pour avoir un échantillon représentatif des comportements et des réponses à l'enrichissement (croissance, distribution horizontale, réponse à la nouveauté, niveau de stress).
Raffinement
Tout sera mis en place dans le cadre de la procédure pour limiter la souffrance et le stress des animaux. Pendant le marquage et les biométries nous utiliserons une procédure d'anesthésie optimisée pour cette espèce. Durant les phases d’élevage, les poissons seront en condition optimale d’alimentation (ad libitum alimentaire). La luminosité du bassin sera réglée afin d’optimiser l’apaisement des poissons avec l’utilisation d’un cycle correspondant à un ensoleillement avec 14 heures de jour et 10 heures de nuit comprenant une phase d’aube et de crépuscule.
Choix des espèces
Dicentrarchus labrax est une espèce d’importance majeure pour la pisciculture européenne. Pouvoir mesurer en conditions d’élevage les bénéfices que pourraient apporter l'enrichissement physique dans les bassins est une étape afin d’améliorer le bien-être en pisciculture. Il s'agit de poissons au stade juvénile, immatures et dont le sexe n'est pas déterminable extérieurement, le sex ratio est estimé autour de 50%. Ce stade de développement permet de mesurer une évolution significative de leur croissance, possiblement différente selon le traitement (enrichi vs. non enrichi).
Elevage de lignées murines transgéniques avec génotypage par méthodes invasives
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système respiratoire
62 764 souris vont être utilisées dans une procédure d'identification et de génotypage impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit un tatouage aux doigts et une amputation du bout de la queue sans anesthésie, la contention constituant la principale source de stress. Le devenir dépend du génotype, une partie rejoignant d'autres protocoles ou l'élevage, une autre étant tuée dès le sevrage faute d'utilisation possible ou une fois trop âgée pour la reproduction. Le porteur affirme que les prélèvements salivaires ou pileux ne sont pas assez fiables et présente le tatouage et la biopsie de queue comme les seules méthodes "aussi performantes".
Objectifs
L'objectif de cette demande est d’identifier et de caractériser génétiquement les animaux. Ces animaux sont identifiés par tatouage aux doigts et caractérisés à l’aide du prélèvement du bout de la queue. Cette DAP d’identification et de génotypage se justifie par la nécessité de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour l’expérimentation (inclus dans d'autres DAP) - sélectionner les animaux d'entretien des colonies - sélectionner les animaux pour • la formation, • le maintien des compétences, • les prélèvements d’organes ou de tissus pour des études ex vivo (hors champ de DAP).
Bénéfices attendus
Le génotypage est une étape nécessaire pour déterminer quels sont les animaux dont le génotype est pertinent pour mener à bien les expérimentations, dans le but de trouver des thérapies innovantes qui puissent être transposées en recherche clinique. L’identification par tatouage permet : - d’identifier individuellement les animaux ; - d’identifier un grand nombre d’animaux ; - d’identifier les animaux de manière permanente ; - de ne pas mutiler les animaux ; - d’éviter le recours à l’anesthésie. Le génotypage par biopsie de l’extrémité de la queue permet : - l’obtention de résultats fiables; - de minimiser les risques de contaminations entre échantillons ; - d’éviter le recours à l’anesthésie.
Procédures
Les animaux de cette DAP seront soumis à deux gestes techniques invasifs consécutifs: 1/ l'identification par tatouage digital: 1 fois, durée de quelques secondes 2/ biopsie de queue: 1 fois, durée de quelques secondes
Impact sur les animaux
La procédure de génotypage décrite dans cette DAP est composée de deux actes techniques invasifs : - le tatouage au niveau des phalanges et/ou des coussinets - la biopsie de queue, qui consiste en un prélèvement de l’extrémité de la queue. Ces deux gestes provoquent une très légère douleur. L’animal est maintenu en contention pendant les deux actes et donc tout au long de la procédure ce qui est une source de stress.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de cette unique procédure, puis leur devenir est différent selon leur génotype: a/- ils sont prévus pour expérimentation, formation ou maintien des compétences (inclus dans d'autres DAP): utilisation continue b/- ils sont sélectionnés pour entretien des colonies, puis mis à mort lorsque trop âgés ou mauvais reproducteurs c/- ils sont utilisés ex vivo, donc mis à mort avant utilisation (hors champs DAP) d/- ils sont mis à mort dès sevrage si aucune utilisation possible au vu de leur génotype e/- ils sont mis à mort à tout moment si atteinte d'un point limite (par décapitation ou dislocation cervicale selon l'âge)
Remplacement
Les méthodes alternatives à l'expérimentation animale se développent de plus en plus, cependant pour certaines problématiques telles que l'étude de phénomènes physiologiques elles restent incomplètes et insuffisantes, puisqu'elles ne mettent pas en jeu toutes les interactions au sein d'un organisme vivant. A ce jour, les prélèvements salivaires et pileux pour génotypage ne sont pas suffisamment fiables. Il n’existe donc pas d’autres méthodes aussi performantes que les tatouages et la biopsie de queue.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces nous permettant de sélectionner les animaux transgéniques. Le responsable de l’EU établi les plans d’élevage en amont, en concertation avec le porteur de projet, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux identifiés et génotypés. En outre, nous favorisons l’utilisation des animaux au génotype sans intérêt dans d’autres projets ou des formations afin de ne pas élever ces animaux à ces seules fins et de réduire le nombre d’animaux global produits dans l’EU. De la même façon, certains animaux non utilisés dans les projets sont conservés avec d’autres animaux qui auraient été isolés sans cela.
Raffinement
Les actes d’identification et de génotypage sont réalisés par un personnel expérimenté à jour de ses formations. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Ces identifications et génotypages des animaux sont réalisés avec du matériel adapté en respectant les conditions d’asepsie établies dans l’établissement. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère.
Choix des espèces
Au sein de notre EU les équipes de recherche utilisent le modèle souris pour sa facilité de manipulation technique, génétique, la rapidité de production de lots expérimentaux, et le grand nombre de pathologies humaines qu'il est possible de modéliser. Les animaux sont identifiés et prélevés entre 7 et 12 jours selon la règlementation européenne.
Etude de l’impact de l’exposition séquentielle à différents pathogènes sur les capacités fonctionnelles du système immunitaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une à quatre immunisations par injection sous anesthésie et autant de prélèvements de sang, pour recréer des expositions successives à des pathogènes et étudier la maturation du système immunitaire. Le porteur annonce peu de douleur, avec une perte de poids transitoire et parfois du sang dans les fèces, puis une mise à mort pour prélever les organes. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode ne reproduit ce qui se passe dans un "organisme entier" et conclut au caractère "obligatoire" du recours à la souris.
Objectifs
Au cours de sa vie, l’Homme est infecté par une quantité d'agents pathogènes (bactéries, virus, etc…). Cette exposition aux microbes de l’environnement, façonne notre système immunitaire au cours du temps et modifie probablement ces propriétés. Cependant, de façon surprenante, la majorité des études sur le système immunitaire sont basés sur des souris élevées dans des conditions d’hygiène très strictes et très contrôlées. Ces animaux exemptes de pathogènes sont actuellement la référence pour les études scientifiques et pour les tests précliniques. Récemment, plusieurs travaux suggèrent que l'élevage de souris dans un environnement sans agents pathogènes a des effets importants sur l’état de maturation du système immunitaire. En effet, il a été montré que le système immunitaire des souris de laboratoire est proche de celui d’un nouveau-né, alors que le système immunitaire de souris vivants dans la nature est lui, proche et représentatif d’un humain adulte. Dans ce contexte, les différences observées entre souris de laboratoire et souris issues de milieu sauvage, font des souris de laboratoire un modèle inadapté pour les études précliniques et soulignent la nécessité de nouveaux modèles murins qui intègrent des variables environnementales. Ainsi, ce projet vise à tout d’abord à comprendre l’impact, sur le système immunitaire, d’une exposition successive à différents pathogènes qui mimerait ce que l’Homme subit au cours de sa vie. Puis, dans un second temps, ce projet permettra également mieux comprendre les maladies liées à un dérèglement du système immunitaire comme les maladies auto-immunes et le lupus en particulier.
Bénéfices attendus
Cette étude originale permettra d’améliorer la compréhension des réponses immunitaires anti-infectieuses et d’améliorer les modèles murins actuels de maladie humaine. En effet, ce projet permettra de développer un modèle murin reflétant plus justement le système immunitaire humain adulte et qui intègre des variables environnementales. De plus, les résultats obtenus permettront de mieux caractériser les dysfonctionnements du système immunitaire liés aux pathologies auto-immunes comme le lupus.
Procédures
Les animaux seront soumis à des immunisations (injections, 10 secondes) 1seule fois/animal, ou 4 fois/animal et seront réalisées sur animaux anesthésiés . Des prélèvements de sang seront réalisés sur animaux anesthésiés (10 secondes - 1 seule fois/animal , ou 4 fois/animal avec un mimimum de 14 jours d'intervalle entre les 2 prélevements).
Impact sur les animaux
Peu de douleur est attendue au cours des procédures réalisées. Peu de douleur également attendue au cours des prélèvements de sang. Cependant, une legere perte de poids transitoire peut etre observé après immunisation. De facon rare, des féces molles ou du sang dans les feces peuvent également être observé au cours de la procédure.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort afin de prélèver les organes et d'étudier plusieurs paramètres immunologiques.
Remplacement
Le but de ce projet est de comprendre comment une exposition antérieur à des pathogenes peut génerer des cellules spécifiques protectrices qui vont infiltrer les tissus et y résider de facon permanente. Il n’est pas possible de mimer cette réponse physiopathologique dans un modèle in vitro et aucune autre alternative ne peux mimer ce qui se passe dans un organisme entier, de ce fait l’utilisation d’un model in vivo est obligatoire pour comprendre ce mécanisme.
Réduction
Un nombre minimum de souris nécessaire à une analyse statistique sera utilisé en prenant en compte la variabilité inter-individuelle. Ainsi, 5 animaux par groupe seront néccessaire. Un test statistique sera réalisé permettant la comparaison de 2 groupes avec un faible nombre d’échantillons, et aucune hypothèse n'est présupposée.
Raffinement
Une semaine d'acclimatation sera réalisée avant la mise en place de chaque expérience. A la réception, des groupes seront réalisés et maintenus tout au long de la procédure pour créer des groupes sociaux et éviter le stress dû à l'isolement. Des enrichissements de l’environnement (composants de nidification et igloo) seront apportées. Précautions particulières : - Immunisation par les différents pathogenes : Les immunisations sont réalisées sous brève anesthésie. Aucun signe clinique, n’est attendu suite à l’immunisation. Néanmoins, afin de s’assurer qu’aucun signe de souffrance ne soit observé, les animaux seront pesés quotidiennement les 7 jours suivant l'immunisation et feront l’objet d’une surveillance dans les minutes qui suivent l’injection, le lendemain, puis chaque semaine.
Choix des espèces
Parmi les différentes espèces animales utilisées en expérimentation, la souris est l’animal le mieux adapté pour le développement de modèles immunologiques. En effet, bien qu’il existe certaines différences entre l’immunologie murine et humaine, d’innombrables découvertes faites chez la souris s’avèrent transposables chez l’humain. Les souris seront âgées de 6-10 semaines au démarrage de l’expérience car le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant.
Étude du rôle d’ApoE4 sur les altérations du protéome synaptique menant à la dégénérescence synaptique dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 425 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier les protéines des synapses dans un modèle de maladie d'Alzheimer. Une partie sert à créer et maintenir les lignées et reste vivante à l'animalerie, l'autre est tuée après biopsie de l'oreille, gavages et prélèvement du cerveau. Le porteur signale qu'environ 15 % des souris du modèle développent une paralysie des membres postérieurs vers 7 à 8 mois. Les bénéfices thérapeutiques annoncés sont renvoyés au 'moyen/long terme'.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer (MA) est la principale maladie neurodégénérative dans le monde et pour laquelle il n’existe aucun remède à ce jour. Dans la MA, les synapses (zone de contact entre deux neurones où a lieu la transmission du message nerveux) dégénèrent progressivement, menant aux troubles de mémoire bien connus dans la MA. L'apolipoprotéine E (ApoE) est une protéine essentielle aux fonctions synaptiques. L'isoforme E4 d’ApoE (ApoE4) augmente fortement le risque de développer la MA. Bien que nos études précédentes aient pu montrer qu’ApoE4 exacerbe la perte synaptique, on ne se sait pas exactement comment. Déterminer comment ApoE4 contrôle la dégénérescence des synapses dans la MA est essentiel pour comprendre la maladie, mais nécessite une caractérisation fine des fonctions ApoE4 au niveau des synapses. Ce projet testera l'hypothèse selon laquelle ApoE4 aggrave la perte synaptique dans la MA par l’intermédiaire des astrocytes (cellules nourricières des synapses) et des microglies (cellules immunitaires du cerveau). Nous voulons identifier comment ApoE4 et les microglies modifient les protéines dans les synapses mais également qui produit ces protéines : le neurone lui-même, ou l’astrocyte, connu pour son interaction étroite avec les synapses. Nous utiliserons des souris P301S, l’un des rares modèles de MA à reproduire la perte synaptique comme observée dans la MA. J'analyserai les protéines synaptiques spécifiquement produites par des neurones ou par des astrocytes chez ces souris. Cette étude nous permettra d'identifier précisément comment ApoE4 et les microglies modifient les protéines dans les synapses endommagées par la MA, ainsi que l'origine cellulaire de ces protéines (neurone ou astrocyte).
Bénéfices attendus
Nous espérons que ce projet nous apportera : A court/moyen terme : Une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux menant à la dégénérescence synaptique dans la MA et le rôle d’ApoE4, des astrocytes et des microglies dans ce processus pathologique. A moyen/long terme : Le développement de stratégies thérapeutiques originales et innovantes basées sur la régulation des activités d’ApoE4 et des microglies pour préserver un échange astrocyte/synapse physiologique et qui pourraient apporter des solutions thérapeutiques chez l’homme. La population européenne vieillissant, le nombre d'Européens atteints de la maladie d'Alzheimer doublera presque d'ici 2050, soulignant l'urgence de développer des traitements efficaces pour arrêter ou au moins retarder la maladie d'Alzheimer avant qu'elle n'atteigne des proportions épidémiques. À cet égard, on estime qu'un traitement qui retarde l'apparition de la MA de 5 ans réduirait automatiquement le nombre de cas de 50 %.
Procédures
- Une biopsie rapide de l'oreille (2 secondes) - Des traitements par gavage oral 1 fois/24 h pendant 5 jours continus, et dans une diète purifiée pendant un mois et dans l'eau de boisson pendant 2 semaines) - Une euthanasie sous anesthésie/analgésie par injection (unique).
Impact sur les animaux
Le gavage oral ne se fait pas sous anesthésie mais sera fait par des experts animalier afin de réduire le stress des souris lors de la procédure et seront faites sur un temps répété relativement court de 5 jours (un gavage par jour). Les souris porteuses du transgène P301S peuvent développer plusieurs phénotypes dommageables qui seront discutés dans la procédure et pour lesquels des points limites stricts seront établis. Les souris peuvent perdre du poids avec le traitement ANL.
Devenir
Pour la partie du projet permettant la création et maintien de lignées de souris à phénotype dommageable, une partie des souris sera gardée afin de maintenir les lignées à l'animalerie, l'autre partie sera utilisée pour la partie du projet avec les traitements, perfusion et prélèvements des tissus. Pour la partie du projet avec les traitements, perfusion et prélèvements des tissus, tous les animaux seront mis à mort pour prélever le cerveau qui doit être analyser.
Remplacement
Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants, ces modèles n’offrent que des informations "physiopathologiques" très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. En ce sens, la dégénérescence synaptique est très difficile à obtenir in vitro. Ces souris P301S représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie d’Alzheimer car c’est l’un des rares modèles de la MA qui développent une dégénérescence synaptique et une atrophie cérébrale, comme observées chez les patients MA et responsables des troubles cognitifs. Puisque le but principal est de comprendre et combattre la dégénérescence synaptique dans la MA, nous devons utiliser un modèle qui développe une perte synaptique similaire à celle présente chez les patients atteints de la MA. Les modèles MA in vitro (culture cellulaire ou organoïdes) actuels ne développant pas (ou très peu) de perte synaptique, nous nous tournons donc vers ce modèle murin.
Réduction
Afin de calculer au plus juste l'effectif des lots d'animaux, nous avons effectué un calcul des effectifs nécessaires grâce à plusieurs tests statistiques. Du fait de la variabilité pathologique précédemment rapportée entre mâles et femelles dans le modèle P301S, nous n’utiliserons que les mâles afin de réduire la variabilité au sein des groupes et ainsi le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons les mâles car ils développent une perte synaptique plus tôt par rapport aux femelles. Les seules femelles utilisées seront celles nécessaires à la création et au maintien des différentes lignées de souris pour la reproduction. Nous avons conscience que l’utilisation des deux sexes serait un atout scientifique mais le nombre d’animaux nécessaires serait bien trop important d’un point de vue éthique. Nous proposons donc de faire cette étude exploratoire chez les mâles. Dans le futur, lorsque les mécanismes liant ApoE4 à la perte synaptique seront établi chez les mâles, nous ferons une nouvelle demande auprès du comité d’éthique afin de confirmer (ou non) les résultats principaux découverts chez les mâles sur une petite cohorte de femelles.
Raffinement
Les souris seront hébergées sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi (alternance entre dômes de plexiglass et dômes en papier, accompagné de Nestlets en coton). Les animaux seront sous la responsabilité de personnels animaliers expérimentés. Une observation quotidienne des animaux sera effectuée pour s’assurer de leur bien-être. Les souris peuvent perdre du poids avec le traitement; Au-delà de 20% de perte de poids pendant l'expérience, la souris sera euthanasiée. Les souris P301S développant des phénotypes dommageables, des points limites stricts seront établis afin de réduire les nuisances causées aux animaux. Pour ces points limites, l’animal sera euthanasié. Environ 15% des souris P301S développeront une paralysie des membres postérieurs à partir de l'âge de 7-8 mois.
Choix des espèces
Les souris P301S constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles de la MA, ainsi que comme modèle pré-clinique pour tester des molécules thérapeutiques potentielles. De plus, la dégénérescence synaptique responsable des troubles cognitifs dans la MA est très difficilement modélisable in vitro et nécessite des modèles transgéniques exprimant des protéines humaines mutées. Pour étudier l’impact d’ApoE4 sur la dégénérescence synaptique, nous utiliserons des souris sauvages et des souris génétiquement modifiées (P301S) exprimant la protéine tau humaine mutée. Ces souris développent une perte synaptique et des troubles cognitifs comme chez les patients MA. Les souris P301S croisées avec des souris transgéniques exprimant les isoformes humaines ApoE2, ApoE3 ou ApoE4 dans un précédent projet, seront utilisées pour l'étude. Pour la procédure 1, les souris seront utilisées pour la reproduction dès 8 semaines. Pour la procédure 2: - Toutes les souris de la procédure 2 seront traitées par gavage à l’âge de 4 mois permettant ainsi l’expression d'une molécule par les neurones ou par les astrocytes. - Une cohorte sera utilisée à 7 mois (avec traitements 1 mois et 2 semaines avant) afin d'évaluer les stades précoces de la dégénérescence synaptique dans ce modèle - Une cohorte sera utilisée à 10 mois (avec traitements 1 mois et 2 semaines avant) afin d'évaluer les stades tardifs de la dégénérescence synaptique dans ce modèle