Recherche fondamentale

2 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour optimiser des combinaisons de radiothérapie, nanoparticules, chimiothérapie et immunothérapie. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau et des prises de sang sous anesthésie, les tumeurs pouvant former des nécroses et ulcérations douloureuses. Le porteur indique qu'environ 75 % des souris seront tuées après un point limite ou une progression tumorale dès la première procédure, le reste à l'issue de la seconde. Le modèle de souris immunocompétente est présenté comme 'indispensable' pour reproduire un 'organisme entier'.

Objectifs

Nous proposons d’optimiser les combinaisons à base de Radiothérapie avec des Nanoparticules et/ou des immunothérapies et/ou des chimiothérapies. L’efficacité de ces traitements sera évaluée par suivi du volume des tumeurs traitées et par étude de la réponse immunitaire à partir d’échantillons sanguins. L’objectif de ces expérimentations est de constituer des bases solides nécessaires aux développements d’essais cliniques en évaluant l’efficacité des combinaisons présentant les meilleurs efficacités en préclinique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices sont cliniques avec l’optimisation et la sélection des meilleurs schémas de combinaison à base de radiothérapie, nanoparticules et ou immunothérapies pour traiter des cancers localisés ou métastatiques.

Procédures

- Injection sous cutanée de cellules tumorales - Prélèvement sanguin sous maxillaire - Ces deux types d’interventions seront réalisés sous AG gazeuse (Isoflurane 2.5%)

Impact sur les animaux

Les tumeurs formées par certains types de cellules peuvent former fréquemment des nécroses/ulcération en surface qui peuvent entrainer une douleur évaluable par palpation de la tumeur Aucun effet secondaire ou nuisance dû aux prélèvements sanguins en sous maxillaire n’est attendu. Ce geste est couramment réalisé par les membres de notre équipe.

Devenir

A l’issue de la procédure N°1 : environ 75% des animaux auront été mis à mort après atteinte d’un point limite ou parce que leur tumeur est en progression. Les 25 autres pourcents des animaux seront pris en charge dans la procédure N°2 A l’issue de la procédure N°2 : tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Etant donné que nous allons évaluer l’effet de la radiothérapie sur l’activation de cellules immunitaires, il nous est nécessaire de réaliser notre étude sur des modèles animaux présentant un système immunitaire actif. Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour cette étude. Toutefois l’étude préalable des molécules d’intérêts sur des cellules en culture nous a permis de nous affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée (REMPLACEMENT)

Réduction

La formation de tumeur par les types de souris qui seront utilisés dans ce projet, se fait de façon homogène, permettant l’utilisation d’un nombre d’animaux relativement réduit pour répondre aux questions scientifiques posées. Afin de pouvoir traiter dans un même groupe des tumeurs de tailles comparables, il faut prévoir seulement 20% d’animaux supplémentaires au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules de cancer de souris permet de pouvoir travailler avec des souris au système immunitaire actif sans entrainer de rejet des tumeurs. Ainsi, nous pouvons étudier les effets de nos traitements à la fois sur la croissance des tumeurs mais aussi sur les cellules immunitaires. Afin de garantir la fiabilité de nos résultats il est nécessaire de réaliser les expérimentations 3 fois.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupe dans des cages de taille adaptées et en présence d’enrichissement (matériel leur permettant de constituer un « nid »). Les combinaisons des traitements par radiothérapie, nanoparticules, chimiothérapie et/ou immunothérapie ont déjà été réalisées dans ces conditions dans notre équipe sans entrainer de toxicités particulières. Cependant si des signes de douleur sont observés (animal prostré, perte d’orientation, perte de poids …), les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse. Toutes les manipulations susceptibles de générer de l’inconfort ou de la douleur aux animaux seront réalisées sous anesthésie générale. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance des animaux.

Choix des espèces

La petite taille des souris, leur grande fécondité, leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font un animal de choix pour les laboratoires. De plus, le modèle de souris est indispensable car les expérimentations sur cellules en culture ne permettent pas de simuler la complexité d’un organisme entier, notamment dans les études impliquant l’activation du système immunitaire. La formation de tumeur par les souris qui seront utilisées dans ce projet est homogène et maitrisé par notre équipe. Ceci permet de limiter la quantité de souris injectées par des cellules tumorales pour constituer des groupes de traitement avec un volume de tumeur comparable. Les souris utilisées seront de 8 semaines minimum, âge adulte de manière à avoir un système immunitaire mature et un poids corporel plutôt stable > 20 g, ainsi qu’une bonne tolérance aux anesthésies, d’après les données de la littérature.

700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier l'épuisement des cellules immunitaires NK en contexte tumoral. Elles reçoivent des injections rétro-orbitaires et intraveineuses de cellules de lymphome, certaines lignées formant des tumeurs dans la rate, la moelle osseuse et le foie et provoquant des troubles locomoteurs des membres postérieurs dès le 14e jour. La rate est prélevée après mise à mort. Le porteur indique anticiper ces signes pour tuer les animaux avant leur apparition et évaluer leur état par un test d'agrippement aux barreaux de la cage.

Objectifs

Les cellules Natural Killer (NK) sont des cellules de l’immunité spécialisées dans la lutte contre les pathogènes intracellulaires (virus et bactéries) et contre les cellules tumorales. Au cours de la progression tumorale, les cellules NK perdent leurs fonctions de contrôle des cellules tumorales. Ainsi, ces dernières échappent alors au contrôle immunitaire et prolifèrent. Il a été mis en évidence que ce phénomène est induit lors d'une stimulation chronique des cellules NK par les cellules tumorales. Cette stimulation chronique mène à l'activation chronique d'un flux calcique . Ce flux calcique chronique conduit alors à la perte des fonctions des cellules NK (elles s'épuisent). Cependant, le calcium entre en jeux dans de nombreux mécanismes intracellulaires et les mécanismes sous-jacents menant à l'épuisement des cellules NK restent inconnus. L'objectif de ce projet est d'étudier le rôle dans l'épuisement des cellules NK de différents acteurs du flux calcique afin de générer des cellules NK résistante à cet état dans le but de concerver des fonctions de contrôle des cellules tumorales. Pour cela, un modèle établi d'épuisement des cellules NK chez la souris sera utilisé. Celui-ci est basé sur 4 lignées de lymphomes (appelées RMA) stimulant plus ou moins fort les cellules NK (RMA : peu stimulante ; RMA-Rae-1b : plus stimulante que les RMA ; RMA-KO : plus stimulantes que les RMA-Rae-1b et RMA-KR : très fortement stimulantes). Ces 4 lignées tumorales permettent la génération de cellules NK avec un profil d'épuisement plus ou moins prononcé permettant ainsi d'étudier le rôle de différents acteurs à la fois dans l'établissement ainsi que le maintien de l'épuisement des cellules NK. Pour cela, les gènes testés seront inactivés dans des cellules NK primaires. Ces cellules modifiées seront re-transférées dans des souris receveuses de souche Rag2-/-yc-/- ne possédant pas de cellules NK. Ces souris recevront alors les différentes lignées tumorales et la fonction des cellules NK sera évaluée.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d'étudier et de trouver des cibles permettant de bloquer l'épuisement des cellules NK en contexte tumoral. Des résultats satisfaisant pourraient ouvrir des profits scientifiques en santé humaine notamment dans le cadre de thérapies cellulaires utilisées dans le traitement des cancers. Ces résultats pourraient ainsi avoir une portée à moyen-long terme au vu des nombreuses étapes nécessaires avant l'élaboration d'un traitement applicable en santé humaine.

Procédures

Les injections rétro-orbitales seront réalisées sous anesthésie à l'isofluorane et de la Tétracaïne sera appliquée. L'anesthésie dure 2 minutes alors que la réalisation de l'injection rétro-orbitale dure moins d'une minute. Les injections intra-veineuse seront réalisée sur des souris mises sous lampes chauffantes durant 20 minutes, dans la veine caudale sur souris vigile, geste durant moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Ce modèle d'étude a été mis au point et est finement caractérisé . Cette connaissance approfondie permet de prédire les jours auxquels les cellules NK sont épuisées tout en limitant la souffrance des animaux. Les complications éventuelles peuvent être liée à l’injection des cellules tumorales si celle-ci se passe mal (injection intra-dermique ou veine caudale transpercée empêchant l'injectionen intra-veineuse). En effet, lors d'une injections IV, les cellules de type RMA forment des tumeurs de façon concommitante dans la rate et la moelle osseuse puis dans d’autres organes tels que le foie, ce qui est source de souffrance pour l'animal. D’après les connaissances de ce modèle, les souris injectées avec les lignées tumorales RMA-KR présentent des troubles locomoteurs des membres postérieurs à partir du Jour 14 post-injection (premier signe visible). Ceci, ainsi que la validation du test d'aggrippement aux barreaux de la cage permet l'évaluation de leur état de santé. Cependant, cette connaissance approfondie du modèle permet d'anticiper ces signes précoces et ainsi de réaliser l'expérience avant même l'apparition des ces signes tout en ayant des cellules NK épuisées.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude ou avant si un point limite est atteint. Nous prélevons la rate des souris, organe riche en cellules NK, afin de réaliser nos analyses, il est donc impossible de ne pas sacrifier les animaux.

Remplacement

Les gènes candidats sélectionnés l'ont été sur la base d'expériences in vitro sur des modèles d'épuisement très simplifiés (ne comportant pas de cellules tumorales). Afin de tester la relevance physiologique réelle de ces candidats il est nécessaire de passer par un modèle d'étude chez l'animal afin de prendre en compte les multiples interaction cellulaires ainsi que l'environnementales mises en jeux lors d'une réponse anti-tumorale.

Réduction

La réalisation de la première procédure permettra d'obtenir des résultats interprétables sur les animaux inclus dans les procédures 2 et 3. La procédure 3 étant conditionnée aux résultats obtenus au cours de la procédure 2, cela permet de réduire potentiellement le nombre d'animaux utilisés. Un test statistique permet de limiter le nombre d'animaux à 10 par groupe. Les expériences n'auront ainsi pas besoin d'être répétées en suivant cette approche statistique, dans un but de réduction. Les groupes étant homogènes cela participe à un effort de réduction car les expériences ne seront pas répétées. Enfin l'utilisation de souris d'un large éventail d'âge et indépendamment de leur sexe supporte le but de réduction.

Raffinement

Ce modèle d'étude a été mis au point finement caractérisé. Cette connaissance approfondie permet de prédire les jours auxquels les cellules NK sont épuisées tout en limitant la souffrance des animaux. Les souris développent une gène des fonctions locomotrices postérieures due à la pousse tumorale dans la moelle osseuse. Ce signe précoce précède la dégradation de l'état général de l'animal. D’après les connaissances de ce modèle, les souris présentant ce signe précoce possèdent des cellules NK épuisées. En cas d'apparition de ce signe sur un animal avant le jour prévu de mise à mort, tout le groupe sera mis à mort. Les groupes étant très homogènes, un tel mode opératoire permet d'obtenir des données interprétables et donc de réduire la variation intra-expérience. Enfin, afin de parer à toute éventualité, les expérimentateurs se tiedront prêt à réaliser l'expérience les jours précédant la mise à mort. Une anesthésie à l'Isofluorane sera effectuée lors de l'injection des cellules NK génétiquement modifiées par voie rétro-orbitale dans le but de réduire le stress des souris. De plus, des visites seront effectuées tous les trois jours au début du protocole puis une surveillance accrue, visite matin et soir, sera réalisée les 3 jours précédents la date de mise à mort des animaux dans le but d'anticiper le moindre signe de souffrance. Enfin, des croquettes humidifiées seront placées dans la cage afin d'en facilité l'accès par les animaux. Des points limites prédictifs de la pousse tumorales ont été établis. Si une souris présente un des ces points limites, l’ensemble du groupe sera mis à mort.

Choix des espèces

Les cellules NK ne sont présentes que chez les mammifères. Parmi ceux-ci, la souris est un modèle de choix. D'une part, et bien qu'il existe certaines différences entre l'immunologie murine et humaine, d'innombrables découvertes chez la souris sont transposables chez l'homme. D'autre part, la richesse des souches murines génétiquement modifiées et des réactifs disponibles permet une compréhension très approfondie des phénomènes mis en jeu du niveau moléculaire au niveau de l'organisme, un atout déterminant dans ce projet. Des souris âgées de 8 à 28 semaines seront utilisées pour les expérimentations. Lors de l'établissement du modèle d'épuisement des cellules NK in vivo aucune différences n'a été observée dans cette tranche d'âge. De plus, c'est à partir de l'âge de 8 semaine que les souris ont un système immunitaire mature (ici elles n'en ont pas mais cela permet de comparer directement avec les résultats préliminaires).

458 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier le rôle de la protéine ApoE4 dans la dégénérescence des synapses. Elles reçoivent une injection rétro-orbitaire et sept injections sous-cutanées, ainsi qu'un régime déplétant les microglies pendant un mois, avant mise à mort pour prélever le cerveau. Le porteur signale que les injections rétro-orbitaires peuvent provoquer une cécité ou une tumeur locale et qu'environ 15 % des souris du modèle développent une paralysie des membres postérieurs. Les bénéfices thérapeutiques sont renvoyés au 'moyen/long terme'.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer (MA) est la principale maladie neurodégénérative dans le monde et pour laquelle il n’existe aucun remède à ce jour. Dans la MA, les synapses (zone de contact entre deux neurones où a lieu la transmission du message nerveux) dégénèrent progressivement, menant aux troubles de mémoire bien connus dans la MA. L'apolipoprotéine E (ApoE) est une protéine essentielle aux fonctions synaptiques. L'isoforme E4 d’ApoE (ApoE4) augmente fortement le risque de développer la MA. Bien que nos études précédentes aient pu montrer qu’ApoE4 exacerbe la perte synaptique, on ne se sait pas exactement comment. Déterminer comment ApoE4 contrôle la dégénérescence des synapses dans la MA est essentiel pour comprendre la maladie, mais nécessite une caractérisation fine des fonctions ApoE4 au niveau des synapses. Ce projet testera l'hypothèse selon laquelle ApoE4 aggrave la perte synaptique dans la MA par l’intermédiaire des astrocytes (cellules nourricières des synapses) et des microglies (cellules immunitaires du cerveau). Le rationnel derrière cet objectif est d'identifier les protéines à l'interface astrocytes/synapses et comment elles sont affectées par ApoE4 et les microglies. Pour cela, nous marquerons et identifierons les protéines à l'interface neurone-astrocyte. Nous utiliserons des souris transgéniques P301S qui reproduit la dégénérescence synaptique comme observée chez les patients MA.

Bénéfices attendus

Nous espérons que ce projet nous apportera : A court/moyen terme : Une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux menant à la dégénérescence synaptique dans la MA et le rôle d’ApoE4, des astrocytes et des microglies dans ce processus pathologique. A moyen/long terme : Le développement de stratégies thérapeutiques originales et innovantes basées sur la régulation des activités d’ApoE4 et des microglies pour préserver l'interaction astrocyte/synapse et qui pourraient apporter des solutions thérapeutiques chez l’homme. La population européenne vieillissant, le nombre d'Européens atteints de la maladie d'Alzheimer doublera presque d'ici 2050, soulignant l'urgence de développer des traitements efficaces pour arrêter ou au moins retarder la maladie d'Alzheimer avant qu'elle n'atteigne des proportions épidémiques. À cet égard, on estime qu'un traitement qui retarde l'apparition de la MA de 5 ans réduirait automatiquement le nombre de cas de 50 %.

Procédures

- Une injection rétro-orbitaire et 7 injections sous-cutanées - Une euthanasie sous anesthésie/analgésie par injections IP et sous-cutanée (unique) - Une diète spéciale permettant la déplétion des microglies (1 mois).

Impact sur les animaux

Il n’y pas d’effets indésirables attendus sur les animaux liés à l’utilisation des traitements proposés (diètes). Les interventions telles que les injections rétro-orbitaires et la perfusion intra-cardiaque seront réalisées sous anesthésie. Suite aux injections RO, les souris pourraient développer de possibles effets indésirables comme un gonflement autour du site d'injection, une exophtalmie, un traumatisme oculaire, une cécité ou encore une croissance tumorale localisée. En ce qui concerne les injections sous-cutanées, elles seront faites sur un temps répété relativement court de 7 jours (une injection par jour) mais pourraient engendrer des plaies ou nécroses. Les souris porteuses du transgène P301S peuvent développer plusieurs phénotypes dommageables. Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure par surdosage anesthésique suivi d'une perfusion intracardiaque.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélever le cerveau qui doit être analysé.

Remplacement

Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants (cellules iPS et système CRISPR/Cas9), ces modèles n’offrent que des informations "physiopathologiques" très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. En ce sens, la dégénérescence synaptique est très difficile à obtenir in vitro. Ces souris P301S représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie d’Alzheimer car c’est l’un des rares modèles de la MA qui développent une dégénérescence synaptique et une atrophie cérébrale, comme observées chez les patients MA et responsables des troubles cognitifs. Puisque le but principal est de comprendre et combattre la dégénérescence synaptique dans la MA, nous devons utiliser un modèle qui développe une perte synaptique similaire à celle présente chez les patients atteints de la MA. Les modèles MA in vitro (culture cellulaire ou organoïdes) actuels ne développant pas (ou très peu) de perte synaptique, nous nous tournons donc vers ce modèle murin.

Réduction

Afin de calculer au plus juste l'effectif des lots d'animaux, nous avons effectué un calcul des effectifs nécessaires grâce à plusieurs tests statistiques. Du fait de la variabilité pathologique précédemment rapportée entre mâles et femelles dans le modèle P301S, nous n’utiliserons que les mâles afin de réduire la variabilité au sein des groupes et ainsi le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons les mâles car ils développent une perte synaptique plus tôt par rapport aux femelles. Les seules femelles utilisées seront celles nécessaires à la création et au maintien des différentes lignées de souris pour la reproduction. Nous avons conscience que l’utilisation des deux sexes serait un atout scientifique mais le nombre d’animaux nécessaires serait bien trop important d’un point de vue éthique. Nous proposons donc de faire cette étude exploratoire chez les mâles. Dans le futur, lorsque les mécanismes liant ApoE4 à la perte synaptique seront établi chez les mâles, nous ferons une nouvelle demande auprès du comité d’éthique afin de confirmer (ou non) les résultats principaux découverts chez les mâles sur une petite cohorte de femelles.

Raffinement

Les souris seront hébergées sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi (alternance entre dômes de plexiglass et dômes en papier, accompagné de Nestlets en coton). Les animaux seront sous la responsabilité de personnels animaliers expérimentés. Une observation quotidienne des animaux sera effectuée pour s’assurer de leur bien-être. Les souris peuvent perdre du poids avec le traitement; Au-delà de 20% de perte de poids pendant l'expérience, la souris sera euthanasiée. Les souris P301S développant des phénotypes dommageables, des points limites stricts seront établis afin de réduire les nuisances causées aux animaux. Pour ces points limites, l’animal sera euthanasié. Environ 15% des souris P301S développeront une paralysie des membres postérieurs à partir de l'âge de 7-8 mois.

Choix des espèces

Les souris P301S constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles de la MA, ainsi que comme modèle pré-clinique pour tester des molécules thérapeutiques potentielles puisqu'elles développent de la perte synaptique et des troubles cognitifs. - Toutes les souris du projet seront injectées via injection retro-orbitaire à l’âge de 4 à 5 mois (sous anesthésie) permettant d'identifier les protéines à l'interface synapse-astrocyte. - Une cohorte (cohorte 1) sera utilisée à 7 mois (euthanasie et collecte des tissus) afin d'évaluer les stades précoces de la dégénérescence synaptique dans ce modèle - Une cohorte (cohorte 2) sera utilisée à 10 mois (euthanasie et collecte des tissus) afin d'évaluer les stades tardifs de la dégénérescence synaptique dans ce modèle

216 souris gestantes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection quotidienne de médicament et trois prises de sang sous anesthésie entre le 11e et le 15e jour de gestation, puis sont tuées au 15e jour pour analyser les placentas et les fœtus. Le projet cherche une preuve de concept qu'une classe de médicaments ralentirait la prééclampsie. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable grave et qualifie le modèle d'animal gestant d'"indispensable".

Objectifs

La prééclampsie est une malade spécifique de la grossesse potentiellement mortelle et pour laquelle il n'existe à ce jour aucun traitement curatif. L'objectif de ce projet est de faire la preuve de concept qu'un type de médicament est potentiellement intéressant pour ralentir l'évolution de la prééclampsie, en prouvant qu'il fonctionne sur les marqueurs de la maladie et qu'il n'est pas toxique pour le foetus. C'est une étape indispensable à nos travaux de recherche.

Bénéfices attendus

Il n’existe à ce jour aucun traitement de la prééclampsie en cours de grossesse. Cette maladie est pourtant potentiellement mortelle pour la mère et pourvoyeuse de grande prématurité. Le développement de médicament est une priorité de la recherche en médecine périnatale. C’est le bénéfice attendu de nos recherches : apporter la preuve de concept qu’une classe médicamenteuse permet de ralentir potentiellement l’évolution de la prééclampsie sans effets secondaires indésirables pour la grossesse.

Procédures

Durant le protocole expérimental, les animaux recevront une injection quotidienne de médicament. L’injection est un acte peu douloureux et peu stressant quand il est réalisé par un opérateur entrainé. Cette procédure est réalisée quotidiennement par un très grand nombre d’équipes de recherche. L’injection de médicament sera effectuée entre le 11e et le 15e jour de la gestation. Les prises de sang (réalisées 3 fois dans notre protocole de recherche, 11e, 13e et 15e jour de la gestation) seront systématiquement réalisées sous anesthésie générale pour limiter au maximum à la fois le stress et la douleur des animaux, et seront réalisées par un opérateur expérimenté.

Impact sur les animaux

Aucun effet secondaire, ni indésirable grave n’est attendu des gestes réalisés en cours de gestation (injection de médicament, prise de sang) au cours de notre protocole. De plus, les médicaments utilisés ont déjà été testés chez la souris pour d’autres applications et n’ont pas d’effets indésirables. Aucune procédure chirurgicale ne sera effectuée sur les animaux jusqu’au jour de l’euthanasie. Une grille de suivi quotidien sera mise en place afin d’évaluer le bien-être animal.

Devenir

Chaque animal sera euthanasié en fin de procédure au 5ème jour du protocole expérimental c’est-à-dire au 15e jour de gestation. Cette euthanasie se justifie par la nécessité d’une prise de sang maternel de plus gros volume et pour l’analyse systématique des placentas et des fœtus. Nos procédures d’analyse ne sont pas possibles après la parturition et la mise bas des portées, puisque nous apportons une attention toute particulière au placenta.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de modèle permettant de remplacer l’interaction entre la mère, le placenta et le fœtus au cours de la gestation. C’est pourquoi en recherche en reproduction le modèle d’animal gestant reste indispensable pour tester l’efficacité de nouveaux médicaments en cours de gestation. De plus, cette étape expérimentale est incontournable pour repérer les éventuels effets malformatifs ou délétères pour la grossesse de classes médicamenteuses.

Réduction

Afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux, nous avons au préalable testé nos hypothèses de travail et l’ensemble des molécules (leur efficacité et leur toxicité) sur des placentas humains. Le nombre de souris nécessaire dans l’étude, c’est-à-dire le nombre de souris dont nous avons besoin pour montrer une différence significative entre deux groupes est de 8 animaux par groupe. Ce nombre a été réduit à son maximum en tenant compte de la variabilité du nombre de fœtus par portée, de la variabilité des dosages sanguins et du fait que l’établissement éleveur ne nous assure pas de la gestation des animaux lors de la livraison (ce qui peut représenter 1/3 de l’effectif total des animaux qui se trouvent être non gestant). De plus, dans notre projet, nous avons prévu de tester 3 doses croissantes d’un médicament. Nous commencerons par tester la dose la plus faible et si celle-ci est suffisante pour observer des effets nous ne testerons pas les 2 doses plus fortes sur les souris afin de limiter au maximum leur utilisation.

Raffinement

Les animaux seront surveillés quotidiennement et ont à leur disposition des maisons en carton et du coton pour se créer des nids. Les critères objectifs de souffrance et/ou la détresse d’un animal seront quotidiennement évalués à l’aide d’une grille de suivi. Si une souffrance et/ou détresse est observée chez les animaux, des mesures seront mises en place (prise en charge médicamenteuse etc). Si malgré les mesures mises en place, l’animal atteint un point limite, c’est-à-dire que sa souffrance et/ou sa détresse dépasse un certain seuil défini au préalable, l’expérimentation sera interrompue pour cet animal immédiatement.

Choix des espèces

Le modèle murin est choisi pour plusieurs raisons : - Son type de placenta est proche de celui de l’espèce humaine - Les molécules responsables de la maladie humaine sont également retrouvées dans le sang maternel au cours de la gestation chez la souris. Les dosages de ces molécules chez la souris sont fiables et commercialisés. - Le modèle de gestation chez la souris est systématiquement utilisé en toxicologie de la reproduction pour étudier de potentiels effets délétères de classes médicamenteuses sur le developpement embryologique et fœtal.

34 moutons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sur des cœurs déjà infarcis. Ils subissent sous anesthésie des examens d'imagerie, une angiographie, une cartographie de contact et une stimulation interventriculaire, cette dernière pouvant déclencher une tachycardie ventriculaire évoluant en fibrillation. Le cœur est prélevé après mise à mort pour des analyses ex vivo. Le porteur affirme que le remplacement des tissus 'n'est pas possible' et présente ce protocole comme 'essentiel' à la compréhension de l'infarctus.

Objectifs

L’ischémie cardiaque est la principale cause des troubles du rythme ventriculaire dans le monde. Afin de mieux comprendre son mécanisme d’action, il est indispensable d’avoir une description détaillée de la structure et de la fonction de l’infarctus et sa relation avec le myocarde sain, notamment, dans les zones de transition entre ces deux types de tissus. Pour cela, le développement et l’optimisation de nouvelles méthodes d’imagerie cardiaque, d’analyse de signaux électriques et optiques sont indispensables. Dans ce projet nous utilisons une procédure pluridisciplinaire permettant donc une étude approfondie qui permet une analyse détaillée in vivo et ex vivo. Afin d’arriver à ce but, le développement de nouvelles techniques applicables dans le monde clinique, seront mises au point, montrant donc le versant translationnel du projet.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’optimiser l’imagerie cardiaque de l’infarctus afin de caractériser le tissu sain à l’intérieur ou autour de la zone de cicatrice. Ces informations sont essentielles en clinique afin d’améliorer le diagnostic des patients et de déterminer la meilleure approche thérapeutique. Une cartographie électrique de contact permettra la visualisation de la transmission électrique dans la cicatrice de l’infarctus et dans le tissu sain. De plus, cette technique permettra d’observer les zones de jonctions entre le tissu sain et la cicatrice. La stimulation des cœurs infarcis à différents fréquences donnera des informations sur les risques des troubles du rythme cardiaque. Toutes ces techniques enrichiront les bases de données numériques afin de créer et améliorer les études de modélisation cardiaque préventive.

Procédures

Les animaux utilisés pourront subir des examens d’imagerie, d'angiographie, de cartographie de contact et de stimulation interventriculaire. Toutes ces analyses seront effectuées sous anesthésie générale et avec l’administration d’une thérapie antidouleur appropriée. Les techniques d’imagerie utilisées sont de types non invasives (IRM, scanner et/ou échocardiographie, 180 min au total). Le protocole d’angiographie est prévu afin de déterminer la présence ou pas d’irrigation sanguine dans l’infarctus (environ 90 min). Des systèmes de traitement d’image et de cartographie de contact nous permettent de cibler les zones potentiellement favorisantes des tachycardies ventriculaires. La cartographie électrique du cœur pourra être effectuée pour évaluer les effets de l’infarctus in vivo (environ 90 min). Une stimulation interventriculaire pourra être effectuée pour déterminer la fonctionnalité ventriculaire à différentes fréquences de stimulation. Une prise de sang avant l’euthanasie (animal sous anesthésie générale, 30 secondes) de 5 ml nous permettra de mesurer l’état final du contexte inflammatoire et du remodelage cardiaque.

Impact sur les animaux

La pose et le retrait des cathéters pour la cartographie peuvent conduire à des saignements aux sites d’introduction. Les anesthésies générales peuvent impactées légèrement le bien-être animal en induisant une légère désorientation ou une apathie transitoire lors du réveil. Lors des procédures d’imagerie non-invasif (échocardiographie, IRM) ou mini-invasif (cartographie de contact), le bien-être animal peut être également impacté par la pose de cathéters: au niveau de la patte avant (pour la perfusion de médicaments et d’agents de contraste) et au niveau de la veine fémorale (guide pour la cartographie de contact). Les procédures de cartographie de contact ou de stimulation interventriculaire peuvent comporter des effets indésirables cardiaques tels que des déclenchements de tachycardie ventriculaire qui peuvent déborder en fibrillation.

Devenir

Afin de prélever le cœur et d’effectuer des études fonctionnelles (cartographie optique) et structurales ex vivo (histologie, micro-scanner, etc.), qui nous permettront de mieux comprendre les caractéristiques électrophysiologies de l’infarctus, l'ensemble des animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Dans le contexte actuel, malheureusement, le remplacement de tissus obtenus via l’expérimentation animale n’est pas possible pour répondre à l'objectif du projet. Le manque de connaissance au niveau de la structure et de la fonction de l’infarctus et sa relation avec le tissu normal ne le permet pas. L’intérêt clinique de l’étude, dû à la prévalence de la pathologie au niveau mondial, rend ce protocole essentiel pour la compréhension du fonctionnement de la maladie et le développement de nouveaux traitements pour les patients. De plus, les résultats obtenus avec les techniques d’imagerie, les mesures électriques et la cartographie optique vont nous permettre d’enrichir la base de données pour la modélisation cardiaque, permettant de s’affranchir dans de nombreuses études, du modèle animal.

Réduction

Dans le cadre de la réduction du nombre d’animaux, nous avons effectué un calcul de puissance statistique pour déterminer le minimum d’animaux nécessaires afin d’avoir des résultats avec une différence statistique. Nous avons également intégré dans le même projet de recherche différents équipes: le pôle d’imagerie, le pôle physiopathologique, le pôle de traitement de signaux et le pôle de modélisation cardiaque. Ce regroupement interdisciplinaire au sein de notre projet, permet le développement et l’utilisation d’un maximum de techniques compatibles avec la quantité minimale d’animaux possible, permettant donc son optimisation.

Raffinement

Pendant les procédures, les animaux reçoivent un protocole antidouleur approprié et ils sont maintenus sous anesthésie générale avec une ventilation mécanique et surveillés par un ECG de surface et un capteur pression sanguine invasive. Cela nous permet d’apporter la nécessaire hydratation ou de fournir des anti-arythmiques en cas de risque de fibrillation ventriculaire. Un défibrillateur diphasique est toujours disponible en salle d’ablation pour éviter la mort précoce de l’animal durant les tests. Si une étape du protocole chronique affecte l'état de santé au point d'atteindre l'un des points limites sans qu'aucune action ne puisse permettre un retour à l'état basal alors le protocole sera interrompu et l’animal mis à mort selon les modalités définies.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme, les ovins ont été retenus car : •Ces modèles sont une référence pour la communauté scientifique dans l’étude des pathologiques cardiaques •Le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ces modèles. Chez l’Homme, la plupart des infarctus se produisent à l’âge adulte. Pour cette raison, des ovins adultes ont été choisis pour ce projet.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une greffe de cellules tumorales sous la peau ou par voie intraveineuse, puis des séances d'imagerie sous anesthésie de 20 à 60 minutes, avec administration d'agents de contraste pour certaines. Le projet vise à mettre au point le suivi du développement tumoral par imagerie non invasive pour évaluer des molécules anticancéreuses. Le porteur décrit une mise à mort systématique à l'issue et un point limite fixé à 20 % de perte de poids ou à une tumeur atteignant 10 % du poids du corps.

Objectifs

Le cancer touche 382000 personnes par an et avec 157400 décès annuel, soit environ 40 % du total, il représente la première cause de mortalité en France. C'est surtout la première cause de mortalité prématurée (avant 65 ans). Un homme sur deux et une femme sur trois sont concernés, avec des localisations différentes selon le sexe : le cancer de la prostate est de loin le cancer le plus fréquent chez l'Homme avant le cancer du poumon et le cancer colorectal, et, chez la femme, le cancer du sein est le plus fréquent avant le cancer colorectal et le cancer du poumon. L'incidence globale du cancer augmente chaque année en raison du vieillissement de la population, de la généralisation des techniques d’exploration et de dépistage, et de causes environnementales. Grâce aux progrès de la prévention, du diagnostic précoce et de la prise en charge, le risque de mourir d'un cancer a diminué depuis 25 ans. Cependant, il n'en demeure pas moins un fléau déclaré priorité de santé publique. Les efforts de développement de nouvelles thérapeutiques doivent donc se poursuivre. Les deux premiers critères mis en jeu dans la sélection de nouveaux médicaments antitumoraux sont, d’une part, l’originalité du mécanisme d’action et, d’autre part, l’activité antitumorale expérimentale dans un modèle animal in vivo. En effet, afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques, il est indispensable de tester ces molécules chez l’animal pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro pouvant remplacer complètement la tumeur dans son microenvironnement et son évolution au sein d'un organisme vivant (prolifération, invasion, dissémination). Il existe cependant des modèles d'étude de clonogénicité, de migration et d'invasion cellulaires in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’homme). Ce projet s'intéresse au suivi du développement tumoral par des approches d'imagerie non-invasive afin d'évaluer l'efficacité de molécules thérapeutiques chez le petit animal (souris).

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet, en proposant l’exploration du développement tumoral par imagerie non-invasive, est de permettre (i) une détection précoce des tumeurs (avant qu'elles ne soient palpables), (ii) le suivi de la progression tumorale au cours du temps (croissance / invasion / dissémination), et (iii) la quantification 2D et/ou 3D des masses tumorales (tumeurs primaires et métastases). L'approche quantitative de l'évaluation de l'efficacité médicamenteuse dans le modèle animal sera abordée par le développement d'outils logiciels pour l'analyse d'images, visant à établir des biomarqueurs quantitatifs d'imagerie i.e. des signaux anatomiques, physiologiques, biochimiques ou moléculaires détectables en imagerie, afin d'améliorer le développement thérapeutique contre cette pathologie au sombre pronostic.

Procédures

Les animaux subiront une greffe de cellules tumorales par voie sous cutanée ou intraveineuse. Nous serons vigilants à intervenir au moindre signe de douleur ou si la taille de la tumeur devait impliquer le sacrifice des animaux. Les tumeurs sous cutanées, parfaitement accessibles, seront mesurées au pied à coulisse. Les tumeurs profondes (tumeurs pulmonaires) seront mesurées par imagerie non invasive. Certaines procédure d’imagerie (bioluminescence, tomographie de fluorescence moléculaire et tomographie par émission de positons) nécessiteront de leur administrer un agent de contraste par voie intrapéritonéale ou intraveineuse. Les autres procédures sont des procédures d'imagerie non invasive n'entrainant aucune douleur pour les animaux. Nous leur éviterons tout stress en les anesthésiant dès le début des sessions d'expérimentation. La durée de l’anesthésie pourra varier de 20 à 60 minutes en fonction de la modalité d’imagerie mise en œuvre.

Impact sur les animaux

Certaines procédures: transplantation sous cutanée ou intraveineuse de cellules tumorales, administration de traitements par voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutanée, prélèvements sanguins (veine mandibulaire ou saphène) sont susceptibles d’induire un stress physique aux animaux. Pour le réduire, ces procédures seront mises en œuvre après anesthésie des animaux. L’apparition des tumeurs induites pourra également induire un stress physique et de la douleur. Ces nuisances potentielles nous conduisent à classer ces procédures en classe modérée.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet auront tous subi une induction de tumeur par injection sous cutanée de cellules tumorales. Ils seront tous mis à mort à l'issue des différentes procédures d'imagerie mises en œuvre.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle in vitro pouvant remplacer complètement la tumeur dans son microenvironnement et son évolution au sein d'un organisme vivant (prolifération, invasion, dissémination). Il existe cependant des modèles d'étude de clonogénicité, de migration et d'invasion cellulaires in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal.

Réduction

Ce projet s'intéresse au suivi du développement tumoral par des approches d'imagerie non-invasive afin d'évaluer l'efficacité de molécules thérapeutiques chez le petit animal (souris). Les mêmes animaux seront mis en œuvre sur les différentes modalités évaluées dans ce projet puisqu'elles sont atraumatiques et non destructrices y compris pour le suivi longitudinal de l'efficacité thérapeutique évitant ainsi de multiplier le nombre de lots d'animaux mis en œuvre pour la totalité du projet.

Raffinement

Tous les animaux sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur (directive européenne 2010/63, décret n°2013-118 du 1er février 2013). Tout animal présentant des signes de souffrance, de léthargie, d'hypothermie persistante, des difficultés respiratoires, une perte de poids supérieure à 20% ou une tumeur de volume supérieur ou égal à 10% du poids corporel ou ulcérée/infectée sera exclu de l’étude et sacrifié. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Les animaux sont anesthésiés pour chaque procédure d'imagerie et une attention particulière est apportée au maintien de leur température corporelle pendant l'anesthésie.

Choix des espèces

Les petits mammifères, notamment la souris, sont à la base de la compréhension de la pathologie cancéreuse et se sont imposés comme modèles fondamentaux dans la recherche biomédicale. Ils sont d'un grand intérêt pour le criblage de nouvelles molécules car, par la présence de gènes équivalents chez l'homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et apportent de nombreuses connaissances sur les relations entre les cellules tumorales et les tissus normaux, notamment le système immunitaire. Ils permettent également l'étude des phénomènes de vascularisation tumorale et de dissémination métastatique, et aident à la compréhension de la résistance des cellules aux traitements. De plus, ils présentent certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Il est important de noter que les molécules utilisées actuellement en clinique, notamment en chimio- et immunothérapie, ont été découvertes ou évaluées sur ces modèles. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (~4-8 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. En effet, il est bien établi dans la littérature que l'induction tumorale par transplantation de cellules cancéreuses chez des animaux jeunes adultes est efficace, fiable et reproductible. Au-delà de cet âge, les tumeurs se développent plus lentement. Dans le cas de notre étude, ce stade de développement est en parfaite adéquation avec la pathologie humaine, notamment en lien avec ses similarités physiologiques et moléculaires. De plus, il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont ainsi adaptés aux études d'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques.

1 488 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome sous la peau du flanc puis des injections intrapéritonéales de traitements anticancéreux trois fois par semaine pendant jusqu'à 112 jours, une partie recevant en plus des cellules immunitaires par la veine de la queue. Le porteur revendique la validation d'une protéine comme cible thérapeutique, les retombées pour les patients étant renvoyées au 'plus long terme' et à d'éventuels autres cancers. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit des 'interactions physiologiques aussi complexes'.

Objectifs

Le mélanome cutané (15500 nouveaux cas par an en France) est un cancer issu des mélanocytes, cellules responsables de la pigmentation de la peau. Le pronostic de ce cancer diagnostiqué précocement est favorable mais au stade métastatique celui-ci reste très mauvais. Malgré les progrès dans le traitement des patients atteints de mélanome cutané métastatique avec les thérapies ciblées et les immunothérapies, plus de la moitié des patients développe des résistances. Les cellules de mélanome sont capables de s’adapter et d’échapper aux thérapies ciblées. De nouvelles approches thérapeutiques sont alors nécessaires afin de resensibiliser les patients aux traitements. Nous avons étudié le rôle d'une protéine d'intérêt sur les résistances des cellules de mélanome aux thérapies ciblées. L'objectif du projet est de valider, chez la souris, le mécanisme montrant la re-sensibilisation des cellules de mélanome aux thérapies ciblées.

Bénéfices attendus

Ce projet est essentiel pour évaluer l'implication de notre protéine d'intérêt dans la résistance des mélanomes aux traitements. La validation de cette protéine comme nouvelle cible thérapeutique permet de pouvoir proposer, à plus long terme, de nouvelles approches thérapeutiques pour améliorer le traitement des patients atteints de mélanomes métastatiques. La validation de notre protéine candidate dans le mélanome métastatique permettra d’étendre nos résultats à d’autres cancers dont les mécanismes de résistance sont similaires.

Procédures

Les souris seront soumise à une injection de cellules en sous cutanée au niveau du flanc gauche sur souris vigile (non anesthésiée) puis à une administration par injection intra-péritonéale (au niveau de l'abdomen) des différents traitements anticancéreux 3 fois par semaine jusqu’à 112 jours (16 semaines) maximum après l'injection des cellules. D'autre part, une partie des souris sera soumise à une injection de cellules en sous cutanée au niveau du flanc gauche sur souris vigile (non anesthésiée) ainsi qu’une injection intraveineuse de cellules immunitaires dans la veine caudale (veine située au niveau de la queue) puis à une administration par injection intra-péritonéale (au niveau de l'abdomen) des différents traitements anticancéreux 3 fois par semaine jusqu’à 112 jours maximum après l'injection des cellules.

Impact sur les animaux

Les souris seront soumises à des nuisances et des effets indésirables auxquels nous seront très attentifs. Ces effets indésirables pourraient être causés par la croissance de la tumeur (gêne, mobilité réduite, perte de poids (malnutrition, déshydratation)) ou par les injections répétées (stress physique) des différents traitements anticancéreux.

Devenir

À l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs de mélanome et/ou les organes (foie, poumons,...) présentant des métastases afin de réaliser des analyses in vitro.

Remplacement

En termes de remplacement, il n'est pas possible de s'affranchir de l'utilisation de souris car il n'existe pas de méthodes alternatives qui permettent de reproduire des interactions physiologiques aussi complexes.

Réduction

En termes de réduction, le nombre d'animaux nécessaire à cette étude a été déterminé à l'aide d'un test statistique. L'utilisation de ces animaux sera optimisée en prélevant les tumeurs de mélanome et/ou les organes (foie, poumons,...) présentant des métastases afin de réaliser des analyses au laboratoire. Il est fort probable que le nombre d’animaux utilisés soit très inférieur à la fin du projet. En effet, selon les résultats de la procédure 2, la procédure 3 sera lancée ou abandonnée. Dans le meilleur respect du bien-être animal et dans le but de réduire, nous utiliserons des souris NSG (souris de laboratoire qui possède un système immunitaire affaibli) mâles et femelles provenant de notre élevage.

Raffinement

En termes de raffinement, les souris seront hébergées à plusieurs par cage avec un environnement enrichi (igloo) et seront observées deux ou trois fois par semaine selon la procédure par les demandeurs du projet afin de prendre en charge tout signe de douleur, de stress ou d’inconfort. Les manipulateurs ont un niveau qui permet d’avoir une bonne vision et une excellente capacité à détecter les problèmes de santé, stress ou malaise. Le suivi est fait par des méthodes non invasives (mesure des tumeurs sous cutanées avec un pied à coulisse (instrument de mesure), pesée des animaux régulières). Le site d’injection au niveau de l'abdomen sera surveillé et changera de côté pour chaque injection. De plus, nous avons fait en sorte que les traitements utilisés puissent être mélangés afin de les injecter en une seule manipulation (diminution du stress). En ce qui concerne les souris NSG (souris de laboratoire qui possède un système immunitaire affaibli), ces dernières seront manipulées sous hotte de type PSM (Poste de Sécurité Microbiologique, hotte qui offre une zone de travail stérile) dans des conditions d'hébergement stérile (igloo, nourriture, changement de cage en condition stérile). Ces conditions d'hébergement permettent donc le maintien d'un statut sanitaire exempt d'organisme pathogène spécifique (SOPF).

Choix des espèces

La souris est un mammifère ayant des similitudes génétiques avec l’homme. De plus, elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction bien connu, une faible taille ce qui permet d’avoir des conditions d’hébergement plus faciles. Les modèles de souris avec un système immunitaire déficient nécessaires à l'étude sont déjà disponibles commercialement ce qui permet de ne pas avoir à générer de nouveaux modèles génétiquement modifiés. Les souris seront utilisées au stade adulte (7 semaines) afin de garantir une prise tumorale optimale.