Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
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Etudes moléculaires chez un nouveau modèle rat du Syndrome de Down et de la Maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent un jeûne de six heures, une pose de bague d'identification et une biopsie de l'oreille, puis un prélèvement de sang sous anesthésie avant d'être tués pour des analyses moléculaires post-mortem. Le projet vise à caractériser une nouvelle lignée de rats reproduisant la trisomie 21 et la maladie d'Alzheimer, le porteur avançant que ce modèle pourrait éclairer les mécanismes des deux pathologies. Sur le remplacement, il affirme qu'"aucune alternative" n'existe et que l'étude du cerveau exige un organisme vivant étudié dans sa globalité.
Objectifs
Le Syndrome de Down (SD) ou Trisomie 21 touche 1 naissance sur 800 et représente la forme la plus fréquente de retard mental. Par ailleurs, les personnes atteintes du SD développent de nombreuses comorbidités parmi lesquelles la maladie d’Alzheimer (MA). Nous venons ainsi de créer un tout nouveau modèle de rats du SD pouvant également être utilisé pour étudier le développement de la MA. Ce dernier pourrait notamment contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologique du SD, ainsi qu’à l’identification de mécanismes impliqués dans le développement de la MA dans ce contexte du SD. L’objectif de ce projet est donc de réaliser une première caractérisation de ce modèle grâce à des analyses moléculaires effectuées sur des échantillons de sang/plasma ainsi que sur le cerveau. Les résultats de ces analyses sont sensibles à la prise alimentaire des animaux. De ce fait, il est nécessaire de réaliser une mise à jeun des animaux afin de contrecarrer les effets de la prise alimentaire, cette dernière étant très aléatoire d’un individu à l’autre. Les animaux seront donc soumis à une privation alimentaire avant d’effectuer un prélèvement sanguin qui sera réalisé sous anesthésie générale.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de caractériser un nouveau modèle de rats du SD. Les bénéfices potentiels de ce projet sont multiples (i) une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques du SD, (ii) une meilleure compréhension du rôle de l’interaction 2 gènes dans le développement de la MA dans le SD, l’un de ces gènes étant connu pour son implication dans le SD et l’autre dans la MA et (iii) une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement de la MA dans le SD. Par ailleurs, les mécanismes identifiés pour le développement de la MA dans le SD pourraient également s’appliquer aux personnes de la population générale affectées par la MA. Par la suite, cela pourrait potentiellement permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le SD et la MA.
Procédures
Dans le cadre de cette étude, les animaux seront soumis à une privation alimentaire en vu d’une mise à jeun. Cette privation alimentaire sera d’une durée de 6h. Elle sera réalisée une seule fois par rat et sur la totalité des animaux du projet, soit 24 rats. Ces animaux seront ensuite anesthésiés pour pouvoir réaliser un prélèvement sanguin. Pour cela, un mélange anesthésique sera administré par voie intrapéritonéale, cette injection est réalisée en 1 à 2 mins par rat. Un prélèvement de sang sera ensuite réalisé, il se fait en 1-2 mins. A noter que l’injection d’anesthésique et le prélèvement de sang sont réalisés qu’une seule fois par rat. Par ailleurs, les animaux seront soumis à la pose d’une bague à numéro unique permettant de les identifier, ainsi qu’au prélèvement d’une biopsie d’oreille afin de déterminer quels animaux sont porteurs de la modification génétique. Ces deux actes sont réalisés une seule fois par animal et de façon successive en 2-3 mins.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à une privation alimentaire afin de réaliser une mise à jeun. Cette privation alimentaire peut induire un stress léger chez l’animal. Par ailleurs, le prélèvement sanguin nécessite d’anesthésier l’animal au préalable via une injection d’anesthésique par voie intrapéritonéale. Cette injection n’induit qu’une douleur minime et très brève au site d’injection liée à l’introduction de l’aiguille. Elle peut également induire un stress de courte durée chez l’animal du fait de la contention nécessaire pour pouvoir effectuer l’injection. Concernant la pose d’une bague à numéro unique et du prélèvement d’une biopsie d’oreille, ces deux actes, réalisés de façon successive, ne génèrent qu’une douleur minime et un stress léger chez l’animal.
Devenir
L’ensemble des animaux prévu dans ce projet seront mis à mort afin de pouvoir réaliser des analyses moléculaires en post-mortem.
Remplacement
Il n’existe à l’heure actuelle aucune alternative à l’utilisation des animaux pour les études concernant le cerveau. La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires des pathologies génétiques et neurodégénératives requiert l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité. Il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo.
Réduction
Cette demande concerne la réalisation de prélèvements sanguins et du cerveau sur des animaux mis à jeun en vu de réaliser des analyses moléculaires. Le recul et les connaissances que nous avons sur la mise en œuvre de ces analyses nous permettent d’estimer que le nombre d’animaux nécessaire est de 6 animaux/génotype/sexe. Cet effectif a été déterminé afin d’avoir un nombre minimal d’animaux tout en ayant des résultats scientifiquement interprétables et ce en prenant en compte une variabilité inter-individu attendue. Par ailleurs, cette étude sera réalisée sur des mâles et des femelles afin d’utiliser l’ensemble des animaux produits et de vérifier qu’il n’y a pas de différence en fonction du sexe.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à une mise à jeun qui n’est en rien délétère pour l’animal. En effet, elle est réalisée sur une période très courte (6h) et pendant la phase de jour, période pendant laquelle les rats dorment principalement et mangent peu, ils ne seront donc que peu perturbés. Il n’y a donc pas de point limite concernant la mise à jeun. Par ailleurs, un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie/analgésie générale profonde. Ainsi, aucune douleur n’est attendue. Le prélèvement de sang ne commencera qu’après la perte totale des réflexes de retrait lors du pincement de la patte et des réflexes de fermeture palpébrale témoignant d’une anesthésie profonde. Les points limites seront donc déterminés en fonction des observations faites pendant l’anesthésie/analgésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l’animal). La procédure d’anesthésie sera arrêtée si ces points limites sont atteints. Par ailleurs, les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien permettant de s’assurer de leur bien-être et de leur santé. Si les animaux présentent des signes de mal être ou de douleur (plaies, hérissement du poil, attitude voûtée, perte de poids, altération de la respiration, comportement anormal (perte de réactivité, animal prostré)), ils seront placés sous surveillance accrue et présentés au vétérinaire. Si un traitement est envisageable, il sera mis en place (antiseptiques, antibiotiques, analgésiques). A noter que le traitement utilisé devra être adapté au cas pas cas en fonction des symptômes rencontrés. Si aucun traitement n’est envisageable et que l’état de l’animal persiste ou se dégrade au cours de la journée, il sera mis à mort. Ainsi, l’atteinte de points limites concernant le bien-être et la santé des animaux sera déterminée sur la base des observations quotidiennes de nos animaux. Par ailleurs, tout au long de leur vie, les animaux seront hébergés par deux, le rat étant une espèce très sociable, et disposeront d’un bâton à ronger en guise d’enrichissement.
Choix des espèces
La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires des pathologies génétiques et neurodégénératives requière l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité. Le rat est physiologiquement et génétiquement plus proche de l’Homme que ne l’est la souris. A ce jour, l’anatomie, la physiologie et la génétique du rat sont bien connues. Par ailleurs, l’évolution de l’ingénierie génétique permet maintenant de réaliser facilement des modifications génétiques chez le rat. L’étude sera réalisée chez des rats âgés de 3-5 mois, car c’est l’âge auquel ont été faites les analyses moléculaires sur les précédents modèles rat du SD. Le but étant de pouvoir comparer les résultats obtenus.
Ischémie-reperfusion hépatique : mécanismes et approches thérapeutiques.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont la souffrance déclarée va du modéré au sévère, 284 d'entre elles étant opérées sous anesthésie et tuées sans réveil. Une partie subit une ischémie du foie provoquée en ligaturant l'apport sanguin pendant soixante minutes après ouverture de l'abdomen, avant reperfusion puis mise à mort, d'autres une perfusion hépatique menée jusqu'au décès ou une péritonite provoquée. Le porteur ne mentionne comme atteinte qu'une douleur post-opératoire prise en charge, alors que 376 souris sont classées en gravité sévère. Il affirme qu'aucune méthode ne reproduit in vitro ce phénomène complexe et revendique le caractère "indispensable" du modèle murin pour les validations précliniques.
Objectifs
En Europe, la transplantation d’organe fait face à un manque de don. Les rares organes disponibles sont menacés par un phénomène appeler ischémie/reperfusion, auquel notamment le foie est très sensible. Le concept d’ischémie-reperfusion (IR) consiste en l’augmentation du dommage tissulaire induit par une carence temporaire en oxygène lorsque cet apport est restauré. Ce phénomène est rencontré très fréquemment dans les pathologies aiguës, et concerne notamment les défaillances circulatoires (états de choc), l’infarctus du myocarde, la transplantation d’organes et le clampage vasculaire au cours de la chirurgie hépatique. Dans toutes ces situations se développe une période plus ou moins prolongée d’ischémie. Bien que le traitement vise à restaurer dès que possible l’apport en oxygène, on sait aujourd’hui qu’une telle restauration engendre en elle-même une série de phénomènes dommageables, regroupés sous le terme générique de «lésion de reperfusion». Sur le plan physiopathologique, les lésions hépatiques d’IR sont caractérisées par un important infiltrat à polynucléaires neutrophiles (PNN) dans les zones de nécrose hépatocytaire. Ces neutrophiles migrent dans le foie sous l’effet de facteurs chimioattractants afin d’exercer sur le site de l’agression leurs fonctions de phagocytose et de défense antibactérienne. Dans le cas de l’IR, les neutrophiles vont avoir un effet délétère en étant responsables des lésions hépatiques. Notre équipe a récemment montré que NOD1, un récepteur des composés bactériens, était un régulateur intrinsèque indispensable aux fonctions de migration et de phagocytose du PNN. Afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques de l’IR hépatique nous allons explorer les mécanismes d’interaction hépatocytes/ neutrophiles dans les lésions d’IR.
Bénéfices attendus
En Europe, la transplantation d’organe fait face à un manque de don. Les rares organes disponibles sont menacés par un phénomène appelé ischémie/reperfusion, auquel notamment le foie est très sensible. Le concept d’ischémie-reperfusion (IR) consiste en l’augmentation du dommage tissulaire induit par une carence temporaire en oxygène lorsque cet apport est restauré. Ce phénomène est rencontré très fréquemment dans les pathologies aiguës, et concerne notamment les défaillances circulatoires (états de choc), l’infarctus du myocarde, la transplantation d’organes et le clampage vasculaire au cours de la chirurgie hépatique. Dans toutes ces situations se développe une période plus ou moins prolongée d’ischémie. Bien que le traitement vise à restaurer dès que possible l’apport en oxygène, on sait aujourd’hui qu’une telle restauration engendre en elle-même une série de phénomènes dommageables, regroupés sous le terme générique de «lésion de reperfusion». Pour faire face à ce problème majeur de santé publique, il est indispensable de mieux le comprendre. Cela nécessite de travailler à l’échelle d’un organisme et donc l’usage des modèles animaux. Afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques de l’IR hépatique nous allons explorer les mécanismes d’interaction hépatocytes/ neutrophiles dans les lésions d’IR. Cette étude nécessite des approches in vivo et ex vivo chez la souris. Elle nécessitera également des souris invalidées pour le gène NOD1. Des tests de puissance ont permis de calculer au plus juste le nombre d’animaux indispensable. Les cellules isolées de souris seront utilisées dans plusieurs expérimentations ex vivo afin d’optimiser leur utilisation. Si de nouveaux outils in vitro apparaissent, ils seront utilisés en remplacement des animaux.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 types d’interventions : 1-une perfusion hépatique : après anesthésie profonde, le foie est perfusé jusqu’à ce qu’il blanchisse (quelques minutes), puis les veines sus hépatiques, caves et l'aorte sont sectionnées pour permettre l’évacuation des effluents (Cela induit alors la mort de l’animal). A la fin de la perfusion, le foie est prélevé afin d'isoler les hépatocytes. Vingt-quatre et 48 heures avant la procédure, certains animaux pourront recevoir une injection de modulateurs de NOD1 ou d’un excipient. 2-une péritonite stérile est induite chez les animaux afin d’isoler les neutrophiles péritonéaux qui seront ensuite utilisés dans des expériences ex vivo. Les animaux sont mis à mort 18h après l’induction de la péritonite stérile. 3-une ischémie-reperfusion du foie. Après anesthésie, la peau de l'abdomen et le péritoine des animaux seront incisés sur 1 cm, le foie externalisé, les lobes médians et latéral gauche seront ligaturés afin d’arrêter l’apport sanguin. Au bout de 60 minutes, la ligature sera retirée puis le foie reperfusé sera replacé dans l'abdomen. 8h ou 18h après levée de la ligature, les souris seront anesthésiées par anesthésie gazeuse pour réaliser un prélèvement sanguin, puis directement mises à mort afin de prélever le foie pour analyses ultérieures. Vingt-quatre et 48 heures avant la procédure, certains animaux pourront recevoir une injection d’un activateur de la voie NOD1 ou d’un excipient.
Impact sur les animaux
La chirurgie est par essence à l’origine de douleurs post-opératoires qui seront prise en charge par un protocole de traitement anti-douleur adapté.
Devenir
Dans les 3 procédures décrites, tous les animaux seront mis à mort, et leurs organes seront prélevés en vue d'effectuer des analyses histoloiques, de biologie cellulaire et moléculaire.
Remplacement
L’ischémie-reperfusion est un phénomène complexe faisant intervenir plusieurs types cellulaires à l’échelle du tissu. Il n’existe pas de méthode capable de reproduire in vitro ce processus physiologique. Par ailleurs, les molécules qui seront injectées aux souris auront été préalablement testées in silico et in vitro. Seules les molécules les plus efficaces seront testées chez les animaux.
Réduction
Les effectifs sont calculés à partir de données de la littérature et de données personnelles.
Raffinement
Les procédures sont définies au mieux pour offrir le maximum de confiance dans les résultats générés dans le respect du bien-être des animaux en limitant la souffrance animale (Raffiner). Lors de la chirurgie, les animaux recevront une anesthésie/analgésie avant le début de la chirurgie. Un anesthésique sera appliqué localement. Les animaux recevront, après la chirurgie, une injection d’antalgique toutes les 12h. Les animaux seront par ailleurs observés durant 15 à 30 min après la chirurgie, puis au bout de 2h jusqu’au réveil complet. Dans tous les cas, les animaux ne sont pas maintenus en vie plus de 24h après chirurgie. En cas de signes de douleurs : poil hérissé, absence de mouvement, baisse significative de l'activité motrice et/ou une perte de poids supérieure ou égale à 15% de la masse corporelle, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
Le modèle d’ischémie hépatique chez les souris est très bien décrit dans la littérature et est indispensable aux validations pré cliniques de candidats médicaments. De plus, pour décortiquer les mécanismes à l’origine de ce phénomène nous aurons besoin de modèles génétiquement modifiés uniquement disponible chez la souris. Enfin, la souris est le plus petit mammifère dans l’échelle de l’évolution parmi les modèles animaux. Les animaux utilisés auront entre 7 et 14 semaines car c’est l’âge optimal pour un développement reproductible des phénomènes d’ischémie-reperfusion.
Développement d’applications thérapeutiques pour améliorer le transfert de thérapies au cerveau par ultrasons
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 136
368 souris et 136 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des ultrasons focalisés destinés à ouvrir la barrière protégeant le cerveau, avec injection de microbulles et d'agent de contraste, certains subissant en plus une chirurgie et jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que l'ouverture de la barrière peut provoquer une inflammation cérébrale transitoire et que les animaux présentant des effets visibles en imagerie sont tués sans réveil. Les retombées annoncées, un meilleur passage des médicaments contre les cancers du cerveau et une thérapie génique du syndrome de l'X fragile, sont renvoyées au conditionnel.
Objectifs
La principale limite à l’efficacité des thérapies dans le cerveau est leur accès restreint en raison d'une barrière protégeant le cerveau qui limite le passage de la majorité des médicaments. Récemment, les ultrasons guidés par imagerie de résonance magnétique et associés à des microbulles ont attiré l’attention en tant que moyen non invasif pour permettre temporairement ce passage. Pour améliorer les traitements, il faudrait pouvoir faire passer ceux-ci plusieurs fois d'affilée au travers de cette barrière. Dans cette étude nous étudierons donc les effets de cette méthode au niveau des vaisseaux sanguins mais aussi l’intérêt de plusieurs ouvertures en faisant des analyses sur le tissu cérébral sain. Dans un second temps nous évaluerons le potentiel thérapeutique de cette méthode chez des rats et des souris présentant le syndrome de l'X fragile, une maladie neuro développementale due à la déficience d'un gène menant à des problèmes de développement du cerveau. Notre but sera donc de déterminer les meilleures conditions d’ouverture de la barrière dans le cerveau (temps d’ouverture, taux d’augmentation du passage des molécules) afin d’améliorer le passage de molécules thérapeutiques de manière non invasive. En plus des données que nous obtiendrons par imagerie par résonance magnétique et l'acquisition des signaux reflétant le caractère réversible ou non de l’ouverture de la barrière, nous évaluerons le passage des molécules d’intérêt et étudierons les changements morphologiques des vaisseaux ayant reçu une onde ultrasonore afin d’en évaluer leur intégrité après traitement. La caractérisation de ces effets permettra d’optimiser les conditions pour déposer localement des médicaments dans un cadre thérapeutique. Pour la partie applicative, nous évaluerons le potentiel thérapeutique de l'injection de thérapie génique chez des souris mimant le syndrome de l’X fragile.
Bénéfices attendus
Les ultrasons représentent un espoir majeur de traitement de nombreuses pathologies cérébrales. Dans le cas des cancers cérébraux, la moyenne de survie chez l'homme est de 15 mois environ. Chez l'animal, plusieurs études ont montré que l'on pouvait guérir des cancers cérébraux, ce qu'aucun essai préclinique n'avait montré jusqu'ici. Les essais cliniques chez l'homme sont en cours. Nous souhaitons ici évaluer des approches plus performantes que les traitements habituels et profiter d'une délivrance par ultrasons. Avec le développement en cours des ultrasons chez l'homme, les méthodes que nous proposons pourraient être rapidement bénéfiques chez l'humain. Dans le cas du syndrome X fragile, une maladie génétique, nous souhaitons évaluer le potentiel des ultrasons pour réaliser de la thérapie génique. Cette approche pourrait permettre de corriger, au niveau génétique, des anomalies localisées dans le cerveau.
Procédures
Suivant les procédures, une partie des animaux subiront des chirurgies sous anesthésie et n'excedant pas 30 minutes. Tous les animaux seront exposés à des tests d'imagerie médicale pour une durée maximale de 2h, anesthésie incluse. Les animaux peuvent être amenés à participer à plusieurs séances d'imagerie (8 au maximum), dans ce cas celles-ci seront espacées d'au moins 24h. Pour les besoins de l'imagerie médicale effectuée dans ce projet, une partie des animaux recevront une injection d'agent de contraste. Tous les animaux recevront une séquence ultrasonore ainsi qu'une injection intraveineuse d'une solution de microbulles. Les injections de produits à visée thérapeutiques sera aussi effectuée sur une partie des animaux.
Impact sur les animaux
L'utilisation des ultrasons focalisés guidés par imagerie de résonance magnétique peuvent provoquer une inflammation transitoire du cerveau qui se résorbe au bout de quelques jours. Cette inflammation est un effet normal dû à cette procédure qui ne provoque pas de dommages apparents pour l'animal. Si des effets néfastes sont visibles en imagerie, les animaux seront mis à mort sans réveil.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Le projet portant sur l’étude de la réponse d’organe entier (cerveau), et plus particulièrement la frontière à l'interface entre le système vasculaire et le système nerveux central, il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. De plus, il n'existe pas à ce jour de méthodes alternatives, n'impliquant pas d'animaux vivants, qui permettent l'étude de l'effet sur le cerveau du passage de particules virales à travers la barrière grâce aux ultrasons. L’étude qui en découle comporte des analyses biologiques afin d'évaluer l’impact des ultrasons qui ne sauraient être remplacés par un modèle informatique ou cellulaire.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé avec l’aide d’un logiciel permettant d’évaluer le nombre d’animaux minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives sur les paramètres à mesurer (données préliminaires obtenues dans d’autres expériences). Ce nombre tient compte des risques de mort et d’exclusion d’un animal lors des différentes procédures. Le nombre d’animaux nécessaires à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats.
Raffinement
Les animaux seront herbergés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l'hébergement des animaux fixés par le ministère, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l'environnement. Toutes les mesures seront prises pour réduire la souffrance des animaux. L’ensemble des expérimentations seront réalisées sous anesthésie adaptée. Dans le cas où certains signes seraient observés, un traitement antalgique adapté sera mis en place.
Choix des espèces
L’ensemble des animaux sera utilisé à l'âge adulte (6 à 9 semaines pour la souris et 6 à 8 semaines pour le rat).
Rôle du récepteur nucléaire PPARy dans la fibrose médullaire et dans le soutien du tissu hématopoïétique.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
536 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une irradiation, une greffe de cellules hématopoïétiques sous anesthésie et jusqu'à six prélèvements de sang, pour étudier le rôle du récepteur PPARγ dans la fibrose de la moelle osseuse au cours de la myélofibrose, un cancer du sang. Le porteur indique que la maladie peut réduire la prise de poids et augmenter la taille de la rate, et que les souris sont tuées en fin d'expérience pour l'examen des fémurs, seuls les reproducteurs de la lignée étant gardés vivants. Sur le remplacement, il affirme qu'il reste impossible de reproduire in vitro la complexité du microenvironnement médullaire et conclut que la validation passe par le modèle murin.
Objectifs
La production des cellules sanguines (hématopoïèse) est réalisée au niveau de la moelle osseuse et résulte d’une interaction fine entre les cellules progénitrices (qui peuvent se diviser et donner les cellules du sang) et les cellules stromales qui sont une composante du microenvironnement de la moelle osseuse. La myélofibrose (MF) est un cancer du sang rare caractérisé par une fibrose de ces cellules stromales entrainant une altération de la production des cellules sanguines. C’est une pathologie grave, avec une médiane de survie de 5 à 6 ans. Il a été rapporté que l’activation du récepteur nucléaire (PPARγ) par des molécules pharmacologiques entraîne une réduction de la fibrose dans des modèles murins de MF. Ces résultats en font une une cible thérapeutique intéressante dans une pathologie où les traitements agissent principalement sur les symptômes de la maladie. Dans l’objectif d’utiliser des médicaments ciblant PPARy dans le traitement de la MF, il est impératif de caractériser le rôle physiologique de PPARy dans le stroma de la moelle osseuse. Pour répondre à cette question, un stroma médullaire murin qui, par l’utilisation d’une technique de génie génétique, n’exprime pas PPARy a été développé. Il récapitule des caractéristiques de la fibrose médullaire avec notamment une altération des capacités à soutenir l’hématopoïèse. Les premiers résultats obtenus in vitro ne permettent pas l’étude du rôle de PPARy dans toutes les composantes de l’hématopoïèse. Pour cela nous prévoyons de développer des systèmes d’étude plus complexes faisant appel au modèle murin. Nous mettrons en place une co-culture de cellules progénitrices hématopoiétiques murines et humaines sur stroma normal (WT) ou invalidé (KO) qui sera transplanté dans des modèles murins pour l’étude de leur hématopoïèse. La même approche sera utilisée avec des cellules progénitrices provenant d’hémopathies afin d’étudier l’effet sur une hématopoïèse pathologique En parallèle de cette étude un modèle murin d’invalidation (KO) de PPARy spécifiquement dans les cellules du stroma de la moelle osseuse sera développé. Il permettra après traitement par une molécule stimulant la MF de déterminer si la sensibilité à la fibrose est corrélée à l’expression de PPARy dans les cellules du stroma de la moelle osseuse. Enfin, on étudiera dans ce modèle la manière dont se développent différents cancers du sang afin de déterminer si la fibrose médullaire impacte l’histoire naturelle de ces maladies.
Bénéfices attendus
La myélofibrose (MF) est la plus grave des néoplasies myéloprolifératives (NMP) (famille de cancer du sang comprenant également la polyglobulie de Vaquez (PV) et thrombocytémie essentielle (TE) avec une médiane de survie de cinq à six ans. Les traitements actuellement disponibles ciblent principalement les symptômes et n’ont que peu d’influence sur l’histoire naturelle de la maladie. Seule la greffe de moelle osseuse est curative mais elle ne concerne qu’une faible minorité de patients qui sont éligibles au traitement. Récemment, il a été démontré que l’activation du récepteur nucléaire PPARy par ses ligands pharmacologiques permettait de réduire le développement anormal de la densité osseuse (ostéosclérose) et de la fibrose médullaire dans trois modèles précliniques murins de la MF. Au cours de ce projet, nous souhaitons caractériser la fonction physiologique de PPARy au sein des cellules du microenvironement de la moelle osseuse (stroma médullaire) qui supportent la production des cellules sanguines et sont les cibles de la fibrose. Nous souhaitons ainsi démontrer que PPARy est un acteur clé de la prévention du développement de la fibrose médullaire, de l’ostéosclérose et de la capacité des cellules mésenchymateuses à soutenir l’hématopoïèse. L’ensemble de ces travaux a pour objectif de mieux caractériser en quoi PPARy peut être une cible thérapeutique ouvrant de nouvelles stratégies de prise en charge (en monothérapies ou associées au traitement conventionnels) des NMP et particulièrement de la myélofibrose. Ces résultats pourront également être étendus à d’autres organes dont les pathologies impliquent le développement d’une fibrose. Dans un contexte plus général ce travail permettra également de mieux comprendre et appréhender la part relative au stroma médullaire dans le développement des hémopathies et le potentiel intérêt d’un ciblage thérapeutique du stroma en plus de celui des cellules hématopoïétiques. Des molécules pharmacologiques ciblant PPARy étant déjà sur le marché, ce travail permettra également d’envisager leur repositionnement thérapeutique dans la prise en charge de la MF.
Procédures
Les animaux seront soumis au maximum à : - Une irradiation : procédure indolore, réalisée en maintenant les groupes sociaux définis, et durant une dizaine de minutes. - Une unique injection pour chaque animal (animal sous anesthésie générale et analgésie) de cellules hématopoïétiques normales ou pathologiques. Cette intervention ne dure que quelques minutes et se déroule sous un contrôle permanent pour veiller à la bonne anesthésie, l’absence de douleur et gérer le réveil. - Des prélèvements de sang : pour le suivi de l’hématopoïèse, réalisés sur animaux vigiles sur une durée ≤ à une minute, avec un délai minimum de 3 semaines entre chaque prélèvement et un nombre maximum de 6 prélèvements - un traitement par injection impliquant un geste d’une durée inférieur ou égale à une minute sur une période maximale de 3 semaines.
Impact sur les animaux
L’irradiation, l’anesthésie, la transplantation de cellules hématopoïétiques, les injections sous-cutanées et les prélèvements de sang au niveau de la veine faciale peuvent engendrer du stress chez la souris. Le développement d’une hématopoïèse pathologique peut également engendrer des modifications des constantes hématologiques avec notamment une augmentation de plaquettes et/ou de l’hématocrite, qui peuvent à terme générer de la fibrose et une diminution de production des cellules sanguines, ainsi qu’une augmentation de la taille de la rate. Durant le développement des hémopathies PV, TE, MF la prise de poids des animaux est réduite.
Devenir
Les analyses de la fibrose de la moelle osseuse ce font par examen histopathologiques des fémurs ce qui nécessite l’euthanasie des animaux à la fin de chaque expérimentation. Seuls les animaux reproducteurs seront maintenus en vie. En effet, si le modèle murin d’invalidation de PPARy dans les cellules stromales médullaires apporte les résultats escomptés, il pourra être utilisé pour d’autres hémopathies ou pour des questions plus fondamentales d’étude de la communication entre le microenvironnement et les cellules hématopoïétiques. Il constituera donc un intérêt pour la communauté scientifique et pourra être pérennisé.
Remplacement
Au cours de ce projet, une grande partie des expériences seront menées in vitro, cependant en raison de la complexité et du nombre d’intervenants cellulaires et matriciels composant le micro-environnement médullaire et régulant l’hématopoïèse, il est actuellement impossible de mimer la physiologie médullaire par des modèles exclusivement in vitro. Nos modèles in vitro seront donc utilisés autant que faire se peut afin de mettre au point les protocoles et de générer les résultats préliminaires, mais ils nécessitent néanmoins d’être validés dans des modèles in vivo murins dans un second temps. D’autre part, ce projet a pour objectif de caractériser la pertinence du ciblage thérapeutique de PPARy dans la myélofibrose. Il est donc important de valider sa fonction dans des modèles murins précliniques, validés et reconnus, de cette pathologie.
Réduction
Dans l’ensemble des expérimentations associées à cette demande les animaux sont hébergés en groupe (n=5 individus par cage). Nos expériences précédentes nous ont montré que pour une condition expérimentale en analyse non-paramétrique un minimum de deux boites (dix individus) était nécessaire. Le nombre d’expérimentations indépendantes pour chaque condition est réduite à 2 (pour vérifier la reproductibilité entre expérience). Lorsque cela était possible, nous avons choisi de réaliser des greffes compétitives. Cette stratégie présente deux avantages, 1) elle augmente la sensibilité en permettant de comparer les conditions au sein d’un même individu ce qui réduit dans les analyses de groupe la variation inter-individu et permet de réduire les effectifs, 2) chaque individu étant son propre contrôle cela permet de supprimer le groupe contrôle et de limiter encore le nombre d’animaux.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, les souris seront hébergées en groupe, avec des éléments d’enrichissement. Elles seront surveillées régulièrement pour limiter tout mal-être éventuel en accord avec les critères d’évaluation de l’état général des animaux. Certains critères biologiques spécifiques comme le taux l’hémoglobine seront également monitorés et pris en compte comme point limite. Les interventions de transplantation seront pratiquées sous anesthésie générale et analgésie en limitant la durée de l’anesthésie et en assurant un maintien de la température corporelle grâce à un tapis chauffant et de l’hydratation des yeux grâce à un gel oculaire. Les animaux sont traités par antibiotiques durant les 3 semaines post-transplantation pour limiter le risque d’infection. Les prélèvements de sang seront faits par voie sub-mandibulaire afin d’être le moins douloureux possible et seront espacés d’au moins 3 semaines.
Choix des espèces
Le modèle rongeur nous semble le plus adapté car c’est historiquement un modèle de prédilection pour l’étude de l’hématopoïèse. C’est un modèle bien établi, validé par la communauté scientifique, et qui fait l’objet de nombreuses publications scientifiques. Les modèles précliniques des différentes hémopathies étudiées, la leucémie myéloïde chronique (LMC), la thrombocytémie essentielle (TE), la polyglobulie de Vaquez (PV) et la myélofibrose (MF) sont établis dans le modèle rongeur. Travailler sur la même souche murine apporte une pertinence à la comparaison entre nos données. Que cela soit pour obtenir une meilleure prise de greffe, ou pour avoir la possibilité de suivre le développement de la pathologie au cours du temps, nous devons utiliser des animaux jeunes (8 semaines).
Evaluation de la sécurité de dispositifs alternatifs à la chirurgie bariatrique dans le modèle porcin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
24 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie endoscopique de deux à trois heures pour la pose d'un dispositif anti-obésité, puis six anesthésies générales échelonnées sur trois mois pour des radiographies et des prises de sang, avant d'être tué et disséqué. Le porteur reconnaît une série de complications possibles, lésions digestives, infection, obstruction, déplacement du dispositif et carences. Le projet teste, pour une entreprise, la sécurité d'une alternative endoscopique à la chirurgie bariatrique, présentée comme "nécessaire" faute d'adhésion des patients à la chirurgie actuelle.
Objectifs
Le traitement de l’obésité est un enjeu sanitaire majeur. L’objectif du projet est de développer un dispositif médical délivré par voie endoscopique (c’est-à-dire par la bouche et l’œsophage) afin de traiter l’obésité. La solution proposée serait une alternative à la chirurgie bariatrique (chirurgie traitant l’obésité) tout en étant aussi efficace que celle-ci et en minimisant les complications associées. En effet, la chirurgie bariatrique est pratiquée sur moins de 2% des patients éligibles en France, ceci étant notamment dû aux complications associées. Une première phase de tests a été réalisée sur des modèles in vitro (en laboratoire) et ex vivo (cadavres humains et animaux). La seconde phase, sur modèles in vivo (animaux) et objet de cette demande d’autorisation, a pour objectif de développer un dispositif avec la simulation des phénomènes physiologiques attendus chez les patients humains (en particulier le phénomène de péristaltisme, c'est-à-dire le phénomène de contractions permettant aux aliments d'avancer dans le système digestif). Dans un premier temps la sécurité du dispositif doit être testée. Si cette phase est validée, nous collecterons, dans un second temps, des données sur la performance de notre approche. Ainsi, au final, la phase animale nous permettra de développer un produit permettant de répondre à la problématique, de tester son innocuité et de mesurer son efficacité. Les données sur l’efficacité seront complétées par celles disponibles dans la littérature. Actuellement, l’implantation du dispositif par voie chirurgicale chez le porc est privilégiée puisque l’anatomie de ce modèle rend l’approche endoscopique complexe.
Bénéfices attendus
L’obésité est définie comme une présence anormale ou excessive de tissu adipeux représentant un risque pour la santé. Ce problème est devenu épidémique avec près de 4 millions de personnes décédant de comorbidités liées au surpoids et à l’obésité chaque année. D’après l’Organisation Mondiale de la Santé, près de 39% des adultes dans le monde, représentant près de 1.9 milliards de personnes, étaient en surpoids en 2016. On estime aujourd’hui que plus de 700 millions de personnes souffrent d’obésité. Bien que l’efficacité de la chirurgie bariatrique ne soit plus à démontrer, seul 2% des patients éligibles décident de se faire opérer à cause du risque de complications sévères et des modifications anatomiques irréversibles. Et pour les solutions moins invasives, comme les ballons gastriques, elles sont aujourd’hui associées à une perte de poids limitée et temporaire. Ce projet est nécessaire pour le développement d’une solution endoscopique afin de traiter l’obésité de manière aussi efficace que la chirurgie bariatrique tout en minimisant les complications associées. En effet, il permettra de vérifier la sécurité et potentiellement l’efficacité des dispositifs testés par l’entreprise.
Procédures
Pour chaque porc : • L’intervention chirurgicale sous anesthésie générale qui dure 2-3 h maximum avec radiographie et prélèvement sanguin au cours de cette anesthésie • Sous anesthésie générale à J0, J7, J14, J30, J60 et J90 soit 6 au total : o Les radiographies : chaque examen radiographique prenant 45 min, il y en a 6 au total o Les prélèvements sanguins sont réalisés au même moment que les radiographies. Chaque prélèvement prenant environ 2-3 min, il y en a 6 au total
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus résident surtout dans la douleur suite au placement du dispositif. Néanmoins, la littérature décrit une série de complications éventuelles : • Lésion du système digestif ; • Infection avec ou sans fièvre ; • Obstruction gastrique ou intestinale ; • Déplacement ou rotation du dispositif implanté ; • Carence en vitamines et minéraux ; • Trouble du transit ; • Vomissement ponctuel post-implantation ; • Réaction inflammatoire locale des tissus. Notre protocole prévoit de surveiller et anticiper ces complications.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort. Pour comprendre l’impact du prototype et statuer sur sa sécurité, il est nécessaire d’inspecter, d’examiner et photographier les zones entourant le dispositif incluant les muqueuses et les organes. Suivant la phase du projet, des prélèvements d’organes pourront être effectués pour observations macroscopiques et analyses histologiques.
Remplacement
Ce projet vise à confirmer l’adéquation du dispositif en cours de développement avec le système digestif. Avant d’initier ce projet, des essais sur sujets cadavres humains et sur carcasses d’animaux ont été effectués afin de simuler la procédure et confirmer l’adéquation des dimensions des prototypes en cours de développement. Des premiers essais pour valider la sécurité ont été menés sur animaux vivants. Les tests de cette présente DAP s’inscrivent dans la continuité de ces tests en affinant les prototypes évalués précédemment. De plus, des essais in vitro ont été réalisés en laboratoire afin de simuler le déploiement du dispositif ainsi que son comportement lors de contraintes mécaniques simulant le péristaltisme. Néanmoins, la complexité et l’adaptabilité du système digestif limitent notre capacité à simuler l’environnement exact. Le dispositif étant à visée clinique, il est nécessaire d’obtenir des données dans ces conditions réelles d’utilisation, ainsi l'utilisation d'un organisme complet et vivant est indispensable, notamment pour le suivi post-implantation.
Réduction
Avant d’effectuer une étude de preuve de concept, une étude pilote a été réalisée en utilisant un nombre réduit d’animaux. Cette étude nous a permis d’obtenir des estimations de l'effet et de la variation qui peuvent servir à calculer la taille de l'échantillon d'études plus importantes. Avant d’effectuer l’étude de confirmation, une première phase de preuve de concept a été initiée en janvier 2023 en utilisant un nombre réduit d’animaux (n=10). Pour arriver à une confirmation de cette preuve de concept, un nombre de 9 animaux est nécessaire sur une base de 3 sessions de 3 animaux. Dans le cas où un nombre inférieur à 9 animaux permettrait de prouver la preuve de concept, la phase 2 sera initiée et la phase 1 terminée sans utiliser les 9 animaux initialement prévus. La preuve de concept sera démontrée si le dispositif répond aux attentes c’est-à-dire s’il est bien toléré et les données obtenues sont concluantes, notamment : paramètres cliniques acceptables, tolérances locales macroscopique et microscopique acceptables (évaluées par un pathologiste indépendant), troubles digestifs acceptables, absence d’obstruction gastrique. Dans le cas où la preuve de concept est démontrée (avec un nombre d’animaux ≤ 9), il sera décidé de passer à la phase 2 du projet (vérification). Pour cette phase, un nombre de 15 animaux sera nécessaire : 3 groupes de 5 animaux (un groupe avec suivi jusqu’à 1 mois, un groupe suivi jusqu’à 3 mois et un groupe contrôle). Dans le cas où la preuve de concept n’est pas démontrée, il sera décidé de relancer une étude afin d’améliorer les caractéristiques du dispositif, si celui-ci ne répond pas aux attentes. Cette étape permettra de réduire le nombre d’animaux (ne pas utiliser les 15 animaux prévus en phase 2).
Raffinement
Les porcs seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec enrichissements propres à l’espèce. Des enrichissements du milieu, tels que jouets en caoutchouc, sont mis à disposition. Les animaux auront un patch de fentanyl 3 jours après la chirurgie protégé par un bandage. Un isolement individuel pendant 24h après la chirurgie sera nécessaire afin de suivre individuellement l’état clinique des animaux (vomis, selles et urines). Pour compenser cet isolement de 24h, les animaux seront hébergés dans des box attenants avec contact olfactif et visuel. De plus, la température de la salle d’hébergement sera maintenue à 21± 2°C. Le suivi quotidien des animaux et les pesées hebdomadaires sont assurés par le personnel technique et animalier habilité et habitué à travailler avec ces animaux. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. Tout acte douloureux ou fortement stressant sera réalisé sous sédation ou sous anesthésie (locale ou générale selon les besoins). La douleur sera prise en charge par l'administration de traitements analgésiques adaptés. En cas de perte de poids importante se rapprochant des 20%, les rations pourront être enrichies avec une solution de nutrition entérale hyperénergétique. Au cours de l’étude, une série d’examens sera effectuée afin de détecter les signes de douleur incluant : - Examens du comportement des animaux avec pesée au minimum hebdomadaire ; - Rayons-X avec ou sans agent de contraste (si indisponible échographie) ; - Examens sanguins afin de confirmer l’absence de carence et de signe d’infection.
Choix des espèces
Le Porc est l’espèce animale la plus étudiée dans la littérature pour la chirurgie bariatrique. En effet, elle possède de grandes similarités avec les humains au niveau du système gastro-intestinal en termes de dimensions et de physiologie. Pour les porcs, le critère de sélection principal sera le poids (environ 60-80 kg) afin d’avoir des correspondances anatomiques similaires à celles observées en clinique. Cela correspondra à des animaux adolescents.
Etude des déplacements des salmonidés migrateurs dans les petits fleuves côtiers
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
120 saumons atlantiques et truites de mer vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, relâchés dans le milieu naturel après pose du matériel puis, pour une partie, recapturés et tués. Chaque poisson reçoit sous anesthésie un émetteur inséré dans l'estomac par la bouche et une puce RFID par trocart, un geste que le porteur décrit comme induisant un malaise passager et une douleur modérée. Les individus sont suivis par radiopistage jusqu'à la reproduction, certains mourant naturellement ou par pêche, d'autres euthanasiés à la recapture pour récupérer l'émetteur. L'étude vise à décrire la recolonisation d'un bassin côtier après l'arasement de barrages.
Objectifs
Les populations de saumon Atlantique et de truites de mer (Salmonidés) ont chuté de 70% depuis les années 1970. La France abrite des populations de ces espèces qui ont une très forte valeur patrimoniale et leur conservation est un enjeu fort. La fragmentation des cours d'eau par des ouvrages comme les barrages est une des causes principales du déclin de ces espèces et la reconnexion des habitats essentiels à l’accomplissement du cycle de vie est un levier pour gérer les populations. L'objectif du projet est d'évaluer les modalités de recolonisation, par les salmonidés migrateurs amphihalins, d'un bassin versant côtier suite à l'arasement de grands barrages. entre 2019 et 2022, une première phase du projet a eu vocation a décrire les déplacements des poissons dans le bassin versant avant l'arasement du barrage et a fourni un état de référence.
Bénéfices attendus
Les connaissances produites sur le comportement des poissons permettront de mieux gérer les populations en protégeant leur habitat par exemple.
Procédures
Les animaux sont soumis à 2 interventions consécutives (réalisées lors de la même anesthésie) et ponctuelles dans la même procédure : l'insertion d'un émetteur dans l'estomac via la bouche et l'oesophage à l'aide d'un tube poussoir et l'insertion d'une puce RFID pour l'identification à l'aide d'un trocart.
Impact sur les animaux
L'insertion d’un émetteur radio dans l’estomac par la bouche est susceptible d'induire un malaise passager (par la suite, la présence de l'émetteur dans l'estomac par la suite est supposé ne pas être problématique car les individus ne s'alimentent plus à ce stade de leur développement). L'insertion d’une puce électronique RFID pour identification à l'aide d'un trocart dans la cavité générale des salmonidés est susceptible d'induire une douleur modérée. Ces interventions sont réalisées sous anesthésie de façon à limiter les nuisances.
Devenir
Après l'insertion du matériel biologique entre juin et août, les poissons sont relâchés dans le milieu naturel pour être suivi par radiopistage jusqu'à la reproduction qui a lieu en décembre. A l'issue de cette période, soit les individus sont morts naturellement ou par pêche, soit ils sont recapturés après la reproduction et euthanasiés par surdose d'anesthésique de façon à récupérer l'émetteur et les données enregistrées.
Remplacement
L’objectif étant l’apport de connaissances sur les comportements migratoires et l’utilisation de l’habitat de ces deux espèces en milieu naturel, le remplacement est impossible.
Réduction
Le nombre annuel d’adultes du genre Salmo (40, essentiellement des saumons, les truites de mer étant très rares dans les captures) résulte d'un compromis entre 3 éléments : 1- la nécessité de ne pas impacter significativement les populations sauvages (par ailleurs sujettes à la pêche de loisir) et la difficulté de capturer les individus. 2- l'acquisition d'une quantité de données suffisante pour fournir une image de la diversité des comportements. L'expérience de 4 années de suivi montre que les comportements varient entre individus au sein d'une année, mais également d'une année à l'autre (en lien avec les conditions environnementales notamment). Ainsi, l'accumulation de données sur plusieurs années est nécessaire pour bien décrire la migration des salmonidés. 3- Il existe une mortalité naturelle et liée à la pêche de loisir (cette dernière pouvant atteindre 10% des effectifs de poissons étudiés) qui réduit les effectifs au cours de l'étude.
Raffinement
Les principales mesures de raffinement concernent la limitation des nuisances (angoisse et douleur) lors de la manipulation des animaux avant, pendant et après les procédures. Les poissons capturés seront anesthésiés avant toute manipulation. Les conditions environnementales d'importance première pour les poissons (température et oxygénation de l'eau) seront contrôlées avant, pendant et après la capture et l'opération. Les individus seront gardés en observation dans un vivier placé dans la rivière afin de contôler la façon dont ils récupèrent de l'anesthésie et seront relâchés lorsqu'ils auront retrouvé un comportement actif normal (équilibre dans la colonne d'eau, nage).
Choix des espèces
Les populations de saumon Atlantique et de truites de mer (Salmonidés) ont chuté de 70% depuis les années 1970. La France abrite des populations de ces espèces qui ont une très forte valeur patrimoniale et leur conservation est un enjeu fort. La fragmentation des cours d'eau par des ouvrages comme les barrages est une des causes principales du déclin de ces espèces et la reconnexion des habitats essentiels à l’accomplissement du cycle de vie est un levier pour gérer les populations. L'objectif du projet est d'évaluer les modalités de recolonisation d'un bassin versant côtier suite à l'arasement de grands barrages par les salmonidés migrateurs amphihalins. Les individus seront des adultes de retour en rivière après la phase de croissance en mer. Les connaissances sur ce stade de vie sensible sont encore très éparses, mais on sait que les individus sont exposés à de multiples stress en particulier les modifications de la continuité écologique qui peut réduire l'accès aux sites de reproduction situés en amont.
Évaluation de nanoparticules de polymère magnétiques dans un modèle de souris immunodéprimées portant des xénogreffes orthotopiques de cellules tumorales mammaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
374 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un implant hormonal sous chirurgie, une greffe de cellules de cancer du sein dans la glande mammaire, des injections répétées de nanoparticules magnétiques, l'application d'un champ magnétique et des séances d'imagerie, avant d'être tuées pour prélèvement des tumeurs et des organes. Le porteur indique un risque d'infection, de nécrose tumorale, de perte de poids et de lésions liées aux injections. Les nanoparticules sont présentées comme une alternative "moins coûteuse" aux anticorps conjugués contre les cancers triple négatifs.
Objectifs
Malgré les avancées notables dans la prévention, le dépistage et la prise en charge du cancer du sein, celui-ci reste un problème de santé publique majeur en raison de ses taux alarmants d’incidence et de mortalité prématurée dans le monde. Le cancer du sein est une maladie très hétérogène. Les cancers mammaires les plus agressifs et les plus résistants aux traitements conventionnels sont appelés triples négatifs. C’est pourquoi développer des nouvelles thérapies capables de cibler spécifiquement ce type de cancer est plus que nécessaire. A ce titre, des anticorps conjugués à des médicaments (ADC) ont été récemment développés et mis sur le marché. Cependant, la production d'ADC est très complexe, longue et surtout coûteuse. Il est donc nécessaire de développer une alternative aux ADCs offrant une nouvelle voie pour le traitement du cancer. Notre projet s’inscrit dans cette logique. Notre objectif est de proposer un nouveau concept de ciblage des tumeurs mammaires en utilisant des nanoparticules magnétiques de polymères emprisonnant des médicaments. La délivrance de ces derniers se fera grâce aux propriétés d’échauffement local des nanoparticules magnétiques sous champ magnétique alternatif (AMF), permettant un contrôle spatio-temporel du relargage du médicament ainsi encapsulés dans le polymère.
Bénéfices attendus
Le projet présente plusieurs bénéfices pour la santé humaine. En effet, ces nanomatériaux, rapides et moins coûteux à synthétiser, présentent de nombreux avantages par rapport aux anticorps conjugués à des médicaments développés récemment. Ils sont faciles et rapides à synthétiser, très peu couteux, présentent une bonne biocompatibilité, sont capables de traverser la membrane cellulaire en absence de toutes réponse immunogène. Cette approche permet de délivrer de façon spatio-temporelle des médicaments anti-cancéreux grâce à ses propriétés de ciblage et de délivrance contrôlée. Ainsi, notre approche transforme potentiellement des agents thérapeutiques non spécifiques avec des effets secondaires prononcés en un système thérapeutique ciblé utile pour la médecine de précision.
Procédures
Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de cancers mammaires et à leurs traitements. Les différents gestes réalisés sur les souris incluront au maximum les étapes suivantes en fonction des questions scientifiques : i) Pose chirurgicale d’un pellet contenant des hormones en sous-cutanée sous anesthésie et analgésie (1x/animal, 5-10 minutes) ii) Injections unique orthotopiques dans la glande mammaire de cellules tumorales sur animal vigile (15 seconde/animal) iii) Suivi du poids et de la croissance tumorale mesure de la taille de la tumeur 3 fois par semaine (2 minutes/animal) iv) Injection intraveineuse ou intra-tumorale des nanoparticules sur animal vigile (1x/semaine, 2min/animal pendant 28 jours soit 4 injections/animal) v) Imagerie sur animal anesthésié (1x/vie, 30 min) vi) Application d’un champ magnétique alternatif sur animal vigile (4x/vie, 30min-1heure) vii) Euthanasie selon une méthode réglementaire à la fin de la procédure et prélèvements des tumeurs et des organes pour analyse.
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables attendus dans ce projet sont : i) le risque infectieux et la sensation de douleur, conséquence potentiel de la pose d’implants d’œstrogènes nécessaire au développement préalable des glandes mammaires avant de pouvoir greffer les cellules cancéreuses. ii) le risque d’une croissance tumorale importante pouvant entrainer dans les cas les plus sérieux : une nécrose des tissus (peu probable d’après notre expérience sur le modèle), des difficultés de mobilité, ou encore une perte de poids. iii) le stress et le risque de lésion au niveau de la queue ou de la tumeur suite aux injections des nanomatériaux par voie intraveineuse ou intra-tumorale. iv) les risques liés aux anesthésies (hypothermie, hypoventilation, arrêt cardio-respiratoire, etc.) v) le stress potentiel pour les animaux lors du transport des animaux sur un autre site en vue de l’imagerie.
Devenir
A la fin des différents actes et de la période de maintien prévu, l’ensemble des animaux (n=374) sont euthanasiés par une méthode réglementaire en vue de réaliser les différents prélèvements. Les tumeurs et les organes seront récupérés et analysés.
Remplacement
Les études in vitro déjà menées ont permis de sélectionner/affiner au mieux les conditions expérimentales du projet afin de réduire au maximum le nombre d’animaux impliqués dans cette étude. En effet, cette étude doit être conduite in vivo car celle-ci prend en considération la tumeur, son environnement ainsi que l’ensemble des interactions mises en jeu. Ainsi, il n’y a pas de modèles alternatifs au modèle animal permettant de recréer l’ensemble des acteurs impliqués dans le développement tumoral et l’action des traitements proposés. Nous avons besoin d’un modèle qui mime ce qui se passe en clinique chez les patients traités. Travailler sur des cellules en culture cellulaire ne permet pas de répondre à ce que sera l’efficacité d’un médicament sur une tumeur en trois dimensions et avec son microenvironnement. C’est pourquoi, le modèle de xénogreffe chez la souris permet de créer un modèle d’étude qui se rapproche de celui observé chez les patients.
Réduction
Le projet impliquera un total de 374 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Notre procédure expérimentale a été affinée pour éviter l'utilisation inutile de souris. Une étude pilote sur 20 animaux permettra d’optimiser les conditions expérimentales en validant le modèle murin ayant le meilleur taux de prise de greffe permettant par la suite de réduire la taille des groupes (moins de variabilité). L’étude de biodistribution sera réalisée sur des groupes de 3 souris maximum. Enfin, chaque groupe de traitement comportera 10 souris au total. Par ailleurs, l'analyse statistique sera réalisée avec les tests adaptés. Pour ce faire, nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.).
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris est un mammifère comme l’Homme, la souris Nude est l’un des rares modèles permettant de créer des xénogreffes de tumeurs humaines sans qu’il n’y ait de rejet du non-soi (modèle immunodéficient). Enfin, la réglementation demande à ce que tout développement de médicaments soit testé chez deux modèles animaux différents avant toute administration chez l’humain. La souris est le modèle le plus utilisé en première ligne et il permet d’acquérir un grand nombre d’information dans un temps relativement court. Description du ou des modèle(s) : Nous utiliserons des souris Nude qui présentent une mutation de leur système immunitaire. Les souris peuvent ainsi recevoir des cellules d’une autre espèce (l’homme dans le cas présent), et il n’y aura pas de réaction du non-soi, les cellules injectées pourront alors pousser sans être rejetées. Le choix de la souche de souris Nude sera effectué à la suite d’une étude pilote nécessaires pour optimiser les conditions de prise des xénogreffes et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaire au projet. Justification du stade de développement : Livraison des animaux âgés de 4 semaines. Début de l’expérimentation après deux semaines d’acclimatation soit à 6 semaines ; ce stade est couramment utilisé dans la littérature ce qui nous permettra de comparer nos résultats avec les données publiées.
Mise en place d’expériences de perception de signaux acoustiques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
80 souris vont être utilisées, réutilisées à l'issue pour d'autres mises au point, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent un marquage par perçage des oreilles au sevrage, puis des isolements de deux à vingt-quatre heures et jusqu'à trois tests de réaction à des cris ultrasonores de congénères. Le porteur affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu et que les animaux n'auront pas subi de "stress significatif". Le protocole prépare des études ultérieures sur des souris modèles de déficiences intellectuelles et d'autisme.
Objectifs
Les souris communiquent entre elles en utilisant principalement l’odorat, mais aussi le toucher, la vue et l’ouïe. En effet, les souriceaux isolés de la mère et du nid ainsi que les juvéniles ou adultes au cours des interactions sociales émettent des cris dans le domaine de l’ultrason, non perceptibles par l’Homme. Des études ont montré que ces cris de petits non sevrés déclenchaient de manière robuste le comportement de recherche de la mère et que les cris ultrasonores du juvénile ou de l’adulte pouvaient refléter la motivation pour l’interaction sociale. Les fonctions plus précises de ces signaux sont cependant encore peu détaillées. Dans ce projet, nous mettrons en place un protocole expérimental qui nous permettra d’évaluer les réactions comportementales des souris à la perception de cris ultrasonores de leurs congénères. Nous établirons donc un protocole permettant de tester la réaction de la mère lorsqu’elle perçoit les cris de ses souriceaux et un protocole permettant de tester la réaction des juvéniles et des adultes lorsqu’ils sont soumis à des enregistrements de cris ultrasonores de congénères.
Bénéfices attendus
La mise en place de ce protocole nous permettra de tester ultérieurement la perception des cris ultrasonores ainsi que d’identifier les régions du cerveau impliquées dans le traitement de ces signaux chez des souris modèles de déficiences intellectuelles et de troubles du spectre autistique.
Procédures
Les animaux subissent une identification par perçage des oreilles au moment du sevrage. Ce geste ponctuel réalisé en contention légère sur animal vigile ne dure que quelques secondes. Les souris juvéniles et adultes seront soumises à un isolement de 2h ou de 24h, respectivement. Ces durées sont maintenues au minimum pour augmenter leur motivation pour faire le test. Ces isolements ne seront pas répétés plus de trois fois chez chaque animal car ils s'habituent très rapidement aux manipulations de playback. Les animaux subissent aussi ensuite un test comportementa de playback (réaction à l'écoute de vocalisations ultrasonores) au maximum trois fois par animal; ce test dure au maximum 10 min.
Impact sur les animaux
Les souris juvéniles et adultes seront soumises à un isolement de 2h ou de 24h, respectivement. Ces durées sont maintenues au minimum pour augmenter leur motivation pour faire le test. Aucun effet indésirable lors du test n’est attendu. Aucun phénotype dommageable n’a été rapporté chez les lignées utilisées. Uniquement une partie des souris subira une légère douleur très ponctuelle lors du marquage à l’oreille au moment du sevrage. Les animaux seront soumis à un stress léger lors des tests comportementaux (isolement ponctuel et exploration d’un nouvel environnement).
Devenir
Les animaux utilisés seront donc conservés pour une réutilisation dans les mises au point de tests comportementaux non invasifs. Ils n’auront pas subi de stress significatif.
Remplacement
Pour évaluer la perception de signaux de communication, il est nécessaire d’étudier un organisme vivant dans son intégrité. L’utilisation d’animaux est donc nécessaire, et en particulier de la souris dans ce cas. En effet, cette espèce sera ensuite étudiée dans le cadre de modèle de maladies neuropsychiatriques d’origine génétique. La souris est une espèce suffisamment proche de l’Homme, physiologiquement et génétiquement, chez laquelle nous pouvons modéliser ces pathologies humaines.
Réduction
Les effectifs nécessaires ont été calculés par rapport aux études précédentes afin d’obtenir des résultats robustes. Les échantillons proposés permettront de vérifier si le test de mise au point donne les résultats attendus.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupes sociaux stables. Les temps d’isolement seront limités au minimum. Dans la procédure impliquant les mères allaitantes, le contact avec les petits sera maximisé, les séparations mère-souriceaux minimisées. Les animaux sont manipulés au moyen d'un tube pour réduire tout stress au minimum. Dans la procédure impliquant des juvéniles, les animaux rejoignent leur groupes sociaux dès la fin du test. Les animaux seront inspectés visuellement pour vérifier leur bon état corporel et leur vivacité; l'animal sera sorti de la procédure si besoin.
Choix des espèces
La souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique sont bien connues. De plus, les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. Comme le laboratoire utilise ces modèles, nous mettons au point les tests comportementaux pour les explorer. Les souris seront testées une fois au stade juvénile (22-35 jours) et au stade jeune adulte (8-12 semaines). Nous avons choisi ces âges car ils correspondent à des périodes critiques pour le test réalisé, suivant les publications existantes.
Mise au point de souris humanisées par du microbiote- EU2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont la gravité déclarée s'étale du "sans réveil" au sévère, alors que le porteur qualifie l'ensemble des actes de "sévérité légère". Des reproductrices axéniques reçoivent un gavage de microbiote de patients obèses, puis les animaux passent une imagerie sous anesthésie sans réveil, un isolement de vingt-quatre heures sans enrichissement et des injections irritantes. Les reproducteurs devenus trop vieux et les descendants au mauvais microbiote sont tués par dislocation cervicale, les autres après imagerie ou tests comportementaux pour analyse du cerveau. Le modèle est présenté comme "unique" pour relier microbiote et déclin cognitif.
Objectifs
Créer des colonnies de souris "humanisées" avec du microbiote issus de patients obèses avec des fonctions cognitives faibles ou fortes afin de démontrer la causalité et d'identifier pour isoler les bactéries d'intérêt. Etudier le rôle du microbiote sur les performances cognitives et émotionnelles des souris et ainsi développer des nouvelles stratégies thérapeutiques visant à ralentir le déclin neurocognitif associé à l'âge.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'établir un modèle unique et original de souris humanisées et stables, colonisées avec le microbiote de patients présentant un score faible ou élevé de fonction cognitive, qui peut être étudié sur plusieurs générations (F1, F2, F3) sans transplantation fécale sur les descendants. Ce modèle de souris axénique humanisé peut être utilisé pour identifier le rôle du microbiote dans la variation des fonctions physiologiques et physiopathologiques, et nous permettront l'étude de l'apparition des composantes cognitives similaires à l'être humain.
Procédures
Pour la procédure expérimentales 1, les souris reproductrices de deux lignées de souris axéniques, C57Bl/6J et Tg2576, recevront un gavage unique d'une solution de 200 ul. Pour la procédure 2, les souris seront, par une unique séance, mises dans l’imagerie non invasive qui est faite sous anesthésie pendant 2 heures. Pour la procédure 3, les souris doivent être isolées, sans aucun enrichissement pendant 24 heures. Dans la procédure 4, marquage des cellules progénitrices par injection intrapéritonéale peut être irritante.
Impact sur les animaux
Notre projet comporte des actes expérimentaux de sévérité légère. En effet la procédure1 consiste en 1/ un gavage unique avec du microbiote de patients obèses qui va coloniser le tube digestif des animaux, qui seront vigiles durant cet acte. Le geste est rapide, sans douleur, générant un stress léger du à la contention, 2/la collecte de fèces pour vérifier la colonisation de leur tubes digestifs, elle est sans douleur. La colonisation du tube digestif par un microbiote humain n’a pas à priori d’impact sur la santé des animaux dans la durée. Pour la procédure 2, des mesures de tissus adipeux seront fait par une technique d’imagerie non invasive (l’IRM) pour lesquels les animaux seront anesthésiés pour les immobiliser, ils ne seront pas réveillés avant leur mise à mort, évitant ainsi toute souffrance/stress. Pour la procédure 3, l'isolement durant 24h pour le phénotypage métabolique en temps réel. Le manque d'un enrichissement au quel les souris sont habituées (sopalin, donc elles ne peuvent pas faire un nid) et il n' y a pas de litière au fond des cages non plus, ce qui peut stresser la souris. Dans la procédure 4, marquage des cellules progénitrices par injection intrapéritonéale peut être irritante.
Devenir
Les reproducteurs devenus trop vieux (à l'âge de 6-8 mois), ainsi que les animaux de la descendance ne présentant pas le microbiote approprié seront mis à mort par dislocation cervicale. Il en va de même pour tout animal qui présenterait le moindre signe de souffrance. Les souris utilisées, pour la procédure 2, seront également euthanasiées à la fin de la séance d’IRM afin de prélever des tissus adipeux qui seront utilisés pour des analyses ex vivo (résonance magnétique nucléaire et lipidomique). Après tous les tests de comportement, les souris seront euthanasiées afin d'étudier l'anatomie du cerveau. Les associations entre les résultats anatomie des tissus et les fonctions cognitives ainsi que les états émotionnels seront évaluées pour comprendre comment l'anatomie du cerveau détermine leur fonction.
Remplacement
Notre étude vise à évaluer les effets de la transplantation de microbiote fécal humain sur les performances cognitives et émotionnelles de souris. Cela ne peut être fait que sur un modèle animal. Comme les animaux présentent un microbiote local, notre étude nécessite un modèle animal dans lequel ce microbiote résident est supprimé (c’est-à-dire, des souris axéniques). Celles-ci offrent la garantie de pouvoir étudier spécifiquement l’impact comportemental du microbiote transplanté. De tels modèles axéniques sont actuellement disponibles dans les espèces de souris. Nous proposons une approche unique et originale pour transplanter le microbiote fécal de patients obèses dans ce modèle de souris axéniques. Dans les études que nous réaliserons au laboratoire, nous serons amenés à tester ces souris axéniques transplantées et leur descendance pour lequel il a été montré une stabilisation du microbiote.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés est réduit pour atteindre une valeur minimale sans nuire à la qualité statistique des données. En outre, les souris seront réutilisées pour plusieurs expériences. Par exemple, après l'isolement dans les cages métaboliques, les souris seront mis à mort et prélever les tissus adipeux et le foie pour le profilage du microbiote tissulaire, afin d'obtenir un maximum de données en utilisant un nombre minimum d'animaux.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans une structure et des conditions parfaitement adaptées (élevage en isolateur, litière changée régulièrement, eau et nourriture à volonté, température et hygrométrie régulée,...) avec une surveillance quotidienne, week-end et jours fériés inclus. Les animaux bénéficient également d’un enrichissement de leur milieux (type feuille de cellulose, permettant une diminution du stress potentiel et la réalisation de petits nids par les animaux). Enfin, la souffrance éventuelle des animaux sera minimisée autant que possible et nous interviendrons immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance.tout animal présentant un aspect inhabituel : prostration, pelage terne et hirsute, traces de blessures infligées par les autres animaux sera isolé. Il fera l'objet d'une attention accrue et benéficiera de soins appropriés (désinfection des plaies ou accès facilté à la nourriture si nécessaire).Si aucune amélioration de son état n'est constaté, il sera mis à mort le plus rapidement possible pour eviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Afin d'étudier l'effet du microbiote, un modèle axénique sera nécessaire pour éviter les effets de la flore locale de l'animal hôte. Les espèces de souris axéniques sont actuellement disponibles. En plus, les modèles de souris sont des modèles bien adaptés à la recherche en neurosciences comportementales, car ils présentent une variété de comportements pertinents pour les maladies humaines. - Pour les souris de production, afin de générer la ligne de la souris, les animaux seront utilisés à l'âge adulte (2-8 mois) car il faut qu'ils aient atteints la maturité sexuelle pour permettre la reproduction. - Pour les souris en experimentation des souris adultes (6-18 mois) seront utilisées pour caractériser les phénotypes des souris dans ce projet et étudier leur évolution au cours du vieillissement.
ETUDE HISTOLOGIQUE SUR L’ORGANISATION TISSULAIRE D’UN HYDROGEL DE REVITALISATION PULPAIRE INJECTE DANS DES RACINES DES DENTS HUMAINES
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
102 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante sous la peau du dos des racines de dents humaines remplies d'un hydrogel ou de sang, pour quatre à douze semaines, avant de les tuer et de prélever les échantillons pour analyse. Le porteur décrit une douleur post-chirurgicale, un stress lié aux points de suture et une anxiété qu'il présente comme "attendue dans toute expérimentation animale". L'objectif est de valider un gel de revitalisation des dents nécrosées comme alternative à la dévitalisation chez de jeunes patients.
Objectifs
L’acte de dévitaliser les dents sur de jeunes patients peut-être éviter en préférant une thérapie régénérative (Traitement Endodontique Régénératif (TER) ou revitalisation pulpaire). Ce traitement se base sur l’obtention d’un tissu vascularisé à partir d’un caillot sanguin formé à l’intérieur de la racine de la dent nécrosée. Pour favoriser le développement d’un tissu de type pulpe dentaire à partir d’un caillot sanguin, au sein de notre laboratoire , a été développé un gel injectable dans la racine de la dent. Les études in vitro ont démontré la capacité de ces matrices sous forme de gel à former un tissu similaire à la pulpe dentaire, vascularisé et organisé. L’étape suivante vise à évaluer et à étudier le tissu formé dans des conditions in vivo chez le rat. Le modèle in vivo consiste en l’implantation sous-cutanée dans le dos du rat, de racines des dents humaines remplies avec les matériaux de revitalisation pulpaire. Pour notre étude, 10 racines remplies avec du gel (groupe test) et 10 racines remplies avec du sang (groupe contrôle) seront implantés sur 10 animaux par groupe. Chaque animal sera implanté avec 2 échantillons selon un modèle en split mouth : un échantillon « contrôle » et un échantillon « test ». Après la fin de la période d’implantation une étude histologique des tissus néoformés dans les racines sera réalisée. L’ensemble de ces résultats seront comparés avec les résultats des études in vitro.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans la continuité de l’étude des effets des biomatériaux pour la revitalisation pulpaire. Les bénéfices attendus de ce projet sont l’obtention d’un tissu en condition proche de la clinique dont les caractéristiques en termes de cellules, de fibres et de formation de vaisseaux sanguins et nerveux seraient proches de celles de la pulpe dentaire. L’étude de la formation du tissu par l’hydrogel en condition in vivo nous permettrait de valider la capacité de l’hydrogel à recréer un tissu proche de la pulpe qui pourrait ensuite être appliqué en condition réelle à l’intérieur de la dent d’un patient, afin de remplacer le processus de dévitalisation.
Procédures
Implantation sous cutanée des échanitillons dans la loge dorsale de l'animal pour une période de 4 et 12 semaines. Dans chaque animal nous allons implanter 2 échantillons - un échantillon "test" et un échantillon "contrôle". Après les deux périodes d'implantation les animaux seront autanasiés et les échantillons prélévés pour une étude histologique et immunohistochimique.
Impact sur les animaux
- Douleur post chirurgicale au niveau du site opératoire (gonflement, inflammation) due à la cicatrisation - Stress physique provoqué par les points de suture au niveau des incisions (excitation, comportement anormal des animaux qui peuvent essayer de se retirer les points) - L’anxiété est un effet indésirable attendu comme dans toute expérimentation animale.-
Devenir
A la fin des deux périodes d'implantation, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération et analyse des échantillons
Remplacement
Ce projet de recherche s’inscrit dans la suite d’études expérimentales in vitro concluantes qui peuvent donner lieu à l’application chez l’homme des biomatériaux proposés. C’est pourquoi, des études sur le petit animal doivent être entreprises pour confirmer le bénéfice in vivo et informer d’éventuels biais non révélés in vitro. Il n’existe pas d’alternatives non animales pour réaliser ce test in vivo. L’implantation de l’hydrogel à base de fibrinogène et du sang dans la racine dentaire humaine permettra de réaliser le test in vivo directement sur l’environnement du produit dans lequel il sera appliqué. En effet, cliniquement, l’hydrogel sera en contact avec le sang de l’hôte pour permettre la formation d’un tissu similaire à la pulpe dentaire humaine. L’implantation de nos échantillons dans le dos du rat offre un environnement avec des conditions de vascularisation similaire à la réalité clinique, ce qui augmente la significativité des résultats.
Réduction
La taille d’échantillon utilisé (racine dentaire humaine 10mm) nous permet d’implanter maximum 2 échantillons dans la loge sous-cutanée thoracique dorsale de deux côtés de la colonne vertébrale par animal. Ansi dans un animal nous allons implanter un échantillon "test" et un échantillon "controle". Cela va diviser par deux le nombre d' animaux necessaires pour tous les tests. Le résultat du nombre de sujets nécessaires est de 10 par groupe (soit 20 échantillons implantés) et par la période d’implantation pour l’étude principale et de deux animaux pour l’étude préliminaire au total 102 animaux. Cela détermine un nombre d' animaux implantés pour l’étude principale égal à 100. Les résultats seront groupés dans des fiches individuelles pour chaque animal.
Raffinement
les animaux seront isolés en post-opératoire afin d'éviter tout risque de blessure.Les rats disposeront dans leurs cages individuelles de modules de cœur de bois de peuplier qui permettent de développer l’activité d’exploration de l’animal et de participer à son bien être. L'environnement du rongeur est également enrichi avec frisottis de papier qui stimule les instincts de nidification et d'exploration de jeu. Le rythme circadien des rongeurs sera respecté. Les procédures ne débuteront que sept jours après réception des animaux pour diminuer le stress lié au changement d’environnement.Visites quotidiennes par le personnel qualifié de l’animalerie. Utilisation d'un anesthésique local en début de toute chirurgie .Mise en place d’un protocole antalgique adapté . En cas de signes clinique d'infection du site opératoire, nous lui administrerons un antibiotique.Mise en place d’une grille de score ,utilisation de points limites adaptés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance .
Choix des espèces
Le rat est un animal dont la taille et les proportions permettent la mise en place d’un protocole chirurgical pour l’implantation des racines dentaires humaines avec ces dimensions déterminées dans le dos du rat. L’implantation des biomateriaux pour la revitalisation de la pulpe dentaire et du sang dans la racine dentaire humaine permettra de réaliser le test in vivo directement sur l’environnement du produit dans lequel il sera appliqué. De plus le rat est un animal connu pour la rapidité de cicatrisation, sa résistance à la douleur et aux infections ainsi que sa bonne tolérance à l’anesthésie. Le rat dispose d'une qualité tissulaire proche de celle de l’homme ce qui nous permettra d’obtenir des conditions expérimentales proches des situations cliniques, augmentant ainsi la significativité des résultats. Animaux adultes : la taille suffisante pour l’implantation de deux échantillons par animal.
Rôle de K1K1 dans la stéatose hépatique non alcoolique (NASH) et la résistance à l’insuline.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
2 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses et diabétiques, elles reçoivent des injections répétées d'une protéine, la pose d'une pompe osmotique et d'un cathéter sous chirurgie, et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, avant d'être tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que la maladie du foie induite peut provoquer douleur, inconfort, inflammation et troubles du comportement. Le composé testé est présenté comme "prometteur" pour traiter le diabète et les maladies du foie, sur la base de données "préliminaires".
Objectifs
Ce projet vise à mettre en évidence que l'administration de K1K1 ralentit la progression de la stéatose hépatique non alcoolique (NASH) en réduisant la stéatose et la fibrose hépatique dans deux modèles nutritionnels de souris atteintes. De plus, nous postulons que l'effet antifibrotique de K1K1 dans le foie sera associé à la prévention de certains types de cancers du foie. In vivo, des données préliminaires montrent que l'administration intrapéritonéale de K1K1 pendant 3 semaines améliore fortement la production, la sécrétion et la sensibilité à l'insuline, conduisant à une réduction significative de l'hyperglycémie dans un modèle de souris obèses et diabétiques. Sur la base de données préliminaires fortes et uniques fournissant la preuve du développement d'un mimétique fonctionnel du facteur de croissance hépatique pour une administration in vivo, nous postulons que le mimétique K1K1 est un composé prometteur pour améliorer la transplantation de cellules des îlots, traiter le diabète et les maladies du foie. Nous proposons donc dans cette étude collaborative de valider l'efficacité et la sécurité de K1K1 d'une part dans le traitement de la stéatose et de la fibrose hépatiques, et d'autre part vis à vis de l'Elafibranor, tout cela à l'aide de modèles in vivo.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait donc permettre de valider le rôle régénérateur de K1K1 dans la fibrose hépatique
Procédures
Pour la procédure 1 : injection de la protéine d'intérêt ou son solvant 3f/semaine pendant 3 semaines. Pendant la semaine 3 : tests de tolérance à l'nsuline, injection d'insuline et prélèvements de gouttes de sang à la queue pour mesurer la glycémie (durée 120 minutes). 3 jours plus tard : tests de tolérance au glucose, gavage de glucose puis prélèvements de sang pour dosage d'insuline à t0, t15 et t90 (durée 120 min). Procédure 2 : injection de la protéine d'intérêt ou son solvant 3f/semaine pendant 3 semaines. chirurgie pour pose de cathéter une semaine avant le clamp. Procédure 3 : insertion de la pompe osmotique en sous-cutané et tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Procédure 4 : insertion de la pompe osmotique en sous-cutané et chirurgie pour pose de cathéter une semaine avant le clamp.
Impact sur les animaux
La stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) est une maladie du foie caractérisée par l'accumulation excessive de graisse dans les cellules du foie. Il peut donc survenir plusieurs effets indésirables au cours de l’étude : L'induction de la NAFLD peut perturber le métabolisme des souris, entraînant une augmentation de la glycémie et une résistance à l'insuline. Elle peut également entraîner une inflammation dans le foie et d'autres tissus, ce qui peut causer de la douleur, de l'inconfort et des troubles du comportement chez les souris. De plus, si celle-ci n'est pas traitée, elle peut évoluer en fibrose hépatique, ce qui peut entraîner une dégénérescence du foie et une insuffisance hépatique. L'accumulation de graisse dans le foie peut également entraîner une production accrue de radicaux libres, qui peuvent endommager les cellules hépatiques et provoquer une réponse de stress oxydatif.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour le prélèvement d'organes et/ou étude de la radioactivité
Remplacement
Le remplacement par des études in vitro (avec l'études de cellules d'hépatocytes en culture par exemple) ne semble pas possible au vue de cette étude: nous souhaitons étudier principalement l'effet du peptide K1K1 sur la stéatose hépatique mais avant tout les bénéfices de celui-ci sur un organisme complexe, avec des effets sur des voies métaboliques intégrées telle que la sensibilité à l'insuline. De plus, l'utilisation de souris est nécessaire, avant les tests chez l'Homme, pour suivre des effets actuellement inconnus (nous souhaitons par exemple vérifier en parallèle si ce traitement permet d'éviter un développement tumoral induit par la NASH, phénomène que l'on peut observer exclusivement dans un organisme vivant complexe, regit par bons nombres de cascades de signalisation inter organes, hormonales, neurales,etc...). Des approches in silico et in vitro ont déjà été mises en oeuvre afin de s'assurer que le peptide K1K1 lie bien le récepteur Met et active la voie de signalisation, ainsi l'utilisation d'animaux est l'étape suivante pour s'assurer d'un effet biologique in vivo. Selon les résultats de l'étude, d'autres approches in vitro pourraient être utilisées afin de disséquer sur des modèles de cellules les mécanismes d'action (on pourrait envisager l'utilisation d'organ-on-chip afin de faire cohabiter les différents types de cellules hépatiques).
Réduction
Plusieurs études au sein de notre laboratoire ont précédemment montré que des groupes de 10 souris étaient necessaire au minimum pour obtenir des résultats optimaux. Afin de réduire le nombre d'animaux contrôles, nous utiliserons des souris contrôles sous régime normal pour comparer aux souris génétiquement diabétiques ou ayant une résistance à l'insuline induite par un régime hyper-lipidique.
Raffinement
Enrichissement environnemental, consistant à fournir un environnement plus stimulant pour les souris, en ajoutant des objets tels que des tunnels, des matériaux de nidification, etc. Cela permet de réduire le stress et l'ennui chez les souris en captivité, tout en favorisant leur comportement naturel. Anesthésie et analgésie : il est important d'utiliser des protocoles d'anesthésie et d'analgésie efficaces pour minimiser la douleur et la détresse chez les souris lors de procédures chirurgicales ou invasives. Suivi régulier de l'état de santé des souris : il est important de surveiller régulièrement l'état de santé des souris pour détecter rapidement tout signe de maladie ou de détresse et agir en conséquence.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle d'étude de l'homéostasie glucidique (physiologie et pathophysiologie très similaires à l'Homme).
Etude de la micro-architecture osseuse dans un modèle murin d’hémiplégie vasculaire: HemiPLOS
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La moitié subit une occlusion de l'artère cérébrale moyenne, un modèle d'AVC provoquant un déficit moteur, une perte de poids et une anorexie possible, l'autre moitié une opération témoin, toutes recevant des injections et des prélèvements sanguins avant d'être tuées à quatre semaines pour prélèvement des fémurs. Le porteur décrit une douleur peropératoire et une mobilité réduite, et justifie le modèle par la "nécessité" d'un contexte pathologique homogène. L'étude vise à décrire la fragilité osseuse après un AVC et l'effet de bisphosphonates, des retombées thérapeutiques renvoyées "à terme".
Objectifs
L’ostéoporose représente l’une des maladies métaboliques osseuses les plus fréquentes ayant comme principale conséquence la fracture, dont les paralysies ou parésies (paralysie partielle) constituent elles aussi un facteur de risque. La fracture est un facteur d’altération de la fonction et de la survie chez les patients ayant eu un AVC. La densité minérale et la micro-architecture osseuse sont deux déterminants clefs de la solidité osseuse. Les modifications concernant la micro-architecture de l'os chez les patients paralysés ou parétiques sont elles peu décrites. Les bisphosphonates (traitement ayant pour but de prévenir la perte osseuse) sont un des traitements les plus utilisés dans l’ostéoporose. Mais il n’existe à ce jour aucune stratégie thérapeutique chez les patients post-AVC afin de prévenir de l’ostéoporose et de leurs conséquences pouvant être dramatiques (les fractures). L’objectif principal de notre travail est l’étude de la densité minérale osseuse et de la micro-architecture osseuse au cours des paralysies ou des parésies. Ce travail permettra d’explorer les mécanismes de la fragilisation osseuse induite par ces conditions. Il sera mené chez l’animal dans un modèle de souris hémiplégiques. Ce choix est motivé par la nécessité d'un contexte pathologique homogène, la fréquence des hémiplégies vasculaires chez l’homme et de leurs complications osseuses ainsi que par l’existence d’un modèle d’hémiplégie vasculaire propice aux explorations physiopathologiques. L’objectif secondaire de notre travail est l’étude de l’effet des bisphosphonates sur la micro-architecture osseuse dans ce même modèle.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la caractérisation de la micro-architecture osseuse, de son lien avec la différenciation des ostéoclastes (cellules qui résorbent l'os) et de l’effet des bisphosphonates après un accident vascualire cérébral. La connaissance de ces modifications micro-architecturales osseuses survenant après une hémiplégie et la connaissance des effets des bisphosphonates sur ces modifications sont essentielles pour l'établissement d'une stratégie de prévention des fractures par fragilisation dans ce contexte. Notre travail pourrait ainsi contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes de la fragilisation osseuse conduisant à la fracture chez les patients paralysés. Il pourrait à terme conduire à l'ouverture de perspectives thérapeutiques visant à prévenir les modifications micro-architecturales osseuses et à réduire le risque de fractures ainsi que leurs complications trop souvent dramatiques, chez des patients fragiles et particulièrement exposés.
Procédures
La moitié des souris subira une intervention chirurgicale d'occlusion artérielle de l’artère cérébrale moyenne transitoire (2 heures en tout, modèle d'AVC) puis l'autre moitié subira une procédure sham (procédure controle, sans occlusion de l'artère). Toutes les souris auront une injection sous cutanée de biphosphonates ou vecteur le jour de la chirurgie. Puis auront lieu pour toutes les souris des injections intra péritonéale de molécules fluorescentes visibles en imagerie et anesthésiants. Ainsi que des prélèvements sanguins avant intervention, à 1 semaine et 4 semaine.
Impact sur les animaux
Les nuisances concernent principalement les souris qui subiront l'intervention "occlusion intraluminale de l'artère cérébrale moyenne (OACM)", avec pour conséquence un déficit moteur diminuant la mobilité, la perte de poids et l'anorexie possible. Ce modèle induit également une douleur peropératoire. Les injections péritonéales sont également une nuisance pour l’animal.
Devenir
Les animaux seront tous mise à mort 4 semaines après la chirurgie afin de pouvoir prélever les fémurs pour l’étude de la microarchitecture osseuse et la moelle osseuse des tibias sera extraite en culture pour l’étude de la différentiation ostéoclastique chez toutes les souris afin de pouvoir répondre aux objectifs de l'étude.
Remplacement
Ce choix du modèle murin type souris est motivé par la nécessité d'un contexte pathologique homogène, la fréquence des hémiplégies vasculaires chez l’homme et de leurs complications osseuses aggravant le pronostic fonctionnel et vital chez ses patients, ainsi que par l’existence d’un modèle d’hémiplégie vasculaire propice aux explorations physio-pathologiques. Il est en effet impossible de reproduire in vitro les conditions de motricité/marche de cellules isolées nécessaires pour cette expérimentation.
Réduction
A des fins de puissance, le protocole comportera 10 souris sur 4 groupes soit un total de 40 souris. Il était impossible de réutiliser un groupe afin de valider scientifiquement notre étude, ni même d’utiliser le côté non hémiplégique d'une souris car dans la littérature le côté non hémiplégique présente également une perte osseuse et représenterait donc un mauvais témoin. Nous avons décidé d'avoir 10 souris par groupe, en sachant qu’avec cette procédure nous avons 20% d'échecs, cela reviendra à 8 souris par groupe, ce nombre sera nécessaire pour une puissance statistique suffisante.
Raffinement
L'environnement sera adapté et une limitation des contraintes et des douleurs sera mise en place. Les souris à la réception dans l'animalerie, seront réparties de façon aléatoire dans un environnement enrichi (jeux, abris, substrats, cachette, blocs de bois). Une période d'acclimatation de 7 jours sera respectée avant toute intervention sur l'animal. Les animaux seront élevés dans un environnement calme et surveillé de façon quotidienne. Si l'animal montre des signes de souffrance (stéréotypies, repli, perte de poids, vocalisations), il sera isolé dans un environnement riche et recevra un traitement analgésique. La chirurgie sera effectué sous anesthésie et les procédures de mesure de la densitométrie seront réalisées après une anesthésie également. Au vu de la procédure, l’analgésie est assurée avant le début de la chirurgie, en per-opératoire et dans les 72 heures post-opératoire (matin et soir). Les souris seront placées dans une couveuseaprès l'intervention et jusqu'au réveil de l'animal. Après avoir vérifié que l'animal retrouve sa mobilité, la souris sera remise dans sa cage et laissée sous le coussin chauffant pendant 12 heures. Parce que la perte de poids post-chirurgicale est généralement observée, la nourriture en purée sera placée dans une boîte de Pétri pour encourager à manger. Les 48 1ères heures, les animaux sont surveillés deux fois par jour, puis après cette période de manière quotidienne par l’animalier.
Choix des espèces
Ce choix est motivé par l’existence d’un modèle d’hémiplégie vasculaire propice aux explorations physiopathologiques, au vu de la capacité de mobilité de cet animal semblable à l'homme et permettant les explorations adaptés pour répondre aux objectifs de l'étude. Les expérimentations in vitro ne permettent pas d'appréhendrer l'objectif de l'étude. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’AVC. Les animaux auront entre 8 et 10 semaines, un age ou les animaux sont dit matures que ce soit pour le modèle hémiplégique et osseux. De plus les animaux sont pris à cet âge-là dans la littérature.