Recherche fondamentale

Les souris de ce projet sont génétiquement modifiées pour étudier deux mutations d'un gène du développement cérébral, LKB1, et certaines lignées peuvent présenter un retard de croissance ou des anomalies du développement. 288 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : des femelles gestantes subissent sous anesthésie une chirurgie d'électroporation in utero, puis leurs souriceaux, triés dès la naissance par la fluorescence visible à travers le crâne, sont étudiés au sevrage ou à 90 jours. Après les accouplements, la majorité des mâles se battent et sont alors hébergés seuls. Le porteur présente les tests de comportement social comme "bien établis chez la souris", sans dire si ce projet en fait passer ni lesquels. Toutes les souris sont tuées : les souriceaux pour des prélèvements, les reproducteurs âgés "réformés" faute de replacement, et les femelles opérées, que le porteur dit ne pas soumettre à une nouvelle procédure "pour raison éthique".

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier le rôle d’un gène comme relai intracellulaire pour les signaux émis par les cellules du cerveau au cours de la formation des réseaux de neurones du cortex cérébral. Les connaissances antérieures ont démontré l’importance de ce gène pour le développement cérébral. Des domaines de régulation de ce gène ont été identifiés dans des lignées de cellules, et ont conduit à l’identification de deux mutations qui perturbent la régulation du gène d’intérêt. Lorsque ces mutations sont introduites chez la souris, elles entrainent des défauts du comportement social rappelant les troubles du spectre autistique. Ce projet a pour objectif d’identifier les défauts de connectivité qui expliquent les défauts de comportement, lors de la mutation de ce gène, chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet répond à une problématique fondamentale qui permettra de mieux comprendre comment se forment les réseaux neuronaux dans le développement normal du cerveau. A terme cette étude permettra de mieux comprendre les causes de troubles du neurodéveloppement tels que les troubles du spectre autistique.

Procédures

Des femelles gestantes seront soumises une fois, à une procédure de chirurgie sous anesthésie et avec analgésie (1 injection avant l’opération, et jusqu’à 2 injections après opération), appelée électroporation in utero, d’une durée de 30 minutes. Pendant cette procédure, le temps total de l’anesthésie est estimé à 5 minutes.

Impact sur les animaux

La manipulation répétée des animaux et leur contention peut entraîner un stress modéré qui néanmoins s’atténue à mesure que les animaux s’habituent à l’expérimentateur. Suite aux accouplements, il est observé chez la majorité des mâles un comportement de bagarre nécessitant leur hébergement en cage individuelle. Certaines lignées peuvent présenter un retard de croissance ou des anomalies développementales. Des animaux subissent une procédure chirurgicale sous anesthésie, pouvant entrainer du stress et de la douleur pendant la phase de réveil et la phase post-opératoire, malgré l’utilisation d’antalgiques.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement des tissus désirés. Les animaux reproducteurs âgés seront réformés et mis à mort, en l’absence de possibilité de replacement. Les femelles ayant subi une procédure chirurgicale ne seront pas soumises à une nouvelle procédure pour raison éthique et seront donc mises à mort en fin de procédure. Les souriceaux doivent être mis à mort pour la réalisation de prélèvements postmortem.

Remplacement

Les études préliminaires à ce projet ont été conduites in vitro, ce qui permet de ne tester chez l’animal que les approches qui ont montré un potentiel résultat . Il est à présent nécessaire d’observer le développement cérébral in vivo pour aller plus loin dans l'analyse des conséquences de la mutation du gène d'intérêt et le lien avec les perturbations du comportement social retrouvées chez les animaux mutants. Ces projections dépendent de l’architecture cérébrale et des interactions cellule-cellule, qui sont reproduites de façon imparfaite in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans l’étude a été calculé sur la base d'expériences similaires pour tenir compte d'aléas non contrôlables tels que la variabilité entre les expériences, ou le génotype des portées. Certains animaux devront être exclus de l’analyse a posteriori pour des raisons techniques, ce qui est compris dans le calcul du nombre d'animaux. Les groupes expérimentaux seront faits séquentiellement, afin de pouvoir arrêter l'étude en cours si le résultat est négatif. Les souriceaux entrant dans la procédure seront sélectionnés par l’observation transcranienne de la fluorescence au moyen d’une lampe LED. Ceci permettra de détecter dès la naissance un éventuel problème expérimental (échec de l’électroporation) et de ne continuer inutilement la procédure sur un animal qui ne sera pas exploitable pour les résultats de l’étude.

Raffinement

Ce projet repose sur des procédures maitrisées par les chercheurs impliqués. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance. L’enrichissement sera contrôlé et strictement identique entre tous les animaux (nidation, cache, objet en boit pour jouer/mâcher…). Un suivi journalier des souriceaux sera effectué afin de détecter immédiatement tout signe d’inconfort. Afin de prévenir toute souffrance inutile, des points limites spécifiques adaptés aux différentes procédures réalisées ont été définis. Un arbre décisionnel, à la disposition des expérimentateurs et des zootechniciens, permettra le cas échéant de décider de l’arrêt des souffrances au moyen de critères prédéfinis, sous le contrôle de la SBEA de l’établissement. Pour limiter la perte de données et tirer plus d’informations par animal, nous utilisons dans l’équipe des outils d’imagerie et d’analyse qui ont été optimisés afin d’obtenir un maximum d’information. Ce projet se déroule sur deux établissements utilisateurs. Le transport des animaux est rapide et sera réalisé dans des conditions minimisant le stress lié au transport et à l'arrivée dans un nouvel environnement.

Choix des espèces

Le choix d'un modèle rongeur (souris) est justifié par le fait que la souris a un cerveau dont la structure est proche du cerveau humain. Le développement embryonnaire est rapide et le développement postnatal est court, ce qui permet d''obtenir rapidement les résultats de l'étude. Enfin, les tests de comportement social pertinents pour l'étude des troubles autistiques sont bien établis chez la souris, ce qui nous assure que le projet permettra de répondre à la problématique scientifique de ce projet et de projets ultérieurs. Les reproducteurs (mâles et femelles) seront des adultes entre 8 et 30 semaines, au pic de leur fertilité. Les souriceaux seront utilisés soit au moment du sevrage (J21), correspondant à l’âge où la connectivité corticale est établie, pour déterminer un effet sur la formation des projections axonales, soit à J90, âge où les connexions sont matures, pour déterminer un effet des mutations de LKB1 sur la sélection des contacts synaptiques liés à la plasticité cérébrale. Cet âge correspond également à l’âge où nous observons des anomalies du comportement social.

88 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales humaines sous la peau puis des séances d'imagerie deux fois par semaine pendant quatre semaines, avant mise à mort pour analyse des tumeurs. Le porteur décrit des brûlures cutanées légères liées à l'éclairage, une gêne ou une ulcération de la tumeur et une douleur à l'injection, pour une preuve de concept d'une photothérapie anticancéreuse. Sur le remplacement, il affirme que le test chez l'animal est "nécessaire" et que le rôle du microenvironnement tumoral impose le "modèle animal".

Objectifs

L'objectif est de montrer l'efficacité de la photothérapie dynamique dans le carde du traitemen de tumeurs solide.

Bénéfices attendus

Preuve de concept de l'efficacité de la thérapie par la lumière dans le traitement anti cancéreux.

Procédures

Injection des cellules en sous cutané : sur animal anesthésié, une seule fois, durée 1 minute. Imagerie optique : nécessite une injection IP sur souris vigile au préalable, puis imagerie sur souris anesthésiée (5 minutes), 2 fois par semaine pendant 4 semaines.

Impact sur les animaux

Légères brulures cutanées liées à l'éclairage. Gêne et/ou ulcération de la tumeur. Douleur au moment de l'injection dans le péritoine. Stress.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de l'étude afin de réaliser une étude histologique des tumeurs.

Remplacement

L'objectif étant de développer des thérapies applicables chez l'homme, le test de faisabilité chez l'animal en amont est nécessaire. De plus dans ce projet nous souhaitons tester notre approche thérapeutique dans un contexte tumoral sachant que le microenvironnement joue un rôle primordial, le modèle animal est nécessaire.

Réduction

L'imagerie optique permet de faire un suivi au cours du temps sur un même animal. Cette méthode permet donc de diminuer le nombre d'animaux au final.

Raffinement

Les lieux d'hébergement et d'expérimentation sont différents. Le transfert des animaux d'un lieu à l'autre se fera dans une cage de transport dédiée munie d'un couvercle filtrant. La cage contient litière, nourriture, eau et est transportée dans un sac à l'abri des regards extérieurs. Le trajet dure quelques minutes. Les souris sont hébergées en groupes avec un enrichissement du milieu (maison en carton, coton). Toutes les procédures sont réalisées sur animal anesthésié et lors de l'anesthésie les animaux sont placés sur un tapis chauffant pour éviter l'hyporthermie. Les animaux sont quotidiennement suivis par l’expérimentateur et en cas de signes de souffrance un analgésique sera administré. Si la souffrance persiste, l’expérience sera stoppée.

Choix des espèces

Nous utilisons la souris car la taille de l'animal est adaptée à l'imagerie optique. Nous utiliserons des souris immunodéprimées NSG car nous injecterons des cellules d'origine humaine. Les souris seront utilisées à un âge adulte compris entre 8 et 12 semaines car à cet âge là les animaux sont facilement manipulables rendant la contention aisée.

150 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Répartis en cinquante protocoles de trois animaux, ils reçoivent une injection sous-cutanée d'antigène couplé à l'adjuvant complet de Freund puis trois prélèvements de sang, avant mise à mort à dix jours, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur reconnaît que l'injection peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et un inconfort. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est aussi efficace et présente la production sur animal vivant comme "indispensable", au service d'une activité commerciale répondant aux "besoins" des laboratoires.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole envisagé est particulier, car il vise à récupérer uniquement les anticorps générés lors d'une réponse primaire. Par conséquent, la procédure expérimentale est plus courte que des protocoles classiques d'obtention d'anticorps polyclonaux et ne nécessitera qu'une seule injection. Les anticorps seront récupérés à l'aide de prélèvement d'échantillons de sang, dont les volumes seront adaptés au poids de l'animal en suivant des recommandations. Le protocole durera 10 jours, ce qui est plus court que les protocoles classiques de 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation d’une subtsance médicamenteuse. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe. Afin de répondre aux besoins exprimés par différentes équipes de recherche, 50 protocoles sont envisagés.

Procédures

1 injection en sous cutanée de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) 3 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en sous-cutanée couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 2% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J10.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'acépromazine, qui possède un effet tranquilisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

324 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris génétiquement modifiées pour porter une mutation de la fièvre méditerranéenne familiale présentent un poids inférieur de 30 à 40 % et une perte de poils, et subissent des prises de température rectales répétées, des prélèvements sanguins et des injections quotidiennes pendant deux semaines. Le porteur ajoute des situations de stress pour amplifier la réponse inflammatoire et prévoit la mise à mort pour analyses immunologiques et histologiques. Il affirme que la réponse au stress n'est pas modélisable hors d'un "organisme entier" et présente les retombées thérapeutiques au conditionnel.

Objectifs

La fièvre méditerranéenne familiale (FMF) est une maladie auto-immunitaire héréditaire, assez fréquente dans certaines régions. Elle est caractérisée par des épisodes récurrents et imprévisibles d’inflammation (réaction de défense immunitaire), qui à long terme peuvent entraîner de graves complications et éventuellement la mort. La solution thérapeutique actuelle est basée sur une administration quotidienne et à vie d'un médicament (qui désassemble certains composants intracellulaires), mais 5 à 10% des patients FMF y sont intolérants ou résistants, d’où l’importance de développer de nouveaux traitements. À ce jour, les mécanismes précis responsables de telles crises inflammatoires chez ces patients demeurent inconnus. Néanmoins plusieurs hypothèses, découlant directement d’observations cliniques (dont le rôle de certaines hormones sexuelles et de molécules du stress), sont maintenant validées en culture cellulaire. En particulier, le stress serait capable d’amplifier l’activation de la réponse inflammatoire impliquée dans la FMF. Reste à comprendre comment ce dialogue a lieu, et montrer en quoi il représente une piste thérapeutique prometteuse. La FMF est due dans la plupart des cas à des modifications génétiques touchant une protéine "récepteur" de l'immunité (la pyrine), dérégulée chez les patients. La majorité de ces mutations affectent un domaine particulier de la pyrine. Il existe des modèles cellulaires pour étudier ces modifications pathologiques dans des cellules en culture, mais leur indispensable analyse à l'échelle de l'organisme est rendue difficile par l’absence de ce domaine particulier chez la Souris. Ceci explique l’intérêt de travailler sur un modèle de Souris génétiquement modifiées pour exprimer ce domaine humain portant des modifications typiques de la FMF. L’objectif de ce projet est d’étudier la modulation des symptômes inflammatoires chez ces souris, par des actions stimulatrices ou inhibitrices sur les signaux de stress, afin de mieux comprendre la régulation des crises inflammatoires et d’en proposer d’éventuels leviers de contrôle.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont à la fois scientifiques (progrès des connaissances sur certaines maladies immunitaires génétiques) et cliniques : 1) À court terme : mise en évidence du rôle des signaux de stress dans la FMF, et de nouvelles voies à cibler pour moduler les symptômes. 2) A plus long terme : mieux comprendre l’origine des crises inflammatoires (dont les facteurs environnementaux par exemple certains stress), et possiblement tester des traitements innovants (plus ciblés et moins toxiques, utilisables à des moments précis de l’évolution de la maladie, potentiellement préventifs aussi).

Procédures

Interventions effectuées: 1) Prise de température rectale (durée

Impact sur les animaux

Les gestes techniques prévus dans les procédures sont de potentielles sources de stress transitoire et/ou de douleur locale. D'autre part les souris "modèles" de la maladie présentent un phénotype susceptible d’affecter leur bien-être (poids final 30 à 40% plus faible que les souris "sauvages", perte locale de poils, organes immunitaires plus volumineux); nous prévoyons donc un contrôle continu de leur élevage (croisement entre parents hétérozygotes, non malades) en fonction du déroulé et des résultats des expériences. Enfin certains traitements sont susceptibles d’entrainer des effets secondaires, notamment gastriques. D'où les mesures de raffinement, de suivi et de dosage approprié.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux participant aux procédures d'expérimentation, pour analyses immunologiques et histologiques post-mortem en lien avec les objectifs du projet.

Remplacement

L’analyse in vivo est indispensable pour remplir les objectifs du projet (suite aux tests préliminaires déjà réalisés in vitro), et pour s’assurer d’une potentielle relevance clinique. En particulier la réponse au stress n’est pas modélisable en dehors d’un organisme entier, d’où l’intérêt d’y d’étudier la réponse inflammatoire dans différents contextes.

Réduction

De nombreux paramètres seront étudiés sur chaque animal inclus dans le projet (mesures corporelles et exploitations post-mortem). De plus l’effectif annoncé est le maximal (révisable à la baisse en fonction des premiers résultats), avec un premier "essai pilote" déterminant. Les nombres d’animaux sont calculés pour permettre des analyses statistiques robustes, en accord avec les objectifs scientifiques et en limitant autant que possible la taille des effectifs.

Raffinement

Nous prévoyons les points de raffinement suivants : 1) Entrainement à la contention (une fois par jour, une semaine avant le début de l'expérience) pour minimiser angoisse et biais secondaire. 2) Anesthésie gazeuse et application locale de collyre lors des prélèvements sanguins rétro-orbitaux. 3) Utilisation de lubrifiant pour les prises de température rectales, et adaptation de la taille de la sonde au gabarit des souris. 4) Minimisation de la fréquence de manipulation (observation et privilège aux mesures les moins intrusives). 5) Mise à disposition de moyens d’hydratation supplémentaires si diarrhées observées en réaction aux inhibiteurs. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux et les expériences menées avec des précautions sur l’âge des souris (

Choix des espèces

Il est ici nécessaire d’étudier un système intégré (in vivo, Vertébré Mammifère), avec un fonctionnement immunitaire reposant sur les mêmes types d’acteurs cellulaires et moléculaires que l’humain. La souris en est un modèle idéal, permettant aussi un accès aux lignées génétiquement modifiées et phénotypes issus de mutations, indispensables pour l’analyse de maladies génétiques comme ici. Les animaux transgéniques envisagés pour ce projet permettent une bonne modélisation des réponses observées chez les patients. L’âge des animaux sera de 6 semaines en fin de procédure expérimentale, dont les expériences de stress (durée maximale après l’injection du traitement : 9h). Les expériences d’injection des inhibiteurs débuteront à l’âge de 4 semaines (pour avoir maximum 2 semaines de suivi), car le phénotype est précoce chez les souris modèles de la FMF et l’espérance de vie est plus courte. Cette chronologie permettra aussi d’inclure le délai de génotypage des petits.