Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Étude d’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle des impacts neurobiologiques du stress hypoxique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
80 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis gardés en vie et rendus à leur animalerie d'origine. Ils subissent un stress d'hypoxie et trois séances d'imagerie IRM sous anesthésie légère, pour mesurer les effets d'un déficit d'oxygène sur l'hippocampe et évaluer une plante, Guiera senegalensis, comme antioxydant. Le porteur indique que l'hypoxie pourrait détruire des neurones sans pour autant affecter le bien-être de l'animal, et surveille la respiration pendant l'anesthésie. Il affirme que cette étude comportementale et neurobiologique nécessite des animaux vivants dotés des structures cérébrales voulues.
Objectifs
Les radicaux libres sont connus pour être responsables d’un vieillissement cellulaire. Dans des conditions normales, les radicaux libres sont produits à de faibles concentrations et agissent comme des molécules de signalisation pour les cellules. Dans certaines situations, le nombre de radicaux libres présents dans les cellules est trop important. Ce stress oxydant conduit à un dysfonctionnement cellulaire, voire à la mort cellulaire. Il a été incriminé dans la physiopathologie de nombreuses affections humaines (par exemple la maladie d’Alzheimer). L’hypoxie (un déficit d’apport en oxygène dans les tissus de l’organisme) est l’une des causes de stress oxydant. Au niveau cérébral, l’hypoxie génère des processus inflammatoires qui peuvent se solder par une destruction des neurones au niveau de l’hippocampe, structure très impliquée dans l’apprentissage et la mémoire. L’apnée, c’est-à-dire un arrêt de la respiration pendant au moins 20 secondes, même si elle est volontaire, pourrait participer à la genèse d’un stress oxydant à travers l’hypoxie créée. En Afrique, Guiera senegalensis (Combretaceae) est une plante utilisée en pharmacopée traditionnelle. Ses feuilles possèdent de nombreux composés, notamment les flavonoïdes et les acides polyphenoliques, qui sont des antioxydants naturels. L’objectif général de ce projet est d’évaluer les effets bénéfiques de l’extrait hydroéthanolique des feuilles de Guiera senegalensis dans la gestion du stress oxydant et dans la prévention d’impacts neurobiologiques de l’hypoxie au niveau cérébral.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera une information précieuse sur le lien entre hypoxie sous apnée et les corrélats neurobiologiques dans l’hippocampe comme prédicteurs de désordres mnésiques, ainsi que le bénéfice potentiel de Guiera senegalensis dans le traitement des effets hypoxiques des phénomènes d’apnée naturelle. De plus, ce projet permettra d’entrevoir une applicabilité potentielle de cette plante dans des pathologies liées au stress oxydatif. Autrement dit, Guiera senegalensis pourrait offrir un choix alternatif ou complémentaire dans la prévention et le traitement de ces pathologies. Il permettra également de collecter des données pilotes nécessaires pour un projet collaboratif plus large, qui se propose de corréler les données acquises sur ce modèle d’apnée chez le rat avec des données acquises sur des apnéistes humains.
Procédures
Trois séances d’imagerie sont prévues pour caractériser le modèle d’hypoxie cérébrale à 1 jour, 7 jours et 15 jours post-induction. Chaque séance (d’une durée d’environ 1/2 journée) comprendra une session d’acquisition IRM (d’une durée maximale de 2 heures).
Impact sur les animaux
Le modèle d'hypoxie pourrait induire des lésions cellulaires et des processus inflammatoires qui pourraient se solder par une destruction de certains neurones au niveau de l'hippocampe, mais cela ne devrait pas affecter le bien-être de l'animal. L’examen IRM étant une modalité de neuroimagerie totalement non-invasive et non-irradiante, les potentiels effets indésirables sont liés au fait que l’examen est réalisé sous anesthésie légère. Pour éviter tout risque d’arrêt respiratoire, la fréquence respiratoire est surveillée en permanence tout au long de l’examen. Il est également possible d’observer une légère perte de poids le lendemain de l’examen, suite au stress potentiellement induit par la combinaison transport (~10min)/examen (~2h) entre les deux bâtiments d’expérimentation se faisant face.
Devenir
Après l’examen IRM les animaux seront gardés en vie et retourneront en hébergement dans leur animalerie d’origine.
Remplacement
L’évaluation comportementale et neurobiologique en réponse à un stress hypoxique induit par apnée, nécessite l’utilisation des animaux vivants possédant les structures cérébrales requises. L'analyse cellulaire des différentes structures cérébrales ne peut être réalisée in silico ou en cellule isolée, ni même chez les invertébrés.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera minimisé autant que possible grâce à l’étude de plusieurs paramètres chez le même animal et de façon longitudinale avec des approches non-invasives comme l’IRM. Les analyses statistiques seront celles classiquement utilisées dans la littérature.
Raffinement
Que ce soit durant leur transport ou lors de l’examen IRM, une grande attention est apportée au bien-être des animaux, et tout est mis en œuvre pour éviter les sources potentielles de stress. Transports : Les animaux sont transportés dans leur boîte habituelle (enrichie), avec leurs partenaires habituels et manipulés par les personnes assurant leur suivi quotidien. Les boîtes sont protégées du froid ou du chaud éventuel. Manipulations/anesthésie avant/après examen IRM : Ces actes sont réalisés par les personnes qualifiées assurant le suivi quotidien des animaux. Examen IRM : Il est réalisé sous anesthésie, dans un berceau chauffé uniquement dédié à ces animaux, avec contrôle de la respiration et de la température. Lors d’une acquisition IRM, si la respiration sort des limites prévues, l’examen est immédiatement interrompu et l’animal est mis sous surveillance accrue jusqu’à sa récupération. En dehors des sessions d’examen IRM, les animaux seront hébergés par groupe (2 à 4) avec de l’enrichissement autant que possible (tunnel transparent de couleur rouge, bâton à ronger, papier à déchiqueter). Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance (mise en place de points limites) et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec la Structure bien être animale et les conseils vétérinaires.
Choix des espèces
La littérature concernant le stress hypoxique est majoritairement basée sur des études chez le rat, fournissant une base de connaissances solide. De plus, la littérature sur les expériences d’apnée est plus importante chez le rat. Ce modèle animal est donc le plus approprié à la fois pour les études comportementales, biochimiques, immunohistochimiques et de neuroimagerie par IRM. Des rats nouvellement sevrés (~23-26 jours) seront utilisés en accord avec les données de la littérature concernant la période adaptée à un bon apprentissage de la nage chez les rats.
Le rat Goto Kakizaki un modèle d’étude du syndrome des ovaires polykystiques
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
312 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Ces rattes Goto-Kakizaki, présentées comme un modèle spontané du syndrome des ovaires polykystiques, subissent des frottis vaginaux, des injections d'un anticorps pendant la gestation et des prélèvements sanguins répétés, y compris des tests de tolérance au glucose, pour étudier le développement du syndrome et tester un traitement. Le porteur affirme n'attendre aucune souffrance des injections et met à mort tous les animaux pour analyser leurs tissus. Il affirme qu'aucun système in vitro ou in silico ne peut remplacer l'animal.
Objectifs
Le Syndrome des Ovaires polykystiques (SOPK) est la principale cause d’infertilité féminine et elle est associée à de nombreuses comorbidités telles que le diabète et les maladies cardiovasculaires. Les hommes apparentés aux femmes ayant ce syndrome présentent des taux d’androgènes élevés et des désordres métaboliques. Il s’agit de plus d’une maladie à fort caractère transmissible par les mères à leurs filles et fils, sans qu’aucun diagnostic puisse être établi précocément puisque l'origine de ce syndrome reste méconnu. Or nous avons mis en évidence récemment que les rattes Goto-Kakizaki, modèle de diabète de type 2 très connu, constituent le premier modèle rongeur spontané du syndrome des ovaires polykystiques. Notre projet est d'utiliser ce modèle de rattes GK afin de mieux comprendre l'éthiologie de ce syndrome en analysant le développement de ce syndrome dès le stade foetal. De plus, nous avons développé un anticorps bloquant les effets de l'hormone Anti-Müllérienne (AMH) qui est suspectée d'induire une hyperandrogénie et une anovulation chez les patientes présentant un syndrome des ovaires polykystiques. Nous proposons donc de traiter des rattes GK avec cet anticorps pendant la gestation pour comprendre le rôle de l'AMH dans le développement du phénotype et à l'âge adulte à des fins thérapeutiques pour normaliser les taux circulants d'androgènes et pour induire une ovulation.
Bénéfices attendus
Pouvoir analyser et comprendre les altérations developpementales chez la descendance de mères SOPK afin d'améliorer par la suite la possibilité de prise en charge des patientes SOPK au cours de la grossesse. Actuellement les patientes SOPK sont traitées de manière symptomatique : soit pour traiter leur infertilité, soit pour traiter l'hyperandrogénie, soit pour traiter les troubles du métabolisme en particulier le diabète. Le traitement que nous proposons de tester permettrait: - d'une part de corriger l'infertilité chez les 25% de patientes SOPK résistantes aux traitements actuels et d'éviter le risque d'hyperstimulation ovarienne induit par les traitements utilisés en PMA (procréation médicalement assistée) - d'autre part de corriger l'hyperandrogénie - d'autre part d'améliorer les anomalies métaboliques.
Procédures
Les animaux subiront des prélèvements de sang de 100 microlitres (environ 5 minutes par prélèvement). Pour l'ipGTT des prélèvements de sang de 30 microlitres (environ 1 minute par prélèvement) aux temps 0, 15, 30 et 90 minutes sont réalisés. Pour l’ipITT, une goutte de sang (10 microlitres, moins d'une minute par prélèvement) sera prélevée pour lecture de la glycémie sur lecteur Accuchek aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 minutes. Les 2 tests seront séparés d’au moins 3 jours pour permettre la récupération.
Impact sur les animaux
Pour le suivi du cycle ovarien par la méthode des frottis vaginaux ainsi que pour l'injection en sous cutanée, les femelles sont préalablement habituées à la contention par les expérimentateurs habilités. Pour les prélèvements sanguins qui seront nécessaires (100 microlitres/rat une fois par semaine sur 3 semaines pour les gestantes et les traitées et sur 5 semaines consécutives pour le lot étudié entre 4 et 8 semaines) le volume de sang prélevé à chaque prise de sang sera toujours en dessous du volume maximal autorisé (5% du volume sanguin total).
Devenir
Toutes les procédures conduiront à la mort des animaux afin d'effectuer les analyses histologiques de différents tissus.
Remplacement
Cette étude ne peut être réalisée que sur des animaux vivants et l'avantage du rat GK réside dans le fait que c'est un modèle de diabète de type 2 sans manipulation génétique et mimant certains aspects du syndrome SOPK humain. Ainsi sur le plan scientifique il est impossible de remplacer ces animaux par des systèmes ex vivo, in vitro ou in silico
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés est réduit au minimum grace à l'utilisation de tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux sont habitués à la manipulation de sorte à réduire le stress. Les prélèvements sanguins représentent moins de 5% du volume sanguin total et sont suffisamment espacés dans le temps pour ne pas induire une détresse chez l'animal. Les injections d'anticorps ne gènèrent pas de souffrance pour l'animal. Cependant, les animaux seront suivi toutes les 48h durant le traitement et si des signes de mal-être apparaissent tels que, prostration,poils hirsute et perte de poids, les animaux seront isolés et gardés en observation. Si la perte de poids est supérieure à 15% du poids de l'animal il sera eutahanasié.
Choix des espèces
Le rat GK est le seul model rongeur disponible developpant spontanémant le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK). Le rat une espèce animale pertinente dans le cas de notre étude parce que les processus physiologiques sont similaires chez le rat et chez l’Homme. De plus, le rat est suffisamment grand pour permettre des mesures physiologiques pratiques. Les stades foetal (18,5 jpc), post natal(5 jours), pubertère et adulte ont été choisis puisque l'environnement maternel SOPK est fortement suspecté de contribuer au dévéloppement de ce phénotype qui apparait progressivement depuis le stade foetal.
Thérapie pour la myopathie à agrégats tubulaires en utilisant des AAV dans le modèle souris – «TransTAM»
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
285 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Ces souris porteuses d'une mutation reproduisant la myopathie à agrégats tubulaires subissent des tests de force et de saignement répétés et des injections d'un vecteur AAV, pour tester une thérapie génique censée corriger les atteintes musculaires. Le porteur décrit des tests de force et d'activité locomotrice et une mesure de production musculaire réalisée sous anesthésie sans réveil, suivie de la mise à mort. Il affirme qu'un modèle cellulaire ne permet pas d'évaluer la contractilité du muscle ni les effets sur l'"organisme entier".
Objectifs
La myopathie à agrégats tubulaires (TAM) est une maladie rare caractérisée par une faiblesse musculaire progressive, des crampes, et des myalgies. La majorité des patients montrent des anomalies de la peau, des os, des plaquettes, et de la rate. La présentation complète de ces signes multi-systémiques est appelé syndrome de Stormorken (STRMK). TAM et STRMK forment un spectre de la même maladie. Afin de corréler les dysfonctions cellulaires avec le développement de la maladie, nous avons généré et caractérisé un modèle murin portant la mutation TAM/STRMK la plus commune. Les souris présentent les principaux signes cliniques des patients. A ce jour, aucun traitement n’est disponible. Nous avons l’intention d'inverser les symptomes des souris TAM/STRMK par une régulation négative d'un gène important pour la maladie, afin de fournir une approche translationnelle pour les essais thérapeutiques prospectifs chez les patients. Nous avons effectué des injections intramusculaires de souris TAM/STRMK et déterminé un effet positif sur la fonction musculaire. Ces résultats préliminaires nous encouragent à tester la même approche sous une forme systémique, afin de pouvoir à la fois prévenir et inverser le phénotype multisystémique des souris TAM/STRMK.
Bénéfices attendus
Il est attendu que cette étude apportera la première preuve de concept pour un traitement efficace de TAM/STRMK. En effet, nos résultats préliminaires ont montré un effet bénéfique suite à l'administration du traitement dans le muscle, et il reste à démontrer que cette approche est également efficace par injection systémique et capable d’améliorer les phénotypes des plaquettes, de la peau, de la rate, et des os. De manière importante, la thérapie est conservée entre la souris et l’homme et pourra être utilisée chez les patients TAM/STRMK dans des tests cliniques ultérieurs.
Procédures
Des tests de comportement seront réalisés une fois par mois chez l’animal vivant à partir de 4 ou 16 semaines selon la cohorte jusqu’à 4 ou 8 mois d’âge. Le test de comportament permettant d’évaluer la force globale de l’animal sera réalisé 3 fois par jour, avec un temps de repos minimal de 10 minutes entre chaque test. Chaque essai durera au maximum 60 secondes. Le test de comportament permettant de mesurer la force musculaire des pattes antérieures de l’animal dure 10 secondes, et sera répeté 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 minutes. Le test permettant mesurer l’activité locomotrice spontanée dure 12h. Le test de saignement est utilisé pour évaluer la coagulation sanguine et la capacité de l'organisme à former un caillot en cas de lésion vasculaire. Il sera réalisé une fois, et il durera au maximum 10 minutes. Les mesures de force musculaire seront réalisées pendant 10 minutes. La mesure de la production de force du muscle est une procédure sans réveil, qui durera au maximum 30 minutes. A l’issue de cette procédure, l’animal anesthésié sera mis à mort. Le test pour l'obtention du sang sera répeté 2 fois dans la vie de la souris, et durera 1 minute. Des injections intraveineuses seront réalisées pour administrer le traitement. Entre l'anesthésie et l'injection, la procédure prendra environ 2 minutes par souris.
Impact sur les animaux
Les souris sont plus petites que les souris sauvages et manifestent des problemes dans le muscle, la rate, la peau, les plaquettes et l'os, démontrant que notre modèle murin est un outil approprié pour étudier le développement de la maladie. Pour la deuxième lignée de souris, une caractérisation complète sera bientôt effectuée pour confirmer un phénotype dommageable. Les tests de comportament peuvent induire du stress sur l'animal. Ces tests dureront le moins de temps possible pour que les tests soient significatifs, de sorte que l'animal souffre le moins possible.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issu des tests pour préléver les muscles nécessaires aux analyses moleculaires.
Remplacement
L’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni d’évaluer les effets sur l’ensemble de l’organisme qui dans notre cas est crucial car nous étudions une maladie associée à un phénotype multisystémique.
Réduction
Pour la partie expérimentale, les tests phénotypiques réalisés de manière non invasive offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. D’autre part, les analyses moléculaires et histologiques seront réalisées uniquement à la fin du traitement, ce qui permet de s’affranchir de générer une cohorte pour chaque point du suivi longitudinal. L’organisation de nos procédures vise à utiliser le plus possible de tissus différents provenant de la même souris afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un maximum d’un test par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Ainsi, nos précédentes études montrent que 15 souris au maximum par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, de la couleur de la peau, ainsi que l'évaluation de la présence d'une poche de lait seront évalués tous les 2 à 3 jours. Après le sevrage, les animaux seront hébergés en groupe dans des cages placées dans un environnement où la température sera maintenue constante. La qualité de l’air sera assurée par une ventilation et un cycle de 12 heures jour/nuit sera respecté. Les animaux auront accès à de l'eau et de la nourriture ad libitum. La litière sera changée aussi souvent que nécessaire afin de maintenir les animaux au propre et au sec. L'environment sera enrichi avec des nids. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 à 3 fois par semaine. En cas de perte de poids, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. La plupart des expérimentations seront réalisées à l'aide de tests permettant une exploration totalement non invasive de la fonction musculaire dans des conditions physiologiques in vivo, ce qui limite le développement de la douleur. Afin de réduire le stress lié aux différents tests, une session de familiarisation sera effectuée avant le début du suivi longitudinal pour chaque test. Pour les mesures de force in situ, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques, permettant d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante tout au long de la procédure pour maintenir sa température corporelle à sa valeur basale. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué.
Choix des espèces
Les souris sont nécessaires pour ces expériences afin de nous permettre de comprendre les propriétés physiologiques des différents muscles et organes après une modification génétique. Le modèle murin nous permet d'étudier l'amélioration potentielle du phénotype musculaire, ainsi que du phénotype observé sur d'autres organes, dans ce modèle de maladie murine multisystémique. Nous devons réaliser des expériences physiologiques in vivo chez la souris. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur des espèces évoluant plus éloignées de l'homme, car la structure musculaire diffère davantage. C'est pourquoi nous proposons d'utiliser des lignées de souris disponibles dans nos laboratoires pour réaliser ces techniques. Les tissus de souris peuvent ensuite être utilisés pour d'autres analyses, maximisant ainsi les résultats obtenus par souris et réduisant le nombre total d'animaux utilisés. Le phénotype multisystémique de notre modèle animal Stim1R304W/+, caractérisé par une faiblesse musculaire et des signes dystrophiques en histologie, apparaît à l'âge de 2 mois et s'accentue avec l'âge, présentant un phénotype modéré à l'âge de 9 mois. Les souris seront utilisées à l'âge adulte, à partir de 4 semaines (pour la prévention de la maladie) jusqu'à 4 mois, puis à partir de 16 semaines jusqu'à 7 mois (pour le traitement de la maladie), afin d'observer le développement des souris après le traitement.
Conséquences de l’obésité maternelle sur le développement neuronal et comportemental de la descendance
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère, dont 520 en souffrance sévère. Les femelles sont rendues obèses par un régime riche en graisses, puis leur descendance subit des tests comportementaux et des analyses neuronales, pour étudier l'effet de l'obésité maternelle sur le cerveau des petits. Le porteur mentionne des tests comportementaux évaluant les capacités cognitives, mnésiques, émotionnelles et sociales sans en préciser le détail, et décrit comme atteinte une dégradation du comportement maternel. Les rubriques sur les dommages et le raffinement restent brèves au regard des 520 souris classées en souffrance sévère.
Objectifs
Le projet a pour but d'étudier et comprendre les conséquences neuronales et comportementales à long terme de l'obésité maternelle sur le développement du cerveau de la descendance
Bénéfices attendus
L'obésité maternelle est un facteur aggravant dans la survenue de maladies neurologiques et neuropsychiatriques. Nous espérons identifier des mécanismes moléculaires et cellulaires altérés par l'obséite materenlle dans l'espoir de développer des stratégies thérapeutiques et/ou préventives pour limiter les conséquences à long terme et sur la survenue de maladies neurologiques.
Procédures
Les animaux seront soumis a différent tests comportementaux dans le but d’évaluer l’impact de l’obésité maternelle induit par un régime alimentaire riche en graisse sur leurs capacités cognitive, mnésique, émotionnelle et sociale. Ces tests comportementaux seront réalisés entre le 8ieme et 10ieme jour de vie postnatale (un test) et entre le 2ieme et 4ieme mois de vie (4 tests). Des analyses neuronales, visant à étudier l’activité neuronale et l’évolution de différents marqueurs moléculaires, seront réalisées en parallèles des analyses comportementales aux mêmes âges
Impact sur les animaux
L’un des dommages de cette étude sera la prise de poids des femelles soumises à un régime alimentaire riche en graisse pour induire une obésité chronique. L’obésité chronique induit une dégradation du comportement maternelle avec une perte d’attention et d’intérêt pour la descendance.
Devenir
les animaux utilisés pour les analyses comportementales et neuronales, avec ou sans injections en période néonatale, seront euthanasiés.
Remplacement
Seule l'expérimentation chez l'animal permettra de remplir les objectifs de ce projet. Il n'est actuellement pas possible pour les méthodes in vitro (non animales) de reproduire les processus physiologiques complexes de la consommation de nutriments et en particulier l'impact que peut avoir la prise d'un régime alimentaire riche en graisse sur le développement neuronal et comportementale de la descendance. L’organisation et le fonctionnement des réseaux neuronaux et l'obésité maternelle ne peuvent être reproduits dans des modèles de lignées cellulaires ou de cultures neuronales.
Réduction
Des calculs statistiques utilisant les données d'études antérieures ont été utilisés pour calculer le nombre minimum d'animaux requis tout en garantissant l'obtention de résultats statistiquement significatifs. Les tâches proposées permettent d’évaluer les animaux sur plusieurs paramètres (comportementaux et électrophysiologiques ou biochimiques ou histologiques), réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires. Pour les enregistrements électrophysiologiques, 3 chercheurs seront mobilisés. Pour les analyses biochimiques et histologiques plusieurs protéines et/ou marqueurs moleculaires seront étudiés par échantillons prélevés et par animal. La litière des cages sera changée
Raffinement
La litière des cages sera changée fréquemment (et autant de fois que nécessaire) pour réduire les risques de graissage de la fourrure des animaux et limiter les risques d'irritation de leur peau. La santé et le poids des animaux seront également surveillés de près afin de s'assurer que le régime alimentaire n'a pas d'impact négatif sur eux. Dans le cas improbable où les animaux auraient subi un impact négatif, ils reprendront un régime alimentaire standard pour rongeurs. L'équipe continuera à examiner les dernières découvertes afin d'identifier toute nouvelle possibilité d'affiner l'expérience de ces animaux, tout en atteignant les objectifs de l'étude.
Choix des espèces
La souris est actuellement l’organisme-modèle le plus utilisé en recherche biomédicale. Elle présente de nombreux intérêts : sa taille, son rythme rapide de reproduction et une gestation courte par rapport à d’autres organismes-modèles. De nombreux animaux transgéniques existent permettant par exemple de déterminer les mécanismes moléculaires impliqués dans différentes pathologies. Enfin, les souris sont susceptibles de contracter certaines maladies humaines telles que certains troubles neurologiques. Les souris sont fréquemment utilisées pour modéliser l'obésité humaine car, comme les humains, elles prennent du poids lorsqu'elles consomment des régimes riches en calories. Elles stockent également les graisses alimentaires dans leur corps de manière similaire et peuvent développer l'obésité . Pour ce projet nous utiliserons des souriceaux de 1 à 2 semaines de vie postnatale, pour étudier les conséquences de l’obésité maternelle sur le développement du cerveau, et des animaux adultes (2 à 4 mois de vie) pour étudier les conséquences à long terme sur les capacité cognitive, sociale et émotionnelle.
Etude de l’impact durable d’un régime appauvri en fibres sur la symbiose hôte-microbiote chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Hébergées seules, elles subissent des gavages, des prises de sang et des collectes de fèces, et un tiers reçoit dans l'eau un produit qui enflamme l'intestin pendant sept jours, provoquant selon le porteur une douleur intestinale croissante et des diarrhées avant la mise à mort. Le projet étudie la rupture de l'équilibre entre l'hôte et son microbiote induite par un régime pauvre en fibres. Le porteur affirme l'impossibilité de modéliser cette dynamique in vitro ou in silico.
Objectifs
Chaque année, 41 millions de personnes décèdent des conséquences de maladies non transmissibles (maladies inflammatoires chroniques intestinales, obésité, diabète, …), ce qui représente 71% des décès dans le monde. Ces maladies sont associées à des signaux déclencheurs provenant de notre environnement (microorganismes de l’intestin, alimentation) et se caractérisent par une inflammation locale de l’intestin. Il apparait aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant leur dépistage et leur traitement. Ces maladies de longue durée résultent de l’association combinée de plusieurs facteurs génétiques, physiologiques, comportementaux et environnementaux dont la nutrition et l’environnement microbien. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes vivant au sein de cet organe. Ces micro-organismes forment une association intime, durable et à bénéfice mutuel avec l’hôte que l’on qualifie de symbiose. Depuis plusieurs années, de nombreux travaux scientifiques ont décrit des altérations de la composition du microbiote intestinal chez des patients atteints de maladies non transmissibles. Cette altération de la symbiose hôte-microbiote est caractérisée par une modification de la composition du microbiote couplée à la perturbation du système immunitaire de l’hôte qui conduit à la mise en place d’états « pré-pathologiques » et/ou pathologiques. Ce déséquilibre, récurrent dans différentes maladies non transmissibles, a été décrit chez l’animal et l’humain. Il se caractérise souvent par la diminution du potentiel fonctionnel du microbiote intestinal et de son hôte. Notre projet consiste à évaluer la mise en place et le maintien à long terme d’une rupture de symbiose hôte-microbiote induite par un régime pauvre en fibres et à déterminer les conséquences de ce changement de régime alimentaire sur la symbiose lors d’un stress inflammatoire aigu. L’objectif final de nos travaux est de caractériser la rupture de symbiose et d’en évaluer les conséquences sur la santé dans un modèle animal afin d’identifier des leviers, à la fois côté hôte et côté microbiote, qui permettraient de retarder, prévenir et/ou traiter sa survenue, son installation et sa persistance chez l’individu.
Bénéfices attendus
Les maladies non-transmissibles, qui sont en constante augmentation, sont une préoccupation majeure de santé publique. Diagnostiquées précocement au cours de la vie de l’individu, elles sont souvent de longue durée. De nombreux travaux témoignent d’une perturbation du microbiote intestinal due à un régime alimentaire appauvri en fibres. Notre projet amènera à une meilleure compréhension des mécanismes de la rupture de la symbiose microbiote-hôte en lien avec un régime alimentaire appauvri en fibre s ; compréhension qui permettra d’identifier de nouvelles solutions de dépistage et de traitement.
Procédures
Tous les animaux seront hébergés en cage indivuduelle tout au long de l'expérimentation. Les deux tiers des animaux recevront un régime appauvri en fibres pendant une durée de 4 semaines. Tous les animaux recevront une solution par gavage au minimum 2 fois et au maximum 8 fois durant la procédure. Le temps de contention sera de 5 à 10 secondes maximum. Tous les animaux auront au minimum 2 et au maximum 4 prises de sang à la queue. Le temps de collecte est de 2 à 3 minutes maximum. Tous les animaux auront au minimum 1 et au maximum 3 prises de sang. Le temps de collecte, contention comprise, sera de 30 secondes à 1 minute maximum. Les fèces de tous les animaux seront collectées lors de l’émission naturelle de manière quotidienne ou hebdomadaire en fonction des différentes périodes établies dans la procédure. Les animaux seront placés dans un pot de collecte 5 min maximum. Un tiers des animaux recevra dans l’eau de boisson un produit induisant l’inflammation de l’intestin pendant sept jours consécutifs en fin de procédure.
Impact sur les animaux
Les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré. Il est attendu que les animaux réduisent de 5 à 10% leur prise alimentaire durant les 5-7 jours qui suivent l'exposition à un régime inflammatoire, ce qui pourra entrainer une perte de poids. Les prises de sang engendrent une douleur modérée de courte durée et un stress léger dû à la contention. De même, les gavages seront réalisés par un expérimentateur confirmé à l’aide d’une sonde gastrique et engendreront un stress léger dû à la contention de quelques minutes mais ne causeront pas de douleur. L’absorption du produit inflammatoire entraine une douleur intestinale croissante pendant les 7 jours de traitement occasionnant des diarrhées avant la mise à mort des animaux.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter le sang et les tissus pour analyses.
Remplacement
Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de reproduire/modéliser in vitro ou in silico la dynamique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte.
Réduction
D’après les études antérieures menées au laboratoire, nous estimons que 120 animaux pour le groupe contrôle et 240 animaux pour les groupes expérimentaux sont nécessaires afin de mettre en évidence des différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’un enrichissement composé d'un abri en propylène rouge et d’un Mouse Swing et d'un abri en propylène rouge afin de répondre au mieux à leurs besoins comportementaux naturels et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. Les cages seront transparentes afin que les animaux gardent un contact visuel avec leurs congénères et n’auront pas de couvercles filtrants afin de maintenir le contact sonore et olfactif. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole et mis à mort. Le poids et la consommation alimentaire seront renseignés dans un tableau hebdomadairement. Nous définissons un point limite sur le poids, l’apparence des animaux et leur comportement.
Choix des espèces
Les animaux utilisés dans notre étude seront des souris qui sont largement utilisées pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes pauvres en fibres en raison de ses réponses reproductibles. Les animaux seront âgés de 6 semaines, ce qui nous permettra de débuter le traitement nutritionnel inducteur à 8 semaines. Ceci correspond à l’âge moyen auquel les modèles sont utilisés dans la grande majorité des laboratoires. Cet âge constitue donc une référence pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos expériences précédentes. Il est également admis qu’à cet âge le microbiote de ces animaux est mature et stable d’un point de vue fonctionnel et compositionnel.
Identification de régions chromosomiques associées à la durée de la gestation chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
894 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles sont mises en reproduction, échographiées chaque semaine sous anesthésie puis isolées en cage individuelle jusqu'à la mise bas sous surveillance vidéo, et une soixantaine subit un prélèvement sanguin et une amniocentèse avant d'être tuée, pour repérer les régions chromosomiques liées à la durée de gestation. Le porteur ne déclare comme atteinte que le stress lié à la manipulation et à l'isolement, alors que l'effectif dépasse largement les animaux décrits dans les procédures. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut étudier cette question.
Objectifs
Les anomalies de la durée de la gestation compliquent plus d’un quart des grossesses dans l’espèce humaine. La prématurité est la première cause de morbi-mortalités périnatales et dans les premières années de vie, et de handicaps dans la petite enfance. Le dépassement du terme est associé à une incidence accrue de mortinatalité ou de décès néonatal et de dysmaturité fœtale, ainsi qu’un taux accru d’accouchements par césarienne qui sont associés à un risque plus élevé de morbidité maternelle aiguë sévère. Chez la souris, les lignées de laboratoires présentent des différences de durée de gestation qui sont génétiquement fixées. Nous utiliserons deux souches consanguines murines (FVB/N et Balb/c) montrant plus de 30h d’écart dans la durée de gestation pour identifier des régions chromosomiques affectant la durée de la gestation. Nous obtiendrons également des données de l’expression des gènes à l’interface fœto-maternelle chez les cas les plus extrêmes avec des technologies de dernière génération. La combinaison de ces deux analyses et la puissance de la génétique de la souris ouvrent la possibilité d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans le déterminisme de la durée de la gestation, question non résolue actuellement dans de nombreuses espèces de mammifères, incluant l’espèce humaine.
Bénéfices attendus
L’étude des déterminants génétiques de la durée de la gestation chez la souris nous permettra de mieux connaitre les mécanismes de la cascade de la parturition. Une meilleure connaissance de ces mécanismes pourrait permettre d’identifier des déterminants du déclenchement du travail dans l’espèce humaine et de mieux comprendre la physiologie de l’accouchement à terme et la physiologie de l’accouchement prématuré.
Procédures
Toutes les souris (414 souris) : - seront mises en accouplement - auront une échographie par semaine pour la détection de la gestation (deux fois pendant la gestation). Pour cet acte, les souris seront sous anesthésie générale et rechauffée par une platine chauffante. La durée de l’échographie est d’environ 5 minutes. - seront mises seules dans un cage si elles sont gestantes, dans la mesure où nous avons besoin de connaître précisément la durée de gestation de chaque femelle. Une surveillance vidéo en continu (Infra-rouge, non invasive) de la cage permettra de dater précisément la mise bas. Les souris seront isolées dès le diagnostic de gestation par échographie et jusqu’à la mise bas. Pour quelques souris seulement (60 souris): En fin de gestation, un unique prélèvement sanguin (200μl prélevés à la veine sous-mandibulaire avec une lancette, ainsi qu’un unique prélèvement de liquide amniotique (amniocentèse) seront réalisés sous anesthésie générale et analgésie, avant la mise à mort. L'analgésie se fera par injection d'un traitement antidouleur. L'injection dure quelques secondes et les effets antidouleurs plusieurs minutes. Le prélevement sanguins durent moins d'une minute et le prélèvement de liquide amniotique dure environ 1 minute par unité foeto-placentaire. Il est prévu un total de 15 minutes pour effectuer le prélèvement sanguin et le prélèvement de liquide amniotique
Impact sur les animaux
Stress potentiel due à la manipulation et à l’isolement.
Devenir
Mise à mort des animaux en fin de procédure afin de limiter la souffrance animale potentielle.
Remplacement
Il n’existe pas de modèle alternatif (organoïde, culture cellulaire) pour étudier la durée de la gestation et ses déterminants génétiques.
Réduction
Utilisation de croisement de différentes lignées de souris dont le fonds génétique est stable. Utilisation de l’échographie pour le suivi de gestation qui permet de détecter les gestations de façon précoce et de diminuer le nombre d’animaux à utiliser dans la phase d’élevage. Les gestations courtes et le fait qu’il y ait une dizaine de petits par portée permet de réduire aussi le nombre de croisement nécessaire pour obtenir les effectifs nécessaires pour les études statistiques. Les données de la littérature permettent de réduire le nombre d’animaux pour la deuxième génération. Des tests statistiques seront réalisés pour analyser les données et ont été utilisés pour ajuster le nombre minimal d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les animaux disposent de rouleaux de cartons et du coton compacté comme enrichissement. Les femelles gestantes sont surveillées en continu par des cameras infrarouges. Les échographies sont réalisées sous anesthésie générale. Les souris endormies sont placées sur une plaque chauffante et leur température sera surveillée pendant toute la durée de l'échographie (durée de 5 minutes). Un traitement antidouleur sera administré avant le prélèvement sanguin et de liquide amniotique.
Choix des espèces
Une meilleure connaissance du déclenchement du travail permettrait de mieux prédire, voire de contrôler l'accouchement, afin de limiter la prématurité. Une des difficultés d'étude cette question dans l’espèce humaine est l'impossibilité pratique d'établir le moment exact de la parturition et ainsi d'effectuer des études longitudinales chez la femme. Nous pouvons lever cette barrière en utilisant des modèles de souris, où nous pouvons surveiller avec précision la progression de la gestation à l'aide de mesures par échographie et prédire et enregistrer l'accouchement. Des composants de la cascade de la mise en travail et de l'accouchement sont partagés chez la souris et l'homme, comme l’inflammation sans infection, dont l’origine est inconnue. De plus, la durée de gestation est génétiquement déterminée dans les souches consanguines, ce qui favorise l'étude de la génétique chez la souris. Nous utiliserons des souris sexuellement matures, à savoir dès 8 semaines de vie.
Effet de l’exposition à de haute tension d’oxygène sur les cellules souches hématopoïétiques (CSH) de la moelle osseuse.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées, jusqu'à douze pour certaines, et des prélèvements sanguins, pour étudier l'effet d'un composé libérant l'oxygène sur les cellules souches du sang dans la moelle osseuse. Le porteur signale comme atteintes des douleurs aux points d'injection et le stress lié aux manipulations. Il affirme qu'il faut mener l'étude sur des individus vivants et met à mort les souris pour analyser leurs cellules.
Objectifs
Les cellules du sang assurant l'oxygénation des tissus et la défense immunitaire se développent dans la moelle osseuse (MO) à partir de cellules souches hématopoïétiques (CSH) tout au long de la vie des individus. L'ensemble des mécanismes biologiques qui gouvernent l'auto-renouvellement et la différenciation des CSH ne sont pas totalement élucidés. Chez l’homme, la perturbation de ces mécanismes participe au développement de maladies auto-immunes et de leucémies. Une meilleure compréhension de ceux-ci permettra de développer des cibles et des stratégies thérapeutiques pour traiter les patients. Les CSH sont maintenues dans la moelle osseuse qui constituent leur niche. Il a été montré que le faible niveau d’oxygène présent dans cette niche est essentiel au maintien des CSH en dormance. Récemment un dérivé synthétique qui augmente la libération de l’oxygène dans les tissus et le sang a été développé. Ce dérivé est utilisé pour rétablir des niveaux d’oxygène normaux dans le traitement de cancers solides. Ce composé est actuellement en essai clinique phase II pour le traitement de patients atteint de cancer du pancréas. Notre but est de définir si des niveaux d’oxygène plus importants dans la niche des CSH, lors de traitement avec ce composé, perturbent le maintien des CSH et conduisent à des dérégulations de ces cellules.
Bénéfices attendus
Nous espérons par ces expériences mettre en évidence qu’un niveau d’oxygène plus important dans la niche perturbe la maintenance des CSH et influence leur différenciation qui peut être à l’origine d’un vieillissement prématuré du système hématopoïétique ou d’immunodéficience. Il est important de connaitre les effets de composés libérant l’oxygène dans les tissus puisque des patients atteints de cancer solides sont traités avec ces substances. Une meilleure connaissance du développement des CSH en présence de traitement augmentant l’oxygène dans les tissus permettra d’adapter plus précisément le traitement de patients atteints de cancer.
Procédures
12 souris seront injectées 4 fois, 12 autres souris 8 fois et 12 autres souris 12 fois. La durée du temps d’injection est inférieure à une minute. 12 animaux seront soumis à des prélèvements sanguins prélevés 2 fois à 4 semaines d'intervalles et 12 autres seront prélevés 1 fois. Le prélèvement de sang est de l’ordre de la minute.
Impact sur les animaux
Les nuissances sur les animaux dans ce protocole sont les douleurs au niveau des sites d'injection de l'ITPP et le stress des animaux lors de ces injections et durant les prises de sang.
Devenir
Les souris injectées intrapéritonéalement seront mises à mort pour être analysées et évaluer les effets du traitement.
Remplacement
Les cellules souches hématopïétiques (CSH) se développent dans une niche de la moelle osseuse. Cet environnement particulier permet d’établir un gradient d’oxygène faible dans les zones périphériques (près de l’os) et élevé dans les zones vascularisées centrales. Les CSH sont maintenues dans les zones faibles en oxygène. Nous cherchons à définir si un traitement anti-hypoxie mené sur un individu peut affecter ces CSH dans leur environnement. Pour cela il est important de mener l’étude sur des individus vivants.
Réduction
Ces expériences seront réalisées sur 6 animaux pour les traitements avec le composé et comparées à 6 animaux contrôles pour chaque temps de traitement analysé (4, 8 et 12 semaines). A l'aide de tests statistiques utilisés nous serons en mesure de conclure.
Raffinement
Pour le raffinement : puisque les souris peuvent êtres immunodéficientes elles seront hébergées en cages ventilées et filtrées et manipulées sous -hotte pour maintenir un environnement le plus aseptique possible. Nous serons très vigilants pour être dans les conditions les plus aseptiques possibles lors des injections intrapéritonéales ainsi que lors des prises de sang.Si les animaux présentent des signes de souffrance (perte de poids supérieur à 20% ou prostration de l'animale) liées au traitement nous éliminerons ces animaux par euthanasie et chercherons à déterminer les causes de ces souffrances. Si des antibiotiques ou des analgésiques peuvent éliminer les souffrances animales détectées nous les utiliserons.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour l'analyse du développement des CSH dans la moelle osseuse. De nombreux réactifs (anticorps permettant d'identifier les CSH notament) pour mener à bien ces analyses sont disponibles. De plus les études visant à traiter les cancers humains à l’aide de composé favorisant la libération de l'oxygène ont été menées chez la souris, indiquant que cet animal est un modèle de choix pour l’étude de ce composé. Les animaux sont utilisés à partir 6 semaines ce qui correspond au stade de maturité adulte du système hématopoïétique et avant 6 mois pour ne pas introduire un biais dans les résultats avec des animaux vieillissants.
Rémission de la pathologie cardiaque pour un vieillissement de qualité : recherche et validation d’acteurs moléculaires dans un modèle murin EU1/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ce volet jumeau d'un même protocole multicentrique impose à chaque animal deux chirurgies cardiaques espacées de quatre semaines, des séances d'imagerie sous anesthésie, des courses forcées sur tapis roulant et des prélèvements sanguins, pour caractériser la récupération du cœur après un stress pathologique transitoire. Les bénéfices avancés pour l'Homme restent formulés au conditionnel et à long terme, l'objectif immédiat étant le séquençage des gènes exprimés dans le cœur. Le porteur décrit l'insuffisance cardiaque comme une atteinte de l'"organisme entier" et affirme la "nécessité" du modèle murin.
Objectifs
L'insuffisance cardiaque (IC) se développe suite à l’accumulation d’altérations induites par un stress pathologique comme l’hypertension ou les atteintes des artères coronaires. Ces multiples altérations sont regroupées sous le terme général de remodelage. Les avancées thérapeutiques permettent de ralentir cette progression vers l’IC et parfois de lever le stress cardiaque initial. Cependant de nombreux patients voient leur fonction cardiaque décliner inexorablement ou secondairement. Des études récentes conduites chez l'Homme et chez l’animal ont montré que suite à un stress cardiaque pathologique transitoire, certaines lésions semblent irréversibles d'autres s’estompent constituant un processus de remodelage inverse. L’analyse au niveau moléculaire de ce processus indique qu'il correspond en fait à un nouvel état plutôt qu’à un retour à la normale. Ces données sont cohérentes avec la description clinique d’altérations tardives après une prise en charge efficace dans un premier temps. Ce retentissement à long terme sera probablement de plus en plus fréquent avec le vieillissement de la population. Le projet vise à identifier, in vivo dans un modèle murin, les mécanismes intimes, cellulaires et moléculaires, impliqués dans le remodelage inverse et susceptibles de favoriser une récupération plus complète et durable. Les recherches précliniques sur cette problématique sont à ce jour balbutiantes. Le projet permettra de compléter ces études en profitant des dernières avancées technologiques, de proposer et de tester des stratégies thérapeutiques complémentaires et nouvelles. Sur la base d'un modèle murin bien caractérisé de pathologie cardiaque, adapté pour être transitoire, ces objectifs seront suivis par 1) une caractérisation moléculaire approfondie du cœur en phase de récupération de la pathologie comparée à celle de cœurs sains et malades. Cette approche sans à priori, par séquençage à large échelle des gènes exprimés dans ces différentes conditions permettra de décrire les évènements moléculaires et de générer de nouvelles hypothèses d'intervention. 2) le suivi de la trajectoire du vieillissement, normale ou altérée, après récupération par des explorations physiologiques régulières d’une cohorte d’animaux. 3) la réalisation d’essais précliniques d’interventions (exercice, traitements, thérapie génique) pour favoriser la récupération. Les techniques utilisées seront déployées dans 2 zootechnies disposant d'outils et compétences complémentaires.
Bénéfices attendus
Le projet s'inscrit dans les recherches expérimentales pour l'amélioration future de la prise en charge et du traitement de pathologies humaines et le maintien en bonne santé. Il s'intéresse à une cause majeure de morbi-mortalité dans les pays dits développés, les maladies cardiovasculaires. Il se penche sur un aspect nouveau de l'atteinte cardiaque, les altérations persistantes malgré une prise en charge efficace. A long terme chez l'Homme, la description de cette atteinte et la compréhension de ses mécanismes pourraient permettre de favoriser un vieillissement en meilleure santé et aussi de cibler des mécanismes pathologiques nouveaux lors du traitement. Le projet déploit les dernières avancées technologiques (séquençage haut débit) pour une meilleure description moléculaire des altérations, une évaluation fonctionnelle approfondie et des essais précliniques de test d'interventions thérapeutiques. A plus court terme, la faisabilité d'une mise en place d'un modèle in vitro de fibroblaste activé sera testée. Ce type cellulaire participe de manière importante à l'atération du muscle cardiaque en synthétisant en son sein une matrice rigide responsable de défauts mécaniques et électriques cardiaques. Cette matrice excessive constitue un type de lésion nommée fibrose. Après récupération, cette fibrose persiste et aucun traitement ne cible spécifiquement cette altération, actuellement. L'établissement d'un modèle ex vivo permettrait de diminuer le nombre d'animaux nécessaires pour des études futures de certains mécanismes du remodelage pathologiques ou de criblage de candidat-médicament.
Procédures
La mise en place du modèle expérimental de récupération de la dysfonction cardiaque repose sur la réalisation de 2 interventions chirugicales (d'environ 30 min chacune) : une d'induction de la pathologie puis, 4 semaines après, une de correction. Pour les différents objectifs du projet, les animaux sont soumis à des techniques non invasives d'imagerie sous anesthésie générale : echocardiographie, examen d'environ 10 min utilisé pour le suivi c'est à dire répété à intervalle régulier (max 1fois/semaine) et scanner, examen de 2h réalisé une fois en fin de protocole. Le suivi des animaux sera également mené par des mesures répétées (fréquence de 1 fois/mois) de l'activité physique maximale via une épreuve de course sur tapis roulant avec mesure de la performance (durée de course) confirmée par un marqueur sanguin nécessitant le prélèvement d'une goutte de sang. Pour certains objectifs du projet, incluant une approche préclinique, l'administration de médicaments (quotidienne) ou d'agent de thérapie génique (unique) sera réalisée.
Impact sur les animaux
L’approche expérimentale nécessite 2 interventions chirurgicales. Il faut noter que la 2nde permet de mettre fin au stress cardiaque pathologique qui autrement conduirait à l'insuffisance cardiaque. Les chirurgies comportent toujours un risque, comme chez l'Homme. Elles constituent les sources de douleur (chirurgies et période post-opératoire) mais toutes les mesures d’analgésie nécessaires et validées seront prises pour l'empecher. Pour les modifications pathologiques induites par la première chirurgie, il n’y a pas de symptômes et les lésions s'accumulent progressivement, silencieusement (pas de douleur, pas de retentissement sur l'activité au moins dans les conditions d’hébergement sédentaire des animaux). L'altération de l'état général de l'animal qui pourrait être associée à ce type de pathologie n'est présente qu'à un stade très avancé qui n’est pas l'objet de ce projet. La limitation des atteintes sera mesurée objectivement par les mesures non invasives d’imagerie cardiaque (echocardiographie). Pour les stress, ils sont de bas niveaux (echographie et scanner réalisés sous anesthésie générale gazeuse, course sur tapis roulant), transitoires et limités au besoin scientifique du projet.
Devenir
Toutes les procédures se soldent par l'euthanasie des animaux et le prélèvement des tissus d'intéret. Ils serviront à des analyses des tissus, des cellules, des protéines et de l'expression des gènes. Ainsi, chaque animal utilisé apportera un maximum d'informations pertinentes pour les objectifs scientifiques du projet grâce à des mesures intégrées sur le phénotype (fonction cardiaque, capacité d'exercice) associées à des mesures détaillées de laboratoire.
Remplacement
Le mécanisme du remodelage cardiaque aboutissant à l'insuffisance cardiaque (IC) en réponse à un stress implique tous les types cellulaires constitutifs du tissu mais aussi le recrutement de cellules, en particulier inflammatoires et l’interaction avec d’autres organes (rein, système nerveux, …). L’IC est donc une pathologie touchant tout l’organisme rendant indispensable une approche in vivo. De manière analogue, le remodelage inverse nécessite la même approche. De plus, le meilleure critère d'évaluation de la fonction cardiaque est la capacité physique à l'image de ce qui est réalisé chez l'Homme (périmètre de marche, épreuve d'effort).
Réduction
L’approche sans à priori utilisant un criblage à large échelle sera réalisée avec le minimum d’animaux possibles car son objectif est principalement d’identifier les pistes à approfondir. Ensuite cette approche in vivo est complémentaire d’études in silico et in vitro qui seront conduites en parallèle et en complément. L’étude informatique des réseaux de gènes nous aidera à identifier les éléments clés. Le criblage à large échelle combiné à une analyse informatique permettra de recueillir un maximum de données à partir des animaux inclus dans le protocole. Ensuite, les molécules candidates pour améliorer la prise en charge seront testées chez les animaux dont le nombre sera déterminé par une approche statistique adaptative. Elle favorise l'utilisation d'un nombre minimum d'animaux nécessaire sans compromettre les résultats scientifiques grâce à une analyse intermédiaire des résultats obtenus sur un effectif réduit d'animaux par rapport à l'effectif total planifié. La décision est alors prise de poursuivre si les résultats sont encourageants ou de stopper l'essai si l'intervention testée est trop peu efficace. Pour tous les points du projet, la technique chirurgicale utilisée correspond au dernier développement publié pour permettre une diminution de la variabilité du remodelage ce qui entraîne une diminution du nombre d’animaux comparativement à la technique historique.
Raffinement
Les procédures susceptibles d’induire la douleur sont bien identifiées : l’approche chirurgicale d’induction et de correction de la pathologie cardiaque. Lors de ces interventions, l’analgésie locale en complément d’une analgésie générale (morphinique) permet de prévenir la douleur. De plus, les chirurgies seront réalisées par un chercheur rompu à la technique permettant des opérations rapides et des ouvertures minimales diminuant les risques opératoires et participant à une meilleure récupération. Les derniers développements de la technique chirurgicale qui rapportent un meilleur taux de succès seront mis en œuvre. Le suivi est renforcé dans la période post-opératoire (48 h), l'analgésie est poursuivie et les animaux disposent d'aliments spécifiques, dédiés à la récupération. Il n’y a pas de source de douleur ensuite : le remodelage induit est silencieux même si les animaux sont suivis quotidiennement. Les stress potentiels associés aux procédures sont de faible intensité, de courte durée (anesthésie/reveil, course forcée) et espacés dans le temps. Les animaux sont par ailleurs hébergés dans un environnement enrichi (matériel de nidification) et les groupes sociaux sont conservés tout au long de l’étude.
Choix des espèces
La souris est le mammifère chez lequel la grande majorité des études précliniques ont été conduites. Les connaissances et techniques acquises par la communauté scientifique sur cette espèce, toutes nécessaires à tirer le plus d'information à partir du présent projet, permettent l'analyse fine de l'expression génique et l'exploration poussée de la physiologie cardiovasculaire. De plus, il s’agit de l’espèce pour laquelle les modifications génétiques sont les plus aisées actuellement, permettant de tester plus aisément les hypothèses scientifiques. Elle combine donc les avantages d’être de la même classe que l’Homme et d’exister sous diverses souches génétiquement modifiées permettant des démonstrations expérimentales puissantes. Les animaux seront utilisés majoritairement à l’âge de jeune adulte (à partir de 6 semaines) car les pathologies étudiées sont, le plus souvent, des pathologies acquises. L’utilisation d’animaux jeunes est en revanche éloignée de la situation clinique mais permet une bonne récupération des procédures expérimentales chirurgicales et donc une bonne qualité de vie. Si une cible thérapeutique identifiée lors de la réalisation du projet necessite un outil de thérapie génique, seule la procédure d'injection de vecteur viral sera réalisée avant, à 3-4 semaines lorsque le système immunitaire n'a pas été en contact avec des virus banals qui pourraient induire une réaction croisée avec le vecteur et l'inactiver.
Rémission de la pathologie cardiaque pour un vieillissement de qualité : recherche et validation d’acteurs moléculaires dans un modèle murin EU2/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit deux chirurgies cardiaques, une pour induire la pathologie puis une pour la corriger quatre semaines plus tard, suivies d'échographies et de scanners sous anesthésie, de courses forcées sur tapis roulant et de prélèvements sanguins répétés, pour étudier le remodelage inverse du cœur. Les retombées annoncées pour les patients, un vieillissement en meilleure santé et de nouvelles cibles thérapeutiques, sont renvoyées au conditionnel et au long terme, alors que l'objectif immédiat reste de décrire des mécanismes moléculaires. Le porteur affirme que l'insuffisance cardiaque touche l'"organisme entier", ce qui rendrait une approche in vivo "indispensable", et conclut au recours à la souris.
Objectifs
L'insuffisance cardiaque (IC) se développe suite à l’accumulation d’altérations induites par un stress pathologique comme l’hypertension ou les atteintes des artères coronaires. Ces multiples altérations sont regroupées sous le terme général de remodelage. Les avancées thérapeutiques permettent de ralentir cette progression vers l’IC et parfois de lever le stress cardiaque initial. Cependant de nombreux patients voient leur fonction cardiaque décliner inexorablement ou secondairement. Des études récentes conduites chez l'Homme et chez l’animal ont montré que suite à un stress cardiaque pathologique transitoire, certaines lésions semblent irréversibles, d'autres s’estompent constituant un processus de remodelage inverse. L’analyse au niveau moléculaire de ce processus indique qu'il correspond en fait à un nouvel état plutôt qu’à un retour à la normale. Ces données sont cohérentes avec la description clinique d’altérations tardives après une prise en charge efficace dans un premier temps. Ce retentissement à long terme sera probablement de plus en plus fréquent avec le vieillissement de la population. Le projet vise à identifier, in vivo dans un modèle murin, les mécanismes intimes, cellulaires et moléculaires, impliqués dans le remodelage inverse et susceptibles de favoriser une récupération plus complète et durable. Les recherches précliniques sur cette problématique sont à ce jour balbutiantes. Le projet permettra de compléter ces études en profitant des dernières avancées technologiques, de proposer et de tester des stratégies thérapeutiques complémentaires et nouvelles. Sur la base d'un modèle murin bien caractérisé de pathologie cardiaque, adapté pour être transitoire, ces objectifs seront suivis par 1) une caractérisation moléculaire approfondie du coeur en phase de récupération de la pathologie comparée à celle de coeurs sains et malades. Cette approche sans à priori, par séquençage à large échelle des gènes exprimés dans ces différentes conditions permettra de décrire les évènements moléculaires et de générer de nouvelles hypothèses d'intervention. 2) le suivi de la trajectoire du vieillissement, normale ou altérée, après récupération par des explorations physiologiques régulières d’une cohorte d’animaux. 3) la réalisation d’essais précliniques d’interventions (exercice, traitements, thérapie génique) pour favoriser la récupération. Les techniques utilisées seront conduites dans 2 zootechnies disposant d'outils et de compétences complémentaires.
Bénéfices attendus
traitement de pathologies humaines et le maintien en bonne santé. Il s'intéresse à une cause majeure de morbimortalité dans les pays dits développés, les maladies cardiovasculaires. Il se penche sur un aspect nouveau de l'atteinte cardiaque, les altérations persistantes malgré une prise en charge efficace. A long terme chez l'Homme, la description de cette atteinte et la compréhension de ses mécanismes pourraient permettre de favoriser un vieillissement en meilleure santé et aussi de cibler des mécanismes pathologiques nouveaux lors du traitement. Le projet déploit les dernières avancées technologiques (séquençage haut débit) pour une meilleure description moléculaire des altérations, une évaluation fonctionnelle approfondie et des essais précliniques de test d'interventions thérapeutiques. A plus court terme, la faisabilité d'une mise en place d'un modèle in vitro de fibroblaste activé sera testée. Ce type cellulaire participe de manière importante à l'atération du muscle cardiaque en synthétisant en son sein une matrice rigide responsable de défauts mécaniques et électriques cardiaques. Cette matrice excessive constitue un type de lésion nommée fibrose. Après récupération, cette fibrose persiste et aucun traitement ne cible spécifiquement cette altération, actuellement. L'établissement d'un modèle ex vivo permettrait de diminuer le nombre d'animaux nécessaires pour des études futures de certains mécanismes du remodelage pathologiques ou de criblage de candidat-médicament.
Procédures
La mise en place du modèle expérimental de récupération de la dysfonction cardiaque repose sur la réalisation de 2 interventions chirugicales (d'environ 30 min chacune) : une d'induction de la pathologie puis, 4 semaines après, une de correction. Pour les différents objectifs du projet, les animaux sont soumis à des techniques non invasives d'imagerie sous anesthésie générale : echocardiographie, examen d'environ 10 min utilisé pour le suivi c'est à dire répété à intervalle régulier (max 1fois/semaine) et scanner, examen de 2h réalisé une fois en fin de protocole. Le suivi des animaux sera également mené par des mesures répétées (fréquence de 1 fois/mois) de l'activité physique maximale via une épreuve de course sur tapis roulant avec mesure de la performance (durée de course) confirmée par un marqueur sanguin nécessitant le prélèvement d'une goutte de sang. Pour certains objectifs du projet, incluant une approche préclinique, l'administration de médicaments (quotidienne) ou d'agent de thérapie génique (unique) sera réalisée.
Impact sur les animaux
L’approche expérimentale nécessite 2 interventions chirurgicales. Il faut noter que la 2nde permet de mettre fin au stress cardiaque pathologique qui autrement conduirait à l'insuffisance cardiaque. Les chirurgies comportent toujours un risque, comme chez l'Homme. Toutes les mesures d'anesthésie et d’analgésie nécessaires pour prévenir et empecher la douleur sont prises. Pour les modifications pathologiques induites par la première chirurgie, il n’y a pas de symptômes et les lésions s'accumulent progressivement, silencieusement (pas de douleur, pas de retentissement sur l'activité au moins dans les conditions d’hébergement sédentaire des animaux). L'altération de l'état général de l'animal qui pourrait être associée à ce type de pathologie n'est présente qu'à un stade très avancé qui n’est pas l'objet de ce projet. La limitation des atteintes sera mesurée objectivement par les mesures non invasives d’imagerie cardiaque (echocardiographie). Pour les stress, ils sont de bas niveaux (echographie et scanner réalisés sous anesthésie générale gazeuse, course sur tapis roulant), transitoires et limités au besoin scientifique du projet.
Devenir
Toutes les procédures se soldent par l'euthanasie des animaux et le prélèvement des tissus d'intéret. Ils serviront à des analyses des tissus, des cellules, des protéines et de l'expression des gènes. Ainsi, chaque animal utilisé apportera un maximum d'informations pertinentes pour les objectifs scientifiques du projet grâce à des mesures intégrées sur le phénotype (fonction cardiaque, capacité d'exercice) associées à des mesures détaillées de laboratoire.
Remplacement
Le mécanisme du remodelage cardiaque aboutissant à l'insuffisance cardiaque (IC) en réponse à un stress implique tous les types cellulaires constitutifs du tissu mais aussi le recrutement de cellules, en particulier inflammatoires et l’interaction avec d’autres organes (rein, système nerveux, …). L’IC est donc une pathologie touchant tout l’organisme rendant indispensable une approche in vivo. De manière analogue, le remodelage inverse nécessite la même approche. De plus, le meilleure critère d'évaluation de la fonction cardiaque est la capacité physique à l'image de ce qui est réalisé chez l'Homme (périmètre de marche, épreuve d'effort).
Réduction
L’approche sans à priori utilisant un criblage à large échelle sera réalisée avec le minimum d’animaux possibles car son objectif est principalement d’identifier les pistes à approfondir. Ensuite cette approche in vivo est complémentaire d’études in silico (modélisation informatique) et in vitro qui seront conduites en parallèle et en complément. L’étude informatique des réseaux de gènes nous aidera à identifier les éléments clés. Le criblage à large échelle combiné à une analyse informatique permettra de recueillir un maximum de données à partir des animaux inclus dans le protocole. Ensuite, les molécules candidates pour améliorer la prise en charge seront testées chez les animaux dont le nombre sera déterminé par une approche statistique adaptative. Elle favorise l'utilisation d'un nombre minimum d'animaux nécessaire sans compromettre les résultats scientifiques grâce à une analyse intermédiaire des résultats obtenus sur un effectif réduit d'animaux par rapport à l'effectif total planifié. La décision est alors prise de poursuivre si les résultats sont encourageants ou de stopper l'essai si l'intervention testée est trop peu efficace. Pour tous les points du projet, la technique chirurgicale utilisée correspond au dernier développement publié pour permettre une diminution de la variabilité du remodelage ce qui entraîne une diminution du nombre d’animaux comparativement à la technique historique.
Raffinement
Les procédures susceptibles d’induire la douleur sont bien identifiées : l’approche chirurgicale d’induction et de correction de la pathologie cardiaque. Lors de ces interventions, l’analgésie locale en complément d’une analgésie générale (morphinique) permet de prévenir la douleur. De plus, les chirurgies seront réalisées par un chercheur rompu à la technique permettant des opérations rapides et des ouvertures minimales diminuant les risques opératoires et participant à une meilleure récupération. Les derniers développements de la technique chirurgicale qui rapportent un meilleur taux de succès seront mis en oeuvre. Le suivi est renforcé dans la période post-opératoire (48 h), l'analgésie est poursuivie et les animaux disposent d'aliments spécifiques, dédiés à la récupération. Il n’y a pas de source de douleur ensuite : le remodelage induit est silencieux même si les animaux sont suivis quotidiennement. Les stress potentiels associés aux procédures sont de faible intensité, de courte durée (anesthésie/reveil, course forcée) et espacés dans le temps. Les animaux sont par ailleurs hébergés dans un environnement enrichi (matériel de nidification) et les groupes sociaux sont conservés tout au long de l’étude.
Choix des espèces
La souris est le mammifère chez lequel la grande majorité des études précliniques ont été conduites. Les connaissances acquises par la communauté scientifique sur cette espèce, toutes nécessaires à tirer le plus d'information à partir du présent projet, permettent l'analyse fine de l'expression génique et l'exploration poussée de la physiologie cardiovasculaire. De plus, il s’agit de l’espèce pour laquelle les modifications génétiques sont les plus aisées actuellement, permettant de tester plus aisément les hypothèses scientifiques. Elle combine donc les avantages d’être de la même classe que l’Homme et d’exister sous diverses souches génétiquement modifiées permettant des démonstrations expérimentales puissantes. Les animaux seront utilisés majoritairement à l’âge de jeune adulte (à partir de 6 semaines) car les pathologies étudiées sont, le plus souvent, des pathologies acquises. L’utilisation d’animaux jeunes est en revanche éloignée de la situation clinique mais permet une bonne récupération des procédures expérimentales chirurgicales et donc une bonne qualité de vie. Si une cible identifiée au point 1 du projet necessite un outil de thérapie génique, seule la procédure d'injection de vecteur viral sera réalisée avant, à 3-4 semaines lorsque le système immunitaire n'a pas été en contact avec des virus banals qui pourraient induire une réaction croisée avec le vecteur qui l'inactiverait.
Effet curatif de deux plantes médicinales, MA et AA, issues de la tradithérapie tunisienne, sur l’amélioration des paramètres métaboliques chez le rongeur présentant un diabète de type 2.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Rats : 72
442 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont rendus diabétiques puis gavés quotidiennement pendant cinq semaines, avec une quinzaine de prélèvements sanguins, avant prélèvement des tissus. L'objectif est de tester deux plantes de la tradithérapie tunisienne comme antidiabétiques. Le porteur affirme que l'équilibre énergétique et le dialogue entre organes ne sont pas modélisables in vitro et que le rongeur reste un "modèle de référence".
Objectifs
Le diabète de type 2 (DT2) touche 90% des personnes diabétiques, principalement au-delà de 40 ans, souvent en surpoids ou obèse, qui ont un régime alimentaire déséquilibré (trop riche en gras et en sucres) et/ou dont l’activité physique est insuffisante. Cette maladie métabolique est caractérisée par un excès chronique de sucre dans le sang Parmi les nouveaux axes de recherche pour traiter le DT2, émergent des alternatives thérapeutiques, préventives et curatives. Parmi ces alternatives thérapeutiques, la tradithérapie offre un panel de substances naturelles méconnues dont les effets n’ont été que très peu caractérisés de façon préclinique et clinique, bien qu’elles soient, localement, couramment utilisées par l’Homme. Ainsi, deux plantes médicinales ont été identifiées comme ayant des caractéristiques phytochimiques intéressantes pour prévenir et traiter le DT2 (ces plantes sont nommées ici MA et AA pour des raisons confidentielles). Spécifiquement, le but du projet sera d’établir chez l’animal diabétique: 1) Si le traitement par MA ou AA présente un effet-dose sur l’amélioration de la glycémie et de comparer ce traitement chronique à des anti-diabétiques déjà sur le marché. 2) Si une unique dose de la plante est suffisante pour améliorer la tolérance au glucose 3) Si les fractionnements successifs des composés de la plante reproduisent les effets anti-diabétiques observés, en vue d’isoler le(s) principe(s) actif(s).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de caractériser un nouvel antidiabétique issu de plantes pris par voie orale et d’isoler le (les) principe(s) actif(s)
Procédures
Les animaux seront soumis au traitement antidiabétique par gavage : un par jour pendant 5 semaines, avec un volume de 250 µl/souris ou un volume de 1,5 ml chez le rat. des prélèvements de sang seront effectués : un par semaine afin d'évaluer l'effet du traitement, 5 les jours de test : soit 15 prélèvements au total pour 3 tests.
Impact sur les animaux
Les nuisances dues aux déifférents traitements seront : Au début du traitement par gavage : du stress, Une douleur locale et passagère lors de l'injection intrapéritonéale ainsi que lors des prélèvements sanguins.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort car les tissus gluco-sensibles seront prélevés pour divers dosages
Remplacement
L’étude des variations de la glycémie, de l’insulinémie ne peut être réalisée que sur des animaux vivants, ce qui rend impossible le remplacement de ceux-ci par des modèles in vitro. L’étape de caractérisation des effets sur la sécrétion d’insuline a déjà été faite sur des lignées de cellules pancréatiques mais les effets sur les autres organes insulino-sensibles sont indispensables à caractériser. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. L’étude du métabolisme implique plusieurs organes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ce projet sera réalisé chez la souris mais aussi chez le rat, qui constituent des modèles de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques.
Réduction
Nous utiliserons des tests statistiques permettant de détecter les différences significatives entre les groupes expérimentaux, ce qui permet enfin de mener des études conformes sur des effectifs réduits. Le nombre d’animaux sera réduit grâce à l’utilisation de tests statistiques permettant de calculer le nombre minimum d’animaux pour calculer l’échantillon représentant la population, et suffisant pour détecter des différences. Chaque fois que ce nombre pourra être réduit, le nombre d’animaux utilisé sera diminué. Chaque fois que cela est possible, les mêmes animaux seront utilisés afin de réduire le nombre d’animaux : tous les tests métaboliques sont faits chez les mêmes animaux après un temps de repos et de récupération.
Raffinement
Depuis l’arrivée des animaux au laboratoire, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux (manipulation par les personnes compétentes, calme dans les pièces). Après réception des animaux, une semaine d’acclimatation sans intervention d’expérimentateurs sera respectée pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et au personnel. Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidation et carré de coton pour les souris ou des bâtonnets de bois et rouleaux de carton pour les rats qui permettent l’expression de comportements innés. Ils seront répartis à quatre par cage pour les souris et à deux pour les rats. Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux. Les différentes manipulations des animaux et injections seront effectuées par du personnel compétent, conformément à la législation. Les animaux seront manipulés quotidiennement avant les expériences de manière à diminuer leur stress et inconfort au moment des expériences. Le poids corporel et la prise alimentaire seront également contrôlés quotidiennement de manière à s’assurer du bon état de santé des animaux. Douleur et/ou souffrance des animaux sont rendues tolérables lors des prélèvements de sang en effectuant une application d’anesthésique local avant une incision minimale puis désinfection à l’eau oxygénée qui a un fort pouvoir coagulant (en plus d’être un antiseptique). Un animal présentant une perte de poids (
Choix des espèces
Le rongeur est l’animal le plus fréquemment étudié dans les études métaboliques précliniques avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisé. Les animaux, rats et souris spontanément diabétiques et ceux au régime gras et sucré seront âgés de 14 semaines.
Étude de la dynamique des modifications de l’expression des gènes au cours de la tumorigenèse dans le cancer du sein triple négatif
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
956 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines développent spontanément des tumeurs mammaires, d'autres subissent l'ablation du coussin adipeux et une greffe sous anesthésie, puis des traitements, avant prélèvement des échantillons. L'objectif est d'étudier les modifications épigénétiques précoces de la tumeur du sein triple négatif. Le porteur affirme utiliser en priorité des cultures d'organoïdes mais conclut que celles-ci ne reproduisent pas le développement tumoral complet in vivo.
Objectifs
Le cancer du sein est une maladie qui touche 1 femme sur 8, en France. Un des sous-types le plus agressif est le cancer du sein triple négatif (TNBC), qui représente 17% des cancers du sein. Des raisons génétiques peuvent être la cause du développement de ce cancer mais l’analyse des gènes ne permet pas à elle seule d’expliquer l’initiation et la progression de la maladie. Une mutation peut empêcher ou activer l’expression d’un gène. Mais d’autres mécanismes peuvent également perturber l’expression de ces derniers : ce sont les mécanismes épigénétiques. Ils régulent la structure de l’ADN (la chromatine), modifiant ainsi son état de compaction et donc la capacité d’un gène d’être exprimé ou non. Notre projet consiste à étudier les modifications du paysage épigénétique dans les cellules pré-tumorales et tumorales, afin d'étudier leur potentiel rôle dans la transformation des cellules saines en cellules cancéreuses au cours de la tumorigenèse. Plusieurs applications cliniques peuvent découler de ce projet, identifier et caractériser les cellules pré-tumorales est en effet un enjeu majeur pour améliorer la prise en charge et le diagnostic des patientes à risque. Ce projet présente un défi majeur : comment étudier une population de cellules rares avant l’apparition de tumeur ? L'accès à des échantillons pré-tumoraux humains est évidemment très rare, il est donc indispensable de travailler sur un modèle murin qui développe des TNBC. En prélevant des échantillons à différents moments de la croissance tumorale, nous pourrons alors cartographier l’identité des cellules à chaque stade de la tumorigenèse (avant apparition de tumeur, pendant transformation des cellules saines en cellules tumorales, à différents stades de croissance de la tumeur). L’objectif général est donc de caractériser et d’identifier les modifications non génétiques – i.e les modifications sur la chromatine et d’expression des ARNs - qui participent à tumorigenèse du cancer du sein triple négatif.
Bénéfices attendus
Notre projet va permettre une compréhension détaillée de la mise en place des tumeurs mammaires depuis les premières altérations d’une cellule d’origine à la formation d’une tumeur entière qui déstructure le tissu. Ces étapes initiatrices sont inaccessibles chez la femme, car les patientes arrivent à l’hôpital avec un cancer déjà apparu. L’étude moléculaire complète à haute résolution temporelle de la tumorigénèse mammaire chez l’animal va nous permettre de déterminer les éléments clefs qui mènent à la formation des tumeurs dans la glande mammaire. A plus long terme, ce projet pourrait ouvrir des perspectives pour l’interception et la détection des tumeurs mammaires de manière extrêmement précoce. Grâce à nos études chez l’animal, nous espérons à long terme avoir un impact sur la prise en charge et le traitement du cancer du sein triple négatif. En effet, un objectif est d’identifier des marqueurs de transformation précoce, pouvant servir de biomarqueurs de détection, ainsi que des voies de signalisation activées dès les premières étapes de la transformation mammaire, pour proposer de les cibler par des approches thérapeutiques chez les femmes à risque.
Procédures
Une partie des animaux de ce projet sera injectée (1 fois) dans l’abdomen (injection intrapéritonéale sur animaux vigiles) avec un produit non toxique et non douloureux (durée du geste inférieur à 10 sec). Une autre partie des animaux sera anesthésiée puis opérée (ablation du coussin adipeux mammaire puis injection de cellules mammaires ou de fragments fragments mammaires) (durée de l’anesthésie inférieure à 20 minutes). Une autre partie des animaux recevront un traitement test anti-cancéreux par voie orale ou directement dans l’abdomen. En fonction des molécules le traitement pourra être administré de 1 fois toutes les 3 ou 4 semaines à 1 fois par jour pendant 3 à 6 semaines (durée du geste inférieure à 10 sec)
Impact sur les animaux
Les 4 lignées d’animaux transgéniques vont spontanément développer des tumeurs mammaires sous-cutanées (1 ou plusieurs). Des méthodes non invasives seront utilisées pour évaluer l’apparition de ces tumeurs. Les nuisances expérimentales se limiteront aux stress de la contention et de la manipulation des animaux et les nuisances modérées sur les animaux seront donc la conséquence de l’apparition des tumeurs Les animaux greffés avec des cellules tumorales dans la glande mammaire développeront des tumeurs qui seront mesurées quotidiennement. Les nuisances attendues suite à l’injection de produits dans l’abdomen des animaux sont les douleurs liées à la piqûre.
Devenir
Toutes les souris sont mises à mort au terme de l’expérience pour récupérer les échantillons d'intérêt.
Remplacement
Nous avons développé différents systèmes d’analyse en culture cellulaire de la glande mammaire et des cellules tumorales (système de culture organoïde – où les cellules de la glande mammaire se cultivent en 3D et s’organisent en mini-glandes - ces cultures sont mises en place à partir d’échantillons de glandes mammaires pré-tumorales ou contrôles). Ces essais permettent d’obtenir des informations très importantes sur les capacités de prolifération et de différenciation des cellules saines et tumorales. Nous les utilisons en priorité par rapport à l’expérimentation in vivo, notamment pour faire tous les tests fonctionnels. Toutefois, aucun d’entre eux ne permet d’analyser dans leur ensemble les processus complexes du développement et transformation de l’épithélium mammaire à partir de cellules isolées ou de fragment tissulaire, comme il est possible de le faire après transplantation dans le coussin adipeux de souris hôtes. De la même façon, seuls les modèles transgéniques permettent d’analyser in vivo l’impact de la perturbation de molécules régulatrices sur le développement et la tumorigénèse mammaire.
Réduction
Pour l’étude du développement tumoral dans les lignées transgéniques, la stratégie d’accouplement a été optimisée pour obtenir le maximum de souris de génotype adéquat et ainsi réduire l’élevage. Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Nous limitons également le nombre d’animaux utilisés en réalisant les expériences fonctionnelles ex vivo, à partir de culture organoïdes de la glande mammaire animale.
Raffinement
Pour limiter le stress, les femelles sont regroupées à raison de 6 femelles maximum par cage. Les souris transgéniques pour lesquelles le développement de tumeurs est attendu seront surveillées 2 fois par semaine. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux. Les animaux qui subiront des procédures chirurgicales recevront des anesthésiques et analgésiques. La chirurgie et le réveil seront réalisés sur plaque chauffante pour éviter tout risque d’hypothermie. Des aliments gélifiés seront mis à disposition des animaux pendant les 2 semaines suivant l’opération. Les animaux seront surveillés 2 fois par semaine pendant 8 à 12 semaines après la transplantation. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux. En cas d'atteinte d'un point-limite, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Notre programme de recherche nécessite l’utilisation de mammifères. Le modèle souris est le plus approprié à l’expérimentation sur la glande mammaire, en biologie du développement comme en cancérogenèse. Les souches murines sont parfaitement définies et permettent l’obtention de modèles génétiquement modifiés. L'organisation générale, le développement et le fonctionnement de la glande mammaire sont très similaires chez la souris et chez la femme. Les souris génétiquement modifiées pour lesquelles le développement de tumeurs est attendu seront utilisées à l’âge adulte (stade de développement des tumeurs). Les souris utilisées dans les expériences de transplantation sont des femelles prépubertaire âgées de 3 semaines, âge nécessaire car à ce stade l’épithélium mammaire est très peu développé, on peut donc l’éliminer par microchirurgie et transplanter les cellules du donneur dans la partie du coussin adipeux resté intact.
Modulation de la formation de la cicatrice gliale après une lésion de la moelle épinière chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
376 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque souris subit une lésion de la moelle épinière sous anesthésie, par section partielle ou par contusion, provoquant une paralysie des pattes, une incontinence urinaire, un risque d'escarres et une douleur pouvant atteindre l'hyperalgie et l'allodynie. L'objectif est de tester un traitement oral limitant la cicatrice gliale pour favoriser la récupération motrice. Le porteur affirme que les cultures cellulaires ne reproduisent pas la complexité de la lésion in vivo et qualifie ce modèle animal d'"incontournable".
Objectifs
Les lésions de la moelle épinière (LME) touchent 2.5 millions de patients dans le monde (dont 40 000 en France) et induisent des symptômes allant de troubles neurologiques sensori-moteurs minimes à la tétraplégie complète souvent associés à des douleurs neuropathiques. Il n'existe aucun traitement curatif efficace pour aucun des symptômes induits par une LME. Il est donc de grand intérêt de mettre en place des stratégies thérapeutiques visant à augmenter la récupération motrice et sensitive suivant une LME. Après une lésion de la moelle épinière une cicatrice se forme et constitue un obstacle physique et chimique à la repousse des cellules nerveuses lésées, empêchant ainsi la récupération fonctionnelle. Cette cicatrice est majoritairement composée de deux types de cellules. Nous avons montré chez des individus jeunes, qu’un traitement pharmacologique qui limite la prolifération d’une des deux populations cellulaires formant la cicatrice, donné par voie orale avant et juste après une section partielle de la moelle épinière favorise la récupération motrice chez les souris. Dans un but de transposition à la clinique, nous allons tout d’abord étendre notre approche (1) à un traitement initié plus tardivement lors de phases chroniques après la LME (transposition aux patients chroniques) et (2) à des individus plus âgés. De plus nous allons tester ces approches dans un autre modèle de LME, la contusion (ou choc) médullaire, plus proche de la réalité clinique.
Bénéfices attendus
Les lésions de la moelle épinière (LME) induisent des symptômes allant de la paraplégie partielle à la tétraplégie complète. Il n’y aucun traitement curatif. Développer des travaux s’intéressant aux phases aiguës et chroniques représentent donc un enjeu majeur tant sur le plan de la santé individuelle que sur le plan économique et social. Les lésions médullaires étant d’origines variées chez l’homme (section par arme blanche, choc et écrasement…) nous utilisons des modèles similaires chez l’animal car ils représentent actuellement les paradigmes expérimentaux les plus pertinents pour comparer à la pathologie humaine. De plus, l’étude à des âges différents est aussi importante dans un contexte de translation à la clinique avec une population vieillissante dans les pays industrialisés. Notre projet est donc conçu avec un objectif de recherche translationnelle grâce à (1) l'utilisation d'un traitement par voie orale, (2) le traitement post lésionnel en phases aigüe et chronique, (3) l’analyse dans 2 modèles lésionnels, (4) l’étude d’individu jeunes et âgés, et (5) le suivi de l'évolution de la lésion par IRM comme chez l’homme. Nous obtiendrons aussi des informations mécanistiques sur le dialogue moléculaire des deux populations cellulaires formant la cicatrice gliale.
Procédures
Tout ou partie des animaux seront soumis à plusieurs interventions. Le prélèvement de tissu d’oreille est nécessaire pour effectuer le génotypage des animaux et sera effectué sur animaux vigiles de manière unique au moment du sevrage (J21). Les animaux subiront des lésions de la moelle épinière sous anesthésie générale d'une durée 30 min (n=376) . Les animaux seront évalués à différents temps au niveau comportemental (2 tests différents sans contraintes pour l’animal) afin de déterminer la récupération des fonctions motrices après lésion de la moelle épinière (fréquence, durée, nombre). La moitié des animaux recevra via l’alimentation un traitement pharmacologique pour une durée de 7 jours soit juste après la lésion, soit 4 semaines ou 10 semaines après la lésion (le composé est inséré dans les croquettes). Les animaux recevront des injections quotidiennes en intra-péritonéal durant 7 jours soit juste après la lésion, soit avant l'euthanasie des animaux en fonction des groupes étudiés. Les animaux recevront une injection en sous cutanée d'anesthésique local (moins de 1min) puis une injection IP d’anesthésique (moins d'1 minute) afin de procéder aux prélèvements de tissus post-mortem et d’initier les études moléculaires, cellulaire ainsi que l’analyse des tissus.
Impact sur les animaux
Le génotypage peut induire un stress pour l’animal. Les injections quotidiennes en i.p. peuvent induire un stress pour l’animal. Nuisances motrices : paralysie de la patte arrière du côté de la lésion spinale (hémisection) ou des deux pattes (contusion), une récupération spontanée du support de poids est observée dès le 5ème jour après lésion dans le cas de l’hémisection et dès le 14ème jour après la lésion dans le cas de la contusion. Nuisance urinaire : le contrôle du sphincter urinaire est altéré dans les deux modèles lésionnels, une récupération spontanée est observée dès le 7ème jour après lésion dans le cas de l’hémisection et le 14ème jour après une contusion. Nuisances sensitives : suite à la chirurgie des signes de détresse (pilo-érection, déshydratation, apparence voûtée, yeux enfoncés ou comportement d'isolement) peuvent être observés. 24-48hrs suivant la lésion, la douleur des animaux peut être de niveau 3 (hyperalgie, allodynie). Suite à la chirurgie, une perte de poids est observée pendant 1 à 2 jours après la lésion. A cause de la paralysie des escarres peuvent se former. Suite à la lésion, des comportements de domination peuvent être observés. Une anesthésie peut induire une hypothermie transitoire et un dessèchement de la cornée.
Devenir
A la fin des expériences, les animaux seront euthanasiés afin collecter les tissus d’intérêt pour faire des analyses post mortem histologiques, cellulaires et moléculaires. Notre projet est donc conçu avec un objectif de recherche translationnelle grâce à (1) l'utilisation d'un traitement par voie orale, (2) le traitement post lésionnel en phases aigüe et chronique, (3) l’analyse dans 2 modèles lésionnels, (4) l’étude d’individu jeunes et âgés, et (5) l'imagerie de la lésion par IRM. Nous obtiendrons aussi des informations mécanistiques sur le dialogue moléculaire des deux populations cellulaires formant la cicatrice gliale. L’analyse des tissus du système nerveux central est le seul moyen permettant de valider ou non nos hypothèses.
Remplacement
La règle des 3R sera appliquée. L’alternative à l’expérimentation animale est encouragée par l’utilisation des cultures primaires de neurones et de cellules gliales. Néanmoins, l’environnement cellulaire des neurones dans son ensemble (astrocytes, microglies) est limité par les co-cultures. Les cellules cultivées ne peuvent pas remplacer la complexité physiologique et pathologique que l’on a in vivo. In vivo un nombre important de populations cellulaires interagissent tant sur le plan moléculaire que structurel, ceci ne peut être reproduit in vitro. Les modèles animaux de traumatisme médullaire représentent donc actuellement le paradigme expérimental le plus pertinent qui reproduit fidèlement la pathologie humaine. Ces modèles animaux seront utilisés pour étudier l’altération tissulaire et cellulaire ainsi que les modifications moléculaires in vivo et nous aideront à évaluer de nouvelles approches thérapeutiques. Ces approches thérapeutiques ne peuvent être menées que chez l’animal et représentent une étape préclinique capitale et incontournable si l’on projette une application clinique.
Réduction
Ce projet permet l’utilisation de tous les animaux produits. De plus de nombreuses analyses sont effectués sur les mêmes animaux. Grâce aux études précédentes que nous avons mené mais également par anticipation des approches statistiques que nous utiliserons nous avons déterminé un nombre d’animaux permettant de conclure sans engager d’expériences supplémentaires tant pour les approches comportementales, histologiques (évaluation de la puissance statistique d’un protocole en fonction des effectifs) . Afin d’optimiser les lots, nous avons décidé de développer cette étude portant à la fois sur les 2 sexes, mais également à deux âges différents, ce qui permet l’utilisation de tous les animaux générés. Dans le cadre de l’étude transcriptomique, nous veillons à optimiser les lots d’animaux générés en réservant les animaux porteurs du transgène pour les expériences de biologie moléculaire, les compagnons de portée non transgénique seront utilisés dans les autres expériences.
Raffinement
Afin de réduire le stress, les expérimentateurs seront toujours les mêmes au cours de l’étude et les animaux seront habitués aux tests. Une attention particulière sera portée à l’enrichissement de l’environnement (hutte, coton). Pour la gestion de la douleur, utilisation d’anesthésiants adaptés mais compatible avec les lésions de la moelle épinière et le type de données analysées (biais). Réduction de la souffrance : soins quotidiens spécifiques (zone d’incision vérifiée, vessie vidangée manuellement 2 fois par jour, absence d’escarre, prise alimentaire vérifiée). Signes de détresse vérifiés 2 fois par jour après la lésion [au moins 2 semaines, (pilo-érection, déshydratation, apparence voûtée, yeux enfoncés, perte de poids, comportement d'isolement)]. Nous utilisons une évaluation par grille de score adaptée permettant après concertation de déterminer un seuil de souffrance nécessitant l’euthanasie de l’animal concerné.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux le plus utilisées dans le cadre de la recherche sur les LME, en particulier avec le développement de plusieurs modèles chirurgicaux différents (section, compression, contusion). Travailler avec cette espèce nous permet de comparer avec les résultats précédemment obtenus dans notre groupe et dans les autres équipes de recherche. Les souris expriment un marqueur fluorescent, ), spécifiquement dans les astrocytes et la microglie . Ceci permet le tri cellulaire et l’obtention de population pure de cellules ainsi que l’identification sans marquage des cellules gliales . Nous travaillons avec ces deux souches depuis de nombreuses années et avons donc de nombreuses données disponibles. Les animaux sont opérés à 3 mois et observés pendant 1, 2, 6 ou 12 semaines. Nous utilisons des animaux adultes car les souris plus jeunes présentent des phénomènes de récupération spontanée plus importants et surtout non homogènes. Ceci n’est ni compatible avec des analyses statistiques fiables ni avec notre optique de transposition à la clinique. Les animaux sont gardés 1, 2, 6 ou 12 semaines pour avoir un suivi des évènements moléculaires, cellulaires, tissulaires et phénotypiques en phase chronique. Ceci est primordial dans le cadre d’une transposition à la clinique pour des patients aigus et chroniques.