Recherche fondamentale

1 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent l'implantation d'électrodes dans le cerveau et des injections de virus, suivies d'enregistrements pendant l'éveil et le sommeil, avec douleur post-chirurgicale, risques anesthésiques et hébergement isolé. Le porteur mène une recherche fondamentale sur les récepteurs du glutamate et renvoie au long terme d'éventuelles stratégies contre les troubles anxieux. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe et que la modélisation informatique de ces réseaux reste hors de portée.

Objectifs

Le projet a pour but d’étudier des récepteurs activés par le glutamate et fortement présents dans le système nerveux central des vertébrés. Ces récepteurs jouent un rôle central dans la communication et le fonctionnement de nos neurones, ainsi que dans les mécanismes associés à l’apprentissage et la mémoire. Ces récepteurs étant également impliqués dans de nombreuses pathologies neurologiques et psychiatriques (épilepsie, neurodégénérescence, troubles cognitifs), ils constituent des cibles thérapeutiques à fort potentiel. L’objectif de ce projet est d’évaluer et comprendre le rôle et l’importance de la régulation d’un des récepteurs au glutamate dans le fonctionnement des circuits neuronaux, à la fois dans un cadre physiologique et pathologique. Nous voulons comprendre si et comment ces récepteurs participent à l’activation et au dialogue de différentes structures du cerveau durant la veille et le sommeil. Pour cela, nous réaliserons des enregistrements de l’activités des neurones chez des souris libres de leurs mouvements et endormies.

Bénéfices attendus

Les troubles anxieux sont des troubles psychiatriques très répandus et constituent une préoccupation croissante pour la santé publique mondiale. Ils sont aussi systématiquement associés à des troubles du sommeil, considérés soit comme une cause, soit comme une conséquence des symptômes. Ce projet de recherche fondamentale utilisera des modèles animaux pour développer nos connaissances sur les mécanismes neurophysiologiques précis potentiellement affectés chez les patients humains. A long terme, il permettra ainsi de développer et de mettre en œuvre des stratégies thérapeutiques précises de prévention et de guérison axées sur le sommeil dans les troubles anxieux.

Procédures

Selon la procédure considérée, les animaux seront soumis à un ou deux types de chirurgie au niveau du cerveau (implantation d’électrodes (2-6h) et/ou injection de virus (1h30)) avec ou sans enregistrement de l’activité des neurones pendant l’éveil et le sommeil sur animal vigile (2 à 8 h, 1x/jr). Ainsi, 3 options peuvent se présenter : 1) implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones ; 2) injection de virus ; 3) injection de virus + implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones. A la fin de chaque procédure, il sera réalisé sur chaque individu une euthanasie selon une méthode réglementaire qui permet les prélèvements et analyses ultérieurs (10min). L’ensemble des actes est réalisés sous anesthésie et analgésie.

Impact sur les animaux

Nous détaillons ci-dessous l’ensemble des dommages prévus dans ce projet. Nuisances induites par les actes effectués : Chirurgie du cerveau : implantation d’électrodes et injection de virus (légère perte de poids, problème de cicatrisation et douleur post-chirurgicale pendant 48h) ; risques anesthésiques (hypothermie, détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, etc) ; isolement (stress modéré).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques (prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem).

Remplacement

Un impératif concernant les études sur récepteurs natifs est de conserver l’intégrité d’un réseau neuronal afin de préserver les connections synaptiques. A ces fins, il n’existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l’utilisation de modèle rongeurs. Les techniques d'enregistrement chroniques sont invasives et ne peuvent être effectuées chez l'homme chez le sujet sain. Elles sont utilisées chez des patients épileptiques dont l'activité cérébrale est par conséquent anormale. Ceci ne permet pas d'effectuer des études systématiques car le placement des électrodes est dicté par l'impératif médical. D'autre part, l'état des connaissances actuelles et la puissance requise d'un point de vue technologique ne permettent pas de modéliser le fonctionnement de ces réseaux sur ordinateur.

Réduction

Les enregistrements électrophysiologiques de grande ampleur in vivo permettent d'enregistrer un grand nombre de neurones simultanément, ce qui augmente la puissance statistique des analyses et permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Pour les tests comportementaux, le nombre d'animaux proposé reste standard par rapport à la littérature existante. Le couplage entre électrophysiologie in vivo et comportement permet également de corréler les résultats comportementaux des individus avec leur activité neurale. Ceci permet de s'affranchir partiellement du problème de variabilité individuelle et de réduire le nombre d'animaux. Le calcul du nombre d’animaux a également été réalisé en fonction des travaux précédents. Au total, sur 5 ans, ce projet de recherche impliquera 1360 animaux.

Raffinement

Après leur réception, les animaux sont habitués à l’animalerie de l’Institut pendant une semaine avant de débuter toute procédure. Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les enregistrements en soi ne sont pas douloureux. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux sont stabulés dans les conditions d'hébergements standards (enrichissement de nidification) comme défini dans l'agrément de notre établissement. Les animaux implantés seront maintenus en isolation: la présence d'une autre souris pourrait ralentir la cicatrisation et endommager les électrodes implantées chroniquement (grattage, rognage) entraînant l’euthanasie de l’animal et ne permettant pas de récolter des données. Le maintien en isolation permet donc de maximiser la quantité de données récoltées sur chaque animal et ainsi de minimiser le nombre total d'animaux pour le projet. Les animaux non-implantés servent de groupe contrôle et doivent donc être logés dans les mêmes conditions que les animaux implantés. Cependant, pour diminuer le stress lié à l’isolement les animaux sont maintenus dans des cages contenant 2 compartiments séparés par une cloison transparente percée de trous permettant ainsi à l’animal d’avoir des interactions avec l’animal isolé dans le second compartiment (contiguïté visuelle, olfactive, auditive). Afin de garantir la taille minimale réglementaire au sein d'un compartiment une fois la cloison installée, les cages utilisées sont des cages prévues pour des rats. Pour éviter toutes blessures et d’endommager les électrodes, la nourriture sera directement dispersée dans la sciure. Cette démarche aura pour avantage d’enrichir l’environnement de l’animal puisqu’il sera obligé de fouiller la sciure pour trouver les croquettes et facilitera l’accès à la nourriture. Cet enrichissement sera également complété par le dépôt de morceaux de bois dans la cage de l’animal. Une construction de lego sera mise en-dessous du biberon d’eau pour réduire la hauteur et faciliter l’accès à l’eau. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur (utilisation de l’échelle de grimace), les animaux seront exclus du protocole.

Choix des espèces

Le choix de la souris est scientifique : il s’agit d’un mammifère de petite taille, au cycle de vie reproductif rapide et qui possède un système nerveux central ‘développé’. La souris est un modèle classique pour l'étude de la physiologie des réseaux neuronaux en lien avec le comportement. Seules des souris au stade adulte seront utilisées pour ce projet (à partir de 6 semaines), plus alertes et plus prompts à explorer leur environnement que les animaux âgés.

840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique du cerveau, des injections répétées et un régime alimentaire, parfois une restriction alimentaire qui les stresse, pour modéliser la boulimie et la frénésie alimentaire humaines et en disséquer les circuits neuronaux. Le porteur reconnaît des risques d'infection et de douleur post-opératoires, ainsi qu'un stress lié à l'isolement. Il affirme qu'aucun modèle non animal ne permet d'étudier de tels comportements et que les lignées transgéniques requises n'existent que chez la souris.

Objectifs

L'obésité augmente considérablement dans le monde. Malgré des recherches approfondies et des développements dans le domaine, le problème ne cesse de s'aggraver. Les comportements de dépendance alimentaire tels que la boulimie et la frénésie alimentaire sont considérés comme des traits caractéristiques des personnes obèses. Ces comportements pathologiques sont mal connus. Ce projet dissèque les circuits neuronaux des comportements de dépendance alimentaire en modélisant la boulimie et la frénésie alimentaire chez la souris. Dans ce projet, nous concevons un paradigme pour imiter les caractéristiques comportementales de boulimie et de frénésie alimentaire chez la souris. Les objectifs de ce projet consistent à identifier les circuits hypothalamiques sous-jacents au comportement alimentaire compulsif, puis à moduler ces circuits pour arrêter le comportement. L'activité des circuits cérébraux sera imagée lorsque les souris sont impliquées dans des comportements alimentaires compulsifs. Sur la base des résultats d'imagerie, nous ciblerons des populations neuronales spécifiques dans l'hypothalamus. Les objectifs de ce projet consisteront à étudier des circuits neuronaux hypothalamiques spécifiques et à tester si leur ciblage a un potentiel thérapeutique pour développer des stratégies de ciblage de médicaments.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet seront de déterminer des nouvelles cibles thérapeutique pour les troubles alimentaires.

Procédures

Procédure 1 : Dans chaque groupe, les souris seront soumises à un régime alimentaire pendant 16 séances. Les souris recevront 2 injections intrapéritonéales sur animal vigile au cours de cette procédure (30 sec par injections). Procédure 2 : Dans chaque groupe, les souris seront soumises à 1 chirurgie stéréotaxique intracérébrale, 2 injections sous-cutanées et 1 injection intrapéritonéale sur animal vigile. Procédure 3 : Dans chaque groupe, les souris seront soumises à 1 chirurgie stéréotaxique intracérébrale, 2 sous-cutanées, 1 régime alimentaire et 5 injections intrapéritonéales sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Chirurgie stéréotaxique : Après la chirurgie, Il existe aussi un risque d’inflammation de la plaie, d’infection et de douleur post-opératoire. Prise alimentaire : la restriction alimentaire pourra entrainer un stress de l’animal. Cette restriction ne sera utilisée uniquement si nécessaire, lorsque les animaux n’apprendront pas à manger dans les chambres opérantes. En temps normal les souris auront libre accès à leur alimentation normale pendant toute la procédure d'expérimentation. De plus, l'isolement et la présence d'un régime riche en graisses et en sucre peuvent entraîner une augmentation du poids corporel (qui sera enregistrée lors des paradigmes comportementaux et de la procédure). Ces expériences choisies ne posent aucun risque corporel pour l’animal. Les tests de prises alimentaire sont potentiellement stressant pour l’animal car les souris seront soumises à un isolement. Les souris seront injectées en intrapéritonéale ,il y a donc la possibilité d’irritation du site d’injection.

Devenir

mise à mort pour prélèvement

Remplacement

Remplacement : Les conduites addictives alimentaires ne peuvent pas être récapitulées dans d'autres modèles cellulaires. Il est impossible d'étudier la complexité de tels comportements dans des modèles non animaux. Afin d'étudier les circuits impliqués dans le cerveau, l'utilisation d'animaux vivants est nécessaire car il n'existe actuellement aucun autre modèle où une telle expérimentation peut être effectuée. Plus précisément, dans ce projet, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées pour imager ou cibler un circuit spécifique dans le cerveau de souris comportementales. À l'heure actuelle, nous n'avons pas de stratégies ou de modèles alternatifs pour étudier le cerveau et le comportement sans utiliser d'organismes vivants.

Réduction

Réduction : Afin de réduire le nombre d'animaux dans l'étude, des souris seront consanguines et plusieurs paramètres seront testés de manière longitudinale. Nous optimiserons les conceptions comportementales et les chirurgies pour obtenir une conclusion statistiquement pertinente avec un nombre minimum de souris. Les nombres seront optimisés selon les données de la littérature, compte tenu de la variabilité interindividuelle, des groupes expérimentaux requis et des complexités procédurales.

Raffinement

Raffinement : Les souris seront maintenues dans des conditions d'hébergement optimisées dans des cages ventilées individuellement (IVC) où les souris seront logées en groupe. Chaque cage a un environnement contrôlé, enrichi d'une barre à ronger, de serviettes en papier et d'un nid. Pour réduire la douleur et l'inconfort de toutes les souris d'expérience non invasives, elles seront habituées pendant quelques jours à l'environnement et à l'expérimentateur. Pour effectuer des procédures invasives, les souris seront sous anesthésie et recevront des analgésiques. Pendant toutes les procédures invasives, la température corporelle à l'aide de tapis thermostatiques jusqu'à ce que les souris soient complètement éveillées. Les souris seront étroitement surveillées après les procédures pour la douleur et l'inconfort. Nous évaluerons le corps et le poids, la consommation de nourriture et d'eau des souris pendant les 3 à 4 prochains jours afin de déterminer si les souris se sont bien rétablies ou non de la procédure invasive. Nous utiliserons une grille d'évaluation pour déterminer la santé des souris et dans des circonstances où la santé se détériore, les souris seront euthanasiées.

Choix des espèces

Le projet étudie les circuits neuronaux sous-jacents au comportement alimentaire compulsif in vivo, et aucune alternative in vitro n'est disponible pour les expériences que nous réalisons. Les lignées transgéniques nécessaires à ce projet ne sont disponibles que chez les souris, ainsi des souris adultes sont choisies car ces comportements addictifs ont été observés chez chez l'homme adulte selon la littérature.Les caractéristiques uniques de l'approche adoptée dans mon laboratoire incluent la combinaison d'études comportementales avec des études anatomiques et biochimiques sur les mêmes animaux. Les phénomènes que nous souhaitons étudier ne se produisent pas en culture cellulaire.

332 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections en contention vigile et un prélèvement sanguin sous anesthésie, pour étudier le rôle d'une hormone du fer dans la réponse à l'inflammation, puis sont mises à mort pour prélever leurs organes. Le porteur reconnaît des nuisances possibles, une détresse, du stress et des douleurs physiques, sans détailler davantage les actes infligés. Il affirme recourir aux souris quand les questions ne peuvent être résolues in vitro, tout en indiquant avoir déjà obtenu la production de l'hormone sur des lignées cellulaires.

Objectifs

L’inflammation est une pathologie où le fer joue un rôle primordial car il est à la fois pro-inflammatoire et un facteur de prolifération des bactéries. L’anémie est une complication systémique fréquente au cours des maladies inflammatoires. L’anémie de l’inflammation est caractérisée par une carence en fer. L’hormone du fer, l'hepcidine, est produite majoritairement par le foie et est le stabilisateur du taux de fer dans l’organisme. En plus de réguler le fer circulant, elle possède des propriétés antimicrobiennes. Une production de cette hormone a été décrite également au niveau intestinal. L’intestin permet d’absorber le fer mais est aussi une barrière qui protège l’organisme des bactéries. L’objectif de ce projet est de déterminer le double rôle de l’hormone du fer (absoprtion du fer et peptide antimicrobien), au niveau intestinal, en réponse à une inflammation.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est la découverte de l’expression d'une hormone dans la lumière intestinale sous deux formes avec leurs fonctions propres dans la réponse inflammatoire systémique.

Procédures

Sur animaux vigiles : deux contention de 15 secondes pour l'injection de produits. Sur animaux anesthésiés : Prélèvement sanguin (30 secondes par souris)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues durant et consécutivement aux différents actes menés sur l’animal sont une possible détresse, du stress et voir des douleurs physiques.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes pour des analyses.

Remplacement

Les modèles animaux sont développés ici dans le but d'obtenir des modèles pathologiques de d’inflammation. Les processus inflammatoires sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux organes qui communiquent entre eux. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Ils permettent d'obtenir une représentation simplifiée de systèmes biologiques impossibles à étudier directement chez l'Homme. Cependant, nous avons utilisé le lipopolysaccharide sur des lignées de cellules intestinales qui induit une production de l’hormone d’intérêt par ces dernières.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la robustesse de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. De plus des expérimentations in vitro ont été effectuées auparavant pour démontrer la production de l'hepcidine par les cellules intestinales en réponse à l'inflammation. De plus, pour étudier la production "in vivo" de l'hepcidine, nous allons faire des expérimentations "ex vivo" par technique de boudins inversés. Cette technique permet qu'avec une seule souris nous puissons étudier en même temps 3 parties de l'intestin (duodénum, iléon et colon) ce qui réduit considérablement le nombre de souris et nécessite aucun traitement chez la souris.

Raffinement

La durée et dose des traitements seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés par les manipulateurs. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum et de petites maisons. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. De plus, l’application des points limites établis pour chaque procédure de ce projet sera effectuée.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études de processus inflammatoires. Les souris utilisées seront âgées de 6-8 semaines. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal mature et suffisamment gros pour la chirurgie.

860 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer une fibrose du foie, parfois des tumeurs hépatiques que le porteur décrit comme asymptomatiques, elles subissent une chirurgie terminale unique sous anesthésie sans réveil, pour prélever le foie et en isoler des cellules fibrogéniques. Le porteur affirme qu'un "organisme entier" est nécessaire pour reproduire ces interactions et qu'une comparaison rigoureuse du modèle est "indispensable". Il écarte les lignées cellulaires existantes, jugées non représentatives des sous-populations visées.

Objectifs

La fibrose hépatique constitue un enjeu majeur de santé publique. Elle se caractérise par un dépôt excessif de matrice extracellulaire, synthétisée par une population de cellules hétérogènes : les myofibroblastes. Une population de myofibroblastes ayant des caractéristiques particulières a été récemment identifié. Notre postulat est que ces myofibroblastes spécifiques induisent la progression de la fibrose et qu'il serait avantageux de les détruire chez les sujets ayant une fibrose à un stade avancé, plutôt que d'autres types de myofibroblastes qui interviennent dans la réparation tissulaire. Pour produire les outils permettant le ciblage spécifique de cette population ou de tous les myofibroblastes du foie, nous devons au préalable isoler ces cellules à partir du foie sain et fibreux et identifier des marqueurs spécifiques de ces cellules par des études moléculaires. Différents vecteurs viraux dont la finalité est l’expression de gènes suicides spécifiquement dans la population de myofibroblaste cible ou dans tous les myofibroblastes hépatiques, seront générés à partir de ces données et testés sur les différents types cellulaires hépatiques.

Bénéfices attendus

Dans son ensemble, ce projet pourrait permettre de développer des outils thérapeutiques anti-fibrotiques. Les bénéfices attendus du projet sont : - Une meilleure caractérisation des cellules fibrogéniques du foie et de leurs précurseurs en vue de leur ablation ciblée à l’avenir par thérapie génique. Une meilleure caractérisation d'un des modèles de souris transgéniques les plus utilisés pour mimer les maladies biliaires et plus généralement de fibrose hépatique. Les travaux utilisant ce modèle ont porté sur des souris sur différents fonds génétiques. Cependant, une comparaison rigoureuse est indispensable pour une connaissance approfondie et une utilisation optimale du modèle.

Procédures

Les souris transgéniques utilisés dans ce projet développent des lésions du foie qui habituellement n’entrainent aucun symptôme jusqu’à l’âge de 12 mois, qui correspond à l’âge maximal inclus dans cette étude. Tous les animaux subiront une intervention chirurgicale unique et terminale sous anesthésie générale et analgésie d’une durée maximale de 15-20 minutes.

Impact sur les animaux

Le modèle de souris utilisé développe une fibrose hépatique qui reste asymptomatique jusqu’à l’âge de 12 mois chez les souris sur fonds FVB/n (d’après notre expérience) ou C57BL/6J (d’après la littérature). Des tumeurs hépatiques de type carcinome hépatocellulaire, peuvent apparaître à partir de l’âge de 9 mois mais restent asymptomatiques et n’entraînent aucune surmortalité par rapport à des souris sauvages au moins jusqu’à l’âge de 17 mois. Une injection sous-cutanée préalable à l’anesthésie afin d’administrer un anti-douleur pourrait causer une gène et un stress transitoire liés à la contention et l’introduction de l’aiguille. Par la suite, les seuls actes réalisés sur les animaux seront effectués sous anesthésie et les nuisances sont donc celles associés à l’anesthésie : hypothermie, risque d’arrêt cardio-respiratoire, etc. Les animaux ne se réveilleront pas à l’issue de l’anesthésie car l’euthanasie interviendra durant celle-ci.

Devenir

Le prélèvement du foie entier ou pour isolement cellulaire ne permet pas la survie des animaux. Les animaux seront donc tous euthanasiés à la fin des procédures pour perfusion ou explantation du foie qui est requis pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Remplacement

Un système vivant est nécessaire 1) pour reproduire les interactions inter-cellulaires et inter-organes aboutissant dans l’organisme entier à une maladie biliaire et à la fibrose hépatique et 2) pour définir le transcriptome des cellules fibrogéniques du foie ayant été activées in vivo, dans l’organe entier. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec ses interactions inter-cellulaires et inter-organes. Par ailleurs, il existe des lignées de cellules fibrogéniques, mais celles-ci ne sont pas représentatives des sous-populations auxquelles nous faisons référence dans ce projet, et qui ne peuvent être étudiées qu'en culture primaire, qui ne peuvent être obtenues qu’à partir d’un nombre important de souris.

Réduction

Le projet impliquera un total de 860 animaux. Nous avons calculé le nombre minimal d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités entre animaux et entre procédures d’isolement cellulaire, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Les tests des vecteurs viraux seront réalisés sur des cellules primaires qui sont amplifiées en culture après isolement, mais qui ne peuvent être maintenues à long terme. Autant que faire se peut, nous nous efforcerons d’isoler plusieurs types cellulaires à partir des mêmes animaux. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyses à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, toutes les procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.).

Choix des espèces

Justification de l’espèce : L'existence d'un modèle de souris transgénique mimant la cholangite sclérosante primitive chez l'homme justifie le choix de l'espèce. Un tel modèle n'existe pas chez les autres espèces. Justification des stades de développement : Le modèle de souris transgénique utilisé développe une fibrose biliaire qui évolue avec le temps. Nous utiliserons des animaux jeunes adultes dans lesquels les lésions sont déjà présentes mais à un stade débutant (4 semaines), jusqu'à un âge plus avancé pour suivre l'évolution des lésions (12 mois). Le but étant d'avoir des échantillons représentant les différents stades de la maladie. Justification du sexe : Chez la souris, comme chez l’Homme, la gravité des lésions hépatiques est variable en fonction du sexe. C’est pourquoi, il est nécessaire d’inclure dans ce projet environ 50% de souris mâles et 50% de souris femelles.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Vieillies puis soumises trois mois à un régime gras déséquilibré, elles subissent un test de tolérance au glucose puis une chirurgie d'accident vasculaire cérébral de dix à quarante minutes, qui provoque une douleur peropératoire, des pertes sensorimotrices et une perte de poids. Le porteur indique qu'une première étape sert surtout à choisir le meilleur modèle et à faire acquérir le geste chirurgical par deux personnes du laboratoire. Il écarte le remplacement en affirmant que l'étude ne peut s'envisager que dans un "organisme entier", et justifie la mise à mort par le prélèvement des tissus.

Objectifs

Les maladies cardiaques sont l'une des principales causes de problèmes de santé et de décès chez les personnes âgées, en raison des problèmes de santé associés (vieillissement de leurs artères et troubles métaboliques). Ce projet de recherche se concentre sur l'accident vasculaire cérébral, maladie de plus en plus fréquente chez les personnes de plus de 60 ans. Aujourd’hui aucune thérapie ne permet une bonne prise en charge de la maladie. Chez ces patients, les comorbidités, telles que l’hyperglycémie et l’hyperlipidémie sont des facteurs de risque bien identifiés, aggravant les conséquences de la maladie. L’objectif de ce projet est dans un premier temps de déterminer le meilleur modèle d’étude de la maladie chez le sujet âgé. Dans un premier temps nous comparerons deux modèles classiquement utilisés et qui sont les plus proches de l’accident vasculaire cérébral chez l’homme. Dans un second temps, le modèle choisi fera l’objet d’une acquisition du geste chirurgical par deux personnes pour permettre la continuité de la compétence acquise au sein du laboratoire. Enfin, le modèle sélectionné et acquis par le personnel compétent sera appliqué dans le cadre d’une première étude dont le but est de prendre en compte le rôle de l’âge et des comorbidités associées dans l’accident vasculaire cérébral. En effet, la prise en compte des problèmes de santé associés à l'âge est nécessaire pour déterminer l’impact de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cette étude permettra de choisir un modèle d'étude fiable et reproductible pour mieux comprendre les caractéristiques de l'accident vasculaire cérébral dans le contexte de vieillissement et ses problèmes de santé associés.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en place un modèle adapté et robuste pour comprendre le rôle des comorbidités dans les conséquences de l'accident vasculaire cérébral. Les bénéfices attendus concernent la progression des connaissances scientifiques, connaissances qui pourront être appliquées à l'Homme et ce grâce à la prise en compte de la réalité de la clinique (âge et comorbidités).

Procédures

Tout d’abord, nous testerons 2 différents modèles d’accident vasculaire cérébral ischémique chez des animaux de plus de 9+/- 2 mois. La chirurgie est de 40min pour le modèle semi permanent (procédure 1) et de 10 min pour le modèle permanent (procédure 2). Après 3 mois d’administration d’un régime riche en protéines et en lipides et pauvre en glucides, les souris suivent un test d’intolérance au glucose (une injection de glucose intrapéritonéale et mesure de la glycémie). Puis, nous mimerons l’accident vasculaire cérébral ischémique en utilisant un modèle in vivo, préalablement retenu, d'ischémie cérébrale (chirurgie de 10 ou 40 min). Les effets du régime sur la réponse à l’ischémie seront analysés à 72h après la mise en place du modèle d’accident vasculaire cérébral à l’aide de tests de comportement et de l’imagerie post mortem.

Impact sur les animaux

L’âge (animaux âgés de plus de 6 mois) et le changement de l’alimentation induit une prise de poids qui est conséquente (animaux de 35 – 60g). Le test d'intolérance au glucose pourra induire une légère douleur de courte durée (1 injection intrapéritonéale de glucose et prélèvement de 5 gouttes de sang pour mesure de la glycémie). Le modèle d’accident vasculaire cérébral induit une douleur peropératoire et perte sensorimotrice. Une perte de poids et déshydratation peuvent également être attendues.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour récupérer les tissus et faire de l’imagerie

Remplacement

Le projet a pour but d’étudier l’ischémie cérébrale dans un contexte de vieillissement vasculaire et comorbidités liées à l’âge, qui met jeu en des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants puisque l'étude des conséquences métaboliques du vieillissement et son retentissement sur le vaisseau et sa fonctionnalité, avec ou sans traitement, ne peut s'envisager que dans un organisme entier.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu de vieillissement vasculaire et un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’accident vasculaire cérébral. De plus, le plus grand nombre de tissus et organes d’un animal mis à mort sera systématiquement prélevé et stocké pour l’utilisation de projets futurs sur les rôles de ces perturbations métaboliques.

Raffinement

Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement antalgique en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 72h. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse). En post-chirurgie une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et/ou mis à mort selon le score.

Choix des espèces

Des études précédentes ont montré la pertinence du modèle souris pour étudier les maladies cardiovasculaires liées à l’âge et ses comorbidités. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’accident vasculaire cérébral et pour lequel les outils sont nombreux pour le suivi de cette étude et ultérieurement pour le suivi de cette pathologie (anticorps, imagerie, modèles génétiquement modifiés). L’ischémie cérébrale étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte. Le choix du modèle sera réalisé en utilisant des animaux âgés d’au moins 6 mois, âge permettant de mimer la physiologie du vaisseau à l’âge adulte. Pour prendre en compte les comorbidités liées au vieillissement, les animaux seront préparés par la mise en place d’un régime conduisant à des comorbidités en accord avec les recommandations données par le groupe de réflexion sur les modèles précliniques d’accident vasculaire cérébral. Les souris utilisées pour cette étude seront âgées de 24 semaines (6 mois) avant les 3 mois de régime.

1 722 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un agent inflammatoire est appliqué sur l'oreille sous forme de goutte, de piqûres superficielles ou d'injection, suivi de sessions d'imagerie sous anesthésie pouvant durer jusqu'à deux heures et répétées jusqu'à sept fois, pour étudier la migration des cellules immunitaires dans la peau enflammée. Le porteur compare la gêne à celle ressentie après un vaccin et l'affirme "limitée en temps et intensité". Il reconnaît l'existence de modèles in vitro mais affirme que la souris reste "indispensable" pour disposer d'un tissu et d'un système immunitaire complets.

Objectifs

La peau est le plus grand organe du corps humain, indispensable à notre survie. Elle agit comme une barrière protectrice, maintient la température corporelle stable et joue un rôle crucial dans notre système immunitaire. La peau est composée de trois couches : l’épiderme, le derme et l’hypoderme. L’épiderme, la couche externe, est principalement constitué de kératinocytes qui synthétisent la kératine, une protéine qui protège la peau contre les dommages et la déshydratation. Le derme, la couche intermédiaire, contient des fibres de collagène et d’élastine qui lui donnent élasticité et fermeté. Il abrite également des vaisseaux sanguins, des nerfs, ainsi que des follicules pileux. Enfin, l’hypoderme est la couche la plus profonde de la peau et est essentiellement composée de tissus adipeux et conjonctif. Elle fournit une isolation thermique et agit comme un coussin pour les organes internes. Dans le derme et l’épiderme des tissus, les cellules immunitaires patrouillent à la recherche de pathogènes ou de signaux de danger pour la mise en place d’une réponse immunitaire efficace, qu’elle soit spontanée suite à une infection ou à l’apparition d’une tumeur, ou induite par un vaccin par exemple. Ce processus est aussi essentiel pour le maintien de la tolérance immunitaire, et ainsi éviter les maladies auto-immunes. Dans les tissus, la migration des cellules immunitaires est guidée par des signaux chimiques et physiques, qui sont profondément modifiés en cas d’inflammation ou d’infection par exemple. Notre projet vise à comprendre comment les propriétés de la peau sont modifiées par différents signaux inflammatoires, et comment cela affecte la migration et l’efficacité des cellules immunitaires dans ce tissu.

Bénéfices attendus

Comprendre comment l’inflammation modifie les tissus et la migration des cellules immunitaires permettra à la fois d’obtenir des connaissances fondamentales sur la migration des cellules dans les tissus, mais également de déchiffrer certains des mécanismes déterminants dans les stratégies de vaccination, où une inflammation est générée artificiellement afin de stimuler la réponse immunitaire mémoire. Nos résultats pourraient par exemple aider aux choix des composés d’un vaccin, en particulier de l’adjuvant utilisé, ou de la voie d’administration. Ces résultats permettront aussi de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans les maladies inflammatoires chroniques comme le psoriasis.

Procédures

La première procédure vise à évaluer l’effet d’une inflammation locale aigue de la peau sur la structure du tissu et l’infiltration du tissu par les cellules immunitaires. Les souris sont anesthésiées. Un agent inflammatoire est appliqué sur une des 2 oreilles (goutte de liquide, goutte de liquide + piqures superficielles, ou injection sous cutanée), 1 seule fois par expérience. Les souris sont ensuite remises dans leurs cages pour le réveil. L’anesthésie de chaque animal dure au maximum 10 minutes. La seconde procédure vise à déterminer comment la modification de la structure du tissu par l’inflammation aigue impacte la migration des cellules immunitaires dans le tissu (derme et épiderme) au pic de l’inflammation. L’inflammation est réalisée comme dans la première procédure. 5 minutes avant la mise à mort, les souris sont anesthésiées et un marqueur des vaisseaux est injecté en intraveineuse, 1 seule fois par expérience (durée du geste inférieur à 30 secondes). La troisième procédure vise à évaluer les effets de l’inflammation aigue sur la migration des cellules immunitaires depuis l’application de l’agent jusqu’à la résolution totale de l’inflammation et le retour à l’état normal du tissu. L’inflammation est réalisée comme dans la première procédure. Pour l’imagerie, les souris sont anesthésiées, un marqueur des vaisseaux est injecté en intraveineuse, puis les souris sont placées sur le flanc dans une enceinte chauffée et l’oreille est immobilisée sous le microscope. Chaque session d’imagerie dure maximum 1h30. L’anesthésie dure maximum 2h. Chaque souris est imagée au maximum 1 jour sur 2, au plus 7 fois. Les mêmes procédures sont réalisées sur un autre groupe d’animaux, mais pour induire une inflammation chronique, l’agent inflammatoire est appliqué sous forme de crème, tous les jours pendant 5 jours (durée du geste inférieur à 30 secondes).

Impact sur les animaux

Pour cette étude, une inflammation sera induite par application d’un agent inflammatoire : - Par dose unique avec différentes posologies : goutte de liquide, goutte de liquide + piqûres superficielles ou injection sous cutanée. - Par plusieurs doses appliquées sous forme de crème. L’inflammation se caractérise par la douleur, le gonflement, la rougeur et la chaleur. Induire une inflammation artificiellement engendre ces 4 caractéristiques, qui peuvent entraîner une gêne chez l’animal. Néanmoins, il s’agit ici d’une inflammation locale et de faible intensité, comparable à ce qui peut être ressenti après un vaccin, et donc la gêne sera présente mais limitée en temps et intensité. Les animaux seront suivis pendant 4 semaines afin d’étudier également la résolution de l’inflammation, mais nous ne nous attendons pas à des effets forts pendant plus de 5 jours. Dans certaines procédures, les animaux subiront une injection intraveineuse, sous anesthésie gazeuse, dont les effets indésirables sont limités à l’intensité et la durée d’une piqure.

Devenir

Les animaux sont mis à morts pour des analyses post-mortem

Remplacement

De nombreuses études in vitro ont pu montrer l’influence du microenvironnement sur la migration des cellules immunitaires. L’ajout de composant bactérien sur certaines cellules immunitaires par exemple les fait migrer plus vite in vitro. Néanmoins, il s’agit d’un effet direct d’un agent inflammatoire sur les cellules, qui ne prend pas en compte le contexte complexe et la réponse du tissu. Il est donc difficile d’extrapoler ces données sans avoir une description précise et quantitative des propriétés du microenvironnement in vivo. L’objectif de ce projet est de fournir cette description, afin ensuite de pouvoir établir des modèles in vitro conformes aux propriétés des tissus observées in vivo. Cela permet d’autre part d’isoler les propriétés du tissu une par une et de tester leur effet individuel sur les cellules immunitaires, afin d’identifier les paramètres les plus importants. Cela permettra aussi de déchiffrer le dialogue entre différentes cellules immunitaires dans un organisme vivant intégré dont le système immunitaire est proche de celui de l’homme, comme la souris. L’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet, afin d’avoir un tissu et un système immunitaire complets et fonctionnels.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les expériences de mise au point seront réalisées sur des échantillons prélevés sur des animaux utilisés pour d’autres expériences (mise à mort pour prélèvement d’autres organes que l’oreille). Une procédure pilote sera réalisée afin de déterminer le meilleur temps expérimental et la dose minimale à utiliser pour observer un remodelage du tissu. Cela permettra de concentrer ensuite la caractérisation sur ces conditions expérimentales et donc de limiter le nombre total d’animaux utilisés. Pour chaque expérience, les ganglions lymphatiques, qui ne sont pas utilisés pour le présent projet, seront prélevés et cryopréservés afin de pouvoir être utilisés dans un potentiel second projet permettant de voir l’effet d’une inflammation locale sur le ganglion drainant. Les échantillons « oreilles inflammées » seront toujours comparés à l’autre oreille n’ayant pas subi de traitement inflammatoire local. Ceci permettra de réaliser des tests statistiques plus puissants et donc permettant de limiter le nombre de souris nécessaires.

Raffinement

En accord avec les recommandations internationales, les animaux sont suivis attentivement afin d’assurer leur bien-être, et les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d'atteinte d'un point limite, les animaux seront mis à mort. Pour la procédure pilote visant à déterminer les meilleurs temps expérimentaux et la meilleure dose d’agent inflammatoire à utiliser, les animaux seront suivis quotidiennement pendant 5 jours après stimulation, puis tous les 2-3 jours jusqu’à résolution complète de l’inflammation (ou à la mise à mort de l’animal). Le suivi des animaux pour les procédures suivantes sera adapté en fonction de ce qui a été observé dans la procédure pilote. Les souris sont identifiées individuellement par tatouage sur les coussinets et toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en immunologie. La forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins en font un modèle idéal. Par ailleurs, nous utilisons des modèles murins génétiquement modifiés déjà développés et bien caractérisés qui sont les plus adaptés à ce projet. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, afin d’avoir un système immunitaire adulte.