Recherche fondamentale

150 chevreuils sauvages vont être utilisés, puis relâchés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Capturés au filet et anesthésiés, les brocards subissent une collecte de sperme par électro-stimulation, un prélèvement de sang à la jugulaire et des prélèvements de fèces et de poils, une fois par an. Le porteur reconnaît des risques de blessures, de stress de capture et de myopathie de capture pouvant être mortelle. Il justifie l'étude de la sénescence de reproduction par la nécessité d'une population sauvage suivie de longue date, qu'aucune population captive ne pourrait remplacer.

Objectifs

La sénescence de reproduction - le déclin des performances de reproduction avec l'âge - est un processus biologique très répandu dans le vivant, associé à de profondes implications biologiques, démographiques et sociétales. Pourtant, très peu d’études se sont intéressées à la sénescence de reproduction des mâles en milieu naturel. L’objectif de notre projet est donc d’identifier les facteurs biologiques (ex : effort de reproduction en début de vie, santé des individus) et écologiques (ex : qualité des ressources, exposition à des polluants) qui modulent les performances de reproduction au cours de la vie des mâles, en milieu naturel. Pour mener à bien ce projet, il est par essence indispensable de travailler sur une population animale sauvage pour laquelle les individus sont suivis de la naissance à la mort. En outre, il est nécessaire que les trajectoires individuelles des mâles qui seront échantillonnés soient déjà disponibles (données sur la croissance ou la santé des individus). Nous analyserons les causes évolutives de la sénescence de reproduction des chevreuils mâles (brocards) dans une population française de chevreuil. Nous organiserons des captures estivales afin de collecter de nouvelles données sur les traits pré-copulatoires (ex : morphologie des bois) et post-copulatoires (ex : qualité des spermatozoïdes) pendant la période du rut. Nous testerons ensuite des prédictions issues des théories évolutives du vieillissement, en examinant si une forte allocation à la croissance et à la reproduction en début de vie est associée à une sénescence de reproduction plus précoce ou plus marquée. De plus, nous explorerons si ces associations sont modulées par les conditions environnementales et par une dégradation de santé des individus (évaluée par divers marqueurs de la sénescence, tel que l'âge épigénétique). Basé sur une combinaison unique de données comportementales, physiologiques, génétiques et de traits d’histoire de vie, ce projet permettra d’obtenir une compréhension fine des causes et conséquences évolutives de la senescence de reproduction. Ces travaux menés chez un mammifère longévif en milieu naturel ouvriront de nouvelles perspectives de recherche aussi bien pour la biologie évolutive que pour la biogérontologie. Les individus qui composent la population d'étude sont suivis individuellement depuis plus de 40 ans.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’identifier des marqueurs phénotypiques (ex : taille des caractères sexuels secondaires) et moléculaires (ex : âge épigénétique) de la sénescence de reproduction des mammifères mâles. A terme, ce projet permettra d’identifier les mâles souffrant d’une fertilité réduite par des mesures bien moins invasives que l’électro-stimulation (ex : par simple mesure phénotypique ou dosage sanguin). Ainsi, l’identification plus aisée des mâles les plus fertiles permettra d’affiner les protocoles de gestion des populations. La majeure partie de nos connaissances actuelles sur le vieillissement est basée sur des expériences menées sur des modèles animaux à courte durée de vie dans des environnements contrôlés (par exemple des rongeurs de laboratoire), ce qui rend difficile l'extrapolation des résultats à des espèces à longue durée de vie comme l'humain. Dans ce contexte, notre projet est porteur pour la recherche biomédicale car le chevreuil présente un cycle de vie lent (c'est-à-dire une faible fécondité annuelle et un taux de survie élevé à l'âge adulte) plus proche de celui de l'homme que de nombreux organismes de laboratoire. En outre, il se concentre une population naturelle, et pour laquelle les individus sont suivis de la naissance à la mort et les échantillons biologiques couvrant toute la vie des individus déjà disponibles. De plus, il fournira des informations essentielles sur le rôle joué par les conditions environnementales sur le déclin des capacités reproductrices masculines. En effet, les perturbations écologiques actuelles sont susceptibles d'avoir des conséquences néfastes sur la fertilité des mâles, et pourraient être déjà impliquées dans la détérioration inquiétante de la santé reproductive des hommes comme actuellement documentée dans la plupart des populations humaines du monde entier. À plus long terme, ce projet pourra également fournir des connaissances fondamentales sur l'étiologie des maladies reproductives masculines. Jusqu'à présent, les études sur le vieillissement reproductif masculin dans les sciences vétérinaires et biomédicales n'ont pas intégré de considérations éco-évolutives. Pourtant des approches similaires, réalisées dans des populations sauvages de mammifères longévifs ont déjà conduit à des percées dans notre compréhension de la santé reproductive des femmes.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : pose de boucles auriculaires à la première capture (si non marqué - durée 1 min), pose d'une puce d’identification injectable à la première capture (si non marqué - durée 1 min), une anesthésie, une collecte de sperme par an (durée 20 min maximum), 1 prélèvement de sang dans la jugulaire (14 ml mL maximum) (durée 1 min), un prélèvement de fèces au niveau rectal (durée 2 min), 1 prélèvement de ~100mg de poils au niveau du miroir (durée 1 min), 1 prélèvement de touffes de poils au niveau des glandes interdigitales et métatarsales (durée 2 min).

Impact sur les animaux

Les deux effets indésirables principaux sont i) les risques de blessures superficielles et de traumatologie (fractures extrêmement rares mais possibles lorsque l’animal se prend dans le filet) et ii) le stress causé par la capture (phase de course qui précède la capture au filet puis démaillage et mise en sabot). Contrairement aux captures hivernales, le stress lié à la contention sera atténué puisque les animaux seront anesthésiés. La conséquence la plus fréquemment observée de ce stress de capture est une réduction de l’activité locomotrice journalière dans les jours suivant la capture, dont la durée a été évaluée à 14 jours chez le cerf de Virginie. Plus rarement peut survenir une hyperthermie liée au stress et à la contention, ou une myopathie de capture, s’exprimant essentiellement soit sous la forme d’un choc post-capture (dans les 6 heures suivant la capture, avec risque mortel) soit sous la forme d’un syndrome d’ataxie-myoglobinurie (dans les heures ou jours suivant la capture). Les prélèvements d’échantillons seront réalisés sur des animaux anesthésiés et analgésiés. Ainsi, le stress associé aux protocoles d’échantillonnage sera limité (collecte de fèces, prise de sang, pose de boucles auriculaires et d'une puce d'identification injectable, éléctro-stimulation), et l’inconfort et les douleurs associées (potentiellement détectées par des vocalisations) au protocole seront modérées, de courte durée et ne persisteront pas au-delà de la manipulation. L’inconfort qui pourrait émaner de ces protocoles sera réduit au minimum par l’administration d’un analgésique à action centrale. Aucun des prélèvements n’est à même de provoquer une douleur qui persisterait une fois l’animal réveillé et relâché.

Devenir

Les animaux seront remis en liberté.

Remplacement

Ce projet de recherche sur le chevreuil repose sur le suivi individuel de brocards. Il vise en particulier à explorer les trajectoires d’allocation dans la reproduction des brocards au cours de la vie et de comprendre comment celles-ci sont modulées par les conditions environnementales (ex : niveau de pollution, conditions climatiques) à la naissance ou au cours de la vie adulte et influent la survie des individus à long termes. Ce projet est dans la lignée des suivis à long-termes en écologie basés sur le suivi le plus long et le plus complet possible des individus au cours de leur vie en milieu naturel. Il n’existe donc, par essence, aucune méthode substitutive à notre protocole de recherche. Les approches in vitro ou in silico, ne permettent pas d’étudier simultanément les réponses des individus aux variations de conditions environnementales de manière intégrée (prises en comptes du spectre complet de traits reproducteurs, morphologie des bois, sécrétions odorantes, quantités et qualité des spermatozoïdes) au niveau individuel ainsi que les conséquences à long terme sur la valeur sélective des individus. En outre, une compréhension fine du rôle de l’environnement sur la sénescence nécessite, par essence, de se focaliser sur des populations sauvages. Nous avons en effet démontré que les conditions de captivités modifient les patrons de sénescence. Les populations de mammifères captives ou de laboratoire ne constituent donc pas une alternative pertinente à l’utilisation de populations sauvages lorsqu’il s’agit d’étudier le rôle de l’environnement sur le processus de sénescence. Notre protocole est calibré pour que toutes les quantités de tissus prélevées soient en adéquation avec des objectifs prédéfinis précis. Toutefois, si certains échantillons s’avéraient non utilisés (en particulier les échantillons de sperme pour lesquels nous ne pouvons pas contrôler de manière précise la quantité que nous allons collecter) ou si une amélioration des protocoles de biologie moléculaire permettait de réduire la quantité de tissus à utiliser pour la quantification d’un paramètre donné, les échantillons supplémentaires et restants seraient mis à disposition de notre réseau de collaboration (et participerait ainsi à du remplacement pour des projets futurs).

Réduction

Notre objectif est de réaliser le protocole sur un total de 30 brocards (d’âges connus ou non), lesquels seront recapturés annuellement le temps de la durée du projet. Ce nombre de 30 individus est le nombre minimal pour pouvoir utiliser les outils statistiques appropriés à l’étude de la sénescence en milieu naturel (ex : modèle linéaire mixte généralisé avec un effet aléatoire de l’individu sur l’intercept du modèle. Dans cette étude nous ciblerons, lors des mini-traques, des mâles déjà marqués lors de captures hivernales précédentes (pour lesquelles le comité d’éthique a déjà rendu un avis favorable) et pour lesquels une partie des trajectoires individuelles est déjà connue. Ce ciblage permet de limiter la capture de nouveaux individus tout en se concentrant sur ceux ayant le plus de valeurs scientifiques. Si un animal venait à être capturé une seconde fois au cours du même été, aucun prélèvement ne serait pris et l’animal serait immédiatement relâché sur son site de capture. Toutes les femelles et les individus de moins de 1 an (faons de l’année) seront également immédiatement relâchés. Le nombre et la quantité des échantillons prélevés seront minimisés lors des captures estivales. La quantité de sang prélevée passera notamment de max 1 ml/kg (volume max= 20ml) à 14 ml (individus >20kg) afin de quantifier uniquement les paramètres physiologiques qui seront mis en lien avec les traits reproducteurs (ex : morphologie des bois, sécrétions odorantes, quantités et qualité des spermatozoïdes) et la santé des brocards. Les fèces collectés en amont de l’électro-stimulation avant de vider le rectum seront conservés pour des analyses d’éco-physiologie. La réduction des prélèvements est également anticipée par le stockage des échantillons non utilisés et leur mise à disposition pour notre réseau de collaborations. Les données collectées sur les 6-8 individus capturés au cours des trois jours de tutorat seront utilisées dans les analyses (avec ajout d’un facteur ‘phase pilote’ dans l’analyse) et contribueront donc à réduire le nombre d’individus capturés (ces brocards feront parties des 30 individus prévus dans le projet).

Raffinement

Le respect du bien-être animal est une préoccupation majeure du programme chevreuil. Afin de minimiser l’inconfort et la douleur des individus, plusieurs dispositions ont été prises. - Les protocoles ont déjà été travaillés en amont pour limiter les nuisances pour les animaux. Par exemples, l’ajout d’un analgésique (butorphanol 0.2 mg/kg) a déjà été rajoutée au protocole d’anesthésie afin de limiter de façon substantielle les possibles douleurs associées à l’électro-stimulation. - Les protocoles d’anesthésie et d’électro-stimulation seront optimisés en fonction des réponses du chevreuil aux protocoles initialement définis (ex : diminution de la tension maximale si trop de vocalisation, voir ci-après). D’autres alternatives qui pourraient le cas échéant être envisagées ont également été listées, comme par exemple la collecte de sperme par pharmaco-induction si l’électro-stimulation s’avérait trop inconfortable pour les animaux. - Des points limites spécifiques à la réalisation du protocole, l’anesthésie et l’électro-stimulation ont déjà été établis (voir section ci-après). - L’équipe technique sera tutorée (6 personnes tutorés: 3 pour l’anesthésie et 3 pour l’électro-stimulation) par des vétérinaires experts de l’anesthésie et de l’électro-stimulation. Pour les années suivantes, les experts reviendront le premier jour des captures pour revalider les compétences de l’équipe technique et éventuellement raffiner les protocoles en fonction des progrès et avancées réalisées dans le domaine. - Les manipulations seront effectuées dans un local réservé à cet effet par du personnel qualifié afin de minimiser le stress pour les animaux capturés. Les brocards auront les yeux couverts d’un tissu le temps que les prélèvements soient réalisés. Une fois manipulés, les brocards seront remis dans un sabot (caisse de contention adaptée à la morphologie du chevreuil et permettant un déplacement rapide des animaux) de façon à être immédiatement relâchés au plus près de leur territoire (sur la parcelle où ils ont été capturés).

Choix des espèces

Le chevreuil est pertinent pour l’étude de la sénescence reproductive masculine puisqu’il s’agit d’une espèce longévive et que les brocards allouent de façon complexe à la reproduction (ex : territorialité, pousse des bois, émission de molécules odorantes). La population ciblée revêt en de nombreux avantages pour ce projet. Dans cette population, clôturée et très faiblement chassée, les individus sont suivis individuellement de la naissance à la mort depuis bientôt 50 ans. Les animaux d'âge connu sont suivis de près tout au long de leur vie grâce à des captures hivernales et des observations sur le terrain. De nombreuses données (ex : démographiques, phénotypiques, génétiques) sont donc déjà disponibles pour plus de 50% des individus de la population, notamment ceux qui seront ciblés en priorité pour ce projet de recherche. De plus le recours à des populations captive ou de laboratoire ne permettrait pas de répondre aux objectifs de notre projet. Le projet repose sur l’étude de la reproduction des mâles. Les études antérieures sur les brocards ont révélé que les mâles étaient sexuellement matures à 9-10 mois ou un peu plus tard (14 mois environs, c’est à dire le second été suivant leur naissance). Nous inclurons donc dans notre étude, uniquement des mâles ayant au moins 14 mois. Au cas où un mâle plus jeune (c’est à dire un faon de l’année) se ferait piéger dans les filets au moment des captures, il serait relâché aussitôt.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intramusculaire puis jusqu'à deux injections intrapéritonéales par jour pendant dix jours, et un prélèvement de sang intracardiaque sous anesthésie avant leur mise à mort. Le porteur indique un inconfort et un stress liés aux injections répétées, sans attendre d'autre effet des molécules testées. Il affirme que le modèle murin est le seul modèle préclinique adapté pour étudier la réponse immunitaire après une greffe de poumon.

Objectifs

BOB1 est un facteur exprimé dans les lymphocytes. Dans des travaux antérieurs de l’équipe il a été montré que chez des patients transplantés le niveau d’expression de BOB1 dans les lymphocytes est associé au risque de dysfonction chronique du greffon pulmonaire. Pour étudier la fonction de BOB1, nous développons des petites molécules inhibitrices qui font l’objet d’une demande de dépôt de brevet. Nous avons démontré que le ciblage de BOB1 réduit les réponses des lymphocytes in vitro. L’inhibition de BOB1 devrait permettre de « calmer » les lymphocytes activés qui devraient moins agresser le greffon.. Un des axes de ce projet consiste à développer différents petits inhibiteurs de BOB1, à les valider in vitro et finalement à étudier in vivo l’effet de l’inhibition spécifique de BOB1 par ces molécules sur la réponse immune allogénique (qui se met en place après une greffe). Pour cela, nous utilisons un modèle murin de réponse immune allogénique, que nous avons mis au point et déjà utilisé dans d’autres travaux. Les petits inhibiteurs qui seront validés in vitro feront l’objet d’une étude pharmacocinétique in vivo chez la souris au préalable. Basés sur ces résultats, nous souhaitons les utiliser dans le modèle murin de réponse allospécifique afin d’étudier le rôle de BOB1 dans ces mécanismes et le potentiel bénéfice thérapeutique qui pourrait y être associé, pour des patients ayant subi une greffe de poumons.

Bénéfices attendus

D’un point de vue cognitif, la compréhension du rôle de BOB1 dans la réponse allo-spécifique est le premier bénéfice attendu de ce projet. Au delà, l’identification d’inhibiteurs de cette voie est très prometteuse dans le but de développer des approches thérapeutiques pour prévenir le risque de dysfonction chronique du greffon pulmonaire, chez des patients transplantés.

Procédures

Les animaux recevront une injection intra-musculaire (durée 1 minute, animal anesthésié). Certains lots d’animaux recevront jusqu’à 2 injections intra-péritonéales par jour pendant 10 jours (durée 30 secondes chaque, animal vigile). Un prélèvement sanguin intra-cardiaque (durée 1 à 2 minutes, animal anesthésié) est prévu avant euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet nous procèderons à des injections intra-péritonéales répétées, et un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine), pourra être ressenti par les animaux. De plus la répétition de ces injections sur une durée de 10 jours pourrait engendrer un certain stress des animaux. Les différents inhibiteurs auront tous été validés pour une absence de toxicité in vitro, et in vivo dans une étude de pharmacocinétique. Nous n’escomptons pas d’effets indésirables de ces molécules par elles-mêmes ou comme conséquence de l’inhibition de la réponse immune spécifique. Toutefois, comme il s’agit de molécules nouvelles, les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive au cours du traitement.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures sont euthanasiés pour récupérer les organes, le sang, la rate, les ganglions et mener des analyses de biologie cellulaire et d’immunologie.

Remplacement

Les premières études des conséquences de l’inhibition de BOB1 ont été autant que possible réalisées sur des cellules en culture, y compris les premiers tests de toxicité cellulaire des inhibiteurs. De plus tous auront fait l’objet d’une étude de pharmacocinétique in vivo au préalable. Le passage aux études in vivo est réduit aux tests nécessaires qui requièrent un système physiologique complexe, qu’il n’est pas encore possible de modéliser in vitro. Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique adapté.

Réduction

Nous estimons que pour ce projet 1200 animaux seront étudiés : Nous estimons un nombre total de 200 lots de 6 animaux. De façon à réduire au plus le nombre d’animaux nécessaires, le calcul des effectifs a été réalisé par un calcul de puissance, basé sur des expériences préliminaires réalisées dans des conditions comparables, et à l'aide de tests statistiques. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si certains des inhibiteurs, parmi les 10 étudiés ne passent pas les étapes préalables de toxicité cellulaire et d’étude pharmacocinétique in vivo. Dans un but de réduire le nombre d’animaux, nous pourrons réduire le nombre de groupes contrôles s’il s’avère que les solvants et les concentrations sont les mêmes pour plusieurs inhibiteurs et en absence d’autres effets potentiels de paramètres extérieurs qui pourraient interférer. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

Les animaux provenant de l’extérieur seront stabulés une semaine au sein de l’animalerie. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Afin de limiter le stress des animaux, un foisonnement à base de frisures de papier kraft sera mis dans les cages. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, si toutefois des souris paraissent agressives lors du protocole, une séparation pourrait être nécessaire avec le maintien d’un enrichissement de type tunnel rouge ou dôme. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale gazeuse. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur un tapis chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Il nous permet d’étudier un processus complexe tel que la réponse immune allo-spécifique, à notre connaissance il n’y a pas d’autre modèle pertinent. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont des souris adultes de 6 à 8 semaines, car le système immunitaire est mature. A des âges plus avancés le système immunitaire peuvent varier, ce qui pourrait engendrer une plus grande variabilité dans l’induction de l’immunité et dans son inhibition.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses humaines du sein ou du pancréas sous la peau, les tumeurs étant ensuite fragmentées et regreffées sur d'autres souris, puis des injections répétées d'une molécule à base de fer dans la queue. Le porteur indique que la croissance tumorale et les injections répétées peuvent provoquer douleur et lésions. Il conclut que ces études précliniques restent nécessaires au dépôt de brevet et à la poursuite d'essais cliniques.

Objectifs

Malgré les progrès dans leur diagnostic et traitement, les cancers du pancréas et certains cancers du sein ont encore un pronostic défavorable. Ainsi il est primordial de trouver de nouveaux traitements. Ce projet a pour but d’étudier le pouvoir anti-cancéreux d’un nouveau produit à base de fer (à une dose déjà montrée comme non toxique pour les souris) sur des souris ayant reçus une greffe au niveau du flanc, sous la peau, de cellules cancéreuses humaines (pancréas ou sein).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet à court termes sont de prouver que la molécule a un effet anticancéreux dans un modèle animal (souris). A long terme, cela permettrait de réaliser d’autres essais pré-cliniques voir cliniques et in fine améliorer le traitement des patients atteints du cancer du pancréas et du cancer du sein.

Procédures

Les animaux recevront une injection unique de cellules cancéreuses (mammaires pour une partie et pancréatique pour une autre partie) au niveau du flanc sous la peau. Une fois les tumeurs développées, elles seront fragmentées pour être greffées sur de nouvelles souris et ce à deux reprises. Cela permet d’obtenir un modèle tumoral fiable. La durée de cet acte est approximative car cela dépendra du temps que mettent les cellules à former une tumeur à chaque étape. 14 souris seront nécessaires pour cette étape (7 par modèle de cancer : sein et pancréas). Ensuite, aura lieu les greffes des fragments obtenus lors de la dernière transplantation, aux 66 souris nécessaires pour l’injection du composé. Une fois les tumeurs obtenues, les souris seront réparties en groupes pour les injections. Pour chaque modèle (cancer du sein et cancer du pancréas), il y aura 3 groupes de 11 souris , 1 groupe contrôle et deux groupes recevant 2 modalités d’injections de la molécule différentes. Pour chaque groupe, 4 souris seront mises à mort en cours d’expérimentation (étude de l’effet précoce de la molécule sur la tumeur) et les 7 autres en fin d'expérimentation.

Impact sur les animaux

Durant les actes expérimentaux, les souris seront soumises à différents injections. Elles seront également soumises à une chirurgie légère. A la suite de ces actes, les souris pourront ressentir une soif ou/et une faim moins importante que d’habitude. Les injections répétées de la molécule au niveau de la queue peuvent entrainer une douleur et une atteinte des tissus au niveau du site d’injection, afin d’éviter cela, nous injecterons à différents endroits de celle-ci. Le développement des tumeurs peut entrainer une douleur et une gêne, au fur et à mesure de la croissance de la tumeur. Les animaux seront donc susceptibles de gratter la zone de greffe ou d’injection. Après tout acte chirurgicaux ou injections, les animaux seront isolés le temps qu’ils récupèrent toutes leurs facultés mais seront rapidement remis en cage collective afin d’éviter un stress lié à l’isolement de l’individu.

Devenir

Pour la première partie de l’expérimentation, tous les animaux seront mis à mort en cours de procédures pour récupérer au fur et à mesure les tumeurs et les fragmenter / regreffer. Pour la deuxième partie de l’expérimentation, tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les tumeurs et étudier l'effet des différentes injections à un temps précoce ou à l'issu de l'expérimentation (temps tardif)

Remplacement

Aucune méthode alternative de remplacement ne permet de satisfaire l’objectif de Remplacement à notre connaissance. Ces études précliniques chez l’animal restent nécessaires au dépôt de brevet concernant son effet anticancéreux sur les animaux et à la poursuite d’études cliniques pour exploiter pleinement les capacités antitumorales de la molécule AIM3 dans le traitement de cancer du pancréas et du cancer du sein triple négatif

Réduction

Dans le but de réduire au maximum le nombre de souris, nous avons décidé d’éviter un quatrième groupe contrôle (ne recevant qu’une injection de la solution dans lequel est repris le composé). Nous utiliserons donc un seul groupe contrôle pour les comparaisons aux deux groupes traités.

Raffinement

Les expériences seront réalisées afin de minimiser le stress et l’apparition de douleurs chez les animaux. Les injections seront effectuées sur animaux anesthésiés afin de limiter le stress engendré par la contention. La présence d’enrichissement dans les cages (frisure de papier kraft, de bûchettes et/ou tunnel) est un critère de raffinement. Des critères d'arrêt anticipés de l'expérimentation en cas de survenue d'une complication ont été identifiés. Dès qu’un des points limites est atteint la souris en question sera écartée du protocole et mise à mort par dislocation cervicale à la suite d’une anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

Le modèle de souris « nude » du fait de sa déficience en système immunitaire est le modèle animal le plus approprié pour des études en cancérologie expérimentale car il permet d’injecter chez l’animal des cellules cancéreuses d’origine humaine sans risque de rejet. La taille de la tumeur de la souris est suffisante pour l’analyse de la distribution de la molécule d’intérêt. 8 semaines : adulte, poids d’au moins 20 g. La veille bibliographique réalisée sur les études in vivo établies à partir de modèle de cancer du pancréas et de cancer du sein démontrent l’utilisation de souris femelles « nude » sans système immunitaire âgées de 8 semaines.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 20 reproducteurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris transgéniques reçoivent une inoculation intracérébrale d'extraits de cerveaux de patients atteints d'Alzheimer, puis cinq séances d'ouverture de la barrière hémato-encéphalique par ultrasons sous anesthésie, avant un test de mémoire. Le porteur indique que ces souris développent une paralysie des membres postérieurs et un amaigrissement, et que la chirurgie intracérébrale peut provoquer une douleur. Il affirme qu'aucune alternative non animale ne peut se substituer à ces souris transgéniques.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative incurable qui est devenue un impact majeur de santé publique. La maladie d’Alzheimer est caractérisée par l’accumulation anormale de différentes protéines dans le cerveau des patients. Une de ces protéines est nommée Abéta et se dépose sous forme de plaques appelées plaques amyloïdes. De nombreux essais cliniques, chez l’animal et chez l’homme, montrent une élimination de la protéine Abéta du cerveau des patients mais sans effet sur les symptômes. Une autre protéine, la protéine tau, s’accumule également dans le cerveau des patients. Tau s’agrège à l’intérieur des neurones et fait l’objet de nombreuses recherches cliniques et pré-cliniques, notamment parce qu’elle est fortement liée au déclin cognitif des patients. Un obstacle majeur au développement de thérapies efficaces dans la maladie d’Alzheimer repose cependant sur l’existence d'une barrière « sang-cerveau » qui contrôle les entrées et sorties entre le cerveau et l’extérieur. Cette barrière a pour rôle de protéger le cerveau. Cependant, la barrière sang-cerveau rend aussi difficile la pénétration des molécules thérapeutiques dans le tissu cérébral. Ces dernières années, un moyen d’ouvrir cette barrière a été décrit. Il s’agit de l’utilisation d’ultrasons appliqués sur la surface du crâne, associée à l’injection intraveineuse de microbulles (produits de contraste échographique couramment utilisés) qui permettent de distendre, de manière transitoire et sans effet secondaire, les parois de la barrière et ainsi autorisent la pénétration des molécules thérapeutiques. Cette technique a déjà été appliquée avec succès dans le traitement par chimiothérapie des tumeurs cérébrales. Concernant la maladie d’Alzheimer, il a été montré chez l’animal des effets bénéfiques de l’ouverture de la barrière seule sur l’élimination des protéines pathologiques (Abéta et tau). Cependant, les effets de l’ouverture de barrière sur la propagation des lésions dans le cerveau ne sont pas connus. En particulier, est-ce que l’ouverture transitoire de la barrière sang-cerveau permet de freiner la progression des agrégats de protéines tau en empêchant leur passage d’une aire cérébrale à une autre ? Cette question constitue l’objet de notre travail. Celui-ci sera réalisé sur des souris génétiquement modifiées pour reproduire les accumulations de protéine tau caractéristiques de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Plusieurs études récentes ont montré des effets bénéfiques de l’ouverture de la barrière via l’association des ultrasons avec les microbulles chez l’animal avec une diminution de l’accumulation de la protéine Abéta et de la protéine tau dans le cerveau. Le ou les mécanismes par lesquels l’ouverture seule de la barrière (non associée à l’injection de molécule thérapeutique) permettrait ces effets thérapeutiques restent à ce jour non connus. Par ailleurs, d’autres études ont montré que l’inoculation intra-cérébrale d’extraits de cerveaux d’individus atteints de maladie d’Alzheimer provoquait expérimentalement, chez l’animal, une augmentation de la propagation de la pathologie. Ainsi, notre projet a pour visée de déterminer l’effet de l’ouverture de la barrière par ultrasons sur la propagation de la pathologie tau. Notre hypothèse est que l’ouverture de barrière permettra de freiner la dissémination-propagation des lésions. Au long terme, ces recherches pourraient permettre le développement de stratégies thérapeutiques et diagnostiques innovantes et, parallèlement, une meilleure compréhension des mécanismes biologiques à l’origine de la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Les animaux transgéniques sont un modèle de maladie d’Alzheimer avec des lésions cérébrales et des signes cliniques (paralysie, perte de poids) qui peuvent être précoces. Pour cette raison, les animaux feront l’objet d’un suivi rapproché pendant toute la durée de l’étude (examen et pesée 1-2 fois par semaine). Pour les animaux, il y aura au maximum 3 étapes expérimentales : La première consiste en l’inoculation intra-cérébrale des extraits de cerveaux de patients présentant une Maladie d’Alzheimer. Celle-ci est réalisée, chez 130 souris, sous anesthésie générale. Cette chirurgie est unique, d’une durée d’environ 30 minutes, et associée à une prise en charge de la douleur (analgésiques). Par la suite (15 jours plus tard), aura lieu la seconde étape (ouverture de la barrière par ultrasons). Cinq séances d’ouverture de la barrière par ultrasons (en externe, sans ouverture du crâne) seront réalisées à un rythme d’une séance par semaine. Lors de chacune de ces séances, les souris seront anesthésiées. La durée d’une séance pour chaque animal est d’environ 10 minutes. Au bout de 5 semaines de traitement par ouverture de barrière, 80 des 130 animaux seront finalement évalués par un test de mémoire non-invasif (observation du comportement spontané dans une enceinte carrée pendant 2x10 minutes). Le test sera réalisé 72 heures après la dernière séance de sonication. A la fin de l’étude, l’examen du cerveau des souris sera effectué en postmortem afin d’explorer l’effet de l’ouverture de la barrière sur la propagation de la pathologie chez les souris. Pour produire les 130 souris nécessaires au projet, nous utiliserons les animaux reproducteurs de notre colonie (20 mâles transgéniques). Le nombre total d’animaux est donc de 150.

Impact sur les animaux

Les souris transgéniques utilisées dans cette étude présentent un phénotype dommageable et développent vers l’âge de 7 mois (parfois plus tôt) des lésions des voies motrices entraînant une paralysie des membres postérieurs. Ce tableau clinique s’accompagne d’un amaigrissement lié aux difficultés d’accès à la nourriture et à la boisson. Comme nous utiliserons des souris jeunes (4-6 mois) nous ne devrions pas observer ces phénotypes dommageables. Les deux manipulations chirurgicales de ce projet (inoculations intracérébrales et ouverture de la barrière hémato-encéphalique) sont associées aux risques anesthésiques habituels. Ceux-ci comprennent le risque d’hypothermie lors de l’anesthésie, le risque de déshydratation et le risque de d’anomalies cardiaques et respiratoires liées au produit anesthésique. La chirurgie d’inoculation intra-cérébrale pourrait de plus provoquer une douleur pendant et après la chirurgie. Aucun autre effet indésirable n’est attendu pour cette chirurgie si celle-ci est correctement réalisée (chirurgie courte, utilisation de produits anti-douleurs). Concernant l’étape d’ouverture de la barrière, il n’est pas attendu d’effet indésirable supplémentaire à ceux de l’anesthésie. En effet, celle-ci n’implique pas d’ouverture cutanée. Enfin, l’étape d’évaluation de la mémoire repose sur un comportement spontané de l’animal, sans restriction d’accès à l’eau ou à l’alimentation, sans menace pour l’animal, et impliquant un stress modéré lors de la manipulation (sortie de la cage) et du placement dans un nouvel environnement.

Devenir

A l’issue de la procédure, l’ensemble des animaux expérimentaux (n = 130) sera ensuite euthanasié pour prélèvement de leurs cerveaux à visée d’analyse. Les animaux transgéniques servant à la reproduction (n = 20) seront euthanasiés.

Remplacement

L’étude préclinique, fondamentale ou appliquée de la maladie d’Alzheimer, nécessite le recours aux modèles animaux, seuls à même de reproduire le contexte physiologique de cette pathologie neurodégénérative complexe. Il n’est donc pas possible de substituer aux souris transgéniques une alternative non-animale. Ce modèle de souris est le modèle le plus couramment utilisé dans les études précédentes sur le sujet.

Réduction

Le nombre d’animaux produits et maintenus sur site est réduit au maximum. La taille des groupes d’animaux (10-20 souris par groupe expérimental) produits pour les futures études est définie en fonction de nos expériences antérieures et des données de la littérature afin de permettre de générer des données fiables. L’ensemble des animaux seront produits sur site (colonie implantée depuis plusieurs années). 7 lots expérimentaux seront utilisés : Expérience 1 (étude pilote) – Effet de l’ouverture de la barrière sur la propagation des lésions cérébrales 3 lots d’animaux (normaux ou transgéniques) recevront une inoculation intracérébrale couplée (ou pas) à une ouverture de la barrière. Ces 3 lots serviront à l’évaluation du traitement sur la cible principale (lésions tau dans le cerveau). Expérience 2 (plan expérimental complet) - Effet de l’ouverture de la barrière sur les fonctions cognitives et les lésions cérébrales 4 lots d’animaux (normaux ou transgéniques) recevront une inoculation intracérébrale (« Alzheimer » ou « contrôle ») couplée à une ouverture de la barrière. Les animaux seront ensuite testés dans un test de mémoire. Ces 4 lots permettront une description complète (clinique, neuropathologique et biochimique) des effets du traitement (inoculation intracérébrale + ouverture de la barrière). Au total, 130 souris seront utilisées pour les expériences et 20 souris transgéniques seront utilisées pour la production des animaux expérimentaux.

Raffinement

L’établissement utilisateur où sont hébergés les animaux étant agréé, les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées quotidiennement. Les animaux sont hébergés par groupes de 4 ou 5 souris et bénéficient également d’un enrichissement matériel (coton ou kraft pour faire un nid, maisons en cellulose). Nous avons déjà mis en place un programme qui vise au suivi rapproché de la lignée de souris modèle de maladie d’Alzheimer afin de détecter l’apparition de symptômes dommageables. Ce suivi sera réalisé pendant toute la durée de l’étude, de la naissance à la mort, et permettra de détecter les animaux avec des signes cliniques et de prendre des mesures adaptées (prise en charge de la douleur, aménagement environnement, euthanasie). Les deux étapes du projet (inoculation intracérébrale et ouvertures de la barrière hémato-encéphalique) sont associées aux risques anesthésiques habituels (hypothermie, deshydratation, sur- ou sous-dosage) pour lesquels plusieurs mesures seront mises en place (tapis chauffant, réhydratation avant la chirurgie, surveillance rapprochée de la sédation). Une surveillance post-opératoire sera également mise en place. La chirurgie d’inoculation intra-cérébrale pourrait de plus provoquer une douleur pendant et après la chirurgie chez l’animal mais nous avons prévu de prévenir celle-ci par l’administration d’anti-douleurs (analgésiques) avant et après la chirurgie associée à l’anesthésie. Aucun autre effet indésirable n’est attendu pour cette chirurgie. Concernant les étapes d’ouverture de la barrière « sang-cerveau » et d’évaluation comportementale, il n’est pas attendu d’effet indésirable supplémentaire à ceux de l’anesthésie. Enfin, l’étape d’évaluation de la mémoire repose sur un comportement spontané de l’animal, avec accès à l’eau et l’alimentation, sans renforcement aversif, et n’impliquant à priori pas de stress majeur chez l’animal (si ce n’est la manipulation et le placement dans un nouvel environnement). Le suivi rapproché des animaux au cours de la phase d’élevage et d’expérimentation permettra d’identifier l’atteinte de points limites et d’intervenir pour minimiser toute souffrance animale.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris transgéniques qui développent des lésions similaires à celles des patients atteints de maladie d’Alzheimer. Il n’existe pas à notre connaissance de modèle autre que ces souris transgéniques permettant d’atteindre les objectifs du présent projet. Toutes les expérimentations seront réalisées sur l’animal à l’âge adulte. Les injections intracrâniennes seront effectuées sur les animaux jeunes adultes (âgés de 4 mois), âge auquel les lésions de type Alzheimer ne sont pas encore importantes et la boite crânienne est mature et stable, autorisant une chirurgie stéréotaxique précise. Les traitements d’ouverture de barrière seront initiés à l’âge de 4.5 mois (début des lésions) sur une durée d’un mois et demi avant évaluation comportementale et l’euthanasie des animaux. L’évolution des lésions à 6 mois pourra ainsi être évaluée et leur régression après traitement mesurée.

295 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une instillation nasale d'adénovirus qui déclenche des tumeurs pulmonaires, puis des injections intrapéritonéales répétées de thérapie ciblée, de chimiothérapie et d'immunothérapie pendant vingt semaines, avec des séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que les tumeurs, invisibles de l'extérieur, peuvent provoquer une insuffisance respiratoire et une cachexie, les souris perdant 20 % de leur poids étant mises à mort. Les retombées annoncées pour les patients atteints de ce cancer du poumon restent au conditionnel, et il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne permet d'évaluer l'anticorps.

Objectifs

Le carcinome squameux du poumon (LUSC) est un sous-type courant de cancer du poumon. Il est la deuxième cause de décès liée au cancer du poumon, causant environ 400 000 décès par an dans le monde. La grande majorité des patients atteints de LUSC sont de gros fumeurs actuels ou anciens indiquant une forte association de la pathologie au tabagisme. Contrairement à d'autres sous-types de tumeurs du poumon, il n'existe pas encore de thérapies ciblées approuvées pour le LUSC, ce qui souligne la nécessité de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Le projet vise en prérequis à étudier le développement tumoral dans un modèle murin de LUSC. L'objectif principal de notre projet est d’étudier l’effet d’une thérapie ciblée seule ou en association avec une chimiothérapie ou une immunothérapie sur le développement des tumeurs dans ce modèle murin. Nous analyserons pour cela l’incidence et la progression tumorale. La pertinence de notre thérapie ciblée sera également évaluée par ablation génétique de son gène. De manière secondaire, nous étudierons la biologie de notre cible thérapeutique dans ce même modèle à l’aide de systèmes rapporteurs d’expression.

Bénéfices attendus

Des options thérapeutiques limitées sont disponibles pour le LUSC à un stade avancé. Malgré une compréhension plus approfondie des altérations génétiques qui caractérisent les LUSC et des années de travaux d'essai ciblant ces altérations, les thérapies personnalisées restent peu satisfaisantes. Seule l'immunothérapie a marqué la première amélioration substantielle de la survie globale des patients atteints de LUSC depuis plus d'une décennie, mais moins d’un tiers des patients montrent un bénéfice au traitement. Les travaux présentés dans ce projet permettront une meilleure compréhension du fonctionnement de notre cible thérapeutique (et de son activité en association avec des chimiothérapie et des immunothérapies. Ils permettront également de mieux définir le profil des patients éligibles au traitement et susceptibles d’y répondre.

Procédures

Prélèvement tissulaire sur animaux vigiles, de 2 mm au niveau de la queue pour génotypage à 4 semaines postpartum. 1X 5 sec. Marquage à l’oreille à 4 semaines postpartum. 1x 5 sec. Pour l'injection de virus: Anesthésie par injection. 1X 20 sec. Durée de l'anesthésie 5 min. Pour l'imagerie intra-vitale: Anesthésie gazeuze. 1X20 sec toutes les 4 sem de 4 à 40 sem post-infection. Durée de l'anesthésie 10 min. Instillation nasale de virus 1X 5 min. Injections intraperitonéales sur animaux vigiles : Thérapie ciblée injections 2X/sem pendant 20 sem, 20 sec. Immunothérapie 2X/sem pendant 5 sem, 20 sec. Chimiothérapie 1x/sem pendant 20 sem, 20 sec.

Impact sur les animaux

Les animaux sont anesthésiés pour procéder à l’instillation nasale des adenovirus. La manipulation des souris et les diverses injections intrapéritonéales peuvent générer du stress à l’animal. L’instillation nasale des virus peut provoquer de légères lésions au niveau des narines ainsi qu’induire de la toux. Les tumeurs induites par l'adénovirus se développent au niveau pulmonaire. Elles ne sont par conséquent pas visibles de l’extérieur et peuvent occasionner une insuffisance respiratoire. Les contentions lors des pesées et des traitements peuvent générer du stress. Les méthodes d’imagerie imposent des manipulations, du transport et de l’anesthésie par inhalation qui sont autant de stress pour l’animal. Dans les traitements avec chimiothérapie, une cachexie chez certains individus (associée à une forte perte de poids). Les animaux peuvent présenter des blanchissements et refroidissement des extrémités. Ces signes peuvent être en lien avec l’affaiblissement provoqué par l’atteinte pulmonaire caractéristique de ce modèle de souris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort et leurs tissus prélevés pour analyse à la fin de chaque procédure.

Remplacement

L’étude de la biologie de notre cible thérapeutique a été réalisée sur des lignées cellulaires au préalable. Des analyses d’expression ont été effectuées sur les données publiques. L’ensemble des résultats obtenus nous a conduit à la nécessité de recontextualiser les cellules tumorales dans leur environnement. La complexité des réponses thérapeutiques de certains traitements anticancéreux rend difficile leur étude sur des lignées cellulaires. Les modèles murins représentent en ce sens un modèle adapté qui intègre la dynamique des nombreux type cellulaires impliqués dans la mise en place de ces réponses. De plus, le modèle génétique utilisé récapitule parfaitement toutes les étapes de développement de ce type de cancer pulmonaire. Son utilisation est donc nécessaire pour évaluer l’effet d’une thérapie sur l’incidence et la progression de la maladie. La présence de tous les différents types cellulaires est nécessaire à la compréhension des mécanismes biologiques qui impliquent l’activité dde notre traitement. Il n'existe pas de modèles d'étude in silico ou in vitro permettant l'évaluation de l'efficacité de notre anticorps dans le contrôle de l’immunité et les cellules cancéreuse.

Réduction

Les travaux actuellement publiés sur ce modèle de tumorigénèse n’indiquent pas la variabilité d’apparition des tumeurs chez les individus et ne permet donc pas une évaluation du nombre d’individus par une approche de calcul statistique. Nous avons calculé le nombre minimum de souris à inclure, en prenant en compte notre expérience sur la réponse aux traitements utilisés dans d’autres modèles et pour disposer de suffisamment de matériel biologique pour rendre nos résultats interprétables. Les effectifs seront évalués au regard de la variabilité observée dans les premières expériences de mise en place du modèle. La stratégie de production des animaux et d’entretien la lignée génétiquement modifiée permet de réduire le nombre d’individus avec un génotype non désiré. 40 souriss seront utilisées pour réaliser un suivi longitudinal afin d’identifier l’hétérogénéité et la rapidité du développement tumoral de ce modèle de 20 à 40 semaines. Les temps de mise à mort pour le reste des proédures pourront être redéfinis au regard de ces résultats. L’autopsie des animaux sera réalisée afin de quantifier les lésions pulmonaires et détecter d’éventuelles invasions métastatiques (celles-ci n’ayant pas été décrites aux temps réalisés dans ce modèle). Certaines expérimentations seront faites 2 fois pour permettre différents types de prélèvements tissulaires. Les effectifs tiennent compte de la variabilité des effets de l’immunothérapie et de la chimiothérapie observée dans d’autres protocoles identiques. Dans un but de réduction, la répétition de ces expériences ne sera pas réalisée en cas d’absence d’effet mesuré. Les effectifs évalués prennent en compte la mise au point des protocoles de traitement des échantillons biologiques récupérés.

Raffinement

Dans ce modèle de souris, des petites lésions pulmonaires apparaissent à partir de la semaine 30 post induction avec le virus. 100% des animaux présentent des lésions entre 40 et 50 semaines. Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux permettra la recherche de tout signe de souffrance. Le poids des animaux sera évalué 2 fois par semaine selon les phases du développement tumoral. Pour l’ensemble des expériences, les signes de souffrance seront surveillés 2 fois par semaine puis 3 fois par semaine à partir d’un âge de 30 semaines. Des signes d’insuffisance respiratoire, d'amaigrissement et de prostration sont également possibles en lien avec la pathologie induite ou après l’administration de chimiothérapie. Des mesures d'enrichissement du milieu à partir de 20 semaines permettant un réchauffement des individus seront mis en place afin de limiter l’apparition d’hypothermies. De la nourriture semi-liquide sera mise dans la cage en cas de perte de poids

Choix des espèces

Le modèle de souris génétiquement modifiées utilisé est capable de générer des tumeurs pulmonaires représentatives uniquement du sous-type désiré, dans 100 % des souris et qui récapitulent les aspects génétiques, moléculaires et microenvironnementaux de la maladie humaine. L'administration nasale de virus permet la spécificité d’organe. La souris immunocompétente est le modèle le plus approprié pour faire des suivis pharmacologique dans le cadre de traitements avec des anticorps monoclonaux, de la chimiothérapie ou de l'immunothérapie. Par ailleurs la posologie des drogues utilisées est bien standardisée (voie, doses, volumes, etc...) contrairement à d'autres modèles tels que le poisson zèbre. Par conséquent, les modèles de souris immunocompétentes sont nécessaires à la réalisation de cette étude. Les expérimentations seront effectuées sur des souris jeunes adultes (âge supérieur à 7 semaines) conformément au modèle établi. Le développement tumoral pulmonaire commence à partir de 20 semaines suivant l'administration nasale de virus.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une démyélinisation est induite par la cuprizone, puis les souris reçoivent un gavage quotidien pendant six semaines, des séances d'IRM sous anesthésie et, pour la mise à mort, une perfusion ou une ponction intracardiaque, afin de tester une molécule ciblant le récepteur 5-HT7 dans la sclérose en plaques. Le porteur indique n'attendre pas de douleur liée à la cuprizone mais reconnaît que les injections quotidiennes peuvent stresser les animaux. Il affirme que l'évaluation de ces ligands "nécessite l'utilisation de l'animal" pour considérer un "organisme entier".

Objectifs

L’objectif du projet est de caractériser le rôle du récepteur 5HT7 dans les processus de démyélinisation/remyélinisation, la réponse inflammatoire en particulier son rôle sur la microglie, macrophages résidents du système nerveux central. Nous déterminerons si l’activation de ce récepteur avec une molécule que nous venons de caractériser et qui cible ce récepteur permettra de ralentir les signes pathologiques dans la sclérose en plaques. Nous comparerons son efficacité par rapport à une molécule de référence ciblant également le récepteur 5-HT7 mais qui possède des propriétés pharmacologiques différentes comparées à la molécule à tester. Nous utiliserons un modèle animal de la maladie après traitement cuprizone chez des animaux sauvages et des animaux dont le gène codant pour le récepteur 5-HT7 est non fonctionnel, ceci afin d'explorer le rôle du récepteur dans le développement de la maladie.

Bénéfices attendus

Parmi les bénéfices attendus du projet, nous espérons l'identification d'une molécule qui permettra de réduire d'au moins 50% la demyélinisation et capable d'induire la remyélinisation. L'efficacité du traitement sera évaluée après analyse des images IRM obtenues et la quantification des immunomarquages qui seront réalisés après mise à mort à 6 semaines et 12 semaines pour suivre les paramètres inflammatoires et le niveau de myélinisation.

Procédures

Les animaux ne seront soumis à aucune intervention impliquant des procédures chirurgicales. Des injections par voie orale (15sec/gavage/jour) seront réalisées tous les jours pendant 6 semaines sur 220 animaux vigiles. Une partie des animaux (160 animaux) sera utilisée pour l'imagerie IRM (5 acquisitions de 45 minutes/animal réalisées à intervalle de 3 semaines). Pour se faire les animaux seront anesthésiés et placés dans l'imageur IRM pendant maximum 45 minutes pour l'acquisition des images. 80 animaux recevront un agent de contraste par voie intraveineuse sous anesthésie générale (5min/injection/animal) avant de réaliser les acquisitions IRM sous anesthésie (5 acquisitions de 45 minutes/animal réalisées à intervalle de 3 semaines). La moitié des animaux (360 animaux) recevront une dose sublétale d'anesthésique (15 sec/injection intrapéritonéale) avant perfusion intracardiaque. L'autre motié des animaux (360 animaux) sera anesthésiée sous isoflurane avant prélèvement sanguin intracardiaque (5 min/souris) et récupération des tissus.

Impact sur les animaux

Nous ne nous attendons pas à l'apparition de douleur suite au traitement cuprizone qui est ajoutée dans la nourriture. De même, le suivi par IRM n'est pas connu pour induire de la souffarnce. Cependant l'injection quotidienne de ligands du récepteur 5-HT7 peut induire un stress des animaux. Si nous n'avons pas observé d'effet indésirable après adminisstration unique, l'administration répétée peut induire différents effets indésirables tels qu'un inconfort dû à l’injection ou des effets secondaires liés au composé (comme la sédation par exemple).

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des mesures biochimiques et histologiques (prélèvement sanguin et cerveau).

Remplacement

Des études in vitro seront réalisées en parallèle des études in vivo afin d’obtenir plus d’informations sur les mécanismes d’actions et les voies de signalisation impliquées. Cependant, l’évaluation de l’effet anti-inflammatoire et neuroprotecteur des ligands du récepteur 5-HT7 de la sérotonine nécessite l’utilisation de l’animal afin de considérer un organisme entier et de confronter l'effet de nos ligands à la complexité des mécanismes neurologiques mis en jeux dans la démyélinisation /remyélinisation induite par la cuprizone.

Réduction

Les approches décrites nécessitent des cohortes de 10 animaux minimum par groupe. Chaque expérience sera réalisée deux fois indépendamment afin d’assurer la validité statistique des résultats

Raffinement

Les souris seront hébergées en portoirs ventilés dans des cages disposant d'un environnement enrichi dès leur arrivée. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture. Les animaux seront observés tous les jours durant la durée de chaque procédure pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter d'éventuels signes de souffrance, en plus des pesées (2 fois/semaine). La cuprizone, contrairement aux modèles animaux d’Encephalomyélite Autoimmune Expérimentale (EAE), mimant la sclérose en plaques chez la souris, n’induit pas de paralysie de l’animal. Le suivi IRM sera effectué sous anesthésie gazeuse et les animaux seront maintenus sur un tapis chauffant à 37°C. Une grille de score, l'utilisation de points limites, d'un arbre décisionnel et de critères d'arrêt de souffrance seont utilisés. Ainsi, si un animal présente un signe de souffrance lors des observations quotidiennes, l'utilisation d'analgésique ou la décision de mise à mort sera prise en concertation avec le responsable du bien- être des animaux du projet.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies du système nerveux central. L’existence de nombreuses lignées transgéniques et la disposition d’outils moléculaires spécifiques (eg. anticorps spécifiques, sondes moléculaires …) ont apporté ces dernières années une meilleure compréhension des neuropathologies et ont conduit aux développements de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous utiliserons également des souris inactivées pour le gène du récepteur 5-HT7 (5-HT7 KO), afin de discriminer l’implication des autres récepteurs de la sérotonine dans les résultats observés. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (8 à 14 semaines) afin de garantir un système nerveux central mature.

500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du crâne avec fixation d'une pièce sur la tête, puis une dizaine de séances d'enregistrement du mouvement, d'imagerie calcique et d'électrophysiologie, pour étudier l'adaptation motrice. Le porteur reconnaît des dommages osseux et tissulaires liés à la chirurgie et une restriction en eau imposée aux souris pour les motiver pendant les tests. Il affirme que ce projet de neurophysiologie "ne peut être conduit que sur animal vivant" et libre de ses mouvements.

Objectifs

La capacité d'apprendre des programmes moteurs précis et coordonnés et de les adapter à un environnement changeant est essentielle à la survie de tous les animaux. Élucider les interactions cellulaires et réseau au cours de l'adaptation motrice nécessite un paradigme comportemental qui permet l'observation simultanée de l'adaptation neuronale et comportementale aux changements entre la réafférence perçue et attendue. Dans une expérience classique chez l'homme, la réafférence perçue est découplée de la réafférence attendue à l'aide de lunettes à prisme qui déplacent le champ visuel de plusieurs degrés tandis que les gens utilisent des mouvements balistiques pour localiser une cible dans l'espace. Chez les sujets en bonne santé, l'échec initial à localiser une cible informe les tentatives futures, et les sujets adaptent les programmes moteurs pour localiser de manière fiable les cibles extrêmement rapidement. Cependant, les patients présentant des déficits cérébelleux ne parviennent pas à adapter les programmes moteurs à la nouvelle réafférence sensorielle produite par les lunettes, vraisemblablement parce que la comparaison entre la réafférence perçue et attendue ne peut être réalisée sans le cervelet. Nous avons récemment développé une nouvelle tâche comportementale chez des souris à tête fixe qui nous permet d'utiliser l'électrophysiologie et l'imagerie pour observer l'activité de cellules individuelles dans le cerveau, et récapitule les composants essentiels de l'expérience des lunettes à prisme chez l'homme : les souris à tête fixe utilisent un membre antérieur pour contrôler un joystick qui déplace un distributeur d'eau. Nous utiliserons des techniques d'électrophysiologie et d'imagerie pour observer comment divers types de cellules du cervelet et cortex perçoivent, apprennent, et stockent la réafférence attendue générée par des perturbations de la réafférence attendue.

Bénéfices attendus

Notre recherche vise à comprendre les bases fonctionnelles qui permettent au cerveau d'effectuer des tâches motrices. Nous serons ainsi en mesure, à terme, de démontrer comment divers types de cellules du cervelet et cortex perçoivent, apprennent, et stockent des mémoires nécessaires pour adapter nos mouvements dans un environnement qui change. Une meilleure compréhension du fonctionnement des neurones dans les structures concernées est nécessaire pour permettre de diagnostiquer et traiter des pathologies neurologiques liées à des dysfonctionnements moteurs.

Procédures

Les souris de cette étude subiront 4 procédures. Les animaux subiront 1 chirurgie de < 1 heure et environ 10 séances (< 2 heures chacune) de comportement couplé à des enregistrements de mouvement d'un membre anterieur, d'imagerie calcique, et d'electrophysiologie.

Impact sur les animaux

Les chirurgies prévues par le protocole impliquent des dommages osseux et tissulaires. En conséquence, les animaux peuvent être potentiellement exposés à la douleur combinée à une perte de poids, à l'immobilité ou à un comportement anormal. Avant, pendant et après la chirurgie, nous traitons ces problèmes potentiels par l'administration de médicaments analgésiques et anti-inflammatoires. La durée typique de récupération après une opération est de 1 à 2 jours, période pendant laquelle les animaux sont traités avec ces médicaments. La fixation crânienne sur la tête va initialement induire un stress chez l'animal et réduire très légèrement sa mobilité. Après que l'animal se soit habitué et afin de s’assurer que les souris boivent au cours des expériences de comportement, les souris seront restreintes en eau. Si il y a une réduction du poids corporel qui dépasse 15 % par rapport au poids initial, le souris est donné de l’eau tout de suite.

Devenir

Tous les animaux sont mises à mort après anaesthésie pour prélèvement d'organes et analyses microscopique des cerveaux. L'étude des cellules post-mortem nous permet d'identifier la localisation et l'identité des neurones qui ont été enregistrés pendant les expériences.

Remplacement

L'intégration des informations sensorimotrices pendant les perturbations sensorielles implique de multiples régions et réseaux cérébraux. Afin de comprendre le rôle des neurones dans le comportement moteur, il est donc primordial de réaliser des expériences sur animal vivant et libre de ses movement afin de conserver la structure et l’activité des réseaux neuronaux sous-jacents. : Il s’agit d’un projet de neurophysiologie intégrative qui ne peut être conduit que sur animal vivant.

Réduction

A fin de réduire le nombre d'animaux, cette étude d'imagerie in vivo est réalisée avec des implants chroniques. Une fois implantés, les animaux sont maintenus en vie et utilisés pour de nombreuses sessions d'enregistrement. L'optimisation des soins aux animaux contribue en outre à l'utilisation d'animaux pour plusieurs sessions d'enregistrement. Enfin, nous utiliserons les tests statistiques appropriés afin d’obtenir des résultats exploitables à partir du plus petit nombre d’animaux possible.

Raffinement

Les animaux sont gardés dans des cages dans l'animalerie avec leurs congénères. Les cages seront enrichies de roues de course et des rouleaux pour se cacher. Les souris seront maintenues avec nourriture ad libitum. Leur état général sera surveillé de façon quotidienne pendant toute la durée du protocole. Pour éviter toute souffrance, tout signe de douleur, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé avec des analgésiques et anti-inflammatoires. Une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. La surveillance régulière de l'animal permettra d'arrêter toute procédure expérimentale en cas de signes d’anxiété ou de souffrance définis dans l’échelle d’évaluation.

Choix des espèces

La souris a été choisie car nous pouvons utiliser des techniques génétiques qui ne sont pas possible avec d'autres espèces. Nous serons en mésure de mésurer et perturber l’activité dans le cerveau pendant une tâche motrice. Il s'agit de mammifères dont le fonctionnement du cerveau peut être comparé à celui de l'homme pour les questions abordées dans ce projet. Les animaux seront utilisés à partir de l’âge où structures cérébrales impliquées dans le mouvement sont maturées, au-déla de 30 jours après la naissance.

140 rattes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La seule intervention sur l'animal vivant décrite est un frottis vaginal quotidien pendant deux semaines, les rattes étant ensuite tuées pour prélever l'hypophyse et étudier la régulation de la fertilité femelle. Le porteur affirme que ce geste, bien réalisé, "n'induit pas de nuisance au-delà de l'acte de contention". Il indique retenir la ratte pour la régularité de ses cycles et la richesse de la littérature, aucun modèle in vitro ne recomposant selon lui ce cycle biologique complexe.

Objectifs

Chez le mammifères dont l’espèce humaine, la fonction de reproduction est contrôlée par l'axe gonadotrope, constitué par l'hypothalamus, l'hypophyse et des gonades. Dans l'hypophyse, les cellules gonadotropes jouent un rôle essentiel dans le contrôle de la fonction de reproduction. En effet, ces cellules intègrent différents signaux venus de l'organisme et secrètent en réponse deux hormones, la LH (hormone luteinisante) et la FSH (hormone folliculo stimulante) qui régulent les fonctions gonadiques et donc la fertilité. L'un des régulateurs majeurs de la fonction des cellules gonadotropes est le neuropeptide hypothalamique GnRH, mais il est maintenant bien décrit que les cellules gonadotropes sont sensibles à de très nombreux signaux comme les hormones sexuelles secrétées par les gonades, faisant de ces cellules de véritables plateformes d'intégration de signaux. De plus, le cocktail de stimulation que reçoit les cellules gonadotropes varie fortement au cours de la vie des mammifères, entraînant des modifications de secrétions des hormones gonadotropes. Cela permet la mise en place des étapes clefs de la vie reproductive comme la puberté ou le déroulement des cycles sexuelles chez les femelles. Cette stimulation complexe, associée à la complexité structurelle de l'hypophyse, composée de 6 types cellulaires endocrines chez les rongeurs, a cependant longtemps représenté un frein à l'étude des mécanismes moléculaires de l’intégration par les cellules gonadotropes. Etudier ces phénomenes complexes et dynamiques dans des modèles de cellules en culture est cependant difficile : Les modèles de cellule en culture, par nature réductionniste, peinent en effet à cette complexité physiologique, et les résultats obtenus à partir de ceux-ci traduisent donc mal les processus se déroulant dans l'animal vivant. L’avènement récent des techniques en cellules uniques représente une opportunité extra-ordinaire pour étudier les mécanismes régulant la fonction gonadotrope dans toutes leurs complexités physiologiques, dans l’animal vivant. Ces nouvelles techniques de pointe permettent, en effet, de dissequer les méchanismes moléculaires au sein même des tissus, dans toute leur complexité biologique. Ce projet permettera donc de comprendre comment les cellules gonadotropes régulent la fertilité alors que celle-ci décline dans l’espèce humaine et chez de nombreux animaux d’élevage.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait, à cours terme, permettre de mieux comprendre comment les cellules gonadotropes intègrent une signalisation complexe et changeante afin de réaliser sa fonction de régulation hormonale de la fertilité femelle. Ce projet permettra de découvrir de nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans la régulation de la fonction gonadotrope et donc dans la régulation de la fertilité chez les mammifères. A plus long terme, les résultats de ce projet pourraient permettre d’identifier de nouvelles causes génétiques des infertilités humaines, un sujet de préoccupation émergent dans nos sociétés modernes.

Procédures

Le projet n'inclu qu'un seul type d'intervention sur l'animal vigil: La réalisation de frottis vaginaux quotidien pendant deux semaines. Chaque frottis est réalisé en moins d'une minute (environ 10 à 30 secondes)

Impact sur les animaux

Ce projet ne fait intervenir qu’une étape, hors mise à mort, pouvant induire un éventuel inconfort : la réalisation des frottis vaginaux. Ceux-ci seront cependant réalisés par un personnel compétent qui veillera à réduire l’inconfort des animaux. Ce geste, quand il est réalisé dans les règles de l’art, n’induit pas de nuisance au-delà de l’acte de contention.

Devenir

La finalité de l'expérience est de prélever l'hypophyse. Ceci ne peut être fait sur animal vivant. L'ensemble des animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure pour permettre le prelevement de l'hypophyse.

Remplacement

Les modèles cellulaires in vitro ne peuvent se substituer aux modèles animaux dans ce projet car nous nous interessons à des phénomenes physiologiques qui se déroulent aux cours d'un cycle biologique complexe, impossible à recapituler fidelement in vitro. Le modèle rat est particulierement approprié car c'est le modele animal dans lequel les connaissances en physiologie de l'axe gonadotrope sont les plus pointues d'un part, et d'autre part, les rattes présentent des cycles oestriens extrêmement répétables et réguliers, en comparaison d'autres especes comme la souris. Ceci permet de selectionner des animaux de façon fiable et donc de réduire le nombre d'animaux utilisé.

Réduction

Comme indiqué si dessous, la robustesse des événements physiologiques programmant la fertilité femelle chez la ratte permet de limiter le nombre d'animaux necessaire pour obtenir des résultats significatifs. De plus, les echantillons seront analysés par des methodes de pointe en cellule unique permettant l'acquisition d'une grand nombre de donnée sur le même echantillon. Cela permettra donc de réduire le nombre d'échantillon necessaire. Un projet pilote montre que trois hypophyses prélévées au même moment du cycle donnent une representation statistiquement fiable des evenements moléculaires qui se déroulent à ce moment précis. Des expériences de confirmation des résultats ainsi acquis seront cependant necessaire et necessiteront des animaux supplementaires. Notre recul expérimental nous permet de penser que, pour les verification de l'expression des genes et des proteines, 3 hypophyses par groupe de ratte seront suffisantes. Pour les expériences necessitants des cultures primaires de cellules hypophysaires, notre experience montre que les résultats sont fiables à partir de 10 rattes par culture primaire.

Raffinement

Le projet ne fait pas intervenir de pratique invasive générant des dommages sur animaux vivants. Les frottis vaginaux necessitant toutefois une contention, les animaux seront accoutumés quotidienement à la contention et par simulation d’un frottis pendant une semaine avant le début des vrais frottis. Conditions d'environement: Les rattes seront hébergées dans les conditions suivantes: deux femelles par cage, cage enrichie de materiel de nidification et de rongeage, nourriture et eau ad libitum, cycle jour nuit 12H-12H. Points limites: L'aspect global des animaux sera évalué quotidiennement (pelage propre, présence de blessure...). En cas de signe de déterioration de l'état de santé (perte de poinds, pélage sale, prostration), les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Comme déja indiqué, le rat est une espèce de choix pour l'étude des processus de régulation neuro-hormonale de la fertilité femelle chez les mammifères de part : 1) la régularité des cycles sexuels et 2) par l'existence d'une bibliographie étendue sur le sujet. Nous utiliserons des rattes femelles adultes de 8 semaines puisque nous nous intéressons à la régulation du cycle estrien qui se met en place après la puberté (7-8 semaines chez le rat Wistar)