Recherche fondamentale

270 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections de cytokines inflammatoires, dont jusqu'à six injections directement dans le liquide céphalo-rachidien au niveau du tronc cérébral, pour provoquer une allodynie, une douleur déclenchée par un contact normalement indolore, puis subissent des tests comportementaux avant d'être tués. Le porteur reconnaît qu'il lui est "impossible de soulager la douleur de ces animaux le temps de l'expérience", puisque c'est la douleur elle-même qui est étudiée. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne remplace l'étude in vivo de l'intégration de la douleur.

Objectifs

La douleur est un processus physiologique nécessaire à la survie : elle prévient l’organisme d’un danger imminent et permet la mise en œuvre de réponses adaptées qui visent à en limiter les effets délétères. Cependant, lorsque la douleur est chronique ou persistante, elle devient alors pathologique car elle n’offre plus aucun avantage mais provoque au contraire une extrême souffrance. C’est notamment le cas de douleurs inflammatoires qui aparaissent suite à une inflammation du système nerveux périphérique ou central. Les traitements disponibles ne sont souvent que partiellement efficaces et peuvent s’accompagner d’effets secondaires importants. Il est donc essentiel de découvrir de nouveaux traitements, et pour ce faire, de déchiffrer les mécanismes responsables de l’apparition de ces douleurs chroniques. Parmi les symptômes douloureux, nous nous intéressons à l’allodynie qui correspond à une douleur provoquée par une stimulation normalement non douloureuse qui peut être déclenchée suite à l’inflammation. En condition physiologique, les informations non douloureuses et douloureuses ne sont pas intégrées au même niveau du tronc cérébral, permettant ainsi de dissocier distinctement les deux modalités sensorielles (tact et douleur). Cependant, en condition pathologique, comme dans le cas de l’allodynie, le tact va être capable de devenir douloureux. Ce phénomène provoque l’activation de plusieurs populations neuronales, mais fait également intervenir les astrocytes, un sous-type de cellules gliales. Cependant, les mécanismes astrocytaires impliqués dans l'apparition de l’allodynie en condition inflammatoire au niveau trigéminal sont peu connus. Les résultats obtenus ont permis notamment de mettre en évidence que l’inflammation induisait une réactivité astrocytaire ainsi qu’une diminution des canaux astrocytaires. Cependant, la question de comment l’inflammation est capable d’entrainer cette dérégulation de canaux astrocytaires, ainsi que la réactivité astrocytaire reste toujours en suspend. Diverses études démontrent que certaines molécules libérées, dont les cytokines, sont capables d’activer les astrocytes. C'est pourquoi nous nous intéresserons à savoir quelle cytokine induit un dysfonctionnement et de déterminer si son blocage a des effets bénéfiques.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes centraux induisant la dérégulation d'un canal astrocytaire, impliquée dans les phénomènes d’hypersensibilité douloureuse. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux douleurs chroniques, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 3 : • Injections intra-péritonéales : ces injections(

Impact sur les animaux

Injectant des cytokines pro-inflammatoires chez l’animal, nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse. Cependant, puisque nous travaillons sur la douleur, il nous est impossible de soulager la douleur de ces animaux le temps de l’expérience. Les résultats obtenus des travaux du laboratoire ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux mise à part le développement d'une allodynie faciale suite à une stimulation tactile. La douleur occasionnée à l’animal est estimée comme étant « modérée » (retrait de la face). Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles consistent en la mesure d’un seuil avec possibilité d’échappement et n'entrainent pas de réactions visibles autres que le retrait moteur de la zone stimulée. Les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer leurs gestes habituels.

Devenir

A la fin des procédures , les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort: pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une analyse immunohistochimique, protéique ou électrophysiologique.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique.

Réduction

Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrons rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (lésion de notre région d’intérêt lors des injections intracisternales, problème au moment de la dissection, mauvaise apprentissage lors de l’habituation aux tests comportementaux…). Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc il est préférable de prévoir 10 animaux maximum par groupe: habituation, injections médullaire et systémique,comportement, stimulation et perfusion. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 6 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre d'animaux suffisant et nécessaire. Afin de limiter le nombre d'animaux, les études comportementales et immunohistochimiques seront réalisées avec les mêmes groupes.

Raffinement

Les animaux seront stabulés dans des pièces ventilées, thermorégulées (22±1 °C) avec hygrométrie contrôlée. Le cycle de lumière est inversé (lumière de 19h à 7h). L’accès à la nourriture et à l’eau se fait ad libitum et le changement de la litière se fait 2 fois par semaine. Les rats sont placés 3 par cage de 800 cm2 (enrichissement social). Les animaux seront utilisés avant d'atteindre un poids supérieurs à 300g.Des rouleaux de cartons sont ajoutés pour pouvoir se cacher et grignoter. La surveillance des animaux se fera quotidiennement par les personnes compétentes du laboratoire conformément à la législation en vigueur. L’expérimentation sera réalisée à J+7 après réception (période d’adaptation) et après 5 jours d’habituation pour les expériences encomportement. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. Les animaux seront notamment surveillés quoditiennement lors des différentes procédures. Le poids est mesuré quotidiennement. Si la perte de poids excède 15% du poids initial, les animaux seront mis à mort par injection intrapéritonéale létale de pentobarbital (150 mg/kg). Nous regarderons également l’apparence et le comportement (poils ébouriffés, animal prostré, posture anormale, vocalisations, agitation, toilettage). S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation.

Choix des espèces

La souche de rat Sprague-Dawley est couramment utilisée et est la plus adaptée pour les études comportementales dans le domaine de la douleur en santé humaine. Nous utiliserons des animaux entre 3 à 5 et de 5 à 8 semaines (de 3 à 8 semaines), pour comparer avec les données du laboratoire.

320 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une pompe est implantée chirurgicalement sous anesthésie pour administrer en continu des molécules candidates, avec des prélèvements de sang à la jugulaire sous anesthésie, dans le cadre du développement de médicaments. Le porteur présente cette pompe comme un "raffinement" évitant les injections répétées, tout en reconnaissant des douleurs post-opératoires pendant 48 heures et un risque d'infection au site d'incision. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reflète l'absorption et le métabolisme d'une molécule dans un organisme vivant.

Objectifs

La recherche et le développement de nouveaux médicaments impliquent la réalisation de tests visant à caractériser les molécules candidates et leur comportement après administration chez l'animal que ce soit dans des études de pharmacocinétique ou d'efficacité. La réalisation de ces tests nécessite parfois d'effectuer des administrations répétées de la molécule à étudier. Les pompes osmotiques sont des pompes miniatures pouvant être implantées chez la souris, le rat ou d'autres animaux de laboratoire lors de protocoles de recherche expérimentale. Ces mini-pompes permettent d’administrer des médicaments, des hormones et d'autres substances à l’étude à des débits continus et contrôlés sur une période allant d'un jour à six semaines, sans recours à des branchements externes, ni à des manipulations fréquentes. Leur fonctionnement automatisé libère le personnel de laboratoire des astreintes liées aux injections répétées durant la nuit ou pendant le week-end et permet de raffiner les techniques d'administration des molécules. Ce projet a donc pour objectif de raffiner ces administrations grâce à la pose d'une pompe Alzet®, cette dernière permettra l'administration en continue de la molécule chez les animaux en évitant par la suite des contentions et des injections répétées, ce qui n'affectera pas leur bien-être.

Bénéfices attendus

L'ajout d'un dispositif à administration lente en continu permettra de raffiner les modèles animaux en réduisant les manipulations / contentions chez l'animal, ainsi que les éventuelles administrations répétées de molécules. L'ensemble de ces données aident à la prédiction du comportement d'un médicament lors d'une administration chez l'Homme.

Procédures

Pour la pose de la pompe Alzet® les animaux seront anesthésiés puis subiront une procédure chirugicale (durée d'intervention 10 minutes pour les procédures 1 & 3 et 20 minutes pour la procédure 2). Les animaux seront anesthésiés pour effectuer les prélèvements de sang plusieurs fois au cours des procédures, l'animal sera alors endormi puis prélevé à la veine jugulaire (durée d'intervention 5 minutes).

Impact sur les animaux

L'installation de la pompe chez l'animal peut entraîner des douleurs post-opératoires les premières 48h. Malgré l'aseptie rigoureuse pratiquée lors de l'étape chirurgicale, il est également possible que l'animal présente de légères complications (infections) au niveau de la zone incisée. Une désinfection locale de la plaie sera alors mise en place (Vétédine) et l'animal placé sous surveillance renforcée.

Devenir

Tous les animaux des procédures seront mis à mort car ils auront subi une administration de molécules et ne pourront donc pas être inclus dans un nouveau protocole expérimental. De plus, pour la plupart des tissus seront prélevés afin d'analyses complémentaires.

Remplacement

La recherche et le développement de nouvelles molécules thérapeutiques impliquent la réalisation de tests chez l’animal pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro permettant d'intégrer et de refléter les caractéristiques d'absorption, de distribution, de métabolisme et d'élimination d'une molécule donnée au sein d'un organisme vivant. Il existe cependant des modèles cellulaires permettant d'évaluer la cytotoxicité, l'absorption et le métabolisme de molécules in vitro. Ces tests permettent d'effectuer un premier criblage de molécules, mais doivent ensuite être confirmés chez l’animal. - Des premières données concernant la pharmacocinétique, le métabolisme et la tolérance des molécules in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme). L'ensemble de ces données aident à la prédiction du comportement d'un médicament lors d'une administration chez l'Homme.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire dans chaque lot a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour pouvoir interpréter et valider les résultats d'expérience.

Raffinement

La pose d'une pompe va permettre un meilleur confort de l'animal puisqu'il implique une réduction du nombre de contentions et d'administrations répétées chez ce dernier. Les expérimentateurs qui effectueront la chirurgie de la pose de la pompe sont exclusivement des personnels formés à la chirurgie et maîtrisent les bons gestes garantissant l'aseptie pendant la chirurgie ainsi que le bien-être animal en pré, per et post opératoire. Le milieu sera enrichi dans les cages (igloo, bûchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le poteniel de souffrance et /ou de détresse chez les animaux, des points limites précis et spécifiques ainsi que des critères d'arrêt des souffrances seront mis en oeuvre tout au long du projet.

Choix des espèces

Les multiples homologies de séquences entre le rat, la souris et l'Homme rendent ces modèles prédictifs du comportement des molécules après administration. Il est ainsi d'un grand intérêt pour le criblage de nouvelles molécules. De plus, ces espèces présentent certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (4-10 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. Il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont ainsi adaptés aux études d'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques.

16 mini-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumis à un régime gras, sucré et carencé destiné à provoquer une stéatose hépatique, ils subissent des prélèvements sanguins hebdomadaires pendant deux mois et trois biopsies du foie sous échographie. Le porteur reconnaît des douleurs intercostales liées à la biopsie, un régime peu appétant pouvant entraîner une perte de poids et un hébergement individuel source de stress. Il affirme que ces processus "ne peuvent pas être reproduits in vitro" et retient le porc pour sa proximité digestive avec l'humain.

Objectifs

L’objectif du projet est l’évaluation de l’induction nutritionnelle d’une stéatose hépatique chez le mini-porc par le biais d’un régime riche en lipides et sucre et dépourvu de choline.

Bénéfices attendus

Les bénéfices qui découleront de ce projet sont la contribution à la compréhension de la stéatose hépatique dans des maladies chroniques de type métabolique comme l’obésité ou le syndrome métabolique. Le projet permettra également la mise en place d’un modèle animal permettant l’étude approfondie de cette dérégulation métabolique ainsi que de possibles interventions nutritionnelles pour la prévenir ou faire régresser.

Procédures

Chaque semaine 1ml de sang en artère et en veine porte seront prélevés sur tous les animaux (16 au total) pendant 8 semaines (2 mois) pour suivre le statut physiologique et la mise en place de la stéatose hépatique. Le volume total prélevé sur l’ensemble du protocole sera d’environ 16 mL par animal. Ce prélèvement durera moins d'une minute pour chaque animal. Une biopsie hépatique (50 mg) sous échographie sur chaque animal sera réalisée à 3 reprises : T0, 1 et 2 mois après le début du régime expérimental. Ce prélèvement durera pour chaque animal environ 15 min.

Impact sur les animaux

Des douleurs intercostales peuvent être ressenties par l’animal suite à la réalisation de la biopsie hépatique. Le régime riche en sucre et lipides, dépourvu de choline et à faible teneur en méthionine (choline-methionine deficient diet, CMD diet) nécessite une élaboration avec des ingrédients purifiés qui peuvent s’avérer peu appétant, et peuvent entrainer des refus en début de protocole et une perte de poids si ce comportement n’est pas suffisamment anticipé. En cas d’évolution rapide de la stéatose (vérification par biopsie) le protocole sera arrêté sans laisser les animaux évoluer vers la cirrhose, qui pourrait entrainer des complications plus importantes. Les animaux seront hébergés individuellement pendant toute la durée du protocole pouvant entraîner un stress pour l'animal.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la période expérimentale pour : 1) vérifier le bon positionnement des cathéters sanguins 2) réaliser des prélèvements tissulaires pour des études métaboliques.

Remplacement

La mise en place d’une stéatose hépatique fait intervenir de nombreux processus biologiques coordonnés et régulés, qui à ce jour ne peuvent pas être reproduits in vitro. Le porc présente un certain nombre de similitudes anatomiques et physiologiques avec l'homme. C’est la raison pour laquelle il est fréquemment utilisé comme modèle pour les études de nutrition. Le mini-porc permet de travailler sur des adultes (à stabilité pondérale) d'une taille compatible avec l'expérimentation animale. Il présente de plus l'avantage d'avoir un système digestif très proche de celui de l'Homme et d'accepter de manger tous types d'aliments. Les accès aux entrées et sorties vasculaires du foie est techniquement dangereux chez l’homme et bien que possible chez le rongeur, limité en termes de volume et taille des animaux.

Réduction

La réutilisation d’animaux issu d’un protocole précédent permettra de limiter le nombre d’animaux prévu dans le schéma expérimental : 8 animaux sur la première étude pilote ; 16 animaux si des ajustements ultérieurs sont nécessaires. Celui-ci est réduit à son minimum en tenant compte de la variabilité du principal paramètre mesuré (accumulation de lipides dans les échantillons de la biopsie), estimée à partir d’études réalisées avec un design expérimental similaire (Curtasu et al., Nutrients 2021). Cette variabilité est liée non seulement à la variabilité inter-individuelle des animaux, mais aussi à la qualité des prélèvements effectuées et à la précision des données obtenues par l’analyse biochimique. Ces aspects sont parfaitement maitrisés par les expérimentateurs du projet qui ont une longue expérience dans le domaine. L’approche développée sera peu invasive, et peu traumatisante pour l’animal. La douleur imposée aux animaux pendant l’expérimentation est liée essentiellement à la réalisation biopsie (qui évite l’euthanasie des animaux pour vérification de la stéatose à chaque point de contrôle).

Raffinement

L’approche développée sera peu invasive, et peu traumatisante pour l’animal. Pour réduire les douleurs liées à la réalisation de la biopsie hépatique, les animaux seront anesthésiés et la zone biopsiée sera préalablement tondue, désinfectée et également anesthésiée localement en sous-cutanée. Pendant la période de réveil, les animaux sont surveillés régulièrement (visite toutes les 2 h pendant la journée, vérification de saignement à l’endroit de la biopsie). L'évaluation de la gêne et de la douleur est faite par observation du comportement des animaux : reprise de l'alimentation, posture, vocalises, réactivité et la température corporelle. Le suivi de la prise alimentaire et du poids seront suivis régulièrement. Si une perte de poids supérieure à 20% est observée, Les animaliers et les responsables de l’étude effectueront une observation plus poussée de l’animal et renseigneront le tableau d’observation des points limites. Si 3 points limites notables ou 1 point limite grave sont observés, nous utiliserons l’arbre décisionnel, en discussion avec le personnel de l’animalerie, afin de décider si l’animal sera soigné ou euthanasié. Pendant toute la durée de la période d'expérimentation, les animaux seront hébergés dans des cages au sol de taille réglementaire avec des copeaux de bois comme litière leur permettant de réaliser une activité de fouissage, et avec des parois latérales en plexiglass pour que les animaux puissent se voir et interagir entre eux. Leur environnement est enrichi à l’aide d’une chaîne en métal fixée sur les parois et de ballons. La pièce est à température régulée. Les animaux ont libre accès à l'eau.

Choix des espèces

Le porc présente un certain nombre de similitudes anatomiques et physiologiques avec l'homme. C’est la raison pour laquelle il est fréquemment utilisé comme modèle pour les études de nutrition. Le mini-porc permet de travailler sur des adultes (à stabilité pondérale) d'une taille compatible avec l'expérimentation animale. Il présente de plus l'avantage d'avoir un système digestif très proche de celui de l'Homme et d'accepter de manger tous types d'aliments. Ces animaux sont utilisés dans la très grande majorité des études réalisées auparavant dans notre équipe de recherche, ce qui facilite la comparaison des données issues des diverses expérimentations réalisées. La procédure expérimentale est réalisée sur des animaux en fin de croissance (âge>10 mois), afin de bénéficier d'une stabilité pondérale pendant la totalité de la période d'intervention.

232 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime gras de douze semaines, elles subissent une constriction chirurgicale de l'aorte pour provoquer un stress cardiaque, puis des échocardiographies et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, afin d'étudier le rôle de l'enzyme PIKfyve. Le porteur indique que cette chirurgie a déjà entraîné 10 % de mortalité post-opératoire. Il affirme qu'aucune méthode alternative validée ne permet de se passer du modèle animal en physiopathologie cardiaque.

Objectifs

L’insuffisance cardiaque est un problème majeur de santé publique, dont la prévalence augmente fortement, principalement à cause de l’obésité et du diabète de type 2. Nos études précédentes ont montré que l’enzyme PIKfyve est un acteur majeur dans la progression de l’insuffisance cardiaque chronique. Cependant, son rôle exact reste à élucider, notamment dans le contexte de l’insuffisance cardiaque liée à l’obésité. L'objectif de ce projet est de comprendre le rôle de PIKfyve dans la progression de l'insuffisance cardiaque liée au diabète en utilisant un modèle de souris dont le gène PIKfyve est non-fonctionnel.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre le rôle de PIKfyve dans la progression de l'insuffisance cardiaque en lien avec l'obésité et le diabète de type 2, problématique majeure de santé publique, et permettra d'améliorer nos connaissances sur la progression de cette pathologie multifactorielle et complexe.

Procédures

Les animaux seront soumis à 6 interventions différentes: 1/ un régime riche en graisse afin d'induire un phénotype obèse et diabétique de type 2 (n=96, pendant 12 semaines); 2/ une procédure chirurgicale visant à réaliser une constriction de l'aorte afin d'induire un stress cardiaque (n=96, durée de l’intervention : 1h); 3/ une échocardiographie transoesophagienne afin de mesurer la fonction cardiaque des animaux (n=192, durée de l’intervention 15min); 4/ une mesure de la composition corporelle (n=192, durée de la procédure : 2min); 5/ un test de tolérance au glucose afin de mesurer le métabolisme glucidique (n=192, durée de l’intervention : 3h); 6/ un test de tolérance à l'insuline afin d'étudier la sensibilité des animaux à l'insuline (n=192, durée de l’intervention : 3h).

Impact sur les animaux

Le régime riche en gras induit un phénotype obèse et peut entrainer des difficultés de déplacement des animaux, l'apparition d'un diabète, le graissage du pelage des animaux, une polyurie/polydipsie. Par conséquent, les animaux soumis à un régime riche en gras auront un suivi plus précis avec des remplissages des biberons d'eau et changes de litières plus fréquents si nécessaire. La procédure chirurgicale de constriction transverse de l'aorte (TAC, ou aortic banding) peut entrainer une mortalité post-opératoire (précédemment observée à 10% de l'effectif). Afin de limiter la douleur occasionnée par la chirurgie, nous utiliserons un analgésique lors du protocole chirurgical. La lignée invalidée pour PIKfyve dans le cœur est une lignée déjà établie et qui a fait l'objet d’une étude rétrospective démontrant aucun effet néfaste chez la souris. L’échocardiographie transoesophagienne est réalisée sous anesthésie gazeuse et n’entraîne pas de nuisances pour l’animal. La mesure de la composition corporelle est réalisée sur animal vigile et acclimaté. Pour les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, les prélèvements sanguins sont réalisés au niveau de la veine caudale afin de limiter la douleur occasionnée à l'animal, à 2 semaines d'intervalle afin de garantir un repos suffisants aux animaux. Les volumes prélevés conformes aux BPL. Une surveillance sera assurée par un zootechnicien afin de s'assurer de l'absence de saignements après réintroduction des animaux dans les salles d'hébergement.

Devenir

Tout les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de réaliser les prélèvements d'organes nécessaires.

Remplacement

Quand cela est possible, le modèle animal sera remplacé par des techniques in vitro. Cependant, il n’existe à l’heure actuelle pas de méthode alternative validée permettant de s’affranchir du modèle animal pour les études de physiopathologie cardiaque.

Réduction

Le critère principal de jugement de la fonction cardiaque sera la mesure de la fraction d'éjection (EF) et de raccourcissement (FS) du ventricule gauche. Des données de la littérature nous permettent de prévoir que nos groupes expérimentaux doivent comporter 12 individus afin d’avoir une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les doublons expérimentaux seront évités, et des mesures strictes seront appliquées afin de réduire la douleur pendant les procédures expérimentales : anesthésie, tapis chauffant, monitoring global de l'animal, traitement analgésique après réveil et 24h après l'opération. Un suivi journalier est mis en place par un zootechnicien qualifié afin de détecter le plus précocement possible la souffrance éventuelle de l’animal, selon une grille de score établie. Les signes de douleur spécifiques de la souris seront surveillés, comme la prostration, perte de poids, absence de toilettage. Le franchissement de ces points limites précoces conduira à l’euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux obèses et diabétiques dont un gène a été rendu non-fonctionnel. A ce jour, seul le modèle de souris (Mus musculus) permet de réaliser ces études. Les animaux utilisés seront âgés de 2 mois, correspondant au stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature car ils sont les plus réceptifs à la procédure chirurgicale et au régime riche en gras.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections sous-cutanées d'hydrogels chargés d'anticorps puis des séances d'imagerie en fluorescence sous anesthésie, trois fois par semaine pendant 21 jours, pour comparer ce relargage continu aux injections classiques. Le porteur reconnaît que ces injections peuvent provoquer une inflammation locale, accentuée par les frottements sur le gel. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit la complexité d'un environnement sous-cutané et conclut que la souris est "nécessaire", l'intérêt annoncé étant une administration moins coûteuse.

Objectifs

L’objectif du projet est de démontrer une équivalence ou une amélioration à l'administration d’anticorps thérapeutique en utilisant une formulation à base d’hydrogels comme une alternative aux méthodes d’injections sous-cutanées actuellement utilisée en routine clinique.

Bénéfices attendus

A la fin de ces expériences, nous espérons pouvoir déterminer une méthode de relargage continue d’anticorps améliorée par rapport aux injections cumulées, offrant une nouvelle alternative moins couteuse.

Procédures

Injections sous cutanée des composées sur des souris anesthésiées, durée 1mn/souris, 1 fois seulement. Imagerie en fluorescence sur des souris anesthésiées, durée 1mn/souris. 3x/semaine pendant 21 jours.

Impact sur les animaux

L'injection sous cutanée des composées pourrait engendrer une inflammation locale. De plus les frottements et pressions sur les hydrogels pourraient accentuer potentiellement cette inflammation. Les effets indésirables potentiels de l'anesthésie sont une irritation des voies respiratoires et une légère tendance au spasme laryngé dû à l’âcreté du produit employé, une baisse de la pression artérielle et une augmentation de la fréquence cardiaque. Ces effets potentiels ont été pris en compte dans l'établissement des points limites.

Devenir

Les animaux ayant subi ces interventions ne pourront pas servir pour d'autres expérimentations et seront mis à mort.

Remplacement

Il n'existe pas de méthodes alternatives pour remplacer le présent projet. Les études in silico et in vitro ne permettant pas de reproduire les conditions permettant de récapituler la complexité d'un environnement sous-cutané. Le modèle animal est donc nécessaire pour récapituler le relargage sous-cutané des anticorps piégés dans des hydrogels.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire a été déterminé au minimum mais néanmoins suffisant pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente en tenant compte de la puissance du test statistique qui sera utilisé. De plus l'emploie d'un système d'imagerie en fluorescence du petit animal permettant un suivi dans le temps pour chaque animal, réduit le nombre d'animal requis et renforce la fiabilité des résultats.

Raffinement

Le protocole expérimental prend en compte l’impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour éviter toute souffrance animale. Les souris sont maintenues en groupe de 5 par cage pour maintenir une interaction sociale entre individus. L’environnement d’élevage est enrichi à l’aide de nids et de carrés de cellulose pour garnir ces nids. Si une souris présentait des symptômes traduisant l’apparition de douleurs (réduction de la réactivité, difficulté de locomotion, fourrure non entretenue, tendance à l'isolement) un traitement par un analgésique sera effectué. Des points limites ont été établis pour anticiper toute souffrance animale.

Choix des espèces

Les réplications de mouvement, frottements, pressions sur le gel qu’un humain pourrait avoir ne sont réplicables que sur un organisme vivant. La souris est l’espèce animal la plus propice pour ce type d’étude. De plus la souris est le modèle adéquat pour les raisons suivantes : - nombreux protocoles bien établis pour cette espèce - possibilité de comparaison de nos résultats avec ceux d’autres groupes utilisant des hydrogels de formulations différentes Des souris adultes seront utilisées car le système d'hydrogel s'adresse à ce type de populations.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont mises à jeun, subissent des prélèvements sanguins, des épreuves de course et une mesure de force musculaire sous anesthésie, avant la mise à mort pour prélever leurs tissus. Le porteur mène une étude fondamentale sur un axe de signalisation mitochondrial et renvoie au conditionnel d'éventuelles orientations thérapeutiques. Il revendique un "besoin urgent" d'explorer cet axe in vivo et affirme n'avoir "pas d'autre choix" qu'un "organisme entier".

Objectifs

Dans les cellules qui composent notre corps, il existe des petites centrales énergétiques (les mitochondries) qui fournissent une grande partie de l’énergie nécessaire au fonctionnement de notre organisme. Or, des dysfonctionnements de ces mitochondries dans les muscles, le cerveau ou le système immunitaire sont responsables de nombreuses pathologies chez l’homme. Lorsqu’elles sont endommagées ou bien stressées, les mitochondries transmettent des signaux à la cellule qui adapte alors son métabolisme pour compenser le dysfonctionnement des mitochondries. C’est grâce à un axe impliquant 3 protéines (OMA1, DELE1 et HRI) que les mitochondries affaiblies communiquent avec la cellule pour qu’elle s’adapte. Jusqu’à présent, cet axe OMA1-DELE1-HRI n’a été exploré in vitro que dans des lignées de cellules en culture qui paradoxalement utilisent peu les mitochondries pour produire de l’énergie contrairement aux tissus tels que les muscles où la production d’énergie dépend largement des mitochondries. Il existe donc un besoin urgent d'explorer le rôle physiologique de cet axe OMA1-DELE1-HRI in vivo, notamment dans le muscle, et de mieux caractériser ses modes spécifiques de régulation et d'activation. C'est ce que nous proposons de réaliser dans ce projet. Ainsi, nos résultats fourniront de nouvelles informations sur les mécanismes impliqués dans la restauration du bon fonctionnement cellulaire suite à un stress mitochondrial.

Bénéfices attendus

L'hypothèse centrale de ce projet de recherche est que l'axe OMA1-DELE1-HRI contrôle l’équilibre énergétique du muscle squelettique en régulant l’activité métabolique, et contrôle ainsi les performances musculaires qui se dégradent au cours du vieillissement ou dans des maladies résultant d'un dysfonctionnement mitochondrial, telles que les myopathies mitochondriales. Bien qu’il s’agisse d’une étude fondamentale, l’exploration de l’axe OMA1-DELE1-HRI dans le contrôle de l’équilibre énergétique du muscle squelettique pourrait permettre de déterminer de nouvelles orientations thérapeutiques pour lutter contre les myopathies mitochondriales ainsi qu’améliorer les performances musculaires qui diminuent lors du vieillissement.

Procédures

Les animaux subiront les interventions suivantes : - Mise à jeun de 16h ou 4h, 7 prélèvements d’une très faible quantité de sang, de 20 secondes, sur 2h, 1 fois dans la vie. - Epreuves de course, 1 fois dans leur vie. L’habituation dure de 10 min à 15 min au fil des 4 jours ; la mesure de la vitesse maximale aérobie environ 30 min, l’endurance environ 1h30 et la mesure du lactate dans le sang après une épreuve d’endurance à nouveau environ 1h30. Pour la mesure du lactate dans le sang, les animaux subiront deux prélèvements d’une très faible quantité de sang, de 20 s, l’un avant et l’autre après la course. - Mesure de force musculaire par stimulation musculaire sous anesthésie générale avec analgésie forte, 1 fois dans leur vie : chaque intervention durera au maximum 1h, soit 2h30 de manipulation au total en comptant depuis la première injection d’analgésique et jusqu’au réveil complet. Toutes ces interventions seront séparées a minima de 4 jours.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir un stress léger lié à la contention, aux injections ou aux prélèvements, ou modéré lors des épreuves de course. Les injections et prélèvements pourront causer une douleur légère et brève aux animaux. A l’issue de la mesure de force sous anesthésie, les animaux pourraient ressentir une douleur légère à modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires à de nombreuses analyses histologiques, biochimiques et moléculaires.

Remplacement

Le but de ce projet est d'explorer le rôle physiologique de l’axe OMA1-DELE1-HRI dans la réponse intégrée au stress médiée par les mitochondries in vivo, cela dans le muscle squelettique. Pour évaluer la conséquence de l’absence de Dele1 sur la fonction et la physiologie musculaire notamment suite à un effort, nous n’avons pas d’autres choix que d’étudier un organisme entier, ici la souris, dans un contexte de délétion génétique dont nous avons pu établir la pertinence.

Réduction

Grâce à nos connaissances accumulées sur les tests d’efforts chez les souris et les études ex vivo réalisées, nous pourrons optimiser le nombre de lots et le nombre d’animaux par lot pour les réduire autant que possible, tout en gardant des effectifs permettant d’atteindre une pertinence statistique. Nous utiliserons pour cela des analyses statistiques adaptées.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, par groupe social stable, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Le comportement des mâles est particulièrement surveillé et en cas de bagarre grave amenant à des plaies, le mâle agresseur est séparé de ses congénères et ses congénères sont pris en charge de manière adaptée (mise à mort compassionnelle si blessures trop graves, soins dans les autres cas). En dehors de ce cas, seuls les mâles reproducteurs seront maintenus isolés. Pour l’optimisation de la fonction locomotrice des animaux réalisant des tests de course, nous rajoutons une grille amovible sous le couvercle des cages. Le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft ou du coton, un bâton de bois à ronger et une maison en carton. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Tous les gestes seront réalisés avec une attention très forte au respect physique et émotionnel des animaux. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice, au besoin pharmacologique, et en cas d'absence de bénéfice, nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.

Choix des espèces

Grâce à la génération de délétion génétique de protéines d’intérêt par manipulation du génome, la souris est un mammifère particulièrement pertinent pour l’étude de l’implication d’une protéine dans les mécanismes physiologiques et physiopathologiques. La souris présente par ailleurs des atouts zootechniques (temps de reproduction court, petite taille, effectifs importants) et techniques (familiarité et facilité de manipulation). Nous utiliserons des animaux Dele1-KO et WT issus de mêmes portées entre l’âge de 2 à 9 mois. Ces âges seront pertinents pour les études réalisées car c’est à cet âge que les capacités physiques de la souris sont les meilleures.

2 400 animaux non-humains, 1 000 rats, 800 cochons d'Inde et 600 souris, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sur des animaux sains, on administre par de multiples voies des molécules de clients dont le porteur admet ignorer la nature et les effets, avant la mise à mort pour prélever des organes. L'objet est un service payant d'évaluation pharmacologique dépendant de la demande de partenaires commerciaux. Le porteur affirme que le recours à l'animal est "indispensable" faute d'alternative in vitro donnant les propriétés pharmacodynamiques.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets pharmacodynamiques ou les effets indésirables potentiels de nouvelles molécules. Le type d’étude ex vivo envisagé intervient précocement dans le développement préclinique de candidats médicaments. Réalisées en grande majorité sur des animaux sains, ces études permettent une première sélection de molécules d’intérêt sur un tissu cible avant leur évaluation dans des modèles physiopathologiques in vivo, plus consommateurs d’animaux. Ces études permettent la quantification des effets pharmacologiques ou indésirables de différentes molécules pour les comparer sur différents paramètres. Elles ne s’inscrivent pas dans l’établissement de données de sécurité (toxicologie) avec lesquelles elles ne sont pas redondantes. Les molécules testées par le biais de ce projet le sont majoritairement dans notre champ d’expertise que sont les pathologies de l’appareil génito-urinaire et de l’appareil digestif. Cependant, pour la nécessité de partenaires commerciaux, d’autres champs d’expertise peuvent être explorés occasionnellement.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement sur le marché pour soigner les maladies de l’appareil génito-urinaire ou digestif principalement.

Procédures

Les animaux seront principalement soumis à des administrations de composés (voies et fréquence dépendantes du protocole expérimental). Les voies per os, intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intravésicale et intradermique seront utilisées. Les animaux seront donc peu manipulés.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux. Il sera attendu d’observer chez l’animal toutes nuisances dues à la manipulation, contention et administration de composés (stress possible, douleur possible de l’aiguille, gêne lors de la contention, réveil difficile suite à une anesthésie…).

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort car des prélèvements d’organes sont nécessaires.

Remplacement

Les expérimentations in vitro permettent de connaitre les propriétés physicochimiques de la substance étudiée mais en aucun cas ses propriétés pharmacodynamiques. Ainsi le recours à l’expérimentation animale est indispensable pour une évaluation pharmacologique des effets indésirables ou pharmacodynamiques potentiels des candidats médicaments.

Réduction

Dans le cas d’études fonctionnelles ex vivo et selon la nature du tissu prélevé, plusieurs fragments d’un même tissu peuvent être analysés. Ainsi, selon l’organe cible prélevé, un animal peut fournir plusieurs fragments et limiter ainsi le nombre d’animaux utilisés. Les animaux seront manipulés par du personnel compétent limitant ainsi la douleur et le stress des animaux lors des administrations par exemple. Dans le cas d’études avec analyse statistique, du fait de notre expérience, le nombre de 10 animaux par groupe expérimental est le minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement exploitables, principalement dû à la variabilité interindividuelle des réponses étudiées.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement (tunnel, igloo, carré de coton…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de points limites à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure… Les animaux seront manipulés par du personnel compétent limitant ainsi la douleur et le stress des animaux lors des administrations par exemple. Toute procédure nécessitant une anesthésie sera réalisée avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps, hydraté (accès plus facile à l’eau de boisson si nécessaire, réhydratation par administration de liquide physiologique en sous-cutanée, en gavage…) et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Il est admis qu'il existe des différences entre les espèces en ce qui concerne la sensibilité pharmacodynamique. Le choix de l’espèce sera donc fonction du mécanisme et/ou cible du candidat médicament. Il sera dépendant de la demande des clients. Nous utiliserons principalement des animaux adultes et matures (i.e. âgés d’au moins 6 semaines pour le rat et la souris et pesant au moins 250-300 g pour le cobaye). Très exceptionnellement des souris ou rats non matures (i.e. après sevrage et avant la puberté) pourront être utilisés. En effet, chez ces animaux l’axe hypothalamo-pituito- gonadique n’est pas encore fonctionnel donc les taux d’œstrogènes endogènes sont extrêmement faibles. Une autre méthode aurait été d’utiliser des femelles ovariectomisées mais il nous semble plus souhaitable d’éviter un traitement chirurgical à des animaux.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour une myopathie qui reste sans symptômes marqués, elles subissent des tests de force, des courses jusqu'à épuisement contraintes par de petits chocs électriques et des prélèvements sanguins répétés, avant la mise à mort pour prélever les muscles. Le porteur évalue deux thérapies et attend du projet de "premières preuves de concept" pour de futurs patients. Il écarte le modèle cellulaire, qui n'évalue pas la contractilité du muscle, et juge l'évaluation in vivo "indispensable".

Objectifs

Les cavéolinopathies sont des maladies rares du muscle associées à de la faiblesse, des crampes et des douleurs musculaires chez les patients. Actuellement, aucun traitement n’existe. Le but de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique de deux thérapies, capables d’améliorer les fonctions motrices de souris atteintes d’autres maladies du muscle et présentant des symptômes similaires.

Bénéfices attendus

Ce projet pourra fournir les premières preuves de concept pour soigner des patients atteints d'une maladie rare du muscle. Elle permettra, en outre, de mieux comprendre cette maladie et les acteurs impliqués.

Procédures

Des tests de force non invasifs et durant 1 minute au maximum seront réalisés une fois par semaine entre 7 et 12 semaines. Chacun de ces tests sera réalisé 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 mins. Un autre test de fonction motrice consistant à faire courir la souris jusqu'à épuisement sera réalisés entre 1 et 3 fois durant la période de test des animaux et durera au maximum 1h40. L'animal sera également laissé libre dans une cage pendant 12h afin d'étudier ses mouvement spontanés. Des prélèvements de sang seront effectués toutes les deux semaines au maximum et ne dépasseront pas 10% du volume total de l'animal. Durant ces prélèvements, les souris seront maintenues dans un tube pendant moins de 5 mins afin d'avoir accès à leur queue pour la prise de sang. Des tests cardiaques seront réalisés sur des souris anesthésiées au cours de la même expérience, afin de limiter le nombre d'anesthésies. Ces tests dureront au maximum 30 mins. Un test final sera effectué sur souris anesthésiées précédant l’euthanasie des animaux pour mesurer la force musculaire des souris. Ce test dure au maximum une heure. Une biopsie auriculaire durant moins de 2 mins sera effectuée à 3 semaines afin d'identifier les animaux ainsi que leur mutation grâce à l'ADN qui sera extrait de cette biopsie.

Impact sur les animaux

Il est attendu que les animaux n’aient pas de symptômes cliniques sévères. Les nuisances causées par les différents tests sont la contention temporaire de l’animal, la chute de l’animal dans une cage remplie de litière, l’extension de l’animal par tirement progressif de la queue par l’expérimentateur, l’isolement de l’animal dans un cage spéciale pendant 12 h, la contrainte à la course par délivrance de petits chocs électriques et l’anesthésie générale de l’animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issu des tests afin de récolter les muscles nécessaires aux analyses moléculaires et d'évaluer à une échelle plus petite les effets potentiellement bénéfiques des thérapies.

Remplacement

Le projet consiste à évaluer l'effet bénéfique de deux thérapies sur le muscle et la fonction cardiaque. Malheureusement, l’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni sur l’ensemble de l’organisme. Evaluer les fonctions motrices et la force musculaire in vivo est indispensable pour déterminer l'efficacité d'un traitement contre des myopathies. Le modèle murin est suffisament proche physiologiquement et structurellement pour étudier la physiopathologie ainsi qu'une potentielle amélioration des symptômes dans le cadre d'une thérapie.

Réduction

La grande majorité des tests étant non invasif, il est possible de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. Les tests histologiques et moléculaires seront effectués sur les mêmes animaux après euthanasie. Ces deux points nous permettent de réduire drastiquement le nombre d'animaux. Le nombre d'animaux a été choisi à partir des données présentes dans la littérature, ainsi que de façon à pouvoir détecter une différence statistiquement significative entre les animaux malades, sains et traités.

Raffinement

Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage avant d'être hébergés en groupe. Chaque cage sera enrichie avec des nids de chanvre ainsi que du carton, pour permettre aux souris de ronger. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 1 à 2 fois par semaine. Dès lors qu’une perte de poids sera notée, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. L’animal sera sorti de la cage à l’aide d’un tube ou les mains du manipulateur disposées en coupe pour réduire leur stress. Lors de l'évaluation des fonctions cardiaques sous anesthésie, une crème ophtalmique sera appliquée pour éviter l’assèchement des cornées et la phase de réveil s’effectuera sous une lampe chauffante dans une cage où l’animal sera seul, puis l’animal sera replacé dans sa cage avec ses congénères. Durant les mesures de force, l'animal sera anesthésié et analgésié afin d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. Pour chaque anesthésie, la température corporelle de l'animal sera maintenue au moyen d'une plaque et d'une lampe chauffante. Pour chaque expérience de phénotypage, l'animal sera tout d'abord familiarisé avec le matériel pour minimiser autant que possible son stress.

Choix des espèces

Le modèle murin utilisé reproduit les problèmes de dégénérescence de fibres musculaires retrouvés chez les patients. Les souris malades ne présentent cependant pas de symptômes cliniques importants et peuvent vivre aussi longtemps que des souris saines sans être handicapées au quotidien. Dès 8 semaines, on retrouve des défauts de fibres musculaires, et à 12 semaines une forte régénération des fibres. Les tests seront donc réalisés entre 7 et 12 semaines, sur souris adultes.