Recherche fondamentale

96 souris glaneuses vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Les jeunes sont separes de leur mere aux jours 9 et 12 pour enregistrer leurs cris de separation, puis testes en champ ouvert et face a un objet nouveau aux jours 35 et 50, avant d'etre tues au jour 55 pour peser leurs organes, dont les glandes surrenales comme marqueur de stress. Le porteur reconnait que la separation maternelle peut, dans de rares cas, conduire la mere a un infanticide et que les tests repetes imposent un stress. Il affirme qu'une etude du comportement individuel ne peut se passer d'animaux, l'objectif etant de mesurer l'effet de l'age de la mere sur la personnalite de la descendance.

Objectifs

Les effets de l'âge maternel sur le développement de la personnalité de la progéniture ont rarement été étudiés dans des modèles animaux. Dans notre étude, nous visons à examiner les différences potentielles de différences individuelles cohérentes dans le comportement (c'est-à-dire les différences de « personnalité ») entre la progéniture née de mères jeunes et âgées. Ceci sera fait par le phénotypage comportemental des jeunes. Tout d'abord, pendant la période de nidification, cela se fait par des tests répétés de vocalisation de séparation, libérant généralement des fréquences variables de cris de séparation ultrasoniques chez les petits. Plus tard, après le sevrage, nous effectuons deux tests combinés, qui sont également répétés, les tests en champ libre et directement après, un nouvel objet est introduit dans l'arèneet l'exploration de l'objet par l'animal est quantifiée. Ainsi, ces deux tests servent à quantifier des différences individuelles cohérentes (différences de personnalité) dans la tendance à l'exploration. Le premier type de test a été fréquemment utilisé pour phénotyper les différences individuelles chez les jeunes mammifères, y compris chez les souris. En outre, la tendance à l'exploration, quantifiée par des tests de champs libre et des tests du nouvel objet, est un trait de personnalité clé chez de nombreuses espèces de petits mammifères.

Bénéfices attendus

Nous pourrons mettre en évidence la contribution de l'âge de la mère dans la personnalité de la progéniture, ce qui est un aspect jusqu'à présent peu exploré des caractéristiques maternelles dans ce contexte. Deuxièmement, en associant les vocalisations ultrasoniques des petits en réponse à la séparation à leur tendance à l'exploration lors des tests effectués après le sevrage, nous serons en mesure de conclure dans quelle mesure les vocalisations au cours de la vie précoce sont prédictives des différences de personnalité au cours des étapes ultérieures de la vie.

Procédures

Seules des mesures comportementales seront effectuées. Les tests suivants sont effectués sur des animaux vigiles : (1) Une séparation maternelle est effectuée les jours postnatals 9 et 12 (5 minutes chacun), c'est-à-dire pendant la période de nidification. Au cours de ce test, on quantifie la fréquence des vocalisations non ultrasoniques des animaux lorsqu'ils sont séparés de leur mère et de leurs frères et sœurs (appel de séparation). (2) Les jours postnatals 35 et 50 (5 minutes chacun), les animaux sont introduits dans une nouvelle arène et leur exploration et leur activité locomotrice sont quantifiées. Directement après ces 5 minutes de test, un nouvel objet (une boîte métallique, par exemple) est introduit dans l'arène et les réponses de l'animal (pendant les 5 minutes suivantes) à ce nouveau stimulus sont quantifiées.--- Au total, chaque individu sera soumis à 6 tests comportementaux entre les jours postnatals 9 et 50, chaque test ayant une durée de 5 minutes. -- Une fois l'expérimentation terminée, les animaux sont euthanasiés au jour postnatal 55 et seront disséqués par la suite.

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux que nous utilisons peuvent être considérés comme peu ou modérément invasifs. De brèves séparations des petits de leur mère, comme cela a été fait lors du test de vocalisation de séparation aux jours 9 et 12, peuvent, dans de rares cas, conduire à un infanticide par la mère. En outre, les tests répétés aux jours 35 et 50 peuvent imposer un certain stress aux jeunes. Cependant, nous considérons que les effets négatifs d'un tel stress plutôt léger ou modéré n'affecteront pas notablement le bien-être.

Devenir

A la fin de la procédure, au jour postnatal 55, les 96 animaux expérimentaux seront euthanasiés. Ensuite, les animaux seront disséqués et nous allons mesurer et peser leurs organes. Sur la base de ces données, nous comparerons, par exemple, le poids des glandes surrénales (en tant que marqueur du stress chronique) entre les petits issus de mères âgées et de mères jeunes.

Remplacement

Les conséquences de l'âge maternel sur l'émergence de différences individuelles constantes de comportement ("différences de personnalité") ne peuvent être évaluées par d’autres moyens que ceux où l’utilisation d’animaux est requise. S’agissant d’une étude sur le comportement des individus il n’est pas possible de se passer des animaux.

Réduction

Selon notre hypothèse, la cause sous-jacente des différences potentielles de personnalité entre les descendants de mères jeunes et de mères âgées sont les effets de l'âge des mères, qui trouvent donc leur origine au niveau maternel. Ainsi, il est nécessaire de tester un nombre suffisamment élevé de mères, c'est-à-dire 12 portées de mères jeunes et 12 portées de mères âgées. Cependant, il est également nécessaire de tester plusieurs jeunes par portée afin de démêler les effets de facteurs tels que le sexe et la masse corporelle des jeunes, qui peuvent également influencer l'émergence de différences de personnalité. Ainsi, nous avons décidé de tester 4 jeunes par portée, de préférence 2 mâles et 2 femelles. Cette stratégie nous permettra également de garder les 4 frères et sœurs ensemble dans un groupe après le sevrage, ce qui est favorable du point de vue du bien-être animal. La taille d'échantillon (au total: N = 96 animaux expérimentaux) nécessaire pour obtenir des résultats fiables a été calculée par un test de puissance.

Raffinement

Des enrichissements environnementaux (matériaux de nidification, rondins à ronger) seront fournis aux animaux à tout moment, aux couples reproducteurs ainsi qu'aux jeunes après le sevrage. Après le sevrage, les animaux expérimentaux (N = 96) sont toujours gardés en groupe avec leurs frères et sœurs de la même portée, ce qui leur procure un environnement social stable. En outre, la présence de frères et sœurs apporte généralement un soutien social et contribueront ainsi à amortir les conséquences négatives du stress. Tous les transferts d'animaux d'une cage à une autre ou à un dispositif de test se feront sans manipulation directe mais par l'utilisation d'une petite boîte dans laquelle l'animal sera encouragé à entrer. Les différents tests auxquels les animaux sont soumis sont brefs (5 minutes chacun) et peu invasifs. Lorsque les jeunes sont séparés de leur mère lors des tests effectués pendant les jours postnatals 9 et 12, nous empêchons le refroidissement des jeunes par un sol chauffé à 30°C dans le cadre du test. En outre, pour éviter efficacement un éventuel infanticide de la mère lors du retour au nid, nous avons pris diverses mesures, par exemple : utilisation de gants portant uniquement l'odeur de la portée particulière, séparation courte seulement, la mère n'entendra pas les cris de séparation des petits pendant la procédure. Un point limite majeur de cette expérimentation est d'éviter l'utilisation de petits pour le test de vocalisation de séparation dont la température corporelle s'est déjà refroidie trop bas avant l'expérience. Il s'agit d'un processus réversible, qui peut se produire car certains petits, au cours de leur dynamique naturelle dans le nid, perdent parfois temporairement le contact avec leurs frères et sœurs de portée avant d'être récupérés au nid par la mère. Par conséquent, lorsque nous sortons les petits pour l'expérimentation, nous mesurons leur température de surface corporelle à l'aide d'un thermomètre infrarouge sans contact. Seuls les petits dont la température de surface corporelle est supérieure à 34°C sont utilisés. Si la température de surface corporelle du petit choisi est trop basse, il est ramené au nid et peut être testé après 1-2 heure, lorsqu'il s'est remis de son épisode de basse température. Les tests comportementaux aux jours postnataux 35 et 50 donnent généralement aux animaux la possibilité d'adopter une solution comportementale qui leur convient.

Choix des espèces

La souris glaneuse a, dans des conditions naturelles, une durée de vie très courte. Seuls les juvéniles nés pendant les mois d'été survivent à l'hiver. Pour cette raison, le schéma suivant se dessine : (1) Au printemps, toutes les femelles qui se reproduisent sont primipares mais sont les vieilles femelles (environ 7-8 mois) nées au cours de l'année précédente. (2) Plus tard au cours de la saison de reproduction, les mères sont principalement nées au cours de la même année (=des mères plus jeunes). Il existe des différences distinctes dans l'âge maternel au printemps et en été chez cette espèce. Notre projet utilise ce phénomène intéressant de l'histoire de vie de cette espèce, et explorera dans une étude en laboratoire si les différences d'âge maternel conduisent à des différences de personnalité chez la progéniture. Nous quantifierons la vocalisation des jeunes pendant la période de pré-sevrage, vers les jours 9 et 12. À cet âge, les petits émettent des cris de séparation ultrasoniques lorsqu'ils sont séparés de leur mère et de leurs frères et sœurs. Plus tard, à l'âge de 35 et 50 jours (stade juvénile, avant la maturité), nous testerons la tendance à l'exploration des animaux dans une arène ouverte et lorsqu'ils sont confrontés à un nouvel objet. Des études précédentes ont montré que tester les animaux à ces jours est approprié, car ils sont généralement très motivés pour explorer l'arène de test.

80 souris modeles de la trisomie 21 vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Chaque animal est gave quotidiennement pendant dix-sept jours avec une molecule a visee therapeutique ou sa forme inactive, subit un poincon d'oreille pour le genotypage, passe des tests de memoire spatiale et de reconnaissance d'objets, puis est tue pour doser l'effet du compose dans le cerveau. Le porteur indique que les gavages repetes peuvent devenir douloureux et espere une amelioration des performances cognitives du modele. Il affirme que l'etude de ces deficiences intellectuelles d'origine genetique passe par un organisme vivant proche de l'homme, sans autre methode possible.

Objectifs

Le Syndrome de Down (SD) aussi appelé Trisomie 21 (T21), est dû à la présence d’un chromosome 21 surnuméraire. Ce syndrome touche 1 nouveau-né pour 600-800 naissances et représente environ un tiers des déficiences intellectuelles chez les enfants d’âge scolaire. C’est la forme la plus fréquente de retard mental, qui est également associée à un large panel de dysmorphies ou malformations. Parmi les gènes candidats à l’apparition de ces symptômes, un gène présent sur le chromosome 21 humain et donc en 3 copies chez les sujets porteurs de la T21, est aujourd’hui une des cibles privilégiées pour le développement de traitements thérapeutiques. Les études de ce gène chez la souris ont démontré son implication dans le développement et la maturation du cerveau. En effet, les souris ayant une copie supplémentaire de ce gène présentent une altération des capacités d’apprentissage et un déficit de la mémoire similaires à celles observées dans la T21. Arriver à déplacer de quelques dizaines de points le quotient intellectuel des patients atteints de la T21 leur permettrait d’avoir une vie plus autonome et socialement intégrée et constituerait un progrès très important pour la qualité de vie des patients et de leur entourage. L’objectif de la recherche sur la T21 est donc de mettre au point un traitement améliorant les fonctions intellectuelles des patients. Des collaborateurs proposent de tester 1 nouveau composé (et 1 composé non fonctionnel, utilisé comme contrôle négatif) pour leur propriété à améliorer les capacités cognitives qui sont altérées dans cette pathologie en ciblant l’activité de notre protéine d’intérêt. Durant ce projet, nous souhaitons déterminer si ce composé sera efficace en terme de restauration des fonctions intellectuelles. En parallèle, le composé non fonctionnel devrait avoir aucun effet. Ces composés ont été synthétisés et testés pour l’ADME (Administration, Distribution, Métabolisation et Excrétion) pharmacologique, par nos collaborateurs. Ces composés seront ainsi administrés par notre équipe à des souris modèles de T21. Les souris traitées feront l’objet de différents tests comportementaux afin de détecter une amélioration de leurs performances cognitives.

Bénéfices attendus

Nous espérons obtenir une amélioration significative des performances cognitives (notamment dans 2 types de mémoires : mémoire de reconnaissance spatiale et mémoire explicite de reconnaissance d'objets) dans un modèle murin de trisomie 21, qui montre de faibles performances dans ces 2 tests. Cette amélioration sera caractérisée également par un dosage de l'activité de phosphorilation de Dyrk1a, activité qui devrait être diminuée par l'effet du composé testé. Les animaux traités avec la forme non active du composé devraient présenter les mêmes déficits que les individus contrôles sauvages non traités.

Procédures

Les animaux seront gavés quotidiennement avec des molécules à visée thérapeutique pour une durée maximale de 17 jours. Le temps du gavage est de 20 à 30 secondes maximum. Pour le genotypage des animaux, un poinçon d’oreille sera effectué, conjointement à la pose d'une bague d'identification . Ce geste est rapide et ne prend que quelques secondes

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont l'introduction d'une canule de gavage pour l'administration des molécules per os. Une douleur peut apparaitre à cause de la répétition des gavages, au maximum 17 jours au total, soit 1 par jour. Stress léger et rapide dû à la pose de bague et prélèvement d'une biopsie d'oreille.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issu des 17 jours de traitement. Les cerveaux seront prélevés pour réaliser un dosage de l'effet des molécules à visée thérapeutique.

Remplacement

L’utilisation de la souris dans cette étude est justifiée par le fait que les anomalies à observer (altération des capacités d’apprentissage et déficit de la mémoire) nécessitent un modèle vivant et suffisamment proche de l’homme pour pouvoir être transposé.

Réduction

Pour ce projet, des souris mâles et femelles seront utilisés à partir de 3 mois, âge équivalent au jeune adulte. Nous utiliserons et testerons le composé sur les deux sexes afin de vérifier qu’il n’y a pas de différence entre mâle et femelle. L'étude nécessitera 5 groupes de 16 animaux (8 femelles et 8 mâles), soit 80 souris au total. 13 animaux par groupe sont nécessaires pour avoir une puissance statistique suffisante. Comme les tests comportementaux sont sans contraintes, certains animaux ne répondront pas, c'est pourquoi nous testerons 3 animaux de plus dans chaque groupe.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un suivi quotidien à partir du début de leur traitement jusqu’à la fin de l’expérience. Et dans le cas où les animaux présenteraient des signes de souffrance, de mal-être, ou de douleur, ils seront exclus des analyses et soignés ou euthanasiés selon leur état. Pour la manipulation des animaux, et afin de limiter le stress, nous utiliserons des tubes de manipulation, ce qui évite de les prendre par la queue. Les tubes seront laissés dans les cages d'élevage comme enrichissement du milieu. Les animaux seront élevés par groupe de 2 animaux minimum pour éviter l'isolement.

Choix des espèces

La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires ainsi que des origines développementales des pathologies génétiques associées à des retards mentaux requièrent l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité et il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo. La souris est une espèce physiologiquement et génétiquement proche de l’homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologies humaines. De plus, les études dans le modèle humain sont limitées tandis que le modèle murin permet d’accéder à tous les tissus et à toutes les étapes du développement. En outre, le génome de la souris étant manipulable, il permet donc de recréer les modifications génétiques qui sont à la base du syndrome de Down. Les souris seront étudiées à partir de l’âge adulte, c’est-à-dire 3 mois, car c’est l’âge auquel le comportement exploratoire et les aptitudes de mémorisation sont présents.

578 souris immunodeprimees vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Chaque animal recoit une greffe de cellules de glioblastome humain dans le cerveau par ouverture du crane, puis des seances hebdomadaires d'imagerie sous anesthesie et des instillations nasales de candidats-medicaments, une moitie etant en plus irradiee, avant d'etre tuee pour analyser la progression tumorale. Le porteur decrit surtout le stress lie aux anesthesies repetees et prevoit une mise a mort des qu'un point limite de degradation est atteint. Il affirme qu'aucune alternative n'existe, les organoides cerebraux ne reproduisant pas selon lui la complexite du microenvironnement tumoral.

Objectifs

Avec plus de 3000 nouveaux cas par an en France, les récidives de gliomes de bas grade ainsi que les glioblastomes sont des tumeurs cérébrales avec un mauvais pronostic et pour lesquelles les traitements sont lourds mais peu efficaces. Néanmoins, la chirurgie en association à la radiothérapie et la chimiothérapie permet de prolonger de quelques mois la survie. En effet, la survie des patients après diagnostic n’excède pas 2 ans y compris après un traitement. Dans des études in vitro, nous avons sélectionné de nouvelles molécules qui en association avec la radiothérapie réduisent la croissance des cellules tumorales. Nous proposons de tester ces nouvelles molécules dans un modèle préclinique. La transplantation intracérébrale de cellules issues de gliomes humains chez des souris est le modèle de choix pour tester l’efficacité d’approches pharmacologiques en combinaison avec la radiothérapie.

Bénéfices attendus

Cette étude préclinique permettra d’évaluer l’efficacité in vivo de molécules pour réduire la croissance de cellules de gliomes. Ce travail pourra servir de référence pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques du cancer du cerveau le plus fréquent chez l’Humain adulte.

Procédures

L’opération de xénogreffe comporte 4 étapes : injection d’un antalgique, une anesthésie, ouverture minime de la boîte crânienne et injection de cellules issues de gliomes humains dans le cerveau de l’animal, pour une durée totale de l’opération de moins de 20 min par souris. L’imagerie par bioluminescence sera réalisée de façon hebdomadaire durant 5-9 semaines. Cette mesure nécessite une anesthésie gazeuse de l’animal pour 15-20 min et l’administration intrapéritonéale d’un composé. Deux mois après la greffe, les candidats-médicaments seront administrés par instillation nasale sous anesthésie légère à raison de 5 fois par semaine et pour 1 ou 3 semaines selon la procédure. L’administration est réalisée sous anesthésie gazeuse et dure moins de 5 min. Les jours de mesure de bioluminescence, l’administration sera réalisée au cours de la même anesthésie. La moitié des animaux sera exposée à une radiothérapie sous anesthésie gazeuse pour une durée de 20-30 min.

Impact sur les animaux

La nuisance majeure attendue de cette expérimentation concerne le stress provoqué par les anesthésies gazeuses répétées (opération de transplantation, instillations nasales). L’opération de transplantation est un acte chirurgical qui représente des effets indésirables mais celui-ci est bien maîtrisé et les animaux se rétablissent rapidement après l’opération. L’instillation nasale d’un petit volume d’une solution saline est une méthode non-invasive permettant l’administration de petites molécules qui vont diffuser dans le cerveau. Le stress lié à cette approche réside dans les anesthésies répétées, la contention et l’obstruction momentanée d’une narine. La radiothérapie requiert une anesthésie générale afin d’immobiliser l’animal mais l’exposition à l’irradiation ne génère pas de souffrance et la dose utilisée n’engendre pas d’effets néfastes.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélever le cerveau afin de réaliser des analyses histologiques et d’évaluer l’effets des composés pharmacologiques sur la progression tumorale.

Remplacement

Il n’existe actuellement aucune alternative à l’utilisation d’animaux pour l’étude du glioblastome, particulièrement en raison du microenvironnement tumoral qui joue un rôle défavorable et ne peut être reproduit dans un système in vitro. Des cultures d’organoïdes cérébraux sont en cours de développement mais ce modèle expérimental, dépourvu de certains types cellulaires impliqués dans la croissance tumorale, ne représente pas à ce jour toute la complexité du modèle in vivo.

Réduction

Dans ce projet, deux candidats-médicament seront évalués dont l’un d’entre eux est connu pour ne pas présenter d’effet indésirable in vivo. Des essais de non-toxicité pour la deuxième molécule seront réalisés au préalable et en cas d’effets cliniques néfastes, son utilisation sera interrompue ; l’étude sera limitée à la première molécule. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été défini en fonction de la littérature et notre expérience sur la variabilité des expériences de transplantation. Plusieurs types de cellules de glioblastomes représentant différentes caractéristiques des glioblastomes sont inclues dans cette étude. Les expérimentations seront réalisées indépendamment pour chacun des types de cellules de glioblastome et de façon séquentielle si bien qu’en cas d’évolution tumorale défavorable le protocole pourra être interrompu plus précocement et éviter l’utilisation de tous les groupes d’animaux.

Raffinement

Afin de protéger d’une éventuelle contamination par l’environnement, ces animaux immuno-déficients seront hébergés dans des conditions sanitaires strictes dans des cages avec un système de ventilation contrôlée. Mise en place d’un protocole d’anesthésie/analgésie. Mise en place d’un suivi clinique régulier avec l’aide d’une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance. Des critères de point limite ont été établis et leur expression justifiera l’interruption de l’expérience et la mise à mort de l’animal pour lui éviter toute souffrance.

Choix des espèces

La greffe de cellules humaines sera réalisée sur des animaux immunodéprimés pour éviter tout rejet. Dans ce projet, nous utiliserons un modèle de souris présentant un thymus rudimentaire, connu pour supporter la transplantation et la croissance de cellules de gliomes humains dans leur cerveau. Par ailleurs, ce modèle de souris présente une faible radiosensibilité et permet l’étude de la radiothérapie contrairement à d’autres modèles de souris immunodéficientes. Le gliome est une tumeur cérébrale fréquente chez l’adulte qui affecte sans distinction les mâles et les femelles. Nous utiliserons donc des animaux adultes mâles et femelles.

36 souris vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Chaque animal recoit une puce sous-cutanee sous anesthesie, passe des tests comportementaux (Live Mouse Tracker en arene, apprentissage sur ecran tactile) puis une injection d'un produit convulsivant qui provoque des myoclonies et quelques crises, avant d'etre tue par perfusion intracardiaque de fixateur pour prelever le cerveau. Le porteur fait l'hypothese d'alterations moderees du comportement, proches des troubles autistiques, et affirme qu'etudier le developpement du cerveau impose un "organisme entier". Les benefices avances relevent de la comprehension de maladies neurologiques dont l'autisme.

Objectifs

L’hormone thyroïdienne est essentielle pour le bon développement du cerveau chez les mammifères. Un défaut de celle-ci au cours du développement du cerveau induit des troubles neurologiques tels que retards mentaux, défauts de concentration, épilepsie, défauts de contrôle du mouvement. Les mécanismes par lesquels l’hormone thyroïdienne agit sur le cerveau sont mal compris. Il a été montré récemment qu'un récepteur de l’hormone thyroïdienne joue un rôle majeur, notamment dans les neurones dits inhibiteurs. Parmi ces neurones inhibiteurs, une sous-population particulièrement sensible a été identifiée : des neurones qui expriment une protéine appelée parvalbumine. Chez l’homme, des pathologies telles que l’autisme, l’épilepsie et la schizophrénie sont associés à un déficit de neurones à parvalbumine. De plus, chez la souris, l’invalidation du gène de la parvalbumine induit des altérations du comportement qui évoquent les troubles du spectre autistique. L’objectif de ce projet est d’évaluer si le blocage de l'hormone thyroïdienne uniquement dans les neurones à parvalbumine induit des modifications de comportement chez la souris. Nous faisons l’hypothèse que ces souris pourraient présenter des altérations modérées de leur comportement, potentiellement en lien avec les troubles autistiques.

Bénéfices attendus

L'étude du rôle de l’hormone thyroïdienne dans les neurones à parvalbumine permettra de mieux comprendre le développement du cerveau chez les mammifères. Plus précisément, les résultats de ce travail contribueront à mieux comprendre ce qui se passe chez les patients atteints de pathologies affectant cette hormone thyroïdienne. Plus largement, comme les neurones à parvalbumine jouent un rôle majeur de coordination de l’activité dans le cerveau, les résultats de cette étude devraient améliorer notre connaissance de l’origine de plusieurs maladies neurologiques, dont l’autisme.

Procédures

Une implantation sous-cutanée d'une puce constituera la seule intervention que subiront les animaux. Elle se fera sous anesthésie et avec une couverture antalgique durant une durée de 30 minutes maximum. Les animaux consommeront de l'eau acidifiée pendant le test Touch Screen (21 jours). Une injection d'un produit pro-convulsivant: durée moins d'une minute. Une injection de produits anesthésiques: durée moins d'une minute

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux subiront une implantation d'une puce, permettant l'identification par radiofréquence, en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse. Lors des périodes d'analyse du test Live Mouse Tracker, ils seront simplement transférés dans une arène de 50 cm de côté qui disposera de sciure, boisson et aliment qu'ils pourront explorer. Pour le test du Touchscreen, l'eau des biberons des cages d'élevage sera acidifiée pendant les jours de test (21 jours). Suite à l’injection d'un agent pro-convulsivant par voie intrapéritonéale, les animaux présenteront des myoclonies (contractions rapides et brutales des muscles) et peu de crises cloniques (spasmes rythmés) et toniques (augmentation accrue du tonus musculaire ou raideur). Enfin, les animaux seront anesthésiés avec un mélange d'anesthésiques avant d’être perfusés par voie intracardiaque avec une solution tampon et un fixateur de tissus afin de préléver leurs cerveaux pour réaliser des analyses histologiques.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les cerveaux afin de réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

L'objectif de ce projet étant d'étudier le rôle de l'hormone thyroïdienne dans le dévelopement du cerveau, il est nécessaire de travailler sur un organisme entier, car il est actuellement impossible de reproduire in vitro le développement du cerveau. A cet égard la souris est un modèle pertinent, car elle présente une organisation du système nerveux proche de celle de l'Homme. Des études in vitro sont réalisées en parallèle, notamment pour aborder les aspects moléculaires de l'hormone thyroïdienne.

Réduction

D’après notre expérience, les paramètres comportementaux présentent en général une grande variabilité interindividuelle, il est nécessaire de prévoir 12 souris par groupe pour pouvoir conclure statistiquement. En fonction de la répartition des données nous utiliserons des tests paramétriques ou non paramétriques pour mettre en évidence des différences significatives dans les résultats des tests comportementaux entre les groupes expérimentaux (mutants vs contrôles). A l’issue de l’étude comportementale, nous avons prévu de prélever les cerveaux de 6 souris de chaque groupe, de façon à disposer de matériel biologique qui permettra de prolonger l’étude par une exploration histologique, si les tests comportementaux révèlent des différences entre souris exprimant la mutation et souris témoins. Cela évitera de générer une nouvelle cohorte de souris pour l’histologie, le cas échéant. Le nombre de 6 par groupe est suffisant pour conclure statistiquement sur les paramètres histologiques.

Raffinement

Afin de réduire l'inconfort et le stress des animaux, la durée minimale sera appliquée pour chaque test. Des phases de récupérations entre les différents tests seront prévues. De plus, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et auront un accès illimité à l'eau et à la nourriture. Ils subiront la pose d'une puce sous-cutanée sous anesthésie et avec une couverture antalgique suite à laquelle une attention particulière sera effectuée afin de vérifier la bonne cicatrisation. Nous utiliserons du gel ophtalmique hydratant durant les implantations pour éviter un dessèchement oculaire. Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C), qui permettra un retour progressif de la température corporelle de l'animal. Un antiseptique local par spray pourra être administré si besoin. Nous avons défini des points limites éthiques dans le cadre de la procédure expérimentale. Chaque animal sera ainsi suivi avant les expériences afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt avant l’expérimentation voire l’euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

La souris est un bon modèle pour étudier le rôle de l'hormone thyroïdienne dans l'organisme car elle joue un rôle similaire chez la souris et chez l'homme. De plus, c'est actuellement la seule espèce chez laquelle existent différentes lignées premettant de bloquer cette hormone dans un type cellulaire choisi. Cette étude comportementale sera réalisée sur des souris adultes, âgées de 16 à 20 semaines au début des tests, de façon à ce que le développement du cerveau soit terminé au début de l’étude.

16 macaques a longue queue femelles vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Chaque animal enchaine IRM, scanner et imagerie TEP sous anesthesie generale, plusieurs seances de neurostimulation par ultrasons en chaise de contention, puis un test de memoire ou l'animal doit choisir entre deux gobelets pour obtenir une friandise, avant d'etre tue par surdosage d'anesthesique pour analyser son cerveau. Le porteur decrit un stress a l'induction de l'anesthesie, des douleurs aux sites d'injection et une gene liee a l'intubation et a la contention. Il affirme que les modeles in silico et in vitro ne reproduisent pas la physiologie cerebrale, juge l'usage du singe "indispensable" en vue d'une transposition a l'homme, et prevoit de reutiliser des femelles deja presentes dans l'etablissement.

Objectifs

Actuellement de nombreux protocoles thérapeutiques visant les troubles neuropsychiatriques (autisme, dépression, …) sont confrontés à l’apparition de pharmacorésistance chez de nombreux patients. Il semble essentiel de trouver des solutions innovantes pour parer à ces complications. Plusieurs techniques de neurostimulations sont proposées: la neurostimulation magnétique transcrânienne, utilisée en clinique, est non-invasive mais a une mauvaise discrimination spatiale, et la stimulation cérébrale profonde qui offre une meilleure résolution spatiale mais nécessite une chirurgie lourde. Nous proposons de pallier ces défauts et de garder ces points forts en utilisant la neurostimulation transcrânienne par ultrasons focalisés. La neurostimulation ultrasonore (US) se fera par application d’une sonde US sur le crâne, permettant la propagation intracrânienne d’ondes US focalisées et la stimulation précise de régions cérébrales. Nos résultats actuels ont montré que la stimulation US induit une activation neuronale, un mécanisme capital dans la thérapeutique des troubles neuropsychiatriques. Cette technique de neurostimulation offrirait une alternative ciblée et non-invasive pour les troubles neuropsychiatriques. Des études exploratoires chez les rongeurs ont démontré la faisabilité de cette technique. Cependant, leurs physiologies (épaisseur du crâne, orientation et forme du cerveau) freinent la transposition en clinique humaine. Des simulations numériques et expérimentales ont montré que les ultrasons pénètrent de façon similaire la boite crânienne chez l'homme et chez le primate. Des manipulations sur des singes cynomolgus sont en cours sans anesthésie pour la neurostimulation. Mais il y a des difficultés lors de la stimulation malgré l'habituation (tête non immobile). Dans la continuité de ce protocole, ce projet a pour but d’évaluer la faisabilité, l’efficacité et l’innocuité de la neurostimulation ultrasonore aigüe et chronique sur le primate non humain (PNH) anesthésié. Nous souhaitons tester les effets de la neurostimulation US aigüe (n=8) et la neurostimulation US chronique (n=8). Ce nombre est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. Tous les individus seront euthanasiés à la fin du projet par une méthode réglementaire et les cerveaux seront prélevés pour évaluer l’efficacité et l’innocuité de la neurostimulation US (neuroinflammation, neurotransmission, mort cellulaire, microhémorragies, ...).

Bénéfices attendus

Actuellement, les cas de dépression chez l’homme sont traités à l’aide de divers protocoles thérapeutiques tels que la psychothérapie, les antidépresseurs et autres molécules pharmacologiques. Dans de nombreux cas, les patients développent une pharmacorésistance aux traitements médicamenteux. Cette pharmacorésistance nécessite l’orientation des patients vers d’autres techniques thérapeutiques. Parmi ces techniques, nous pouvons relever la méthode de neurostimulation magnétique transcrânienne ou la stimulation cérébrale profonde (stimulation par implantation d’électrode dans le cerveau) mais la première ne cible pas correctement la zone cérébrale impliquée dans la dépression et la deuxième est trop invasive. Pour pallier ces défauts, nous souhaitons évaluer l’efficacité et l’innocuité d’une nouvelle méthode non invasive et ciblée : la neurostimulation ultrasonore chez le singe. Ce projet permettra ainsi de progresser dans la possibilité de traduire cette technique en clinique humaine. Nous aurons ainsi une avancée supplémentaire pour espérer avoir une alternative non-invasive et résolutive pour le traitement des troubles neuropsychiatriques. La perspective directe de ce projet est une transposition de cette technique pour un essai clinique chez l’Homme.

Procédures

Habituation – renforcement positif : 2 à 5 fois par semaine ; durée : entre 15 minutes et 1 heure par animal ; pendant au moins 1 mois et jusqu’à l’obtention d’une bonne coopération de l’animal vigile. Sont concernés tous les animaux (n=16) IRM cérébrale sous anesthésie générale: Sont concernés tous les animaux (n=16), 1 seule fois par animal ; injection d’anesthésique intramusculaire puis anesthésie gazeuse. Durée d’anesthésie : environ 60min. Scanner CT sous anesthésie générale: Sont concernés tous les animaux (n=16), 1 seule fois par animal ; injection d’anesthésique et de son antidote (voie intramusculaire), durée d’anesthésie : environ 10min. Adaptation du dispositif de neurostimulation : Sont concernés tous les animaux (n=16), jusqu’à 10 fois par animal ; injection d’anesthésique et de son antidote (voie intramusculaire), durée d’anesthésie : environ 30min – 1 mois minimum Imagerie TEP-CT sous anesthésie générale: Sont concernés tous les animaux (n=16). Cette imagerie sera réalisée 2 fois sur 8 animaux et 3 fois sur 8 autres animaux; injection d’anesthésique (intramusculaire); injection du produit radioactif (intraveineuse, par cathéter veine saphène ; durée d’anesthésie : environ 1h30 à 2h00. Neurostimulation ultrasonore sous anesthésie générale chimique: Sont concernés tous les animaux (n=16), 8 animaux avec 2 séances de stimulation et 8 animaux avec 10 séances de stimulation; application sur la tête du dispositif de neurostimulation ; injection d’anesthésique et de son antidote ; durée de contention dans une chaise de contention : environ 30min par stimulation. Test de comportement et de mémorisation : Sont concernés uniquement les animaux ayant une neurostimulation US chronique (n=8); pour la mémorisation, l'animal est placé dans un sas et devra choisir entre deux gobelets pour trouver une récompense (friandise). Euthanasie : Sont concernés tous les animaux (n=16), surdosage d’anesthésie.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont les suivants : - Augmentation du stress lors des phases d’induction d’anesthésie (contention dans la cage). - Douleurs/gênes au niveau du site d’injection de l’anesthésie. - Douleurs/gênes oropharyngées liées aux intubations. - Augmentation du stress lors du transport entre les deux sites de manipulation. - Gênes suite à l’installation dans la chaise de contention. - Gênes au niveau du site d’apposition de la sonde ultrasonore. Concernant l’application des ondes ultrasonores lors de la neurostimulation et d’après nos précédentes manipulations sur rongeurs, la neurostimulation ne semble pas avoir d’effet indésirable. Les ondes ultrasonores auront une fréquence au-delà de celle de la gamme audible des primates, il n’y aura donc pas d’effets indésirable escomptés. Ceci a été validé chez les rongeurs dans nos études précédentes et dans la littérature.

Devenir

A l’issu des 2 procédures, tous les animaux seront euthanasiés pour effectuer des analyses histologiques des cerveaux.

Remplacement

Les modèles in silico, in vitro, (cellulaires) et/ou mathématiques ne permettent pas de reproduire la physiologie cérébrale et son environnement (vascularisation, perfusion, débit sanguin, etc…), l’utilisation d’animaux est donc indispensable. De plus, l’objectif final est de transposer cette technique en clinique humaine, en conséquence les études chez l’animal ne peuvent pas être substituées. Des études précédentes ont été menées sur les rongeurs (souris et rats). Les résultats obtenus sont encourageants mais ils ne permettent pas une transposition directe de la neurostimulation en clinique humaine, notamment à cause des différences physio-morphologiques des rongeurs avec l’homme. Pour pallier ces différences, nous proposons d’évaluer notre méthode sur un modèle animal plus proche de l’homme pour la morphologie cérébrale et crânienne, le singe cynomolgus.

Réduction

Les procédures expérimentales ont été élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible en permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. La réduction du nombre d’animaux se fera aussi par l’utilisation d’imagerie préclinique. Ainsi l’activité cérébrale d’un animal après neurostimulation sera comparée avec sa propre activité cérébrale avant neurostimulation, chaque animal sera donc son propre contrôle. Ces activités cérébrales seront statistiquement comparées. En considérant une modification de 10% de l’activité cérébrale par rapport à l’activité contrôle, un effectif de 8 animaux par groupe sera utilisé.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en volière disposant de plateformes surélevées avec les congénères et en présence d’objets d’enrichissement. L'alimentation couvrira les besoins journaliers et sera complétée par des friandises. Un programme d'enrichissement sera mis en place (recherche et diversité de l'alimentation, manipulation d'objets, échelle, musique, tv...) ceci donnant un environnement favorable aux procédures expérimentales. Pour limiter le stress, nous recourrons à l’habituation (renforcement positif). Elle sera effectuée par le personnel en charge de l’étude et en collaboration avec le personnel d’animalerie. Les animaux seront habitués à recevoir des récompenses (friandises) après réalisation de tâches simples (ex : toucher un objet) afin d’obtenir la coopération de l’animal et instaurer une relation de confiance. Pour les procédures sous anesthésie, les animaux seront manipulés sur un tapis chauffant et sous monitoring cardio-pulmonaire. Les animaux seront placés sous surveillance à leur réveil. Nous avons défini des points limites permettant d’apprécier la douleur et l’inconfort des animaux. Ces points limites seront des signes observables et évaluables par le personnel de zootechnie. Chaque jour, le personnel de zootechnie veillera à l’apparence des animaux. Les animaux seront pesés à réception puis à chaque manipulation nécessitant une sortie de cage. Des mesures préventives seront prises : médication en concertation avec le vétérinaire référent et/ou apports alimentaires alternatifs, notamment après le retrait des cathéters, l’animal pourra recevoir une injection d'un antidouleur au site de pose du cathéter. Nous aurons recours le plus possible à la réutilisation d’animaux inclus dans d’autres projets sous condition qu’ils n’aient subi aucun dommage cérébral, ni locomoteur.

Choix des espèces

Le choix de cette espèce se justifie par l’analogie des zones cérébrales et de la neurobiologie entre le singe et l’humain et par sa proximité phylogénétique avec l’espèce humaine. Des macaques femelles pubères seront utilisées pour cette étude. Les pathologies pouvant être soignées par la méthode de neurostimulation ultrasonore sont pour la plupart des pathologies de l’adulte. De ce fait, il s’avère nécessaire de travailler sur des animaux post-pubères. Pour cette étude, des macaques femelles seront utilisées. Actuellement des macaques femelles sont utilisées au sein de l’EU et seront disponibles à la réutilisation. Cela sera en accord avec les principes de réduction et de raffinement édictés par la règle des 3R. De plus, nos équipements d’imagerie actuels ne peuvent pas supporter la forte corpulence de macaques mâles adultes (poids et largeur d’épaule sont souvent trop importants pour le stade de développement souhaité).