Recherche fondamentale
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Injection de vésicules liposomales dans le traitement des lymphomes sur des modèles murins
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections, une greffe sous-cutanée de cellules de lymphome puis des injections intraveineuses d'immunoliposomes, avec un prélèvement sanguin. Le porteur indique que les tumeurs peuvent atteindre 1500 mm3 et provoquer une détresse de l'animal isolé. Il affirme qu'après une validation in vitro, le remplacement "n'est plus possible à ce stade" du projet préclinique.
Objectifs
Le Lymphome représente la moitié des cancers du sang, c’est un cancer des cellules du tissu hématopoïétique caractérisé par un blocage de maturation et une prolifération cancéreuse des cellules lymphocytaires matures. Le lymphome se caractérise par la prolifération excessive des lymphocytes au niveau des ganglions, du foie, de la rate, plus rarement d'autres organes. Ils provoquent une augmentation de leur taille. Les principaux symptômes consistent donc en une augmentation de la taille des ganglions. Malgré les améliorations des traitements actuels chez l’homme, les taux de rechute restent élevés. Ainsi, pour réduire l’intensité de la chimiothérapie et traiter avec succès les patients en rechute, il est encore nécessaire de développer de nouvelles thérapies. Nous avons identifié de nouveaux candidats thérapeutiques (liposomes) que nous avons validé dans un premier temps par des méthodes alternatives, à l’aide d’outils in vitro. Nous souhaitons maintenant étudier leurs efficacités dans cette étude préclinique in vivo. Pour cela, nous allons utiliser des modèles murins incluant des xénogreffes de cellules humaines dans des souris immunodéficientes ou des greffes de cellules lymphomateuses murines dans des souris. Lors de cette étude préclinique, les souris seront traitées avec ces liposomes afin d’étudier leurs effets sur l’activation de l’immunité antitumorale et le ralentissement de la croissance tumorale.
Bénéfices attendus
En effectuant des expérimentations in vitro sur nos modèles de Lymphomes, nous avons identifié de nouveaux composés (Immunoliposomes artificiels ou liposomes biologiques issus de la culture cellulaire des cellules de Lymphome) qui bloquent la prolifération des cellules cancéreuses. Après avoir validé in vitro leurs actions, nous souhaitons maintenant tester leurs efficacités sur nos modèles murins in vivo lors d’études précliniques. Le bénéfice attendu du projet concerne la découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement des Lymphomes.
Procédures
Les animaux seront soumis à des traitements par voie intra péritonéale (i.p.) 15 et 7 jours (J-15 et J-7) avant l’injection des tumeurs. Les animaux seront soumis à des transplantations de cellules lymphomateuses par des injections sous cutanées (s.c.) dans leur flanc. Une seule injection est prévue par souris, durée de 30 secondes). Après la greffe, des injections intra-veineuses (i.v.) d’immunoliposomes (3 injections par souris sont prévues, à J+6, J+9, J+12, durée par injection de 5 secondes). Un prélèvement de sang à partir de la veine de la queue (un seul prélèvement par souris, durée de 1 minute) sera réalisé à J+15 jours après la greffe.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables causés durant les actes expérimentaux sont des injections intraveinales et intraperitonéales, des contentions des souris dans un tube de contention afin de prélever le sang, des coupures sur la veine caudale pour prélever le sang. Les animaux vont développer des cancers, avec une multiplication proliférative des cellules lymphomateuses au niveau de la zone d’injection du flanc de l’animal, jusqu’à 1500 mm3. Ce développement tumoral peut engendrer une détresse de l’animal qui peut se trouver isolé. L’ensemble de ces nuissances justifient la classe de sévérité des expérimentations.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des expériences
Remplacement
Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler sur des cellules ou des tissus (in vitro). Le recours aux modèles in vitro doit être l’objectif du chercheur si son expérimentation le permet. Les immunoliposomes et les liposomes biologiques que nous allons tester dans ce projet préclinique ont d’ores et déjà été testé in vitro sur des méthodes alternatives, sur des lignées cellulaires. Ceci nous permet d’être sûr que les composés qui vont être étudiés in vivo sont fonctionnelles sur les cellules cancéreuses. Il nous faut maintenant valider sur des études précliniques in vivo l’efficacité de ces molécules et le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche.
Réduction
Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possibles, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet. Les effectifs des souris seront déterminés et nos résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Afin de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux, et ainsi améliorer leur bien-être, en amont des expériences, nous allons planifier les protocoles nous allons aussi planifier et établir les points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure. Afin de limiter le stress des animaux, ils sont placés par groupe de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en carton ou en plastique leur permettant de se regrouper dans un nid. La litière des cages est changée une fois par semaine et les animaliers veillent plusieurs fois par jour à ce que les animaux ne manquent ni d’eau, ni de nourriture. Ces informations seront par ailleurs transmises au personnel de l’animalerie.
Choix des espèces
Pour qu’un nouveau traitement puisse être commercialisé, il est nécessaire de mener des études précliniques et cliniques, afin de prouver son efficacité, d'optimiser les dosages mais aussi d'identifier ses effets indésirables possibles. Les études précliniques nécessitent d’avoir recours à des animaux. Nous disposons d’échantillons de cellules Lymphomateuses qui sont des lignées cellulaires établies et commercialisées. Trois jours après l’injection, les cellules lymphomateuses forment une boule qui peut être palpable au niveau du site de l’injection sous cutané. Ces études ne peuvent se réaliser que dans le modèle murin (A1, mus musculus). L’étude sur l’immunité anti tumorale des souris est en effet celle qui se rapproche le plus de l’homme est c’est ce modèle qui est choisi dans la littérature afin de réaliser des études précliniques sur les Lymphomes en général. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules lymphomateuses sur le flanc des animaux.
Validation d’un dispositif implantable de thérapie cellulaire de la régénération ostéochondrale pour la prévention de l’arthrose précoce chez la brebis
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
16 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 13 tuées à l'issue et 3 rendues à l'élevage après un simple prélèvement de moelle. Les brebis opérées subissent sous anesthésie une ponction de moelle osseuse, l'implantation d'un dispositif dans le genou et des IRM, avant l'euthanasie pour prélever les condyles. Le porteur justifie l'augmentation des effectifs par le risque qu'un incident sur un seul animal "compromette le résultat de l'ensemble de l'étude". Il affirme qu'il n'y a "pas d'alternative non animale" pour étudier le cartilage articulaire et que le passage sur animal vivant est "indispensable".
Objectifs
Les pathologies ostéo-articulaires sont aujourd’hui un problème de santé publique dont la prévalence augmente avec l’augmentation de l’âge de la population avec plus de 10 millions personnes qui souffrent de l’arthrose en France aujourd’hui . Actuellement, les possibilités thérapeutiques proposées chez l’homme ne permettent pas de régénérer un tissu cartilagineux articulaire normal, et de ce fait, sont incapables de restaurer la fonction de l’articulation. Suite à des études in vitro, nous avons montré l’efficacité de ce biomatériau en termes de régénération tissulaire et avons également confirmé ces résultats après implantation chez le petit rongeur. Une étude in vitro réalisée sur le modèle ovin a permis de montrer l'efficacité de notre implant associé une autogreffe de cellules souches mésenchymateuses autologues pour la régénération de lésions ostéocartilagineuses. Dans l’étude actuelle, nous souhaitons confirmer ces résultats chez la brebis, en utilisant le même modèle d’étude que précédemment pour la régénération cartilagineuse avec comme différence l’utilisation de cellules souches mésenchymateuses (CSM) allogéniques de brebis et d’une membrane déposée en superficie du matériau composite utilisé dans l’étude précédente, au niveau de lésions intra-articulaires du genou. Nous avons développé des biomatériaux résorbables hybrides dans le but de régénérer à la fois le tissu ostéochondral mais également le cartilage articulaire. Ces matériaux sont d’une part nanofibreux et équipés de nanoréservoir contenant de l’hydroxyapatite, pour régénérer l’os sous-chondral et d’autre part, ils sont recouverts d’un hydrogel d’alginate contenant des CSM allogéniques pour la réparation du cartilage articulaire en surface. Une couche superficielle supplémentaire nanofibreuse contenant de la chondroitine sulfate et de l’acide hyaluronique vient recouvrir l’ensemble du biomatériel dans certains groupes à tester. L’hypothèse est que les données apportées par cette étude nous permettrons ainsi de confirmer le potentiel de réparation ostéo-chondrale de ces biomatériaux associés à des CSM allogèniques. L’objectif de cette étude sera d’évaluer l’efficacité sur la régénération du cartilage articulaire de ces implants hybrides.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu à court terme est la validation de l’utilisation de cellules souches mésenchymateuses allogéniques dans la réparation des lesions du cartlilage articulaire chez la brebis. Ce travail fera l’objet d’une publication. Le bénéfice à long terme concerne essentiellement l’être humain. Le but est de traiter les lésions cartilagineuses pour éviter qu’elles aboutissent à une arthrose évoluée nécessitant une intervention de type prothèse. Ce serait un bénéfice (une économie) en termes de coût de la santé. Il est nécessaire de tester cette hypothèse sur un modèle gros animal avant de proposer ce type de traitement chez l’être humain (principe de précaution) car les tests sur des petits animaux ne sont pas transposables pour des raisons évidentes de taille, d’anatomie et donc de contraintes mécaniques. Les principaux avantages de l’utilisation de cellules allogéniques par rapport aux cellules autologues sont : a/ d’éviter le prélévement de moelle osseuse 2 à 3 semaines avant l’intervention sur le cartilage b/ de pouvoir administrer un nombre connu à l’avance de cellules.
Procédures
Il n'est pas prévu de prélèvement sur animaux vigiles. Tous les gestes seront réalisés sous anesthésie générale. 3 procédures seront utilisées .1. ponction de moelle osseuse (5 min). 2. intervention pour implantation du dispositi (45 min). 3. IRM (3 x15 min)
Impact sur les animaux
Une intervention sur les genoux et douleur post-opératoire au niveau des genoux opérés, traitée par antalgiques adaptés. Tout geste sur une articulation peut entraîner des complications : -Anesthésiques : difficultés à l’intubation, troubles du rythme cardiaque etc … Moyens mis en œuvre = surveillance permanente de l’animal -Per-opératoires : pas de complications per-operatoires prévisibles car - pas de risque de hémorragique puisqu’on est à distance des gros vaisseaux qui sont à la face postérieure du genou. L’hémostase des petits vaisseaux sera faite au bistouri électrique et la brebis n’est pas sous anticoagulant. - Pas de risque de fracture car aucune contrainte sur l’os, seul un geste sur le cartilage - Post-opératoires : comme pour tout geste chirurgical sur une articulation les risques sont : - Une douleur post-opératoire, qui n’est pas certaine mais dont la présence sera détectée par l’observation de l’animal - Un retard de cicatrisation : surveillance quotidienne - Infection : surveillance quotidienne et geste chirurgicale adapté si nécessaire ou euthanasie Déambulation libre en box de 3,5 m x 3,5 m pendant la période de cicactrisation puis jusqu’au 6ème mois, Déambulation quotidienne sur un périmétre plus large.
Devenir
Les 3 brebis prévues pour le prélèvement de moelle osseuse, pourront être replacées dans l’élevage. Ce prélèvement ne modifie en rien leur état. Les 7 brebis opérées devront être euthanasiées pour pouvoir prélever les condyles en vue de l’analyse des implants et de leur effets sur la régénération du cartilage, ainsi que les 6 brebis surnuméraires (3 déjà autorisées, et 3 demandées dans cet avenant).
Remplacement
Ce protocole d’étude respecte la règle des trois R de l’expérimentation animale (Replacement, Reduction, Refinement) grâce à la possibilité d’imagerie non invasive de l’IRM qui permet de suivre l’évolution des lésions sans avoir à faire de prélèvement chez l’animal. L’utilisation de cellules souches mésenchymateuses allogéniques évite une anesthésie supplémentaire car il n’est plus nécessaire de prélever de moelle osseuse autologue. Il n’y a pas d’alternative non animale pour étudier le cartilage articulaire. Suite à des études in vitro, nous avons montré l’efficacité des implants 3D des chondro-, ostéo-inducteurs et des CSM en termes de régénération ostéochondrale. La principale limite des études-in vitro est l’absence de contrainte biomécanique et son effet sur l’implant et la cicatrisation. Le passage sur animal vivant est ensuite indispensable pour valider notre approche. Il n’est actuellement pas légal de tester chez l’homme une technique innovante sans l’avoir testé chez l’animal quand cela est possible (principe de précaution)
Réduction
Une première étude a été faite sur ce même schéma avec 4 brebis mais en utilisant des CSM autologues, confirmant leur utilité dans la réparation des lésions cartilagineuses.
Raffinement
Dans le protocole actuel le même schéma est reproduit avec comme différence l’utilisation des CSM allogéniques et dans un des groupes une membrane superficielle sensée améliorer la cicatrisation du cartilage. Les 4 brebis de la première étude (opérées des 2 genoux) ont pu être toutes suivies jusqu’au terme de l’expérimentation, ce qui a permis de valider le concept de l’implant utilisé. Cependant sur un aussi petit effectif un incident (problème à l’anesthésie, mauvaise récupération post-opératoire, infection du site opératoire) la perte d’un seul animal peut compromettre le résultat de l’ensemble de l’étude et donc finalement avoir inclus inutilement les autres animaux. Pour pallier cela et augmenter les chances d’atteindre les objectifs scientifiques il est prévu d’augmenter le nombre d’animaux à 7 brebis minimum pour pallier aux éventuels incidents rendant inexploitable une implantation chez l’un des animaux. 3 brebis supplémentaires ont déjà été autorisées afin de comparer l’efficacité des cellules allogénique du premier groupe aux cellules autologues de ce nouveau groupe. 3 de plus font l'objet de cet avenant, afin de tester le même implant avec des cellules autologues (provenant des 3 brebis de l’avenant d’octobre 2022) et allogéniques sur 6 brebis (les 3 brebis ayant fourni les cellules, et 3 brebis supplémentaires faisant l’objet de cet avenant) en induisant l'arthrose à l'aide d'une curette. Les point limites attendus sont : - Une prostration avec abattement et anorexie en cas de douleur importante, difficulté à se déplacer ; - Fièvre, abattement, polynée en cas d’infection post opératoire.
Choix des espèces
La brebis est le modèle gros animal reconnu pour l’étude de l’arthrose. Les brebis agées de 2 à 4 ans sont le modèle animal utilisé habituellement dans les autres études sur le cartilage. Pour ne pas induire une variable supplémentaire par rapport aux études existantes il a été décidé de conserver ce sexe et cette tranche d’age .
Caractérisation par électrophysiologie des cellules engrammes de l’hippocampe de souris (2023-E-020)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie du crâne avec injection d'un lentivirus dans l'hippocampe, puis un conditionnement de peur reposant sur des chocs électriques aux pattes suivi d'un test de rappel, avant d'être euthanasiées pour prélever le cerveau. Le porteur décrit ces chocs comme de "faible intensité" et de courte durée. Il indique viser à terme de nouvelles approches thérapeutiques du syndrome de stress post-traumatique chez l'Homme, un bénéfice renvoyé à des recherches ultérieures.
Objectifs
La mémoire est un processus permettant aux êtres vivants de stocker des informations afin de mieux s’adapter à leur environnement. Les souvenirs sont formés grâce à des changements à long terme dans les neurones du cerveau appelés cellules engrammes. L’objectif de ce projet est de mieux évaluer les propriétés électriques des cellules spécifiques de la mémoire, situées au niveau de l’hippocampe, région cérébrale de stockage de la mémoire, en lien avec une tâche d’apprentissage.
Bénéfices attendus
La formation de souvenirs mal contrôlée peut devenir traumatique, comme c’est le cas lors du développement du syndrome de stress post-traumatique. Ce projet permettra de mieux comprendre les propriétés électriques des cellules de la mémoire, dans le but de développer de nouvelles approches thérapeutiques chez l’Homme afin de traiter le syndrome de stress post-traumatique.
Procédures
Procédure chirurgicale: -Administration en sous cutanée d’anti inflammatoire (par exemple, Type Carprofene, 20 mg/Kg SC) ou de morphinique (Type Buprénorphine, Buprecare, 0,1 mg/kg; SC) 30 minutes avant l’anesthésie (maximum 30 secondes) -Anesthésie de la souris par inhalation (induction : 4-5% isoflurane et maintien 0.5-1.5% d’isoflurane) (maximum 5 minutes) -Application d’un gel ophtalmique (type Ocrygel) dès que l’animal est endormi afin d’éviter le dessèchement de la cornée. (maximum 2 minutes) -Injection d’un analgésique local en sous-cutané au niveau de la zone à inciser (maximum 30 secondes) -Placement de la souris profondément endormie dans un appareil spécifique et adapté pour ce type de chirurgie (maximum 5 minutes) permettant le maintien fixe de l’animal. -Vérification du niveau d’anesthésie de l’animal en permanence en observant son rythme respiratoire et l’absence de réflèxes(maximum 15 secondes) -Incision de la peau (envion 1.5 cm) au-dessus du crâne et désinfection de l’épicrâne (Type Vétédine) (maximum10 minutes). -réalisation de 2 trous au niveau du crâne au dessus de notre structure d'intérêt (30 secondes) -injection du lentivirus (maximum 15 minutes) -Fermeture de la plaie à l’aide d’agrafes (maximum 5 minutes) Conditionnement de la peur : 5 minutes (au maximum 3 chocs électriques de 2 secondes de faible intensité au niveau des pattes), test de rappel de la mémoire (3 minutes)
Impact sur les animaux
Ce projet sera réalisé sur des souris qui ne présentent pas de symptôme de maladie. Suite à l’injection de virus dans le cerveau, les animaux peuvent présenter des signes de douleur malgré les précautions prises pendant la phase de chirurgie (analgésiques, anesthésiques) et en post-opératoire. Lors du conditionnement à la peur, les chocs électriques sont de faible intensité et de courte durée, permettant ainsi de minimiser le stress induit tout en assurant des résultats robustes et reproductibles et en limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés afin de réaliser les coupes cérébrales et procéder aux enregistrements de l’activité cérébrales sur ces coupes.
Remplacement
L'organisation des réseaux neuronaux peut être étudiée sur des coupes cérébrales de rongeurs par des enregistrements électriques. Ces expériences ne peuvent pas être reproduites, ni étudiées dans des modèles de cultures cellulaires in vitro. Nos expérimentations au sein de la société, même si elles nécessitent l’utilisation d’animaux, sont pratiquées avec un souci permanent de réduction du nombre d’animaux et de bien-être pour nos animaux en expérimentation.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme adapté. Les résultats seront analysés par des tests statistiques. Nous adapterons les tests statistiques en fonction des observations.
Raffinement
Avant la chirurgie, une période d’acclimatation des animaux d’au moins 5 jours sera respectée. Pendant la chirurgie, des mesures seront mises en place afin de réduire au maximum la douleur : anesthésiques (en pré-opératoire) et analgésiques (en pré- et post-opératoire), gel ophtalmique, maintien d'une température constante (tapis chauffant). Une période de récupération post-chirurgicale d’au moins 10 jours sera respectée. Dès réception des animaux, une observation journalière sera mise en place. Des points limites préalablement définis et adaptés permettront d’assurer un suivi de l’état général des animaux (souffrance, angoisse…) et de préserver leur bien-être. En cas d’altération de l’état de l’animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérite de la douleur observée. L'atteinte d'un point limite entraînera la mise en place d'interventions précoces et adaptées et des procédures de modifications de soins pourront être mises en œuvre en cas de besoin . Les animaux exprimant des signes permanents de douleur seront exclus de l’étude et euthanasiés immédiatement, sur décision du directeur de l'étude et/ou du vétérinaire désigné.
Choix des espèces
Nos expérimentations sont réalisées chez la souris, dont l’étude est extrêmement répandue au sein des laboratoires de recherche en Neurosciences, rendant les résultats pertinents pour la communauté scientifique nationale et internationale. Au laboratoire, le syndrome de stress post-traumatique peut être facilement modélisé chez la souris par l’utilisation du conditionnement contextuel de peur qui consiste à associer un évenenement ou un contexte neutre à une stimulus aversif. Ainsi, La présentation du stimulus neutre parvient alors au bout d’un certain temps à déclencher à lui seul l’anxiété. De plus, nous pourrons utiliser une lignée particulière de souris qui permet un marquage spécifique d’une population de neurones, associés au conditionnement. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines d’âge minimum (âge de maturité sexuelle).
Influence de deux acides gras (oléate et palmitate) dans l’infection au Sars-Cov-2
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles reçoivent des injections intraveineuses d'acides gras, une injection ou une nébulisation de pseudoparticules virales, des mesures de fréquence respiratoire et cardiaque, puis un prélèvement sanguin terminal. Le porteur attend potentiellement une difficulté à respirer, voire la mort des souris, les pseudoparticules au contact des acides gras étant cytotoxiques in vitro. Il justifie le recours à l'animal par la "nécessité" de valider dans un "organisme entier et complexe" une hypothèse déjà obtenue en culture cellulaire.
Objectifs
Il est connu que pour entrer dans les cellules, le virus Sars-Cov-2 responsable de la pandémie de Covid-19 doit se fixer à un récepteur, le récepteur ACE2 (Angiotensin Converting Enzyme-2). Considérant les profils cliniques des patients atteints de covid sévères, nous avons voulu vérifier in vitro l’impact d’acides gras dans cette infection. Nous avons alors réalisé des études in vitro sur différentes lignées cellulaires et il s’avère que sur des lignées dépourvues du récepteur ACE2 et en présence d’acides gras, le virus était capable de tuer ces cellules. Notre hypothèse est donc qu’il existe un autre moyen au virus pour tuer les cellules. Nos études in vitro ont été réalisées avec du virus fonctionnel et avec des particules de virus inactivées appelées pseudoparticules. Nous souhaitons ici vérifier cette hypothèse en testant deux acides gras et deux voies d’administration des pseudoparticules chez des souris naturellement dépourvues du récepteur ACE2 humain, le Sars-Cov-2 ne se liant pas à l'ACE2 murin.
Bénéfices attendus
Dans cette étude, des souris dépourvues du récepteur ACE2 humain seront utilisées. Si des altérations au niveau des poumons sont observées en présence d’acides gras, cela révèlera la présence d’un second mécanisme d’entrée du virus dépendant de la présence d’acides gras mais indépendant du récepteur ACE2. Il y aura donc d’autres recherches à mener pour identifier cette seconde voie d’entrée, la bloquer et ainsi bloquer l’entrée du virus. Une fois que les deux mécanismes d’entrée du virus dans les cellules seront bloqués (via ACE2 et via le second mécanisme), le virus ne pourra plus se multiplier et provoquer de graves maladies telles qu’observées lors de la pandémie de Covid-19.
Procédures
Les souris seront soumises à 3 injections intraveineuses (3x2min) d’oléate ou de palmitate, 1 injection intrapéritonéale (1min) ou 1 nébulisation de pseudoparticules (30min). Elles seront soumises à une mesure de fréquence respiratoire (5min) et cardiaque (20min). Un prélèvement sanguin (1min) unique sera réalisé à la fin de la procédure juste avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
Les souris seront isolées 30min durant la nébulisation, 5min pendant la mesure de fréquence respiratoire et 20min pendant la mesure de fréquence cardiaque. D'après nos études in vitro, les pseudoparticules en contact de différents acides gras sont cytotoxiques, nous attendons potentiellement une difficulté à respirer, voire une mortalité des souris.
Devenir
A la fin de la procédure, toutes les souris seront mises à mort.
Remplacement
Notre hypothèse selon laquelle il existe un second mécanisme d’entrée du virus dans les cellules dépendant des acides gras a déjà été validée in vitro. Nous souhaitons maintenant la valider in vivo, dans un organisme entier et complexe. Des dosages et caractérisations seront effectuées sur les sérums et organes des souris afin d’identifier le rôle des acides gras dans le mécanisme d’entrée du virus dans les cellules.
Réduction
Le nombre de souris a été déterminé statistiquement pour être nécessaire et suffisant pour répondre à notre hypothèse. Des études statistiques seront également réalisées à postériori pour comparer les groupes 2 à 2.
Raffinement
Les gestes effectués sur les souris seront effectués par du personnel entrainé et tout sera mis en œuvre pour assurer le bien-être des animaux. Les souris seront par groupe de 4 ou 6 dans des cages adaptées et leur bien-être sera évalué tous les jours. La température et l'hygrométrie ambiantes seront également suivies quotidiennement et maintenues respectivement entre 20 et 24°C et entre 35 et 75%. Leur milieu sera enrichi avec un objet en plastique rouge transparent tout au long de l’étude et avec des bâtons de coton pour créer un nid. Les souris seront observées quotidiennement et cette surveillance sera accrue durant les 3 jours d’étude. En cas d’atteinte d’un point limite, la décision de mettre à mort la souris selon une méthode réglementaire, sera prise par le responsable du bien-être animal.
Choix des espèces
Nous envisageons d’effectuer la suite de ce projet sur des souris K18-hACE2 (modèle COVID) de fond génétique C57Bl6, c’est pourquoi cette étude sera effectuée sur cette souche de souris. Souris âgées de 6 mois. Les patients atteints de Covid sévère sont en majorité des personnes âgées, c'est pourquoi nous avons choisi de travailler avec des souris âgées.
Caractérisation comportementale et pharmacologique de trois modèles murins de stress chronique : évaluation de leur pertinence pour l’étude de la dépression
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles sont soumises à trois protocoles de stress chronique, dont un modèle de défaite sociale fondé sur des agressions physiques répétées, que le porteur décrit comme le plus sévère, induisant douleur physique et psychique et un état de stress durable. Les deux autres protocoles enchaînent des situations désagréables provoquant peu ou pas de douleur physique. Toutes les souris sont tuées pour prélever le cerveau, l'objectif déclaré étant de comparer ces modèles de dépression et, à terme, de réduire le nombre d'animaux utilisés au laboratoire.
Objectifs
Les troubles dépressifs sont la principale cause d’invalidité dans le monde. Cependant l’efficacité des antidépresseurs est insuffisante chez un grand nombre de patients, ce qui nécessite une meilleure caractérisation des mécanismes neurobiologiques de la maladie ainsi que l’investigation de thérapies alternatives. Il est donc essentiel de développer des modèles précliniques liés à l’exposition à des événements stressants (« stresseurs ») générant des phénotypes comportementaux récapitulant au mieux certains aspects de la pathologie humaine. Nous proposons de comparer trois protocoles de stress chez la souris : le stress de défaite sociale (SDS), le stress variable chronique (SCV), et le stress chronique imprédictible (SCI). Ces trois protocoles diffèrent par la nature, la durée et l’intensité des stresseurs appliqués. La littérature suggère qu’ils ont également des conséquences qui peuvent être différentes sur l’expression des comportements anxiodépressifs selon les individus et le sexe. L’objectif est donc de comparer ces modèles au niveau des comportements anxiodépressifs qu’ils provoquent à différents points dans le temps. Si ces modèles s’avèrent pertinents pour l’étude de la dépression, nous explorerons leur profil de réponse à un antidépresseur couramment utilisé. Ces recherches permettront d’instaurer une diversité de modèles d’étude sur la dépression dans notre laboratoire, et ont le potentiel de mener au développement de thérapies innovantes et différenciées selon le sexe et l’individu. Nous attendons que ces modèles génèrent des résultats différents : par exemple, il est attendu que le SDS ait un impact plus important sur les phénotypes liés à l’interaction sociale étant donné la nature du stresseur par rapport au CVS ou au SCI. Ces différences sont une richesse, le but étant de modéliser différents symptômes présents chez les patients humains en utilisant plusieurs modèles précliniques. Concrètement, le développement et la validation de ces modèles nous servira dans la plupart de nos études postérieures : par exemple, dans nos études sur la neurostimulation ultrasonore et magnétique, qui sont des traitement alternatifs potentiels aux antidépresseurs. Tester ces nouveaux traitements dans ces modèles de stress nous permettra d’une part d’évaluer l’efficacité de ces traitements par rapport aux antidépresseurs, d’autre part de tester ces traitements dans différents types de stress.
Bénéfices attendus
Ce projet pourra permettre une meilleure utilisation utilisation des modèles précliniques de maladies neuropsychiatriques murins grâce à une caractérisation plus détaillée de trois modèles de stress différents couramment utilisés. Il pourra également identifier de potentielles différences dans les effets du stress ou du traitement antidépresseur selon le protocole, le sexe et les individus. De manière importante, il réduira l’utilisation d’animaux sur le long terme dans notre laboratoire en établissant des protocoles de stress reproductibles et en éliminant des protocoles peu reproductibles. Ces modeles seront par ailleurs essentiels à une meilleure compréhension des substrats neurobiologiques sous-tendant les atteintes aux différentes dimensions comportementales observées dans les pathologies psychiatriques liées au stress. En effet ces études nécessitent la mise en place d’outils d’imagerie de précision (exemple : imagerie calcique), combinés à des approches mécanistiques (modification d’expression de gènes, optogénétique, électrophysiologie, etc), pour la plupart nécessitant des chirurgies stéréotaxiques, et pour lesquelles il est essentiel de disposer d’un modèle comportemental fiable et reproductible.
Procédures
Le modèle de SDS (stress de défaite sociale) est le plus sévère des trois modèles proposés. Celui-ci étant fondé sur des agressions physiques répétées, il induira de la douleur physique (de très courte durée, sauf en cas de blessure où elle sera prise en charge par les expérimentateurs) et psychique, ainsi qu’un état de stress aigu pendant la procédure qui deviendra durable après les répétitions (l’impact comportemental constaté dans la littérature est présent jusqu’à 3-4 semaines). Cela induit des comportements anxio-depressifs chez les souris exposées au modèle. Les deux autres modèles provoquent peu ou aucune de douleur physique et consistent en des enchaînements répétés de situations désagréables. L’objectif final de cette étude étant de comparer les modèles puis d’étudier les substrats neurobiologiques des changements comportementaux pertinents pour nos études ayant été validés par la littérature dans ces modèles, il est essentiel de les caractériser. Ces comportements anxio-dépressifs seront évalués par différents tests : l'apathie est mesurée par un test d'éclaboussement du pelage par une solution de sucrose sur 5 minutes, l'état du pelage évalue les mêmes symptômes (mesure hebdomadaire avec préhension des animaux), le test d'hyponéophagie évalue l'anxiété (privation de nourriture 12-24h puis mise en présence de nourriture pendant 5 minutes), l'open field, la boîte claire obscure et le labyrinthe en croix surélevé également (5 minutes dans l'arène), le test de préférence au sucrose évalue l'anhédonie (24h d'accès à une solution sucrée sur 5 jours), le test de nage forcée évalue les symptômes d'abandon (6 minutes). Les tests d'interaction sociales ont lieu sur des plages de 10 minutes qui peuvent être répétées sur 3 jours. De plus, si ces modèles de stress s'avèrent être pertinents, nous caractériserons également leur profil de réponse à un antidépresseur (fluoxétine dans l'eau de boisson 5 semaines) afin de pouvoir comparer avec les réponses aux traitements chez l'humain.
Impact sur les animaux
Le modèle de SDS est le plus sévère des trois modèles proposés. Celui-ci étant fondé sur des agressions physiques répétées, il induira de la douleur physique (de très courte durée, sauf en cas de blessure où elle sera prise en charge par les expérimentateurs) et psychique, ainsi qu’un état de stress aigu pendant la procédure qui deviendra durable après les répétitions (l’impact comportemental constaté dans la littérature est présent jusqu’à 3-4 semaines). Les deux autres modèles provoquent respectivement peu et aucune douleur physique. L’objectif final de cette étude étant de comparer les modèles puis d’étudier les substrats neurobiologiques des changements comportementaux induits par chaque modèle, et des comportements anxio-dépressifs pertinents pour nos études ayant été validés par la littérature dans ces modèles, il est essentiel de les caractériser. L'administration d'antidépresseurs chez les animaux modèles et contrôles se fera dans l'eau de boisson sur 5 semaines. Aucun effet indérisable de l'antidépresseur n'est attendu : en effet, il sera administré directement dans l'eau de boisson afin d'éviter le stress lié aux injections répétées, et sera utilisé à une dose standard qui ne provoquera pas de nuisances visibles chez l'animal. De fait, l'effet d'un tel traitement est souvent bénéfique : il a été observé dans de mutiples études chez la souris un rétablissement des comportements liés au stress (diminution voire disparition des comportements anxio-dépressifs obtenus suite aux modèles de stress) à la suite d'un traitement chronique.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issu des expériences afin de récupérer les cerveaux pour des études histologiques. Ces études histologiques permettront de décrire les effets de chaque protocole de stress au niveau cérébral afin de mieux comprendre les mécanismes en jeu.
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale nécessite également l’utilisation d’animaux.
Réduction
Les effectifs sont optimisés, les analyses comportementales nécessitent une taille d’effectifs suffisante compte tenu de la variabilité inter-individuelle. Les effectifs seront adaptés en fonction de la taille des effets et deux cohortes seront utilisées au lieu de trois dans la première partie si nous trouvons les conditions adéquates dès la première cohorte. Egalement, la seconde partie sera abandonnée si nous n’obtenons pas de résultats dans la première partie. La stratégie des trois cohortes suit une analyse statistique a priori utilisée de manière standard dans la communauté scientifique.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu. Les animaux sont hébergés une semaine avant l’initiation des expériences. Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. En cas de blessure, les animaux recevront un traitement analgésique . En cas d’hypothermie, chaque animal est placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie. Une surveillance accrue d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris montrant des signes de mal-être et intervenir si nécessaire . Les éxpérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. Des points limites gradés sont appliqués et la décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout d’une semaine.
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, l’implémentation d’un modèle de dépression et de neurostimulation, ainsi que la possibilité d’utiliser des technologies permettant l'étude détaillé du cerveau. Les animauxseront adultes au début de l’étude car il s’agit de comprendre ces phénomènes comportementaux associés à un cerveau adulte.
Optimisation d’un traitement de thérapie génique pour l’hypophosphatémie liée au chromosome X
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
366 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Reproduisant un rachitisme génétique lié au chromosome X, elles reçoivent une injection unique d'un virus-médicament, puis des prélèvements sanguins rétro-orbitaux répétés cinq à vingt fois sur trois à dix-huit mois, avec des mesures morphologiques et un test de la grille inversée. Le porteur indique n'attendre aucun effet secondaire du traitement, les nuisances se limitant au stress de contention et à la douleur des piqûres. Il affirme que les résultats sur cellules "ne reflètent pas toujours" ceux obtenus chez l'animal, ce qui justifie le recours à la souris.
Objectifs
Notre projet a pour but de développer une solution thérapeutique pour les patients atteints d’hypophosphatémie liée au chromosome X (XLH). L’XLH est la forme de rachitisme génétique la plus fréquente touchant 1 naissance sur 20 000 chaque année. Cette maladie métabolique rare se traduit principalement par des malformations squelettiques. Les patients sont de petite taille et souffrent de douleurs osseuses, dentaires, et musculaires. Leurs os sont plus fragiles et les fractures nombreuses. Deux traitements sont actuellement disponibles, mais ils présentent des limitations importantes : i) leur efficacité est transitoire et/ou partielle et nécessite une réadministration fréquente; ii) ils peuvent provoquer des effets néphrotoxiques sévères. C’est pourquoi nous développons une alternative par thérapie génique, qui a le potentiel de guérir les patients en une seule administration. Ce projet va nous permettre d’identifier chez le modèle murin de XLH, un traitement sûr et efficace.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mettre au point, chez un modèle murin, un traitement sûr et efficace pour la maladie XLH. Nos précédents travaux ont permis d’établir la preuve de faisabilité d’une approche par thérapie génique. Dans ce projet, qui durera 5ans, nous voulons améliorer le produit que nous avons conçu et réaliser l’ensemble des études nécessaires à son développement vers la clinique. Les résultats obtenus nous permettront alors d’envisager une solution thérapeutique pour patients XLH, efficace sur le long-terme, afin de stopper l’évolution de leur pathologie. Les bénéfices attendus concernent donc directement l’amélioration de l’état de santé des malades et de leur qualité de vie.
Procédures
Les animaux seront injectés une seule fois avec des virus médicaments dans la veine temporale ou les sinus rétro-orbitaux selon l’âge des souris. Ce geste dure moins de 30 secondes. Les animaux seront anesthésiés par voir gazeuse (isoflurane) puis prélevés en sang au niveau des sinus rétro-orbitaux. Ce geste dure moins de 30 secondes. OEil gauche et oeil droit seront alternés. Ce geste sera réalisé entre 5 et 20 fois, en 3 à 18 mois. Les mesures morphologiques (taille du corps, taille de la queue) seront réalisées juste après les prélèvements de sang afin d’éviter une autre anesthésie. Ce geste dure moins de 30 secondes. Ce geste sera réalisé entre 5 et 20 fois, en 3 à 18 mois. Le test de la grille inversée sera réalisé entre 5 et 20 fois, en 3 à 18 mois. Nous réalisons ce test couramment dans d’autres projets, et aucun traumatisme physique n’a été observé. Ce test dure 3 minutes et le nombre de chutes par minute est comptabilisé.
Impact sur les animaux
Traitement injecté : aucun effet secondaire n'est attendu suite à l'injection du traitement. Traitement des souris HypDuk : diminution des problèmes liés à la maladie (augmentation taille et poids des souris) Injection : Stress lié à la contention + douleur liée à la piqure d'aiguille. Prise de sang : Stress lié à la contention + douleur liée à la piqure. Mesures morphologique : Réalisé sur souris endormies lors du prélèvement de sang : pas de stress supplémentaire. Test musculaire : Stress lié à la manipulation. Euthanasie : Stress lié à la manipulation. Souris HypDuk : pas de douleur quotidienne lié à la maladie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Dans un premier temps, nous avons réalisé un premier tri de nos candidats sur des cellules en culture. Ces tests nous ont permis d'éliminer les candidats produisant une trop faible quantité de protéine. Néanmoins, par expérience, nous savons que les résultats obtenus sur cellules ne reflètent pas toujours les résultats obtenus chez l'animal et ne permettent pas d’identifier si l’approche permet de traiter les symptômes de la maladie. L’utilisation d’animaux est donc primordiale pour réaliser cette étude car (1) il est nécessaire de tester nos produits sur un corps entier pour observer les effets simultanés sur le foie, les reins et sur les os (2) il est nécessaire d’évaluer la croissance ainsi que la force musculaire des souris (3) il faut obtenir des fluides (sang, urine) pour mesurer les marqueurs de la maladie.
Réduction
Afin de d'utiliser le moins d'animaux possible, nous avons calculé le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir des résultats suffisamment fiable (6 souris par groupe soit 186 souris saines et 166 souris malades). Le nombre de souris déterminé ici est le nombre maximal de souris utilisé, si la deuxième procédure n'aboutit pas à des résultats concluant, nous ne passerons pas aux étapes suivantes ou seulement avec 1 candidat. De plus, nous allons prioriser l'utilisation d'animaux sains (186 souris) lors de la sélection de nos meilleurs candidats, cela permettra d'obtenir des animaux plus rapidement (il est plus facile d'accoupler des animaux sains que malades et le nombre de petits par portée est plus important) et permettra aussi de limiter la génération de souris malade.
Raffinement
Dès leur arrivée en zone d’expérimentation, les souris seront manipulées et contentionnées afin d’être familiarisées aux expérimentateurs et aux gestes expérimentaux. Cette habituation devrait réduire le stress et l’angoisse des animaux. Les souris utilisées lors de ce projet ne présentent pas de signes de douleurs évidents. Les virus utilisés sont non dangereux et les doses utilisées ne sont pas toxiques, de ce fait aucune toxicité n’est attendue. Prélèvements de sang: ils seront réalisés au niveau de la veine mandibulaire sur animal vigile. Une fois le prélèvement terminé, un éventuel saignement sera stoppé par l’application d’une compresse au niveau du point de prélèvement. L’animal sera remis dans sa cage. Si des signes de souffrance venaient à apparaitre, la souris sera pesée et surveillée de manière assidue. En absence d’amélioration sur une semaine, ou en cas de perte de poids supérieure à 20% du poids initial, la souris sera euthanasiée. Le nombre d'accouplement mit en place sera réduit au strict nécessaire afin de ne pas générer de souris inutilisées. Certaines souris générées ne seront pas utilisées (comme les femelles qui ne portent pas la maladie), elles seront rapidement euthanasiées afin de limiter le nombre de souris en élevage.
Choix des espèces
A notre connaissance, les seuls modèles animaux de la maladie XLH sont des modèles murins. Il y a 2 modèles : le modèle HypDuk-B6 et le modèle HypDuk-Balb. Ces deux modèles reproduisent les signes cliniques retrouvés chez les patients XLH. La population de patients que nous visons sera composée d’enfants, de jeunes adultes et des adultes, aussi, nous avons besoin de traiter des souris à des âges qui correspondent à ces étapes chez l’homme (souris de 0-2 jours, de 2 semaines, de 4 semaines et de 6 semaines) et d’évaluer si notre traitement pourra être efficace en : (1) en prévention de la pathologie : le traitement est-il efficace s'il est administré avant l'apparition de symptômes important (traitement des souris les deux premiers jours de vie (=nourrisson)) ? (2) le traitement est-il efficace s'il est administré à l'apparition des premiers signes de la maladie (traitement des souris à 2 ou 4 semaines (=enfant ou adolescent)) ? (3) le traitement est-il efficace s'il est administré une fois que la pathologie est bien établie et que les symptômes sont important (traitement des souris à 6 semaines (=adulte)) ?
Rôle des nanoplastiques de polystyrène dans l’induction de l’épilepsie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes et leurs petits sont exposés à des nanoplastiques de polystyrène dans l'eau de boisson jusqu'à dix mois, puis les descendants reçoivent des électrodes implantées dans le cerveau et une injection d'un composé déclenchant des crises. Le porteur indique que les nanoplastiques provoquent une nuisance faible, mais que la chirurgie d'implantation et les crises peuvent être douloureuses ou stressantes. Toutes les souris sont tuées pour prélever le cerveau, l'objectif étant de tester si l'exposition aux nanoplastiques favorise l'épilepsie.
Objectifs
L'épilepsie est une maladie qui se traduit par une activité électrique anormale du cerveau. Elle touche surtout les enfants, les adolescents et les personnes âgées à des degrés divers. Les causes peuvent être génétiques, mais dans la plupart des cas, elles ne sont pas identifiées. Dans 60% des cas d'épilepsie, on suspecte des lésions du cerveau qui ne sont pas détectées par les méthodes de diagnostiques actuelles. Notre hypothèse est que les résidus de polluants environnementaux pourraient altérer le cerveau au moment de sa formation et induiraient de l'épilepsie qui apparaitrait plus tard dans la vie de l'individu. Notre objectif est de comprendre si une exposition aux nanoplastiques de polystyrène peut induire de l'épilepsie ou une sensibilité accrue à des stimulants pro-épileptiques chez les souris. Pour cela, nous allons faire des mesures de l'activité électrique cérébrale via des électroencéphalogrammes (EEG) et des observations du comportement dans ces 2 cas. Indépendamment de l'apparition de crises (ou pas), les enregistrements pourront mettre en évidence des modifications de l'activité cérébrale qui pourraient sous-tendre aux troubles du neurodéveloppement liés à l'exposition aux nanoplastiques, ainsi qu'une sensibilité accrue aux stimuli pro-épileptiques. Ceci sera évalué grâce à une injection d'un composé convulsivant, qui, à faibles doses, n'induit pas de réponse chez l'animal sain mais provoque une crise épileptique chez les animaux susceptibles, indicative d'une fragilité du réseau neuronal.
Bénéfices attendus
Le projet aura des bénéfices sur la santé humaine : (i) identification d'un lien entre l'exposition aux nanoplastiques et l'épilepsie; (ii) si les souris développent de l'épilepsie, cela permettrait d'expliquer, en partie, l'origine de certains cas d'épilepsie; (iii) au vu de la quantité de plastiques rejetés dans l'environnement, il a été évalué que les êtres humains ingèrent l'équivalent d'une carte bancaire par semaine (5 g par personne et par semaine). Nos recherches pourraient pousser les autorités à prendre des mesures plus drastiques pour limiter l'usage des plastiques dans les emballages alimentaires et protéger la santé des populations les plus fragiles étant donné que des études récentes ont montré que les nanoplastiques pénètrent dans le cerveau.
Procédures
Trois interventions : 1) Exposition aux nanoplastiques de polystyrène dans l'eau de boisson sur femelles gestantes et leurs petits jusqu'à 10 mois d'âge. Nombre femelles gestantes = 36 et progéniture = 156. 2) Implantation d'électrodes dans le cerveau des souris (progeniture) en vue d'enregistrements électro-encéphalogrammes (EEG). Durée de la chirurgie = 40 minutes maximum. 7-10 jours entre l'implantation et les enregistrements. Nombre d'animaux = 156. 3) Une seule injection de composé pro-épileptique lors de la deuxième session d'enregistrement EEG. Durée du geste: 30 s maximum. Nombre d'animaux = 156.
Impact sur les animaux
D'après nos résultats préliminaires, l'administration de nanoplastiques dans l'eau des biberons induit une nuisance faible, voire inexistante. L'éventuelle survenue de crises épilepsies peut être source de stress pour l'animal. Il est difficile de savoir si une douleur est associée aux crises motrices (secousses) mais chez l'humain il n'y a pas de douleur rapportée en cas de crise. Concernant l'implantation des connecteurs EEG, la chirurgie en soi pourrait induire une douleur, bien que tout soit mis en place pour minimiser ces effets. La chirurgie sera effectuée sous anesthésie générale après injection d'anesthésiants. Ces injections peuvent engendrer une légère douleur locale. Un spray anesthésiant est également appliqué dans les oreilles afin d'éviter une douleur locale au réveil. Concernant les suites post-opératoires, et d'après notre expérience, ce type de procédure n'engendre pas de signes de douleur, ni d'infection. L'enregistrement des EEG pourrait engendrer un léger stress dû au changement d'environnement.
Devenir
A l'issue de la procédure tous les animaux seront euthanasiés et leur cerveau prélevé pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet, il nous est impossible de remplacer l'animal vivant pour l'étude de l'épilepsie induite par l'exposition chronique aux nanoplastiques. En effet, les phénomènes physiopathologiques que nous souhaitons étudier sont très complexes et ne sont pas reproductibles à ce jour par des modèles in vitro, ni par modélisation. La souris demeure le meilleur choix, surtout en vue de l'existence de souris modèles d'épilepsie.
Réduction
Pour ce projet nous envisageons d'utiliser 210 souris sur la durée du projet. Le nombre d'animaux adéquat a été calculé grâce à un logiciel permettant d'avoir des analyses robustes. Nous avons également tenu compte de notre expertise de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en en gardant un nombre suffisant d'animaux pour ne pas compromettre la validité statistique des expériences qui seront menées. Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées.
Raffinement
Concernant le traitement par les polluants, les industriels ne sont pas tenus de faire des tests de toxicité pour les résidus de plastiques car à ces faibles doses, il n'est pas attendu de toxicité. Par ailleurs, des études préliminaires conduites au laboratoire n'ont pas montré de signes de souffrance chez les animaux exposés pendant 10 mois à ces concentrations de nanoplastiques. La chirurgie sera effectuée sous anesthésie générale, après injection d'anesthésiants. Un spray anesthésiant est également appliqué dans les oreilles afin d'éviter une douleur locale au réveil. Les animaux seront hébergés en groupe, sauf lors de l'implantation des dispositifs nécessaires pour enregistrer l'activité cérébrale, afin d'éviter le risque de blessure mutuelle (par ex. connecteurs arrachés). L'environnement sera enrichi (copeaux, morceaux de coton, papier, maisonette). Afin de diminuer le stress, les souris seront manipulées quotidiennement par les expérimentateurs avant chaque étape de la procédure expérimentale (chirurgie, enregistrement EEG). L'état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l'expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de bien-être, utilisée sur notre plateau d'expérimentation. Cela nous permettra d'intervenir immédiatement et de manière appropriée en fonction de la grille de score établie et si des signes de souffrance sont détectés (détresse, souffrance, prostration, perte de poids supérieure à 15%, poils ébouriffés) .
Choix des espèces
Dans les modèles d'expositions in utéro aux polluants environnementaux, la souris représente un modèle de choix, pour les raisons suivantes: - ce sont des mammifères donc le mode de transmission des polluants via le placenta et le lait est similaire à l'humain; - des études précédentes sur l'exposition aux plastiques ont permis de mettre en évidence que les nanoplastiques affectent le cerveau et le comportement des souris; - la reproduction et la gestation sont relativement rapides ce qui permet de générer les groupes nécessaires à l'étude assez rapidement; - le nombre de petits par portée est élevé, ce qui permet d'avoir une robustesse dans nos études comportementales, de prendre en compte le sexe dans les groupes et d'avoir des échantillons en nombre suffisant pour les analyses. Les mères (6-8 semaines) seront traitées avec les nanoplastiques de polystyrène à faibles doses avant l'accouplement pendant 1 mois, puis pendant l'accouplement et la gestation. Elles seront en permanence sous traitement à une concentration résiduelle, comme c'est le cas de la population humaine exposée chroniquement aux plastiques tout au long de leur vie. Les petits issus de ces portées seront également soumis aux nanoplastiques de polystyrène à faibles doses pendant le développement (stade foetal), pendant la lactation et jusqu'à la date d'euthanasie prévue des animaux.
Traitement thérapeutique in utero de la souris Moblo, un modèle d’étude de la maladie de Menkes
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
132 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, pour tester un traitement in utero de la maladie de Menkès. Les femelles gestantes reçoivent des injections sous-cutanées cinq jours sur sept, et les souriceaux mâles malades subissent sept tests neurocomportementaux de J3 à J38. Le porteur décrit une mortalité importante des souriceaux non traités et un risque de mort par anévrisme aortique, précédé de perte de poids et d'apathie. Douze femelles sont tuées au vingtième jour de gestation et les mâles à J38, tandis que quarante femelles sont gardées vivantes pour de futurs accouplements.
Objectifs
La maladie de Menkes est une maladie genetique rare au niveau du chromosome X qui a pour conséquence un deficit en cuivre dans l’ensemble de l’organisme. C’est l’incapacite du cuivre a franchir les barrieres biologiques (placenta, intestin, cerveau) qui est responsable de la pathologie. Les traitements actuels sont inefficaces et le devenir des enfants malades reste extremement pauvre avec des troubles graves aboutissant a un deces dans les premieres annees de vie. Les nanoparticules ont la capacite de franchir differentes barrieres biologiques dont la barriere placentaire. Nous suivons une piste therapeutique chez la souris porteuse de cette mutation, par l’utilisation d’un transporteur synthetique du cuivre (TSC) qui permet d’acheminer le cuivre aux organes cibles tels que le cerveau ou le placenta. Nos travaux ont montre une tolerance des souriceaux à ce traitement. Nous avons determine une dose et un rythme d’administration optimaux de TSC, et demontre l’amelioration des signes cliniques chez les souriceaux males malades traites par TSC. Neanmoins, malgre un allongement tres net de l’esperance de vie et un comportement exploratoire plus alerte, nous n’avons pas corrige les troubles squelettiques dont les malformations apparaissent au stade embryonnaire, notre traitement actuel ne demarrant qu’au 5e jour post-natal. De plus, les souriceaux males non traites montrent une forte mortalite a la naissance avec des ratio sexe/genotype non respectes. Les atteintes liees au deficit en cuivre apparaissent des le stade embryonnaire. Notre projet vise a montrer qu’un traitement precoce des souris gestantes porteuses de la mutation va permettre une viabilité plus importante tout en corrigeant les troubles squelettiques des descendants malades. Le gène de la maladie du métabolisme du cuivre étant porté par le chromosome X, les mâles sont fortement touchés. L’étude sera donc menée sur des femelles dites hétérozygotes, i.e. porteuses d’une version mutée et d’une version non mutée du gène responsable de la maladie, et ne déclarant que peu ou pas de symptômes. Les souris mâles hémizygotes, i.e. porteuses d’un exemplaire unique du gène muté et donc souffrant de la maladie, et nées de ces femelles seront également utilisées pour réaliser les tests neurocomportementaux pour certains, tandis que les animaux surnuméraires seront traités tout au long de leur vie afin d’établir une courbe de survie pour ce modèle d’étude.
Bénéfices attendus
1) Une restauration des ratios sexe/génotype avec une diminution importante de la mortalité à la naissance 2) Une croissance squelettique normalisée pour les descendants mâles malades mais traités avec le médicament. 3) Une restauration des fonctions biologiques altérées. 4) Une restauration des fonctions cognitives principales. 5) Une amélioration de la survie.
Procédures
- Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 au cours de la gestation jusqu’au 20e jour de gestation pour les femelles porteuses de la maladie mais non atteintes - Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 au cours de la gestation jusqu’à la mise bas - Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 à partir de J5 et ce jusqu’à la fin du protocole à J38 pour les mâles descendants et porteurs de la maladie - Tests neurocomportementaux au nombre de 7 allant de J3 à J38 pour les souris mâles malades.
Impact sur les animaux
1) Une mortalite importante a la naissance des souriceaux issus de femelles porteuses de la maladie mais non atteintes, et non traitees pendant la gestation. 2) Mort des animaux non traites ou traites par histidine-cuivre liee au risque d’anevrisme aortique. Ce point est previsible dans la plupart des cas notamment avec une stagnation voire une perte de poids, ainsi qu’une apathie et une febrilite (troubles de la mobilite, difficultes d’alimentation). Les études précédemment réalisées ont montré que les souriceaux recevant le TSC avaient une espérance de vie considérablement augmentée, ce qui nous permet de dire que les animaux traités ne subiront pas d’anévrisme aortique grâce au traitement administré. 3) Modification du comportement maternel pendant la gestation et a la naissance (construction du nid, gestion de la portee...) grâce au traitement.
Devenir
Les femelles porteuses de la maladie (mais non atteintes) destinées à l’étude du passage placentaire (au nombre de 12) seront mises à mort au vingtième jour de la gestation, juste avant la mise bas. Les femelles porteuses de la maladie (mais non atteintes) (40) allant jusqu’à la mise bas seront gardées en vie pour de futurs accouplements. Les descendants mâles seront gardés en vie jusqu’à J38 pour ceux destinés aux tests neurocomportementaux (40) dans le but d’effectuer les analyses biochimiques et histologiques. La descendance mâle surnuméraire (40) destinée à l’étude de survie sera gardée vie jusqu’à J100 dans le but de valider les effets bénéfiques du traitement sur la survie. L’âge de survie des animaux mutants non traités ou traitées avec le placebo ou l’histidinate de cuivre (traitement actuel mais inefficace de la maladie de Menkes) est comprise entre 3 et 5 semaines. Au total 132 souris seront impliquées dans ce protocole expérimental.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative d’approche in vitro car le projet porte sur l’étude de l’allongement de la durée de vie, le ratio sexe/génotype dans les portées et l’amélioration de la mobilité et du comportement du souriceau porteur de la maladie de Menkès en fonction de la réponse au traitement.
Réduction
L'etude gestationnelle portera sur 52 femelles au total reparties en 4 groupes de 3 femelles pour la validation du traitement gestationnel. La cohorte de 12 femelles porteuses saines de la mutation, sera mise a mort au 20e jour de gestation dans le but de confirmer les effets positifs potentiels du traitement au cours de la gestation. Au vu des résultats encourageants que nous avons obtenus sur nos travaux portant sur le franchissement de la barrière sangcerveau, et partant du principe que les mécanismes biologiques régissant le transport du cuivre sont similaires au niveau du cerveau et du placenta nous pensons que le TSC franchira cette barrière placentaire. Si les résultats de dosage du cuivre confirment notre hypothèse de transport à travers le placenta, 4 autres groupes de 10 femelles porteuses saines de la mutation seront destinees a l'etude de l'impact du traitement gestationnel sur la descendance male. L’etude comportementale, quant a elle, portera sur 40 souris reparties en 4 groupes de 10 souris malades qui seront etudiés et mis a mort une fois les tests comportementaux termines, a l’age de 38 jours. La courbe de survie sera évaluée à partir d'animaux surnuméraires, selon la même distribution de 40 souris mâles supplémentaires et porteuses de la maladie. Au total 132 souris seront impliquées dans l'étude, un nombre d’animaux necessaire pour mener a bien ce protocole expérimental et obtenir une puissance statistique suffisante. De plus, l’hypothèse faite serait que grâce au traitement, les ratios sexe/génotypes devraient être restaurés et produire au moins 2 mâles mutants par portée. Un mâle sera dédié aux tests neurocomportementaux tandis que le deuxième permettra d’établir une courbe de survie nécessaire pour valider l’effet positif du traitement gestationnel.
Raffinement
Toutes les cages du protocole sont garnies d’éléments enrichissants (coton, buchettes, etc.). Ces éléments permettront notamment aux femelles gestantes de nidifier, ce qui va créer une atmosphère sécurisante pour l’ensemble des souris. Au cours des expérimentations, les souriceaux devant subir un traitement seront isolés de la mère le temps de l’expérimentation (injection et/ou tests neurocomportementaux), et la mère mise à distance, dans le but de réduire le stress maternel. A la fin de l’expérimentation, les petits seront remis rapidement dans la cage avec la mère et isolé au calme (pièce d’hébergement, sans mouvement brusque de la cage). S’agissant d’une maladie génétique, les troubles physiologiques sont présents tout au long de la vie de l’animal et il n’est pas prévu de pratiquer une analgésie qui pourrait d’une part générer un stress supplémentaire lors du traitement quotidien et d’autre part perturber fortement les tests neuro-comportementaux, rendant les résultats inexploitables. Une procedure d’estimation et suppression de la douleur est mise en place : differents elements visuels chez l’animal sont evalues afin d’etablir un score qui permet d’anticiper et d’eviter d’atteindre les points limites : isolement, yeux fermes, dos voute, poils herisses, immobilite, perte de poids, yeux et abdomen creux.
Choix des espèces
La souris ATP7Amoblo est le seul modèle de mutation spontanée permettant une étude de cette pathologie génétique. L'utilisation d'un modèle mammifère, et de souris en particuliers, permet d'étudier l'efficacité du médicament dans l'intégralité d'un organisme vivant proche de l'homme. Ce choix se justifie aussi par la possibilité de faire des liens avec d’autres modèles transgéniques murins utilisés pour l'étude d'autres maladies métaboliques. Nous focaliserons l’étude de la conception jusqu’au-delà du sevrage, à J38 pour les souriceaux destinés aux études neurocomportementales et J100 pour les souriceaux surnuméraires destinés à l’étude de la survie. Ceci nous permettra d’évaluer l’efficacité du traitement du développement embryonnaire et ce jusqu’à l’âge adulte. Les femelles porteuses saines de la mutation seront mises en accouplement à l'âge de 3 à 5 mois, et celles qui subissent le traitement pendant la gestation seront utilisées à nouveau pour maintenir la lignée.
Nociception et douleur dans la maladie de parkinson (modèle 6OHDA dans le faisceau médian du télencéphale)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie de lésion cérébrale d'environ une heure trente reproduisant la maladie de Parkinson, puis sept tests comportementaux évaluant les seuils de douleur et les déficits moteurs. Le porteur indique que la douleur liée au modèle "ne peut être soulagée, car c'est l'objectif de l'étude", et attend perte de poids, déficits moteurs et douleurs post-chirurgicales. Il affirme que la caractérisation de la douleur dans Parkinson nécessite une observation comportementale "uniquement possible chez l'animal vivant et vigile".
Objectifs
La maladie de Parkinson est caractérisée par une perte progressive des neurones dopaminergiques localisés dans la substance noire compacte. Cette maladie est classiquement associée à des symptômes moteurs, cependant il est maintenant reconnu que de nombreux symptômes non moteurs, incluant la douleur, sont très communs. Les symptômes douloureux peuvent être observés chez environ 85 % des patients Parkinsoniens. Le seuil de douleur est également altéré chez les patients Parkinsoniens, présentant ou non des symptômes de douleur. Ces douleurs sont négativement associées avec la qualité de vie des patients, en ayant un impact plus fort que les symptômes moteurs. Ces symptômes de douleurs sont donc un souci majeur dans la prise en charge de la maladie. Les douleurs centrales dans la maladie de Parkinson suggèrent que les circuits cérébraux permettant de percevoir et traiter les informations douloureuses pourraient être dysfonctionnels. Cependant, bien que des traitements nociceptifs anormaux aient été reportés dans certaines structures cérébrales impliquées dans la douleur, il n’y a à ce jour aucune hypothèse pathophysiologique permettant de les expliquer. Notre objectif est d'étudier les mécanismes physiopathologiques corticaux et sous-corticaux à l'origine de la douleur liée à la maladie de Parkinson, en utilisant des approches lésionnelles et comportementales.
Bénéfices attendus
le but de se projet est de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques, potentiellement différentes chez le mâle et la femelle, pour traiter les douleurs associées à la maladie de Parkinson chez l'homme.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie lésionnelle d'une durée d'1h30 environ et 7 test comportementaux. Après un repos post chirurgical de 3 semaines les animaux subiront au maximum 1 test par jour et l'ensemble des tests sera reparti sur 3 semaines. Ces tests auront pour objectif d'évaluer les seuils de nociception ou bien les déficites moteurs. La durée des tests peut aller de 10 minute à 20 minutes.
Impact sur les animaux
La présence de douleur liée à la modélisation de la maladie de Parkinson ne peut être soulagée, car c'est l'objectif de l'étude. Les lésions dopaminergiques peuvent entrainer une perte de poids attendue et des déficits moteurs eux aussi attendue. Des douleurs post-chirurgicales au niveau du crâne sont également attendus aini que des douleurs inflammatoires.
Devenir
les animaux seront mis à mort pour prélèvement
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, la caractérisation de la douleur dans la maladie de parkinson nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Chaque groupe expérimental explorant les comportements douloureux et moteurs liés à la maladie de Parkinson sera constitué afin d’assurer d’un échantillonnage intra groupe suffisant et au moins deux séries d’expérience par test seront réalisées afin de s’assurer de la reproductibilité de nos résultats. Au regard de la littérature, de la variabilité phénotypique interindividuelle, le nombre d'animaux a été établi pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en animalerie dont la température, l’humidité et le cycle jour/nuit sont contrôlés. La nourriture et boisson sont disponibles ad libitum. Ils seront hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Nous travaillerons en cycle jour/nuit (lumière allumée de 8h à 20h). Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Lors des chirurgies des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont utilisées. Des points limites ont été etablis permettant de soustraire l'animal à la souffrance . Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point, une concertation avec la structure du bien etre animal pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques.
Choix des espèces
Le modèle lésionnelle de maladie de Parkinson utilisé dans cette étude a été caractérisé et validé pharmacologiquement chez la souris. De plus, pour de futures études, de nombreuses lignées de souris transgéniques existent et sont disponibles ce qui nous permettra de répondre de façon précise la question des mécanismes physiopathologiques impliqués dans cette comorbidité maladie de Parkinson/douleur. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés pour les tests comportementaux
Effets de trois molécules anti-épileptiques sur les crises audiogènes létales dans la lignée de souris LAGS+ employée comme modèle de SUDEP (mort subite dans l’épilepsie)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issues d'une lignée qui répond à 100 % par une crise convulsive, elles reçoivent une injection d'un médicament anti-épileptique puis une stimulation sonore pouvant déclencher une crise potentiellement mortelle. Le porteur indique que ce modèle sert à mesurer si trois molécules réduisent le risque de mort subite lié à l'épilepsie, et que les souris sont ensuite tuées car le médicament reçu interférerait avec toute autre étude. Le stress provoqué par la stimulation sonore est reconnu, que l'animal réponde ou non par une crise.
Objectifs
Le risque de mort subite chez les patients épileptiques (SUDEP pour SUdden Death in Epileptic Patients ou mort subite chez les patients épileptiques) est trois fois plus élevé que chez les personnes saines. Le meilleur modèle de SUDEP actuel chez la souris correspond à une crise épileptique induite par un stimulus sonore et possiblement suivi du décès. L'objectif du projet vise à évaluer si trois molécules connues pour leurs effets anti-épileptiques et couramment employées chez des patients présentant des épilepsies à fort risque de décès, ont aussi des effets bénéfiques pour directement réduire les risques de décès.
Bénéfices attendus
Une validation d'un bénéfice de ces molécules pour réduire la mortalité devrait permettre d'obtenir une extension de l'AMM (autorisation de mise sur le marché) de ces médicaments pour d'autres formes d'épilepsies à fort risque de décès.
Procédures
Une injection d'un médicament anti-épileptique pratiquées aux 240 souris du projet. Une stimulation auditive d'une durée maximale de 60 sec pratiquées aux 240 souris du projet.
Impact sur les animaux
Un stress induit par la stimulation sonore pour les animaux, qu'ils répondent à la stimulation sonore par une crise ou qu'ils ne répondent pas.
Devenir
Les animaux seront mise à mort puisqu'ils ne peuvent pas être réutilisés pour une autre étude, puisqu'ils ont reçu une injection d'un médicament pouvant interférer avec une quelconque étude.
Remplacement
Ce projet vise à évaluer la capacité de certaines médications avec AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) ou de certaines molécules innovantes en développement, à bloquer ou réduire les risques de décès lors d'une crise d'épilepsie humaine. Les procédures de validation d'une efficacité attendue sont légalement très contraintes et elles reposent sur la capacité objective à supprimer ou réduire le risque de décès mesurée sur un animal vivant modélisant une situation homologue chez l'Humain.
Réduction
Ce projet sera réalisé sur une lignée qui présente 100 % de souris répondeuses au test de la crise audiogène létale. Cette situation permet de minimiser le nombre (n=20) de sujets expérimentés par groupe. Il n’est pas envisageable de descendre en dessous de 20 sujets par groupe car les scores analysés statistiquement sont des moyennes et des pourcentages ; ce dernier représentant le facteur limitant. Enfin, un effet dose à 3 points (puisque 3 doses par AED) correspond au nombre minimal possible de doses, sachant que les laboratoires ont une bonne connaissance des doses à envisager pour évaluer un effet anti-épileptique mais pas pour évaluer un effet ant-létal.
Raffinement
Notre protocole suit des procédures standardisées soucieuses de minimiser le stress et toute souffrance des animaux avec une détermination précise des points limites. Sur le plan de l'élevage et du maintien des souris à l'animalerie, ceci se traduit par une visite quotidienne pour contrôler le bien-être des animaux, l’enrichissement des cages autant que faire se peut, le respect des normes liées aux surfaces/volumes des cages pour éviter la surpopulation ainsi que celles liées aux plages acceptables pour la température et l’hygrométrie. Sur le plan du test lui-même, ceci se traduit par une durée limitée de stimulation auditive (max 60 sec), une utilisation d'une arène circulaire pour éviter des cognements dans les angles. Il faut aussi mentionner que la convulsion en elle-même ne dure pas plus de 8 sec dans 99 % des cas.
Choix des espèces
Les travaux sur l'évitement des décès dans l'épilepsie ne peuvent pas, par essence, s'affranchir de l'expérimentation animale qui nécessitent d'expérimenter l'animal et d'observer possiblement son décès. L'AGS est un modèle de choix pour l'étude de la SUDEP car aucun facteur systémique (chimique ou électrique) n'est pas l'origine de la crise létale, pouvant être co-responsable du décès de l'animal. L'AGS n'est pas létale chez le rat, rendant impossible l'emploi de ce modèle. Enfin il n’est pas envisageable d’instrumenter (ECG, EEG, respiration) sur des animaux plus petits que l’espèce souris. Ces approches ne sont pas envisagées dans ce projet mais elles ne seront dans des projets ultérieurs visant à comprendre comment les AED pourraient réduire les décès dans les modèles expérimentaux. Les animaux seront testés à 30-40 jours d'âge, au moment où ils devraient être sevrés.
Maintien des lignées de souris Delta F508 et CFTR à phénotype dommageable.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système respiratoire
800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour maintenir et produire deux lignées reproduisant la mucoviscidose. Ces souris présentent un phénotype dommageable, amaigrissement, difficultés respiratoires et constipation, atténué par un laxatif administré en continu dans l'eau de boisson. Les descendants homozygotes et sauvages sont expédiés à des équipes collaboratrices, les hétérozygotes réutilisés pour la reproduction ou mis à mort. Le porteur affirme que l'étude de cette maladie génétique ne peut se faire que sur un "organisme vivant entier", au motif des interactions entre organes et microbiote.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de maintenir et produire des lots expérimentaux de deux lignées à phénotype dommageable : souris Delta F508 et CFTR. Ces 2 lignées touchent le gène CFTR mais les 2 modifications génétiques sont différentes. Pour la lignée CFTRUNC, le gène CFTR a été modifié afin que celui-ci ne soit plus actif. Cette lignée créée par une équipe américaine a été envoyé en France en 1993 à la demande de l’association Vaincre la Mucoviscidose (anciennement AFLM). Pour la lignée CFTR deltaF508, la mutation est créée dans le gène CFTR en 1995 par une équipe Néerlandaise , celle-ci est identique à celle observée chez certains patients atteints de mucoviscidose. L’association Vaincre La Mucoviscidose est propriétaire des élevages de ces deux lignées dans notre établissement. Elle lance annuellement des appels à projets de recherche sur la mucoviscidose, valide scientifiquement ceux qui seront autorisés à recevoir des lots d’animaux. Notre établissement reçoit la liste des lauréats retenus par l’association et organise les élevages pour être en mesure de distribuer les lots aux chercheurs selon les consignes données. Les souris Delta F508 et CFTR présentent des symptômes proches de ceux des patients atteints de la mucoviscidose : amaigrissement, difficultés respiratoires ou constipation. Ces souris fragiles doivent donc être hébergées dans un environnement propre et à faible empoussièrement (isolateur ou portoir ventilé). Afin de limiter les symptômes, un laxatif doux est administré en continu dans l’eau de boisson et une nourriture riche en protéines/lipides et vitamines doit leur être apportée. Le laxatif doux est un médicament de santé humaine mais il n’existe pas d’équivalence en spécialité vétérinaire aussi efficace et bien toléré par nos souris. Le phénotype dommageable de ces lignées est présent seulement à l’état homozygote. Cependant, le laxatif ainsi que l’alimentation plus riche seront donnés à tous les individus. L’apparition des symptômes est plus précoce et plus marqué chez la lignée CFTR que la lignée Delta F508. Nous pouvons observer les premiers signes dès l’âge de 10 jours. Les expéditions de ces animaux ont lieu vers l'âge de 8- 10 semaines. Seuls les animaux qui présentent un score de 0 seront expédiés aux chercheurs. Une grille de scoring et des points limites seront mis en place.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de fournir des animaux aux porteurs de projet de l’association Vaincre La Mucoviscidose. Les souris Delta et CFTR sont à ce jour les modèles murins les plus utilisés dans la recherche fondamentale sur la mucoviscidose. Notre établissement possède une expertise reconnue dans le maintien des lignées fragiles, nous sommes en capacité de maintenir ces lignées dans les meilleures conditions pour limiter au maximum la souffrance chez ces animaux.
Procédures
Afin de limiter les symptômes, un laxatif doux est administré en continu dans l’eau de boisson.
Impact sur les animaux
Les souris Delta F508 et CFTR présentent des symptômes proches de ceux des patients atteints de la mucoviscidose : amaigrissement, difficultés respiratoires ou constipation. Le laxatif permet d'éviter en très grande partie les symptômes de constipation et donc d'amaigrissement observés chez les individus homozygotes.
Devenir
Les descendants seront sélectionnés selon leur génotype : Les animaux homozygotes et sauvages seront expédiés aux collaborateurs. Les animaux hétérozygotes seront mis en accouplements pour renouvellement des duo/ trio ou mis à mort.
Remplacement
Le modèle animal est fondamental dans notre cas, puisque l’étude de cette maladie génétique qu'est la mucoviscidose ne peut se faire que sur un organisme vivant entier. Plusieurs niveaux de complexité sont nécessaires, impliquant des interactions entre différents types cellulaires et organes, ainsi qu’avec le microbiote intestinal, aspects qui ne peuvent pas être développés in vitro ou in silico.
Réduction
Afin de répondre aux besoins annuels d’animaux pour les porteurs de projet, nous mettons en place le nombre minimal d’accouplements nécessaires. Le but étant de limiter au maximum le nombre d’animaux à phénotype dommageable
Raffinement
Ces souris fragiles doivent être hébergées dans un environnement propre et à faible empoussièrement (isolateur ou portoir ventilé). Afin de limiter les symptômes, un laxatif doux est administré en continu dans l’eau de boisson et une nourriture riche en protéines/lipides et vitamines doit leur être apportée. Le phénotype dommageable de ces lignées est présent seulement à l’état homozygote, cependant, le laxatif ainsi que l’alimentation plus riche seront donnés à tous les individus. Le laxatif permet d'éviter en très grande partie les symptômes de constipation observés chez les individus homozygotes. Ce laxatif est un médicament de sante humaine mais il n’existe pas d’équivalence en spécialité vétérinaire aussi efficace et bien toléré. L’aliment enrichi est de type Harlan teklad Global 2018.L’apparition des symptômes est plus précoce et plus marqué chez la lignée CFTR que la lignée Delta F508. Nous pouvons observer les premiers signes dès l’âge de 10 jours. Les expéditions de ces animaux ont lieu vers l’âge de 8- 10 semaines. Seuls les animaux qui présentent un score de 0 seront expédiés aux chercheurs. Une grille de scoring et des points limites seront mis en place. Au sevrage, les souris seront baguées à l’oreille et un prélèvement d’échantillon caudale sera effectué afin de réaliser le génotypage. La taille de l’échantillon prélevé devra être la plus petite possible.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle de référence pour l’étude de la mucoviscidose. Dès 1992, trois ans à peine après la découverte du gène Cftr, le premier modèle de souris transgénique est créé, des souris « knock-out » pour CFTR . Elles présentent à l'état homozygote des symptômes communs avec les patients humains : une stérilité, des altérations des glandes muqueuses et séreuses, et des obstructions des structures glandulaires. Sans traitement laxatif, les souris KO-CFTR décèdent au bout de 3-4 semaines en raison d’une sévère obstruction intestinale. Ces souris n’ont pas d’inflammation chronique, ni d’infection pulmonaire. La lignée Delta F508 a été générée par une équipe néerlandaise en 1995. Ces souris montrent un phénotype : un poids diminué, une maladie intestinale aboutissant à une obstruction intestinale non létale. Par contre, aucune accumulation de mucus dans les poumons, le pancréas, les canaux biliaires n’a été observée. L’élevage des lignées Delta F508 et CFTR sera réalisé avec des souris adultes âgées d’environ 2 mois. Les animaux sont envoyés aux collaborateurs vers l’âge de 8 à 10 semaines, afin qu’ils soient assez robustes pour le transport. Les animaux seront observés avant le départ afin de s’assurer qu’ils sont aptes au transport, une pâté aliment enrichi + laxatif est mise dans la boite de transport. Seuls les animaux qui présentent un score de 0 seront expédiés aux chercheurs. Les animaux qui ne présentent pas un score de 0 avant le transport, seront maintenus en hébergement, en attente qu'ils soient aptes au transport (score de 0) Le protocole de traitement du laxatif sera fourni au destinataire en amont de l'expédition.
Analyse de pathologies du développement sexuel
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Cinq cents femelles sont superovulées par injections d'hormones pour produire un maximum d'ovocytes, puis tuées pour les prélever, et cent autres subissent une laparotomie de réimplantation d'embryons. Le porteur indique que les receveuses ne sont pas réutilisées car une seconde laparotomie serait plus douloureuse que la première. Il affirme que le recours à la souris est "essentiel" pour la biologie du développement, les cultures cellulaires ne reproduisant pas la vascularisation et le contexte tridimensionnel des organes.
Objectifs
A l ‘heure ou on constate que l’incidence de la plupart des maladies dépend du sexe, il est paradoxal que certains gènes importants pour la détermination du sexe restent à identifier. Chez l’homme (et la souris), les mutations de certains gènes sont responsables d’anomalies du développement du système urogénital (rein et appareil génital). L’appareil génital comprend différents organes dont les gonades qui sont présentes chez l’embryon. Selon le sexe de l’embryon, différents gènes sont activés et vont permettre aux gonades de se développer en testicules chez le futur petit garçon ou en ovaires chez la petite fille, ce qui va initier tout le développement sexuel de l’individu. Les patients affectés ont des symptômes allant de l’absence de gonades à une inversion de sexe c’est-à-dire que l’appareil génital présente toutes les caractéristiques de l’appareil génital de garçon ou de fille quel que soit le sexe génétique de l’enfant. Pour comprendre le rôle des facteurs responsables du développement normal de la gonade (testicule chez le mâle et ovaire chez la femelle), nous devons reproduire les mutations de ces gènes chez la souris, ce qui nous permet d’étudier finement les conséquences pathologiques à différents stades. Ainsi notre projet permettra d’identifier les facteurs clés des premières étapes du développement de la gonade avec un intérêt particulier sur l’ovaire. Cela nous donnera un point d’entrée pour étudier les pathologies telles que l’insuffisance ovarienne précoce dont les symptômes sont le dérèglement ou l’absence de puberté, les problèmes de fertilité, les dérèglements hormonaux et les cancers de l’ovaire.
Bénéfices attendus
A l’heure actuelle, on constate que la plupart des maladies a une incidence et une sévérité qui dépend du sexe de l’individu. Le gène qui est responsable du développement masculin a été découvert il y a plus de 30 ans (gène Sry) mais on ne connait toujours pas à l’heure actuelle, les premières étapes du développement ovarien. Étant donné notre ignorance de ces mécanismes, les cliniciens ont des difficultés à aider les familles dans leur choix pour ou contre une gonadectomie de leur enfant atteint d’anomalies du développement sexuel. Comprendre les mécanismes de différenciation sexuelle et les pathologies associées représentera une aide inestimable pour soutenir les familles dans leur décision.
Procédures
500 femelles donneuses d’ovocytes achetées chez un fournisseur agréé seront superovulées par injection intrapéritonéale afin d’obtenir un nombre maximum d’ovocytes par femelle. Les ovocytes seront microinjectés. La réimplantation des embryons sera réalisée par intervention chirurgicale non dommageable. Cela concerne 100 femelles.
Impact sur les animaux
Pour la procédure 1 de superovulation, les nuisances en lien avec la superovulation est une douleur légère et brève liées aux injections intrapéritonéales d’hormones, les hormones n’induisent pas de douleur chez les femelles. Pour la procédure 2 de réimplantation d’embryons, les nuisances sont principalement la douleur liée à la laparotomie et à sa cicatrisation. Des effets dommageables à court terme et/ou accidentels peuvent résulter de l’intervention. Brièvement, des difficultés opératoires telles qu’une hémorragie supérieure à 0,5 ml, un temps d’intervention de plus de 30 mn ou post opératoire majeures (réveil retardé de plus de 15 mn, saignements, suintements ou ouverture de la plaie, altérations de l’état général : posture de l’animal, mobilité spontanée, entretien du pelage) peuvent subvenir en de rares occasions.
Devenir
A l’issue de la procédure 1, les femelles donneuses seront euthanasiées afin de collecter leurs ovocytes. A l’issue de la procédure 2, les femelles receveuses ne seront pas réutilisées et euthanasiées car une deuxième laparotomie serait bien plus douloureuse que la première.
Remplacement
Ce projet a été élaboré et sera réalisé dans le respect de la règle des 3R (remplacer, réduire, raffiner) : le recours à l'expérimentation animale est essentiel pour la biologie du développement et l'étude des causes des maladies de la différenciation sexuelle: en effet, les techniques de culture cellulaire ne permettent pas d'appréhender le développement de certains organes qui nécessite vascularisation et contexte tridimensionnel et ont montré leurs limites en aboutissant à des résultats erronés. Cependant si de nouvelles conditions de culture satisfaisantes sont élaborées, nous les utiliserons dans la perspective de remplacer les souris par ces nouvelles technologies.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé pour l’utilisation d’un nombre minimal de souris. Nous avons besoin de femelles donneuses et receveuses et pour ne pas générer des males surnuméraires, nous commandons les femelles chez un fournisseur agréé ce qui permet d’obtenir que le sexe d ‘intérêt et de réduire le nombre de souris. Nous utilisons la super-ovulation des femelles donneuses qui permet de produire de 2 à 3 fois plus d’ovocytes par femelle, ce qui permet de réduire le nombre de femelles donneuses. Les femelles receveuses sont mises en accouplement avec des males stériles. Ainsi si la réimplantation des ovocytes n’a pas pu avoir lieu, ces femelles ne donnent pas de portées surnuméraires et peuvent être remises en croisement rapidement. Cela contribue à réduire le nombre d’animaux nouveau-nés. Les protocoles sont standardisés et nous avons déjà réalisés cette chirurgie permettant la réimplantation d’ovocytes. Ainsi notre rapidité d’exécution nous permet de réimplanter des embryons dans les deux cornes utérines de la souris et ainsi de réduire le nombre de souris receveuse par deux. Nous pouvons anticiper la fréquence d’obtention de certains paramètres tels que le sexe de la souris (nous étudions les femelles soit un animal sur 2) mais nous ne pouvons pas évaluer l’activité du transgène car elle dépend du site d’insertion dans le génome (qui est imprévisible) pour déterminer le nombre de souris à générer (ainsi nous anticipons de 3 à 8 réplicas pour un sexe donné). Cependant les micro-injections d’un transgène donné seront réalisées sur plusieurs jours avec un ou deux jours par semaine, ce qui nous permet d’analyser les résultats de façon échelonnée. Dès que le résultat est reproductible au moins 2 fois, nous arrêterons ces travaux ce qui réduira le nombre d’animaux.
Raffinement
Pour la procédure 1 de superovulation, aucune aggravation résultant directement du traitement n’est attendue. Les animaux sont néanmoins surveillés afin de déceler tout signe de souffrance ou de blessure à l’issue d’accident ou bagarre afin de mettre un terme aux souffrances des animaux le cas échéant. Pour la procédure 2 de réimplantation d’embryons, pendant et après la chirurgie, l’anesthésie au gaz isoflurane et l’administration d’antalgiques permet de limiter au maximum les douleurs engendrées. Ces mesures sont accompagnées de la mise en place d’un protocole d’observation permettant de déceler précocement tout inconfort des animaux durant les expériences. Ce protocole inclue la mise en œuvre de points limites précoces et adaptés permettant de mettre un terme aux souffrances des animaux le cas échéant. De plus, les souris seront hébergées par deux ou par trois dans des cages comportant des objets à ronger et des igloos pour se faire un nid de façon à garantir leur bien-être et leur permettre d'exercer les activités spécifiques à leur espèce.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Nous avons tous les outils à notre disposition et déjà au point pour pouvoir étudier chez la souris, l’impact de copies de gènes contenant les mutations responsables de maladies. Nous utiliserons des femelles adultes âgées de 3 à 4 semaines pour les superovulations ou âgées de plus de 6 semaines car c’est l’âge optimum pour la superovulation (avant la mise en place des cycles ovariens ou après leur stabilisation) et 6 à 20 semaines pour les pseudo-gestantes.