Recherche fondamentale
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Regeneration du thymus et des fonctions immunitaires au cours du vieillissement
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
612 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Selon les modèles, elles reçoivent des greffes de mélanome ou de tumeurs mammaires, ou subissent deux irradiations corporelles suivies d'une greffe de moelle osseuse, avec injections et prélèvements sanguins répétés. Le porteur indique que la croissance tumorale peut provoquer douleur, perte de poids et gêne à la mobilité, d'intensité croissante au fil de la procédure. Les retombées annoncées contre le vieillissement immunitaire et le cancer restent présentées comme une "preuve de concept" à moyen terme, l'objectif immédiat étant de tester une protéine censée régénérer le thymus.
Objectifs
Notre projet de recherche porte sur la régulation du développement des lymphocytes T (LT), acteurs clés du système immunitaire. Ces cellules se développent au sein du thymus, hébergeant la production et sélection appropriée des LT. Or, le thymus est un organe extrêmement sensible aux perturbations de la physiologie telles que les thérapies cyto-réductrices précédant une greffe de moelle osseuse ou le vieillissement. En effet, dans ces contextes physiopathologiques, cet organe subit une réduction drastique en taille et en fonctionnalité. Ce processus appelé « involution thymique » résulte en une diminution de la production de nouveau LT, réduisant ainsi fortement le renouvellement des LT de l’organisme. Par ailleurs, l’utilisation de thérapies cyto-réductrices chez des individus âgés aggrave l’involution lié à l’âge, réduisant ainsi de façon additive le renouvellement des LT. L'involution thymique résulte en une susceptibilité accrue notamment aux cancers, ainsi qu’aux rechutes tumorales dans le cas de thérapies cyto-réductrices et greffe de moelle osseuse chez des patients atteints de leucémies. Dans le cas de cancer et leucémies, le succès de la thérapie par blocage des points de contrôle immunitaire (ICBT) repose sur un large répertoire de lymphocytes T capable de reconnaître spécifiquement les cellules cancéreuses. Bien que ces traitements aient récemment amélioré les chances de survie des patients atteints de différents types de cancer, une grande partie des patients ne répondent pas en raison d'un répertoire de LT sous-optimal. L’appauvrissement et la senescence progressive de LT de l’organisme résultant de l’involution thymique contribue à ces réponses de moindre qualité. De manière intéressante, notre équipe a identifié que l’administration de la protéine X promeut la régénération du thymus et la production des LT au cours des thérapies cyto-réductrices et de l'involution associée à l'âge. Ainsi, l'objectif de notre projet est d'apporter la preuve du concept que la régénération thymique médiée par X renforce l'immunité des cellules T antitumorales et augmente l’efficacité des thérapies par blocage des points de contrôle immunitaire.
Bénéfices attendus
Du fait du vieillissement progressif de la population et de l’augmentation de l’espérance de vie, l’immunodéficience liée à l’âge qui est étroitement corrélée avec le processus d’involution thymique, devient une préoccupation de santé publique majeur. Notamment, de nombreuses études révèlent un lien étroit entre le vieillissement et là l’incidence des cancers. Ainsi, notre projet est susceptible d’avoir des retombées majeures dans la compréhension et la lutte contre le vieillissement immunitaire. A moyen terme, notre étude apportera la preuve de concept que le boost de la production de LT médié par la régénération thymique, et ainsi le renouvellement des LT périphériques, confère une protection supérieure contre le développement de tumeurs. De plus, notre approche de combinaison de la régénération thymique avec les ICBT devrait potentialiser l’efficacité de ces molécules thérapeutiques et ainsi améliorer plus fortement les réponses anti-tumorales dans les contextes d’hémopathies malignes et de tumeurs solides. Par ailleurs, notre étude pourrait à plus long terme permettre de définir des biomarqueurs du vieillissement immunitaire et améliorer la prise en charge des patients de façon ciblée. Ainsi, nous nous attendons à ce que les sujets répondant le moins aux ICBT soient les patients avec une immunosénescence prononcée pouvant nécessiter une régénération du développement des LT. Il est également envisageable à plus long terme que notre projet participe au développement des thérapies promouvant le vieillissement en bonne santé en corrigeant les défauts fonctionnels des processus biologiques liés à l’âge.
Procédures
Pour les tumeurs solides (mélanomes et tumeurs mammaires), les souris (au nombre de 432) recevront la protéine X ou la protéine contrôle par injection intraveineuse sous anesthésie générale légère, 3 injections par animal sur 3 jours consécutifs. Trois semaines plus tard, les animaux recevront des cellules tumorales par injection intradermique (mélanomes) ou intra-mammaire (tumeurs mammaires) sous anesthésie générale légère (2 injections simultanées par animal, pour une intervention d’environ 3 minutes par animal). Les tumeurs seront mesurées tous les 2 jours de j8 à j20 sous anesthésie générale légère (2 minutes par animal). Pour les lymphomes, les souris (au nombre de 144) seront soumises à deux irradiations corporelles de 4minutes30 (5Gray) à 12heures d'intervalle, suivi d’une greffe de moelle osseuse (injection de cellules par voie intraveineuse sous anesthésie générale légère durant 2 minutes par animal). Les animaux recevront la protéine X ou la protéine contrôle par injection intraveineuse sous anesthésie générale légère, 3 injections par animal aux jours 2,4 et 6 après la greffe. Trois semaines après greffe, les animaux recevront une injection intraveineuse de cellules de lymphome sous anesthésie générale légère durant 2 minutes par animal. A partir du 10eme jour après l’injection des cellules de lymphome, les animaux seront soumis à un prélèvement de sang sous anesthésie générale légère à la fréquence d’un prélèvement tous les 3 jours avec un maximum de 4 prélèvements. Dans les 3 procédures, la moitié des animaux recevra un traitement anti-tumoral (immunothérapie) et l’autre moitié un traitement contrôle (placebo) par injection intrapéritonéale (4 injections par animal avec 3 jours d'intervalle entre les injections)
Impact sur les animaux
Les nuisances possibles sont : - un stress lié à la manipulation et à la procédure d'irradiation. - une douleur lié aux injections (rétro-orbitales, intra-dermiques, intra-péritonéale) ainsi que aux prélevements sanguins mandibulaires. - une perte de poids, une gêne à la mobilité et/ou une douleur liées à la croissance tumorale et à la réponse immunitaire déclanchée. La probabilité d’apparition de ces nuisances et leur intensité sont susceptibles d’augmenter progressivement au cours de la procédure et devront être contrôlés.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour analyse.
Remplacement
A ce jour, aucune alternative non animale permet d’étudier l’effet de la régénération du thymus par le traitement RANKL en contexte de cancer. Notre projet nécessite une approche in vivo afin de mettre en relation les différentes composantes cellulaires et tissulaires impliquées dans la réponse anti-tumorale étudiée. En effet, une alternative ex vivo serait de cultiver des lymphocytes T purifiés de souris jeunes ou âgées (traitées ou non avec RANKL) en présence de cellules tumorales et d'étudier l'efficacité de ces cellules. Ceci sera réalisé au cours du projet. Toutefois, cette approche limitée ne récapitule pas l’organisation tumorale complexe observée in vivo, la capacité des lymphocytes T à être recrutées au site tumoral, à interagir avec le microenvironnement et les autres cellules immunitaires, à ralentir la croissance tumorale et à stopper la pousse tumorale. Par ailleurs, l'approche ex vivo à court terme ne permet pas de tester l'efficacité des thérapies anti-tumorales qui agissent sur les interactions entre lymphocytes T et cellules immunitaires et tumorales. Ainsi, le modèle murin, qui présente l'avantage d'avoir une physiopathologie proche de l'homme, permettra d'étudier avec le plus de précision possible les différents points de notre projet, à savoir la régénération des lymphocytes T par notre traitement, leur circulation dans l'animal, leur recrutement au site tumoral et leur mode d'action au sein du microenvironnement tumoral.
Réduction
Le choix du nombre de souris est réalisé en prenant en considération les variabilités inter-individuelles, de réponse au traitement, ainsi que de pousse des tumeurs. Ce choix vise également à réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la reproductibilité et la fiabilité des résultats. Ainsi, des cohortes de 4 animaux par groupes seront utilisées pour le suivi de croissance tumorale et des cohortes de 3 animaux pour les analyses en points intermédiaires, avec un total de trois expériences indépendantes dans les deux cas. D’après la littérature et notre expérience passée, un nombre de 10 à 12 animaux par groupe (en tenant compte de la mortalité précoce) devrait fournir des résultats suffisamment robustes et interprétables. Afin de réduire le nombre de souris contrôles utilisées, un maximum de groupes différents seront constitués lors d’une même expérience. La même démarche sera suivie pour les analyses en point intermédiaire et en point final. Afin d’éviter les biais expérimentaux, les animaux seront randomisés en aveugle dans les différents groupes de traitement par un expérimentateur tiers. Par ailleurs, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, des tests fonctionnels in vitro seront menés sur des cellules isolées des mêmes tumeurs que celles analysées pour la composition de l’infiltrat immunitaire des tumeurs. Après la première expérience, le nombre d'animaux à utiliser sera ajusté en utilisant un logiciel (gpower) afin d'estimer le nombre nécessaire permettant une analyse statistique robuste.
Raffinement
Afin de réduire les nuisances, plusieurs mesures seront prises. Concernant le stress, les souris seront manipulées par un seul expérimentateur sauf pour l’étape de randomisation des groupes. Les animaux seront soumis à une anesthésiés générale légère par inhalation d’isoflurane avant chaque injection et mesure du volume tumoral. Les animaux bénéficieront par ailleurs d’une surveillance accrue quotidienne dès le début de la procédure expérimentale afin d’identifier tout signe de gène ou de douleur à l’aide d’une grille d’évaluation. De plus, le poids des animaux sera mesuré tous les deux jours, avec une surveillance accrue dès l’identification d’une perte de poids et un point limite de perte de poids de 20% du poids maximal. En cas de gène de mouvement pouvant générer un défaut d’alimentation ou de perte de poids importante, une alimentation hydratée spécifique sera déposée dans le fond de la cage. Les signes de douleurs seront évalués avec précision selon la grille d’évaluation, et des analgésiques seront administrés à l’apparition de signes de douleurs. Dans le cas des tumeurs solides, l’apparition de signes d’ulcération constituent un point limite. Un autre point limite sera le volume tumorale (répartis entre les deux tumeurs injectées par animal).
Choix des espèces
La souris est le modèle de bases des divers projets de l’équipe, adapté à l’analyse du système immunitaire et à l’oncologie. Les souris seront de fond génétique C57Bl6/J sauf pour le modèle 4T1 qui se développe chez des souris de fond génétique Balb/c. Deux âges sont prévus (cf. procédures): - stade pre-involution thymique : souris âgées de 6 à 8 semaines d’âge - stade avancée d’involution thymique : souris âgées de 12 mois.
Etude de la résistance du parvovirus de la souris à différents modes de stérilisation (irradiation, autoclavage)
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une inoculation du parvovirus par gavage, puis des prélèvements sanguins et de fèces toutes les deux semaines pendant douze semaines. L'objectif déclaré est de mesurer la résistance du virus aux modes de stérilisation, le porteur affirmant que son infectiosité ne peut être validée que par l'inoculation à un "organisme vivant". Toutes les souris sont mises à mort à la fin, en raison de la présence possible de l'agent infectieux dans leur organisme.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer la résistance du parvovirus de la souris (ou MPV) à différents modes de stérilisation comme l’irradiation et l’autoclavage. Le MPV est un des virus de la souris le plus fréquemment rencontré dans les laboratoires de recherche. Il ne génère pas de signe clinique chez les animaux mais perturbe le système immunitaire de la souris et les résultats de la recherche. Sa présence entraîne donc l’arrêt immédiat des procédures avec un impact éthique non négligeable. Comprendre sa résistance aux modes de stérilisation existants permet d’améliorer la prévention de la présence de cet agent dans les laboratoires.
Bénéfices attendus
Le parvovirus de la souris (MPV) est un virus à ADN non enveloppé qui peut être persistant dans l'environnement et chez les animaux infectés pendant une longue période. Après infection, il n'y a pas de signe clinique détectable chez les animaux, même gravement immunodéficients. Cependant, le MPV provoque de fortes interférences avec la recherche et les résultats obtenus en modulant notamment la réponse immunitaire des souris infectées. Sa présence dans un laboratoire entraîne l’arrêt immédiat des procédures en cours et invalide les résultats préalablement obtenus. La prévention de sa contamination permet donc de garantir un état de santé des animaux n’interférant pas avec les recherches et donc une application des 3Rs (réduction du nombre d’animaux utilisés pour obtenir des résultats exploitables). De nombreuses recherches sur le MPV afin de comprendre sa physiopathologie ont été effectuées. Cependant, aucune donnée quant à sa résistance à différents modes de stérilisation n’existe. Comprendre sa résistance aux modes de stérilisation existants permettrait d’améliorer nos connaissances sur cet agent et la prévention de sa présence dans un laboratoire.
Procédures
Inoculation unique par gavage d’une durée de maximum une minute sur tous les animaux. Prélèvement sanguin d’une durée de maximum une minute toutes les deux semaines sur une durée maximale de 12 semaines pour tous les animaux. Contention d’une durée de maximum une minute pour prélèvement de fèces toutes les deux semaines sur une durée maximale de 12 semaines pour tous les animaux.
Impact sur les animaux
Stress provoqué par les contentions, l’acte de prélèvement sanguin toutes les 2 semaines sur 12 semaines et l’inoculation par gavage lors du premier jour de la procédure.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux due à la possible présence dans leur organisme d’un agent infectieux interférent.
Remplacement
Les méthodes in vitro actuellement disponibles permettent de tester la présence du MPV dans différents substrats en contact avec l’animal (air, aliment, litière) mais pas son potentiel infectieux dans sa globalité. L’étude finale de son infectiosité ne peut être validée que par l’inoculation de l’agent à un organisme vivant. L’inoculation d’un agent potentiellement infectieux et la compréhension des mécanismes associés à son infection dans un organisme vivant est un phénomène complexe, mettant en jeu divers processus biologiques et systèmes physiologiques, ne permetttant pas de réaliser de nos jours un tel protocole sur des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire a été fixé afin d’obtenir des résultats expérimentaux exploitables tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Sur la base de la littérature scientifique existante et de recherches similaires préalables (Henderson et al, 2015), des groupes de 4 animaux maximum sont prévus.
Raffinement
Une observation quotidienne de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Des soins spécifiques sont apportés en cas de signes cliniques (traitements médicamenteux, ajout d’enrichissement, mesures de réhydratation ou de réchauffement, ajout d’aliment, de gel hydratant, de litière ou d’eau complémentés ou non directement dans la cage afin d’en améliorer l’accès). En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Des points limites spécifiques sont établis et raffinés au fur et à mesure des observations. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score et document qualité d’enregistrement permettant une traçabilité.
Choix des espèces
Le MPV est un agent infectieux de la souris. L’étude de la possibilité de le détecter après stérilisation par différents procédés (irradiation ou stérilisation à la vapeur) et sa capacité ultérieure à infecter des animaux naïfs ne peut se faire que chez son hôte primaire, la souris. Des animaux de 4 semaines seront utilisés, sur la base de leur sensibilité à une infection au MPV et de la littérature scientifique.
Rôle des canaux ioniques K2P dans la physiopathologie de l’oeil
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une sécheresse oculaire leur est provoquée par instillation quotidienne de chlorure de benzalkonium pendant sept jours, puis leur douleur est mesurée en appliquant une pression croissante près de l'œil jusqu'au clignement, une gêne que le porteur indique ne pas pouvoir soulager par analgésiques "puisque c'est ce paramètre que nous évaluerons". L'étude porte sur le rôle de canaux ioniques dans la douleur oculaire. Le porteur affirme que ce syndrome multifactoriel "ne peut être remplacé" par des modèles in vitro et exige un organisme entier.
Objectifs
La sécheresse oculaire est l'un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie. Sa prévalence varie de 5 à 35 % chez les sujets de plus de 50 ans. La pathologie peut se déclarer chez des sujets plus jeunes en cas de maladie auto-immune, de pollution environnementale, de prise médicamenteuse répétée, après une chirurgie de la cornée ou suite à l'usage intensif des écrans. En conséquence, la prévalence de la sécheresse oculaire est grandissante. Les symptômes regroupent des troubles visuels et des douleurs d’intensité variable qui peuvent devenir chroniques. Les patients se plaignent également d’une sensibilité accrue à la lumière. La sécheresse oculaire est difficile à traiter et ses mécanismes physiopathologiques sont peu connus. Ce constat impose un approfondissement de nos connaissances fondamentales sur les mécanismes cellulaires impliqués dans la douleur oculaire. Des mutations dans les gènes codant des transporteurs de potassium appelés K2P sont à l'origine de douleur chez les patients humains et chez les rongeurs (exemple: migraine). Leur fonction dans l'oeil n'a pas encore été caractérisée. Nous disposons 1) de différents modèles de souris dans lesquels les K2P sont absents, et 2) de molécules analgésiques mises au point pour moduler l'activité des K2P. Nous souhaitons combiner ces outils pour caractériser le phénotype oculaire de ces animaux et déterminer l'effet thérapeutique de ces molécules dans la physiopathologie de l'oeil. L'étude chez l'animal est un prérequis pour évaluer de manière intégrée les conséquences d'un traitement de la pathologie oculaire. Ce projet utilisera au maximum 1080 souris. Grâce à nos études préalables in vitro, nous connaissons le mode d'action de ces transporteurs (remplacement). Le recours aux séances d'habituation et à l'anesthésie gazeuse légère et rapide permet de limiter le stress des souris (raffinement). Les prévisions obtenues avec les logiciels statistiques nous permettent d'anticiper le nombre maximal de souris pour obtenir des résultats significatifs et nous réduirons ce nombre en cours de projet dès que nos données seront suffisamment robustes (réduction).
Bénéfices attendus
La sécheresse oculaire est à l’origine d’une douleur oculaire chronique pouvant être accompagnée de troubles de la vision, de photoallodynie (sensibilité accrue à la lumière) et de dommages de la surface oculaire, et elle représente l’un des principaux motifs de consultation en ophtalmologie. C’est le plus important signe d’alerte en réaction à une inflammation ou à un traumatisme des structures du segment antérieur de l’oeil (cornée, conjonctive, sclère et structures uvéales). Elle affecte la qualité de la vie et près de 60 % des patients se déclarent gênés dans leurs activités quotidiennes. En outre, 80 % des patients qui souffrent de douleur oculaire ne l’estiment pas suffisamment prise en considération tant par leur entourage que par leur médecin. La douleur chronique oculaire est très difficile à traiter et les mécanismes physiopathologiques, de nature neurogène et/ou inflammatoire, demeurent de nos jours très mal connus. Les traitements actuels sont invasifs, peu efficaces et diminuent la qualité de vie des patients. De ce fait, la sécheresse oculaire est considérée comme un désert thérapeutique malgré son incidence grandissante liée au vieillissement global de la population, l’augmentation du recours à la chirurgie réfractive, l’usage des écrans et la pollution environnementale. Le projet que nous souhaitons développer permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de cette pathologie et éventuellement de proposer une stratégie thérapeutique nouvelle si ce projet donne les résultats escomptés. Les bénéfices suceptibles de découler de ce projet sont une avancée significative dans la prise en charge de la sécheresse oculaire.
Procédures
La procédure 1 dure 2X 1 semaine maximum (à 3 mois et à 12 mois environ), la procédure 2 dure 2 semaines maximum. Dans chaque procédure, la mesure du volume des larmes dure 5 minutes (coton au coin de l’œil); la mesure de la stabilité des larmes dure 10 minutes (anesthésie à l’isoflurane, puis administration d’une goutte de fluorescéine). La mesure de la douleur oculaire par un test qui consiste à appliquer une pression croissante sur la zone péri-orbitale et à mesurer la pression (en grammes) induisant le clignement des paupières et le retrait volontaire de la face par la souris, dure 1h. La séance d'imagerie DOLPLER dure 15 minutes (sous anesthésie légère). Dans la procédure 1, chaque animal subira ces 3 tests 1 fois dans sa vie, et 2 fois dans la procédure 2 (avant et après administration de la molécule régulatrice des K2P). Le modèle de la procédure 2 consiste en une injection quotidienne de BAC (chlorure de benzalkonium) pendant 7 jours. Les molécules régulatrices des K2P ou la solution saline contrôle seront administrées en IP, en 1 injection.
Impact sur les animaux
Chez l'homme, la sécheresse oculaire peut occasionner un ressenti très variable selon les individus allant d'une simple gêne soulagée momentanément par des larmes artificielles à une douleur pouvant être plus inconfortable chez certains patients. Il est vraisemblable que cette variabilité entre individus existe également chez la souris. Les effets indésirables prévus sur les animaux sont associés à la sécheresse oculaire qui sera d'intensité modérée. Elle engendre potentiellement un inconfort voire éventuellement une gêne chronique (comme chez certains patients humains) qui ne pourront être soulagés par des analgésiques puisque c’est ce paramètre (et son soulagement) que nous évaluerons. Les animaux auront 3 et 12 mois environ lors de leur entrée en procédure. La durée des nuisances auxquelles ils seront exposés sera donc de 5 jours pour les souris mutantes pour les transporteurs étudiés: habituation aux tests pendant 2 jours et 3 jours de tests (c'est-à-dire 2 fois 2h de tests à 36h d'intervalle: 1 série de tests pendant la journée, 1 seconde série pendant la nuit). La durée des nuisances sera de 6 semaines maximum pour les souris dans lesquelles nous aurons induit la sécheresse oculaire (habituation aux tests, 7 jours d'établissement du phénotype et entre 1 et 4 semaines de traitement avec une série de tests par semaine). Les effets des traitements seront évalués sur 7, 14 et 28 jours maximum puis les animaux seront mis à mort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort selon la législation en vigueur afin de réaliser des analyses histologiques post mortem.
Remplacement
Le syndrome de sécheresse oculaire est d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Son apparition et sa gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts (neuro-inflammation etc) et les études sur l’animal intact sont essentielles et ne peuvent être remplacées. Ceci ne peut malheureusement pas être modélisé in vitro à ce stade du projet. Néanmoins, nos études préalables et celles de nos collègues ont permis de caractériser in vitro (neurones en culture) et in vivo (rongeurs) les effets des molécules d'intérêt et de déterminer leur mode d'action sur les K2P. Cette phase du projet exige maintenant un système biologique intégré tel qu’un organisme vivant pour caractériser précisément in vivo sur l'oeil et quantifier le phénotype oculaire des animaux déficients pour les gènes codant les canaux K2P d'intérêt et les effets thérapeutiques des molécules que nous avons testées.
Réduction
Le nombre d‘animaux (1080) correspond au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs (calculé par le logiciel GPower). Il sera réduit chaque fois que possible, et toute expérience rendue inutile par des résultats précédents obtenus ne sera pas réalisée. Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible. Nos prédictions suggèrent que des lots de 10 animaux par condition permettront une analyse statistique valide permettant d’exclure toute répétition additionnelle. Nous anticipons et choisissons a priori d’inclure 15 animaux/groupe par précaution et en considérant mâles et femelles séparément, et nous réduirons ce nombre dès lors que les résultats seront statistiquement significatifs et en particulier si les deux sexes donnent des résultats similaires.
Raffinement
Notre expertise nous permet de mettre en place des conditions de raffinement adaptées et de réaliser les gestes techniques requis de manière précise et rapide. Nous porterons une attention particulière à limiter au niveau le plus faible le stress occasionné aux animaux. Ceux-ci seront manipulés avec calme dans un environnement limitant toute source de nuisances, dans une salle calme uniquement dédiée à ces tests, dans laquelle nous pouvons moduler l'intensité lumineuse pour limiter la photoallodynie et avec un équipement spécialement conçu pour la bonne réalisation des procédures. Ainsi, nous mettrons en place des séances d'habituation en amont de chaque test, et nous réaliserons la plupart de ces tests sous anesthésie légère à l'isoflurane (15-20 minutes). En cours de procédure, nous suivrons les animaux en nous appuyant sur une grille de score permettant d’évaluer la douleur et de mettre en oeuvre des points limites précoces. Les animaux seront hébergés avec un environnent enrichi, sans isolement, en accord avec la réglementation en vigueur. Enfin, l'utilisation de l'imagerie par échographie-Dopler représente un avantage conséquent dans le respect de la règle des 3R et permet non seulement de réduire le nombre d'animaux mais de diminuer leur manipulation car c'est une technique non invasive et rapide sous anesthésie réalisée par l'expérimentateur principal formé à l'utilisation de l'appareil.
Choix des espèces
Nous avons choisi Mus musculus comme modèle d’étude en raison de ses similarités génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. Le modèle murin reproduisant la sécheresse oculaire est un modèle validé et classiquement utilisé dans la littérature. Deux âges seront étudiés: 3 et 12 mois. Ces âges sont choisis de manière à représenter les différentes périodes de la vie adulte : jeunes adultes (matures) et individus âgés. En effet, l’un de nos objectifs est de déterminer si l’âge/le vieillissement pourraient impacter le phénotype observé dans ces animaux.
Fonction modulatrice des cellules dendritiques sur la thérapie tumorale par radiothérapie et anti-PD-1
- Recherche fondamentale
- Oncologie
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, une irradiation sous anesthésie et des injections de traitements, dont certaines directement dans la tumeur, avant d'être euthanasiées pour analyse des tissus. L'étude porte sur le rôle des cellules dendritiques dans la réponse immunitaire déclenchée par la radiothérapie associée à une immunothérapie. Le porteur déclare la croissance tumorale et l'irradiation "indolores" et affirme qu'il "n'y a pas de modèles alternatifs" pour cette étude du système immunitaire.
Objectifs
Dans les pays occidentaux, deux tiers des patients reçoivent une radiothérapie au cours de leur cancer. Le but de la radiothérapie est de tuer une tumeur ou une métastase aussi directement que possible. Les recherches expérimentales de ces dernières années ont montré que la radiothérapie peut également induire une réponse immunitaire anti-tumorale dans certaines conditions. Cependant, de fortes réponses immunitaires anti-tumorales après radiothérapie n'ont que rarement été observées dans le traitement des patients. L'objectif de ce projet est d'étudier de nouveaux mécanismes qui peuvent limiter ou améliorer les réponses immunitaires anti-tumorales après radiothérapie. Les cellules dendritiques sont des cellules présentatrices d'antigènes professionnelles capables d'induire une réponse immunitaire. En s’appuyant sur les connaissances déjà acquises selon lesquelles les cellules dendritiques jouent un rôle crucial dans le développement d'une réponse immunitaire anti-tumorale dans le cadre de l'immunothérapie ou de la chimiothérapie, ce projet vise à mieux comprendre le rôle des cellules dendritiques dans l'induction d'une thérapie anti-tumorale après radiothérapie et à développer de nouvelles approches thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à découvrir de nouveaux mécanismes biologiques qui devraient permettre le développement de nouvelles thérapies à moyen terme. Il devrait ainsi contribuer à soulager la souffrance des patients atteints de cancer grâce à des thérapies améliorées. Cela inclut les nouvelles thérapies basées sur les cellules dendritiques (thérapies cellulaires). De plus, les résultats du projet de recherche devraient jeter les bases de nouvelles thérapies qui effectuent une modulation ciblée des voies de signalisation dans les propres cellules dendritiques de l'organisme (thérapies ciblées).
Procédures
Injection de cellules tumorales une fois par souris, ansethésie locale, durée 1 minute. Irradiation sous anesthésie générale, durée 11 minutes. Injections de traitements sous anesthésie locale tous les 3 jours à partir de J8 jusqu’à J14 ou J20, durée 1 minute. Injections intra-tumeurs dans certains lots: 2x à 3 jours d'intervalle (J7 et J10) Durée : maximum 1 minute, sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Croissance tumorale sous-cutanée : La formation de tumeurs sous-cutanées dans la région du flanc ou de la patte arrière n'est pas associée à la douleur. Elle peut entraîner des restrictions de mouvement chez la souris. . L'injection de traitements induit une réaction systémique très limitée. L'irradiation tumorale locale est indolore, et z très peu de conséquence. Elle peut induire une perte de poids légère et transitoire.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour analyse sur tissus post-mortem et car il seront porteurs de tumeurs.
Remplacement
Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude de l’activation ou l’inhibition du système immunitaire lors de radiothérapies.
Réduction
Pour la réalisation de cette étude, avons déterminé par calcul de puissance le nombre d'animaux nécessaire pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous regrouperons les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Différents tests statistiques seront utilisés pour l’analyse des résultats et l'étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l'hypothèse de travail.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, et plusieurs fois par semaine lors de l'expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids, de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation. Des mesures seront prises pour limiter le stress: plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux,, animaux hébergés au calme. Les interventions seront réaliséés sous anesthésie générale ou locale dépendamment de l'intervention à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limite ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
Des souris sont nécessaires pour les expériences, car pour l'étude de la radiothérapie ciblée de tumeurs individuelles, selon le recul obtenu, la souris est la seule espèce possible. Les animaux sont utilisés au stade adulte (8 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire mature.
Etude des mécanismes cellulaires conduisant à l’alloimmunisation plaquettaire transfusionnel et à l’état réfractaire associé
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
472 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie menée sous anesthésie sans réveil. Les souris désignées comme "donneuses" sont tuées lors d'un prélèvement de sang terminal, les "receveuses" reçoivent des transfusions de plaquettes hebdomadaires puis subissent une chirurgie abdominale sans réveil pour observer leur rate au microscope. L'étude cherche à comprendre le rejet des plaquettes transfusées chez les patients sous chimiothérapie. Le porteur affirme que ces observations dynamiques "ne peuvent se faire que sur modèle animal" et ne sont pas modélisables in vitro.
Objectifs
La prise en charge des patients sous chimiothérapie aplasiante nécessite un support transfusionnel plaquettaire important et itératif. Une des complications graves de ces transfusions multiples est l’état réfractaire aux transfusions plaquettaires (ERTP), c’est-à-dire le rejet des plaquettes transfusées par le receveur. La transfusion est alors inefficace et ne permet pas de prévenir les risques hémorragiques. Ce rejet est expliqué par la présence, chez le receveur, d’anticorps spécifiques qui entrainent l’élimination rapide des plaquettes transfusées. Le mode d’action de ces anticorps conduisant à l’élimination des plaquettes n’est pas bien compris. Nous proposons d’étudier les mécanismes d’élimination des plaquettes in vivo avec l’utilisation d’un modèle murin d’état réfractaire aux transfusions plaquettaires. Nous étudierons finement les mécanismes moléculaires mis en jeu grâce à l’utilisation de souris transgéniques expriment des protéines humaines qui pourraient être impliquées dans ces réponses. Nous souhaitons caractériser, grâce à l’utilisation d’un microscope permettant les observations intra-vitales, les interactions entre les plaquettes transfusées et la rate du receveur dans une situation d’état réfractaire aux transfusions plaquettaires.
Bénéfices attendus
Les patients qui nécessitent un support transfusionnel important et itératif, notamment ceux sous chimiothérapie, sont susceptibles de développer un état réfractaire aux transfusions plaquettaires. Des anticorps produits par le receveur peuvent mener à l’élimination des plaquettes nouvellement transfusées entrainant ainsi une inefficacité thérapeutique de la transfusion. Identifier les mécanismes sous jacents de cette réponse immunitaire pourrait permettre de faire évoluer la prise en charge des patients nécessitant un support transfusionnel important. En effet, déterminer la cinétique et l’organe dans lequel les plaquettes sont éliminées nous apporterait des éléments de réponses quant aux mécanismes impliquées et nous permettrait ainsi de réfléchir à des nouvelles stratégies thérapeutiques pour éviter les etats réfractaires aux transfusions. Ceci permettrait une meilleure prise en charge des patients limitant ainsi les coups d’hospitalisation, la consommation des produits sanguins labiles et la surmortalité induit par les états réfractaires.
Procédures
Aucun prélèvement ne sera fait sur animal vigile. Prélèvement artériel : prélèvement terminal (dure moins de 5 minutes) Prélèvement sanguin au niveau de la queue (prélèvements hebdomadaires pendant 5 semaines consécutives ; prélèvement dure moins d'une minute Transfusion en intra-veineux hebdomadaire pendant trois semaines consécutives, Procédure chirurgicale (pose d'une chambre d'observation abdominale) (procédure terminale sans réveil, durée de l'observation 30 minutes)
Impact sur les animaux
Possible douleur suite à la transfusion en i.v., durée estimée à 1h post-injection. Les sites d’injections seront particulièrement observés pendant le suivi quotidien des animaux. Possible stress au moment de l’anesthésie gazeuse pour le prélèvement à la queue, durée de 30 secondes avant endormissement Possible difficulté de mobilité/engourdissement au réveil de l’anesthésie gazeuse, durée estimée à 3-5min
Devenir
Les souris "donneuses" sont par définition toutes mises à mort après le prélèvement sanguin car ce prélèvement artériel est terminal. Tous les animaux prévus dans la procédure d'alloimmunisation (souris receveuses) sont gardés en vie car utilisées dans les autres procédures. Après les expériences de microscopie intra vitale, tous les animaux sont mis à mort car c'est une procédure chirurgicale sans réveil (une fois la rate exposée et la chambre d'observation en place, on ne peut pas réveiller l'animal).
Remplacement
Le but de ce projet est de déterminer les mécanismes d’élimination des plaquettes transfusées. L’approche en temps réel sur l’élimination des plaquettes sanguines par la rate et/ou le foie et dans le sang ne peut se faire que sur modèle animaux afin d’observer des processus dynamiques entre le sang et ces organes. Ces approches de cytométrie en flux et de microscopie intravitale nécessitent un modèle in vivo et ne peut pas être modélisée par des techniques in vitro.
Réduction
Les nombres d’animaux utilisés lors des expériences seront minimalisés, avec la contrainte d’obtenir des observations suffisamment représentatives. Des tests sur des tissus fixés ont eu lieu dans un premier temps pour mettre au point les conditions expérimentales optimales de visualisation des plaquettes (cinétique, quantité de plaquettes, optimisation des marquages,) ce qui nous a permis de réduire au minimum le nombre d’animaux requis pour les observations in vivo.
Raffinement
Un soin particulier sera apporté afin de diminuer le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet : - Hébergement dans des cages munies de particules de bois et enrichie avec un carré en coton compressé afin depermettre aux animaux de réaliser un nid conformément à leurs besoins comportementaux - Installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin lutter contre l’hypothermie pendant la chirurgie et pendant toute la durée d’observation sous le microscope. - Anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’opération afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés. - Injection d’analgésique avant chaque procédure. - Mise en place d’une fiche de suivi pour suivre l’état des animaux et veiller à leur bien être tout au long de l’expérimentation. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé.
Choix des espèces
Puisque nous souhaitons mimer la différence génétique entre un donneur et un receveur, nous devons travailler avec des animaux de fond génétique différent. La consanguinité des souris et la bonne connaissance de leur système immunitaire en font un modèle de choix. Nous avons donc choisi deux lignées de souris bien caractérisées : les souris "donneuses" seront de fond génétique C57Bl6 et le souris "receveuses" de fond génétique BALB/c. De plus, nous souhaitons éudier l'importance d'un récepteur exprimé par les plaquettes des souris "donneuses", nous utilisons donc des souris C57Bl6 modifiées génétiquement qui expriment ce récepteur ou d'autres souris qui expriment une protéine fluorescente pour pouvoir les visualiser quand elles sont transfusées dans la souris receveuse. Enfin, un microscope dédié aux observations intravitales sera utilisé sur le modèle murin. La taille de la souris est compatible et adaptée à l’équipement ce qui rend ce modèle totalement pertinent. Les animaux seront utilisés au stade adulte, pubère, agé de 8 à 25 semaines afin d’avoir un système immunitaire mature.
Implication d’un variant de la protéine RPL13 dans le développement osseux d’un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Élevées après le sevrage soit dans une cage équipée pour l'effort physique soit dans une cage à enrichissement réduit, elles subissent une imagerie par microscanner sous anesthésie de vingt minutes, puis sont euthanasiées pour analyse du squelette. L'étude porte sur le rôle d'un variant de la protéine RPL13 dans le développement osseux, le porteur classant la lignée comme à "phénotype non dommageable". Il affirme qu'il n'est "pas possible de remplacer" le modèle in vivo pour étudier la qualité osseuse et la plaque de croissance.
Objectifs
L'objectif du projet est de comparer l’impact d’une activité physique augmentée versus une activité sédentaire, sur la qualité osseuse et la plaque de croissance des animaux issus de l’élevage. La souche de souris utilisée est RPL13, lignée à phéntoype non dommageable. Les souris seront élevées après leur sevrage de 1 mois jusqu’à l’âge de 2 mois dans deux types de cages : une cage enrichie en équipement d’activité stimulant l’effort physique (roue d’activité volontaire, grille d’agrippement, mangeoire en hauteur) et une cage avec un enrichissement moindre avec accès à la nourriture et à l’eau sans effort physique.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'étudier le rôle des ribosomes dans le contrôle de la prolifération et de la différenciation des chondrocytes. Ce projet contribuera à une meilleure compréhension de la croissance osseuse par l'étude du processus physiopathologique d'une dysplasie sévère. Il permettra de mieux comprendre la régulation post-transcriptionnelle donnée par les ribosomes qui interviennent dans le développement osseux et fournira de nouvelles cibles pour le traitement des maladies cartilagineuses.
Procédures
L'anesthésie pour imagerie durera 20 minutes.
Impact sur les animaux
Un stress lié à la contention des animaux lors de l'anesthésie isoflurane pourra être observé. L'imagerie par microscanner (radiographie et microtomographie) se déroulant sous anethésie générale, les effets indésirables liés à l'anesthésie seront observés. Concernant le phénotype dommageable, celui-ci n'ayant pas encore été observé chez ces animaux, il est difficile de décrire les effets indésirables potentiels. Néanmoins, par transposition aux observations faites chez l'homme, un élargissement de la plaque de croissance pourrait être observé, conduisant à une modification du squelette, notamment au niveau des membres postérieurs et antérieurs.
Devenir
Le but du projet étant de caractériser le phénotype des animaux et particulièrement le squelette, l'euthansie des animaux est indispensable.
Remplacement
L'objectif du projet étant d'étidier le la qualité osseuse et la plaque de croissance des animaux, il n'est pas possible de remplacer le modèle in vio par des méthodes alternatives.
Réduction
Des études préliminaires sur cette lignée nous ont permis de mettre en évidence des différences statistiquement significatives pour les paramètres étudiés avec un échantillonnage de 6 individus par groupe, sans distinction entre mâles et femelles. Cependant, ce faible échantillonnage a été rendu possible du fait de la grande homogénéité intra mais également inter sexes au stade de développement étudié (entre 3 et 6 semaines). Ce nouveau projet quant à lui nécessite d'étudier des animaux plus âgés rendant obligatoire la discrimination des sexes. Ainsi, dans le but de réduire au maximum le nombre d'animaux tout en conservant une puissance statistique adéquate, les groupes étudiés seront composés d'environ 8 individus.
Raffinement
Jusqu'au sevrage, le souris seront hébergées en cage ventilée. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Un dôme en carton et des lanières de papier seront disposés dans la cage. Les souris recevront une période d’acclimatation de 7 jours minimum, avant l’entrée en projet, et seront habituées à la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière-obscurité (12h-12h), d’une température (20-24°C) et d’une hygrométrie (45-65%) contrôlées en permanence. Les souris seront monitorées tous les jours pour vérifier l’absence de souffrance.
Choix des espèces
Le but du projet étant d'analyser en profondeur le rôle physiopathologique du variant RPL13 au niveau cellulaire, un modèle in vivo a été développé par Crispr/Cas9. En effet, des souris RPL13 -/- seront utlisées dans le cadre de cette étude. La croissance et l'évolution du squelette dans le temps étant au coeur de ce projet, les animaux utilisés auront entre 2 semaines et 12 mois d'âge.
Rôle de l’Angiopoïétine-like 4 dans la fuite capillaire associée au syndrome de réponse inflammatoire systémique secondaire à un choc cardiogénique post-arrêt cardiaque
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
458 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie menée sous anesthésie sans réveil. Elles subissent un arrêt cardiaque provoqué suivi d'une réanimation par massage cardiaque et ventilation mécanique, le porteur estimant que 20 pour cent meurent dans les trois heures et 40 pour cent dans les six heures malgré la réanimation. L'étude cherche une cible pour limiter la fuite capillaire au cours des chocs, l'arrêt cardiaque induisant selon le porteur un coma qui rendrait la procédure sans inconfort. Il affirme que les études in vitro préalables "ne sont pas satisfaisantes" et que le modèle animal est nécessaire pour intégrer les composantes physiologiques.
Objectifs
Ce projet de recherche fondamentale vise à trouver des cibles thérapeutiques pour contrôler la fuite capillaire (fuite de plasma au travers des vaisseaux) au cours des états de choc cardiogénique chez l’homme. Les états de choc constituent un enjeu de santé publique. Les admissions pour états de choc représentent un tiers des admissions en réanimation (environ 20.000 patients par an), et la mortalité associée reste de l’ordre de 40% actuellement. Il existe au cours des états de choc une fuite capillaire importante). Cette fuite capillaire est due à une augmentation de la perméabilité des vaisseaux du fait de l’activation de l’inflammation (syndrome de réponse inflammatoire systémique : SRIS). Lorsqu’elle est généralisée, cette fuite capillaire aggrave l’insuffisance circulatoire du fait de la baisse du volume sanguin, et participe à l’apparition de lésions sur l’ensemble des organes (syndrome de défaillance multiviscérale). Le contrôle de la fuite capillaire s’est avéré très bénéfique dans plusieurs modèles de choc chez l’animal. Cependant, les déterminants de cette fuite capillaire au cours des états de choc restent très peu connus chez l’homme. Dans un travail prospectif de recherche translationnelle entre un service de réanimation médicale et un laboratoire de recherche, nous avons isolé plusieurs protéines associées au syndrome de fuite capillaire chez des patients atteints de SRIS. Cette étude a permis en particulier d’identifier l’angiopoïétine-like 4 comme cible d’intérêt particulier. Notre objectif est de fournir la preuve de concept que la modulation de l’activité de l’ANGIOPOÏETINE-LIKE 4 permet de diminuer la fuite capillaire et la mortalité au cours du SRIS.
Bénéfices attendus
Ce travail nous permettra de caractériser le rôle de l’ANGIOPOÏETINE-LIKE 4 dans la fuite capillaire associée au choc cardiogénique post-arrêt cardiaque, et le potentiel intérêt de sa modulation. Le contrôle de la fuite capillaire au cours de ce syndrome est une approche totalement innovante. Elle répond à un besoin médical majeur, l’arrêt cardiaque restant associé à plus de 50% de mortalité actuellement, et la fuite capillaire jouant un rôle majeur dans l’évolution défavorable des patients. L’objectif à long terme de ce projet est la mise au point de nouvelles thérapeutiques pour contrôler la fuite vasculaire chez les patients.
Procédures
Une antalgie prophylactique par injection sous-cutanée sera systématiquement réalisée avant le début de la procédure (typiquement 1 à 2 secondes). Un cathéter veineux sera ensuite mis en place (la procédure complète dure environ 30 minutes). Toutes les différentes injections sont administrées via le cathéter et ne nécessitent donc pas d’interventions supplémentaires sur l’animal. La réanimation cardio-circulatoire comporte un massage cardiaque (8 minutes) et une ventilation mécanique (i.e. une assistance respiratoire) d’au moins 1h jusqu’à atteindre une fréquence respiratoire supérieure à 100/min. L’imagerie cardiaque par échographie (non invasive) dure typiquement 15 minutes.
Impact sur les animaux
De par la variabilité physiologique des animaux ou de par leur génotype, certains animaux répondent moins bien à la réanimation et le cœur reste en arrêt malgré la réanimation cardio-respiratoire : nous estimons une perte d’effectifs de 20% à 3h et 40% à 6h. Cependant, l’arrêt cardiaque induit une encéphalopathie post-anoxique avec des troubles de conscience (c'est-à-dire un coma), et les données de la littérature n’indiquent pas d’inconfort lié à cette procédure. Ceci est confirmé par notre suivi des animaux au cours de la mise au point du modèle.
Devenir
Mise à mort, pour récupération post-euthanasie du sérum et des tissus.
Remplacement
Dans un but de remplacement, des études préliminaires in vitro ont été réalisées. Cependant, ces conditions expérimentales ne sont pas satisfaisantes car elles ne permettent pas de reproduire les nombreuses voies physiologiques mises en jeu au cours du SRIS (Syndrome de Réponse Inflammatoire Systémique). La fuite capillaire est en effet d’origine multi-factorielle et l’ANGIOPOÏETINE-LIKE 4 régule de nombreuses voies physiologiques. Notre projet nécessite par conséquent le recours à un modèle animal, qui intègre ces différentes composantes physiologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit à celui requis pour une validité statistique des résultats. Le plan expérimental a été optimisé de façon à combiner les données obtenues pour chaque animal et réduire l’effectif nécessaire. Notamment, l'imagerie cardiaque par échographie sera effectuée sur les mêmes animaux que les mesures de fuite capillaire. De plus, les analyses sanguines et histologiques seront effectuées sur le sang et les organes non prélevés. En parallèle, notre équipe poursuit une veille bibliographique continue sur le sujet et sur le modèle de façon à ne par dupliquer d’éventuelles nouvelles données. De la même façon, l’ensemble des résultats du projet sera publié, pour les rendre accessibles aux autres équipes.
Raffinement
Nous tendrons vers les objectifs préconisés de raffinement. L’arrêt cardiaque induisant une encéphalopathie post-anoxique avec des troubles de conscience (coma), les données de la littérature n’indiquent pas d’inconfort lié à cette procédure. Un suivi attentif d’un potentiel inconfort sera néanmoins mis en place : pour diminuer au maximum l’inconfort potentiel des souris au cours des procédures, une antalgie prophylactique sera systématiquement réalisée avant le début de la manipulation. Ensuite, les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie appropriée. L’état de conscience sera systématiquement dépisté après levée de la sédation toutes les heures pendant 7 heures. L’inconfort sera dépisté par une échelle validée et un traitement antalgique sera administré en cas de besoin. Les mises à mort seront réalisées sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies car le protocole précis de SRIS secondaire à un arrêt cardiaque est établi chez la souris et il permettrait la démonstration de la preuve génétique de l'implication de notre cible d’intérêt dans ce modèle. Ces expériences permettront de définir si le gène d’intérêt peut être une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la fuite capillaire au cours du SRIS chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris de 10 à 12 semaines, le modèle de SRIS étant bien défini dans la littérature pour ce stade de développement, ainsi que lors de nos expérimentations préliminaires sur ce modèle.
Etude de l’effet de nouvelles cibles thérapeutiques dans des modèles d’inflammation et d’emphysème induits par l’inhalation de fumée de cigarette ou l’administration d’élastase pancréatique de porc chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une bronchopneumopathie leur est provoquée par inhalation de fumée de cigarette ou administration d'élastase pancréatique de porc, ce qui induit des douleurs pulmonaires et une perte de poids, puis elles reçoivent des traitements pouvant atteindre 30 administrations et un prélèvement sanguin avant la mise à mort. L'étude teste, pour le compte de laboratoires donneurs d'ordres, de nouvelles molécules anti-inflammatoires contre la BPCO. Le porteur affirme que l'exploration de cette maladie "demande l'étude d'un organisme complet".
Objectifs
La BPCO (Bronchopneumopathie chronique obstructive) est considérée comme la troisième cause de mortalité cette année dans le monde avec le tabagisme comme facteur de risque majeur. Aujourd’hui, très peu de traitements efficaces contre la BPCO sont disponibles. L'objectif de ce projet est de rechercher et de tester de nouvelles molécules thérapeutiques potentiellement inhibitrices de l’inflammation et du développement de l’emphysème dans un modèle in vivo de BPCO. Pour développer un médicament, il faut réaliser des tests de toxicité cellulaire mais aussi tester in vivo sur un animal la/les molécules car aucun médicament ne peut être testé chez l’Homme avant que son profil de sécurité ne soit établi. Les études toxicologiques sont réalisées en amont par le laboratoire pharmaceutique ou de recherche publique donneur d'ordres.
Bénéfices attendus
A ce jour, il n'y a pas de traitement curatif pour la BPCO, mais les traitements disponibles (broncho-dilatateurs, anti-inflammatoires) visent à ralentir l'évolution, prévenir les complications, réduire les symptomes et améliorer la qualité de vie. Dans les cas les plus sévères de BPCO, l'unique solution est l'intervention chirurgicale (greffe du poumon). Ce projet a pour but d’étudier l’effet de nouvelles molécules à caractère anti-inflammatoire dans un modèle d'inflammation ou d’emphysème induits par l’inhalation de fumée de cigarette ou l'administration d'élastase pancréatique de porc chez la souris. Afin de déterminer si une molécule candidat a un potentiel dans ce modèle, plusieurs prélèvements d'organes/tissus seront ensuite effectués pour des dosages immunologiques, analyses histologiques. Ces différents dosages et quantifications vont permettre de valider le modèle ainsi que l'analyse de l'efficacité des différentes molécules testées (diminution de cytokines inflammatoires dans les tissus, diminution du recrutement cellulaire et étude de la structure pulmonaire au niveau histologique...).
Procédures
Un prélèvement de sang rétro orbital (durée du prélèvement 30 secondes) sous anesthésie sera effectué une seule fois juste avant la mise à mort. En ce qui concerne les traitements (voie d'administration variable en fonction des études): En aigue : entre 1 et 8 injections et en chronique : entre 7 et 30 traitements, durée moyenne : 3 secondes/injection
Impact sur les animaux
Ce modèle induit des douleurs inflammatoires pulmonaires à l'animal liées au développement de la pathologie. Les animaux sont suivis quotidiennement pendant la durée de l'expérimentation. La douleur pourra générer une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques, ainsi de valider notre modèle et d’analyser l’effet des différentes molécules testées.
Remplacement
Les études in vitro ne permettent pas l’étude des interactions systémiques (inflammatoires, immunitaires) intervenant dans la maladie. L’exploration des différentes fonctions physiologiques impliquées dans la BPCO demande l’étude d’un organisme complet.
Réduction
Réduction : Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum (n=10) nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations.
Raffinement
Les animaux sont observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter la douleur au moment de l’expérimentation. De plus, si des animaux présentent des signes de souffrance au cours de l'étude, de la Buprénorphine pourra être administrée ou ils seront mis à mort selon les points limites décrits dans la procédure. Les souris seront hébergées dans des cages en portoir ventilé enrichies avec du Celuron ainsi que du Sizzle-Nest en continu dès leur arrivée. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et suivront un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux pour lesquels les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettant la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. De plus leur génome possède 99% de similitude avec le génome humain, ne présente aucun gène manquant/supplémentaire pouvant modifier l’intensité de l’inflammation obtenu. Notre modèle est développé à partir de données littéraires permettant de réduire le nombre d'études de mise au point. Les animaux sont utilisés au stade adulte (8 à 9 semaines) afin de disposer d’organes avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé). Les paramètres étudiés étant l’évaluation du degré de l’inflammation et le développement de l’emphysème après exposition à la fumée de cigarette ou administration d'élastase pancréatique de porc. Un animal juvénile ou trop âgé induira un biais dans l’expérimentation.
Régulation des comportements par la photopériode chez la caille japonaise mâle – partie 2
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
50 cailles japonaises vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Comme dans le premier volet du projet, elles subissent une castration chirurgicale sous anesthésie, pour 40 d'entre elles la pose d'implants de testostérone, puis des tests de comportement dont le détail n'est pas précisé, avant le prélèvement du cerveau. L'étude prolonge la recherche sur la régulation des comportements par la photopériode chez cette espèce. Le porteur affirme que ces études comportementales n'ont "pas de système alternatif" et ne se mesurent que sur animal vigile.
Objectifs
En élevage intensif, les volailles de chair sont soumises à des programmes lumineux avec une longue période de jour (18 h de lumière / 6h de nuit). Ces programmes augmentent le temps d’accès de ces animaux diurnes à la nourriture ce qui accélère leur croissance et augmente la productivité. Néanmoins, de tels programmes lumineux ont des effets délétères bien établis sur la santé des animaux. L’exposition continue à des jours longs augmente la fréquence de certaines pathologies, favorise l’apparition de comportements aberrants et apparaît comme une source notable de stress ; de tels programmes lumineux impactent donc négativement le bien-être de l’animal. Dans une précédente étude que nous avons conduite chez la caille japonaise, nous avons pu mettre en évidence que la photopériode a un effet sur des comportements clés de l'adaptation de l'animal à son environnement, tels que la représentation mentale de son environnement, la cognition au sens large, l’agressivité et le contrôle de l’activité sexuelle. Chez les mammifères, tous ces comportements sont fortement régulés par les hormones sexuelles, en particulier la testostérone chez les mâles. La production de ces hormones sexuelles varie chez les animaux saisonnés, dont la caille japonaise, en fonction de la durée du jour. Les cailles sont sexuellement actives en jours longs, mais complètement inactives en jours courts ; chez les mâles la taille des testicules – et donc la production de testostérone - varie d’un facteur 100 selon la photopériode. Bien que la testostérone soit un modulateur hormonal reconnu de nombreux comportements, dont l’agressivité, il est établi que, chez les oiseaux, ce comportement n'est pas nécessairement corrélé au taux de testostérone. Il semble donc que la photopériode impacte certains comportements via des voies indépendantes des stéroïdes sexuels. Ce projet a donc pour but de tester cette hypothèse, en dissociant l'influence de la photopériode de celles des hormones sexuelles. Nous utiliserons pour nos expériences la caille japonaise qui est un modèle d’étude d’intégration du signal photopériodique depuis plus d’un demi-siècle. De ce fait il existe chez cette espèce de robustes outils endocrines et moléculaires qui permettent de suivre précisément l’intégration du signal photopériodique.
Bénéfices attendus
Avoir une meilleure compréhension des mécanismes de régulation des comportements par la photopériode chez la caille japonaise.
Procédures
50 animaux subiront une gonadectomie, dont 40 avec une pose d’implants de testostérone à l’âge de trois semaines sous anesthésie générale et analgésie (environ 10 minutes d'intervention) . 20 animaux seront concernés par un retrait des implants de testostérone à 7 semaines sous anesthésie générale et analgésie ( intervention de 5 min). 40 animaux participeront une fois à chaque test de comportement (5 min par tests).
Impact sur les animaux
La manipulation des animaux par l'expérimentateur peut induire un stress. La mise à jeun pour une nuit la veille de la gonadectomie peut engendrer un stress. La gonadectomie et la pose des implants peuvent entrainer des douleurs viscérales, musculaires et cutanées et peut présenter un risque d'hémorragie, ainsi qu'un stress. Le retrait des implants peut entrainer des douleurs cutanées et un stress. L’isolement lié à l'hébergement et lors des tests de comportements peut entrainer un stress.
Devenir
À la fin de l’expérimentation, tous les animaux seront euthanasiés et leur cerveau prélevé pour être étudié.
Remplacement
Les études de comportement ne sont pas réalisables in vitro ni par modélisation. Les comportements étudiés dans ce projet, comme tous comportements, ne s'expriment et se mesurent uniquement sur animal vigile. Il n'existe pas de système alternatif à ces études.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au maximum tout en permettant d'observer des différences statistiques éventuelles sur la base de notre expérience préalable quant à la variabilité des réponses comportementales et physiologiques.
Raffinement
Une anesthésie et une analgésie seront mises en place lors des chirurgies, et un suivi post opératoire sera effectué. L'hébergement des animaux se fera en cage individuelle avec enrichissement et contact sociaux visuel et olfactif. En cas de plaie ou de signe de douleur, le responsable du bien-être animal est informé directement afin de traiter l'animal (analgésiques et/ou antiseptiques, ajout de nourriture appétente). Si le traitement ne fonctionne pas et en accord avec les points limites définis, l'euthanasie sera décidée par les responsables du projet pour éviter des souffrances inutiles.
Choix des espèces
La petite taille, la prolificité et le développement rapide de la caille japonaise font de cet oiseau un modèle idéal pour les études réalisées dans le domaine aviaire, avicole. Par ailleurs, la caille japonaise est un modèle d’étude depuis de nombreuses années sur l’intégration du signal photopériodique en lien avec la reproduction. Des outils spécifiques pour examiner l’intégration du signal photopériodique ont donc déjà été développés sur cette espèce. 50 cailles mâles seront utilisées à partir du stade juvénile.
Rôle des facteurs de transcription SRF,Ctip2, le filament intermédiaire Synémine et la protéine mitochondriale Miro1 dans le système cardiovasculaire murin
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 064 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales, l'implantation chirurgicale de pompes miniosmotiques et des examens cardiaques sous anesthésie, avant d'être euthanasiées pour analyse des tissus cardiaques et musculaires. La destruction ciblée de certains gènes vise à comprendre le remodelage du cœur menant à l'insuffisance cardiaque, dans une recherche fondamentale dont les applications thérapeutiques sont renvoyées à "un deuxième temps". Le porteur affirme qu'il n'est "pas possible de reproduire en culture" la fonction cardiaque de l'animal entier.
Objectifs
Une modification des propriétés contractiles, une altération de l'architecture cellulaire du muscle cardiaque et un changement métabolique conduisent à des phénomènes de remodelage cardiaque (hypertrophie/dilatation) aboutissant dans un deuxième temps à l'insuffisance cardiaque. Au niveau moléculaire, ce phénomène de remodelage est caractérisé par un changement dans l'expression des gènes cardiaques. Ce changement est régulé par une série de protéines appelées facteurs de transcription dont l'effet sera analysé dans le cadre du projet. L'altération du cytosquelette cellulaire conduit aussi à des phénomènes de remodellage cardiaque. Ainsi une anomalie des gènes codant pour les filaments intérmédiares peuvent conduire à des pathologies cardiaques et dont les effets seront analysés. Enfin, la mitochondrie, réservoir d'énergie pour les cellules, est régulée par une série de protéines dont la mutation conduit à des défauts métaboliques. Le rôle d'une de ces protéines sera étudié dans le cadre de ce projet. Enfin, l'obésité étant un facteur de risque majeur dans l'avénement de complications cardiovasculaires, le rôle des différents gènes étudiés sera analysé aussi dans ce contexte. Ainsi, l'objectif de notre étude sera d'analyser les fonctions cardiaques de ces gènes à travers leur inactivation à un temps précis dans un modèle murin.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche fondamental, permettra de mettre en évidence le rôle des gènes étudiés dans le cadre de l'étude et aboutira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires liés au remodelage cardiaque dans un contexte de cardiomyopathie en association avec des facteurs de risques comme l'obésité. La mise en évidence de nouvelles voies de signalisation imliquées dans la progression de la pathologie, permettra d'identifier de potentielles cibles thérapeutiques dans un deuxième temps
Procédures
Les interventions sur les animaux seront 1) Contention et injection en intrapéritonéal: fréquence trois jours successives avec alternence des côtés gauche et droite, durée de l'acte 30sec. 2) Incision (5mm) au niveau dorsal pour implantation des pompes miniosmotiques: intervention (5minutes; 1 fois) réalisée sous anesthésie et analgésique (30 minute avant l'incision). L’injection d'analgésique est répétée à 24 et 48h après la procédure pendant la phase de cicatrisation et adaptation de la souris à la pompe. 3) Echocardiographie: fréquence 3, durée 15 minutes, espacé de 15jours puis un mois, intervention non invasive réalisée sous anesthésie 4) ECG: fréquence 3, espacé de 15 jours puis un mois, durée 5minutes. En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés pour l'analyse histologique et moléculaire des tissus afin de récolter les données.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables consistent en une réduction de la fonction cardiaque chez les souris suite à la délétion des gènes étudiés. La contention pour l'injection en IP et pour l'ECG pourrait générer du stress à l'animal, L'implantation de minipompes osmotiques pourrait occasionner une sensation de gêne et douleurs pendant les deux premiers jours.
Devenir
L'ensemble des souris impliqué dans le protocole sera euthanasié par une méthode réglementaire et ceci afin de récolter les différents tissus (coeur, muscles, vaisseaux) et procéder à l'examen histologique et moléculaire de ces tissus et recueillir ainsi les donnés indispensables pour déterminer le rôle des gènes étudiés dans la progression de la cardiopyopathie.
Remplacement
Pour le présent projet, le choix de l’expérimentation animale se justifie par le fait qu’il n’est pas possible de reproduire en culture la fonction cardiaque, vasculaire et musculaire telle qu’elle se retrouve dans l’animal entier (organisation structurale, régulations neuro-hormonale, influence de la dépense énergétique globale de l’organisme).
Réduction
L’utilisation du même matériel biologique pour 3 types d’analyse (morphologie, ARN et protéine) permet de diviser par trois le nombre de souris nécessaire. Le principe de réduction est appliqué par le calcul de puissance statistique de nos test basés sur des expériences de même type dans d’autres modèles de souris qui nous permettent de réduire à 7-10 souris par groupe, le nombre de souris utilisées. Ce projet nécessitera l’utilisation de 76 souris pour chaque lignée (7 lignées) ainsi qu'un nombre équivalent en souris contrôle. Ainsi 1064 souris sont prévues pour l'ensemble du projet.
Raffinement
Nous réduirons au maximum la souffrance des animaux. En effet, toutes les manipulations chez l’animal durant nos procédures seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie (pour l'imlantation de minipompes osmotiques), garantissant une pénibilité minimale pour celui-ci. Pour réduire les effets indésirable liés à des anesthésies fréquentes, l'injection en IP correspondant en terme de douleur et stress à une piqure sera réalisée sans anethésie. Une grille d’évaluation des points limites est établie. Si une souris présente des signes de stress ou de souffrance sans que le point limite soit franchi, il sera reconnu comme souffrant. L’animal sera mis sous surveillance accrue (avec marquage de cage par carte) et l’administration d’un analgésique sera envisagée en cas de nécessité. Tous les animaux qui ont atteint ces points limites seront euthanasiés précocement. Toutes ces attentions particulières portées au bien-être animal seront complétées par un hébergement adapté, c’est-à-dire avec des congénères (répartis en cages de 5) et avec des éléments d’enrichissement dans les cages (cubes de bois à ronger, abris, substrats pour la construction de nids, nourriture et eau de boisson ad libitum) afin de créer un environnement propice au confort des animaux. Le milieu sera enrichi avec des nids et des maisons en carton.
Choix des espèces
Pour atteindre notre objectif, nous sommes amenés à utiliser un modèle murin car aucun système in vitro et aucun modèle d’organisme plus simple ne permet de reproduire la complexité de la fonction cardiaque. La souris a été sélectionnée pour la possibilité de générer par recombinaison homologue ou transgénèse des modèles d’invalidation ou surexpression du gène Les animaux utilisés auront entre 2 et 4mois d'âge (considéré comme l'âge où le coeur a fini sa croissance et présente les caractéristiques d'un coeur adulte) au début de la procédure. Les souris seront maintenues en cages (5/cages)
Recherches sur la maladie de Parkinson et le développement de nouveaux traitements.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie subit une chirurgie du cerveau détruisant les neurones dopaminergiques pour mimer la maladie de Parkinson, avec injections de nanoparticules puis prélèvement du cerveau, certaines perdant plus de 10 pour cent de leur poids et peinant à manger et boire après l'opération. Sur ces 2 000 animaux, le porteur indique que 576 souris seront produites en élevage puis euthanasiées sans jamais entrer en procédure, faute du "bon génotype". Il reconnaît l'existence de modèles mathématiques et in silico, mais affirme qu'ils "ne peuvent pas encore se passer" de l'expérimentation animale.
Objectifs
Avec 200.000 malades en France, la maladie de Parkinson est l’une des maladies neuro-dégénératives les plus fréquentes, qui entraîne d’importants handicaps moteurs, psychologiques et sociaux. Elle est principalement liée une dégénérescence progressive des neurones utilisant la dopamine comme neurotransmetteur (neurones dopaminergiques). Les traitements restent encore symptomatiques et présentent des limites. C’est pourquoi des progrès thérapeutiques sont nécessaires. Le but du projet est deux ordres : 1) renforcer nos connaissances sur les altérations physiopathologiques entraînées par la disparition de la dopamine dans les neurones cibles de ce neurotransmetteur ; 2) développer de nouvelles approches pour stimuler ces neurones cibles de manière contrôlée pour réduire les symptômes de la maladie. Des altérations des voies de signalisation intracellulaire ont été observées dans les neurones du striatum dans des modèles murins de la maladie de Parkinson. Ces changements ont des conséquences sur le développement de symptômes et sur les réponses bénéfiques et/ou néfastes aux thérapies médicamenteuses. Cependant, les altérations dans les différentes populations de neurones du striatum ainsi que leurs mécanismes n’ont pas encore été complètement élucidés. Dans une première procédure, nous proposons de mieux caractériser ces processus et d’en identifier de nouveaux. Dans une deuxième procédure, nous chercherons à montrer l’efficacité de nouveaux outils moléculaires (nanoparticules) sensibles aux infrarouges ou aux ultra-sons pour stimuler les neurones dont l’activité est altérée dans la maladie de Parkinson. Cette procédure est une première étape avant d’envisager l’utilisation de ces nouveaux outils pour réduire les symptômes de la maladie Le modèle expérimental de la maladie de Parkinson consiste à détruire chez la souris l’innervation dopaminergique de la région motrice la plus riche en terminaisons dopaminergiques, le striatum.
Bénéfices attendus
Le projet fera progresser les connaissances dans les domaines de la physiopathologie de la maladie de Parkinson. Nous chercherons à développer des approches thérapeutiques hautement innovantes pour cette maladie. Ces recherches thérapeutiques sont très en amont d’une application pratique en médecine humaine et requièrent une expérimentation animale afin d’apporter la preuve de concept concernant leur efficacité. Il est à noter que si la preuve de concept est apportée dans le domaine de la maladie de Parkinson, des approches similaires pourront être développées pour soigner d’autres maladies neurologiques.
Procédures
- 1 chirurgie stéréotaxique sur animal sous anesthésie et analgésie pendant 30 min - Injection de nanoparticules par voie intracérébrale (animaux sous anesthésie et analgésie, durée 30 min) ou par voie intrapéritonéale (30 s). - 1 Euthanasie sous anesthésie et analgésie en fin de procédure pour prélever le cerveau. Durée du geste : 10 min - Elevage de souris mutantes avec un phénotype dommageable (maximum pendant 6 mois)
Impact sur les animaux
Le projet envisagé propose de détruire l’innervation dopaminergique du striatum unilatéralement chez la souris afin de mimer certains aspects de la maladie de Parkinson. Les injections stéréotaxiques de 6-OHDA induiront potentiellement un stress ainsi que de la douleur chez certains animaux dans les heures ou les jours suivants après la chirurgie stéréotaxique. Les animaux auront souvent du mal à récupérer du fait des déficits moteurs liés à la lésion partielle des neurones dopaminergiques. Assez fréquemment, les animaux présenteront des difficultés à manger et boire dans les jours qui suivent l’opération, perdant parfois plus de 10% de leur poids pendant cette période. Le projet prévoit également des micro-injections stéréotaxiques de vecteurs viraux. Quand des animaux devront être lésés à la 6-OHDA, le neurotoxique sera dilué avec les vecteurs viraux afin de n’effectuer qu’une seule opération chirurgicale par animal. L’expression des vecteurs viraux n’entraîne aucune altération fonctionnelle des neurones striataux infectés et donc aucune modification de la perception ou du comportement de l’animal ainsi qu’aucune douleur ou aucun stress. Les seules conséquences sont liées à l’opération chirurgicale. Certains groupes d’animaux recevront des nanoparticules 2 h avant leur euthanasie sans conséquence néfaste autre que celles induites par le geste expérimental. Pour une partie du projet, nous utiliserons des souris Drd1-KO. Ces souris présentent un poids et une taille inférieurs à la normale. Elles sont aussi hyperactives et ont des comportements anormaux. Cependant, elles ne semblent pas souffrir de ces déficits malgré leur aspect quelque peu chétif. Une mortalité légèrement plus élevée peut être notée. Les animaux seront gardés en vie pendant au plus 4 semaines après la chirurgie.
Devenir
Les animaux d'intérêts avec un phénotype dommageable à l’issue de la procédure d’élevage seront utilisés dans une autre procédure du même projet. Les autres animaux produits devront être euthanasiés, car, n’ayant pas le génotype adéquat, ils seront inutilisables pour les expériences. A l’issue des procédures expérimentales, les animaux seront euthanasiés pour réaliser des analyses physiologiques sur des coupes de cerveaux.
Remplacement
Concernant le développement de nouveaux outils thérapeutiques, il est prévu un programme expérimental extensif sur cellules en culture avant les tests sur les animaux vivants. Cet aspect du projet sera réalisé par des collaborateurs et seules les pistes qui paraîtront les plus prometteuses à l’issue de ces investigations préliminaires seront testées par l’expérimentation animale, limitant ainsi le nombre des essais. Des modèles mathématiques et computationnels ont été développés pour comprendre les mécanismes neuronaux que nous étudions . Cependant, nos connaissances sur les processus neurobiologiques sont limitées et les modèles in silico ne peuvent pas encore se passer de validations avec de l’expérimentation animale. Cependant, nous nous efforçons, autant que possible, d’évaluer nos approches et d’adapter nos expériences en fonction du développement de modèles computationnels, Nous étudierons des fonctions spécifiques du système nerveux dont l’exploration requiert un cerveau avec le moins d'altérations possibles et donc l’expérimentation sur l’animal en absence d’alternative fiable avec des techniques de cellules en culture et des modèles in silico . Notre projet propose de disséquer les conséquences d’une disparition de l’innervation dopaminergique du striatum et de trouver de nouvelles techniques pour les pallier. Le projet utilisera des approches intégrées sur animal entier, nécessitant des souris porteuses de lésions.
Réduction
Nous chercherons à réduire le plus possible la variabilité expérimentale par des protocoles expérimentaux rigoureux et par l’utilisation de groupes d’animaux le plus stables possibles en termes génétiques et d’hébergement. De plus les groupes de souris lésées et non lésées seront issus des mêmes portées dans la mesure du possible. Nous évaluons à 576 le nombre de souris mutantes produites qui présenteront certains déficits comportementaux (phénotype légèrement dommageable) mais qui ne seront pas utilisées dans des procédures expérimentales, essentiellement à cause d'un mauvais génotype. Le nombre total d’animaux impliqués (2000) comprendra donc 1424 souris pour les procédures expérimentales au sens strict, auquel s'ajoutent les 576 souris produites en élevage mais inutilisables dans les expériences. D’une façon générale, les résultats obtenus seront analysés avec des méthodes statistiques rigoureuses et éprouvées. La taille des groupes d’animaux expérimentaux est estimée en se basant des travaux précédents. 8 animaux par groupe seront en général suffisants pour dégager des effets statistiquement significatifs dans les réponses que nous proposons de tester.
Raffinement
Sauf dans des cas rares où cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale et locale en recourant à des analgésiques. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux de 5 individus au maximum et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront exclus du protocole
Choix des espèces
Dans le projet, la souris sera utilisée afin de tirer profit des techniques de transgénèse très efficaces dans cette espèce. La souris est le modèle le plus utilisé pour les maladies humaines du mouvement, notamment la maladie de Parkinson. Pour ces études, la méthode de lésion sélective des neurones dopaminergiques avec la 6-OHDA est très efficace et bien contrôlée depuis de nombreuses années. La souris a des mouvements coordonnés des pattes pour des comportements moteurs élaborés qui sont fortement impactés par la dégénérescence des neurones dopaminergiques, ce qui en fait un modèle particulièrement pertinent pour l’étude de la maladie de Parkinson. Le striatum murin, comporte également une organisation anatomo-fonctionnelle proche de celles des primates non humains et humains, ce qui permet relativement facilement d’extrapoler les mécanismes découverts chez la souris à l’humain. Expériences chez des animaux de l’adolescence à l’âge adulte. Les premières procédures chirurgicales commenceront chez des souris pré-pubères à l’âge de 6 semaines, puis les animaux seront euthanasiés 4 semaines plus tard, à l’âge de 10 semaines juste après la puberté. Cette partie du projet s’intéresse à la pathogenèse et la thérapeutique des mouvements anormaux liés à la maladie de Parkinson qui apparaissent à l’âge adulte et même chez le sujet âgé. Cependant, les expériences envisagées après l’euthanasie, sur les coupes vivantes de striatum, fournissent des résultats plus fiables et plus intenses lorsque le cerveau est jeune. La procédure proposée constitue un bon compromis entre la nécessité scientifique d’étudier le cerveau adulte et les contraintes techniques en faveur d’analyses sur le cerveau jeune.
Impact du microbiote sur le développement tumoral dans des modèles de mélanomes murins spontané ou induit
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 322 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome sous la peau ou en intraveineuse, des gavages répétés pouvant atteindre 52 séances par animal, des applications cutanées de bactéries et des injections d'immunothérapie, avant d'être mises à mort pour prélever tumeurs et organes lymphoïdes. L'étude cherche à comprendre comment le microbiote influence la réponse au traitement du mélanome. Le porteur affirme que l'interaction entre bactéries intestinales et réponse immunitaire ne peut être étudiée que sur "organisme entier".
Objectifs
Le mélanome est un cancer qui se développe initialement au niveau de la peau (mélanome cutané) ou de l’œil (mélanome uvéal). Le mélanome cutané est le cancer dont le taux d’incidence a le plus augmenté entre 2010 et 2018 (+3,4 %). La mortalité due à ce cancer diminue notamment grâce à des avancées thérapeutiques importantes au cours de la dernière décennie. En effet, les immunothérapies permettant de renforcer l’action anti-tumorale des lymphocytes T constituent la première ligne de traitement du mélanome en France. Cependant 60% des patients résistent à ces traitements. Nous étudions une protéine qui pourrait jouer un rôle majeur dans cette résistance. Notre hypothèse est que cette protéine, surexprimée dans le microenvironnement tumoral, élimine des bactéries indispensables pour la réponse au traitement. Nous proposons d’identifier ces bactéries, puis d’évaluer si ces dernières potentialisent l’efficacité de l'immunothérapie. Alternativement, nous évaluerons l’efficacité thérapeutique d’un inhibiteur de notre protéine d'intérêt. L’objectif fondamental de ce projet est de déterminer l’impact de ces traitements sur les cellules immunitaires au site de la tumeur.
Bénéfices attendus
Nous avons mis en évidence le rôle d’une protéine dans l’agressivité du mélanome. Ce projet permettra de mieux comprendre le mécanisme d’action de cette protéine. Compte tenu d’une part de sa capacité à lyser des bactéries in vitro et d’autre part de sa surexpression lors du développement du mélanome, cette protéine pourrait modifier in vivo la composition des bactéries aux niveaux de l’intestin mais aussi de la peau, site du développement tumoral. Nous émettons l’hypothèse que le retard du développement tumoral chez les souris dont l’expression de cette protéine a été inactivée est dû à la présence de bactéries anti-tumorales et que ces bactéries sont spécifiquement éliminées chez des souris exprimant notre protéine d’intérêt. Nous déterminerons quel est l’impact de telles bactéries sur le développement tumoral et la mise en place d’une réponse immunitaire dans un modèle de mélanome induit par transplantation et dans un modèle de mélanome spontané. Nous déterminerons si ces bactéries anti-tumorales ou un inhibiteur de notre protéine d'intérêt augmentent l’efficacité d’un traitement par immunothérapie. Des essais cliniques récents supportent que des patients atteints de mélanome métastatique, initialement réfractaires à une immunothérapie, répondent au traitement après avoir reçu une transplantation des selles de malades répondeurs à ce traitement. A terme, nos travaux pourraient permettre de proposer deux nouvelles stratégies pour traiter le mélanome cutané chez l’homme. Une première stratégie consisterai à modifier la composition des bactéries, non plus de façon systémique, mais au niveau cutané. Alternativement, nous proposer d’associer à l’immunothérapie de référence un inhibiteur de notre protéine d’intérêt.
Procédures
Prélèvement sur souris vigiles de 15-20 jours de bactéries cutanées par écouvillon et de fèces. Rasage des souris (5 minutes par souris), un jour avant l'injection en sous-cutanée des cellules de mélanome. Injection en sous-cutanée (estimation 5 minutes) ou en intra-veineuse (estimation 6 minutes) de cellules de mélanome. Ceci n'est réalisé qu'une fois par souris. Cinq mesures des tumeurs avec un pied à coulisse suite à la transplantation de cellules de mélanome en sous-cutanée. Cela prend environ 5 minutes par souris maintenues en contention. Gavage oral (5 minutes par souris) tous les 3 jours avec des fèces chez des souris avec un mélanome transplanté. Le gavage sera réalisé maximum 6 fois par souris. Application topique avec une pipette de bactéries sur la peau rasée de souris sous anesthésie. 5 dépots de bactéries sont prévus par souris. L'intervention durera le temps de pénétration des bactéries dans la peau puis le temps de réveil. Cela est estimé à 30 minutes par souris. Plusieurs souris seront traitées simultanément. Administration intra-péritonéale (estimation 3 minutes par souris) d'une immunothérapie tous les 5 jours à partir de J14 et gavage oral (estimation 5 minutes par souris) avec des bactéries tous les 4 jours à partir de J15 dans le modèle de mélanome spontané. Au total 10 injections de l'immunothérapie et 11 gavages par des bactéries sont prévus par souris. Gavage oral bi-quotidien (5 minutes par souris) avec un inhibiteur de notre protéine d’intérêt (100µl) pendant 26 jours. Au total 52 gavages par souris.
Impact sur les animaux
Les injections sous-cutanées, intra-veineuses, intra-péritonéales et par gavage oral peuvent occasionner stress et douleurs lorsque celles-ci sont pratiquées aux animaux. Le dépôt de bactéries sur la peau n'engendre pas de douleur. La croissance tumorale, spontanée ou induite par la transplantation des cellules de mélanome, peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs. Enfin la manipulation pour collecter les fèces chez des souris avant sevrage ou encore mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse peut également induire un stress chez les animaux. La transplantation de cellules tumorales en intra-veineuse peut induire une perte de poids des animaux.
Devenir
Les males reproducteurs seront tous mis à mort à l’atteinte des points limites. Tous les autres animaux seront mis à mort pour prélever des organes lymphoides secondaires (rate et ganglions) et des tumeurs primaires et des métastases.
Remplacement
Des expériences in vitro suggèrent que la protéine que nous étudions empêche la mise en place de réponses immunitaires anti-tumorales. Des expériences sont actuellement réalisées in vitro pour évaluer si cette protéine est également capable de lyser spécifiquement des bactéries fécales cultivées dans des conditions qui miment le flux intestinal. L’objectif est d’identifier des bactéries sensibles à cette protéine. Cela sera complémentaire de la caractérisation des bactéries fécales et cutanées présentes chez les souris exprimant ou non notre protéine d’intérêt. Le recours à l’expérimentation animale est justifié par l’impossibilité de modéliser in vitro ou in silico les interactions entre les bactéries intestinales et les cellules immunitaires associés au mélanome primaire ou aux métastases cutanées. En effet, la complexité de la réponse immunitaire in vivo dans la tumeur et les organes lymphoïdes secondaires des vertébrés ne peut être reproduite par des méthodes alternatives. Le bénéfice d’une réponse à un traitement (réorientation du microbiote ou inhibiteur de la protéine d’intérêt) sur le développement tumoral ne peut être étudié que sur organisme entier en raison de l’organisation et de la coopération des tissus.
Réduction
Pour respecter le principe des 3R, la durée du traitement par l’inhibiteur de la protéine que nous étudions a déjà été optimisée par notre collaborateur qui a développé cette molécule. Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant. L’expérience des manipulateurs permettra d’assurer la reproductibilité de la procédure et d’appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. Ainsi les groupes reposant sur le modèle de mélanome spontané nécessitent 40 souris, alors que les procédures de transplantation tumorale requièrent des groupes de 16 souris. Les élevages permettent de générer non seulement des souris transgéniques pour un oncogène développant spontanément un mélanome, mais aussi des souris contrôles non transgéniques de la même portée.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Les souris disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de “maison-abri” en carton. Nous nous efforcerons à chaque instant de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Nous avons défini des points limites pour lesquels les animaux seront mis à mort. L’état général des animaux sera suivi par le personnel qualifié de l’animalerie lors des changes. A partir des traitements, les animaux seront suivis 3 à 5 fois par semaine par le responsable du projet pour suivre le comportement des animaux et la progression tumorale. Les animaux injectés par des cellules tumorales en intra-veineuse seront pesés à J0 et à J7 et J12. Tout état anormal sera transmis au responsable de projet et les mesures pour remédier à la douleur animale seront mises en place (mise à mort et analyse des animaux).
Choix des espèces
La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la réponse immunitaire anti-tumorale, de nombreuses voies étant conservées entre la souris et l'homme. En particulier, le modèle de mélanome spontané est relevant cliniquement par rapport à la pathologie humaine. Nos données préliminaires de co-hébergement de souris,contrôles ou déficientes pour la protéine qui nous intéresse, montrent le rôle du microbiote sur la progression tumorale ce qui justifie d’identifier des bactéries pro- et anti-tumorales chez ces souris. Dans notre modèle comme chez l’homme, le traitement de référence utilisé en clinique pour traiter le mélanome cutané métastatique n’est que partiellement efficace. Nous espérons améliorer son efficacité soit en modifiant simultanément les bactéries présentes aux niveaux intestinal ou cutané, soit en l’associant un inhibiteur de notre protéine d’intérêt. Les souris contrôles et déficientes pour la portéine qui nous intéresse auront entre 6 et 10 semaines au moment de la transplantation tumorale car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral et l’effet de la modulation du microbiote sur celui-ci. Les souris transgéniques que nous utilisons développent un mélanome primaire vers l’âge de 3 semaines qui métastase au niveau cutané vers 4 à 5 semaines. Les fèces seront donc prélevés sur des animaux de 15 à 20 jours, un peu avant la détection macroscopique de la tumeur primaire, dans la mesure où le microbiote influence très tôt le développement tumoral. Ces souris seront également traitées dès J14 pour étudier l’effet de la modulation du microbiote et de l’immunothérapie sur le développement tumoral. Finalement, elles seront traitées avec l’inhibiteur de notre enzyme associé ou non à l’immunothérapie soit à J14 soit à J60 pour étudier l’effet sur le développement tumoral dans des conditions prophylactique et thérapeutique.