Recherche fondamentale

Opérés du crâne sous anesthésie pendant environ une heure, puis soumis à une perfusion intracardiaque qui les tue, 625 rats sont utilisés dans des procédures classées en souffrance modérée. Le projet étudie le rôle du lactate et du glucose dans la communication entre neurones et astrocytes. Le RNT évoque un inconfort transitoire et une douleur modérée après l'opération, pris en charge par un suivi visant à minimiser l'impact sur le bien-être des animaux non-humains. Le nombre de 625 rats n'est rattaché à aucune justification chiffrée dans le texte.

Objectifs

« Le cerveau fonctionne grâce aux neurones, qui communiquent entre eux au niveau de petites structures spécialisées appelées synapses. Des recherches récentes montrent que d’autres cellules, présentes dans le cerveau entre les vaisseaux et les neurones, communément appelées astrocytes, jouent un rôle important dans cette communication neuronale. Pour fonctionner, les neurones ont besoin d’énergie. Il a longtemps été considéré que le glucose était leur seule source. Mais de plus en plus de travaux suggèrent que le lactate, une molécule produite à partir du glucose par les astrocytes, pourrait aussi fournir de l’énergie aux neurones. Plus spécifiquement : l’astrocyte récupère le glucose dans le sang, le transforme en lactate, puis l’envoie aux neurones. Une fois dans le neurone, le lactate est transformé en énergie. Les neurones peuvent aussi récupérer directement du glucose. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre, dans une région précise du cerveau appelée cortex somatosensoriel primaire, quelle source d’énergie les neurones utilisent selon leur activité et donc le niveau de demande énergétique : uniquement le glucose, uniquement le lactate, ou les deux.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à comprendre comment les neurones obtiennent l’énergie dont ils ont besoin pour fonctionner correctement. Les neurones utilisent normalement du glucose, mais il est possible qu’ils tirent également de l’énergie d’une molécule produite par d’autres cellules du cerveau, appelées astrocytes. Savoir exactement quelle source d’énergie les neurones utilisent est crucial pour comprendre comment le cerveau fonctionne, apprend et mémorise. Ces connaissances fondamentales permettront de mieux comprendre le fonctionnement normal du cerveau et poseront les bases pour développer, à l’avenir, des stratégies pour prévenir ou traiter des maladies où le métabolisme énergétique est altéré.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale, d'une durée d’environ 1h afin d’identifier la source d’énergie dont les neurones ont besoin en fonction de leur activité. Ils seront ensuite soumis à une perfusion intra cardiaque après injection d’anesthésiques. La sévérité de la procédure est modérée.

Impact sur les animaux

Les animaux pourraient ressentir un inconfort transitoire lié à la manipulation et à la chirurgie, ainsi qu’une douleur modérée durant la période post-opératoire. Des perturbations temporaires de l’état général, comme une diminution de l’activité ou de l’appétit, peuvent également survenir. Ces effets sont limités dans le temps et pris en charge par un suivi attentif afin de minimiser l’impact sur le bien-être des animaux.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux ne seront pas gardés du fait des techniques subies et seront de ce fait mis à mort.

Remplacement

Dans ce projet, nous étudions la communication entre les neurones et les astrocytes dans le cerveau. Ces interactions sont trop complexes pour être reproduites avec des ordinateurs ou des cellules en culture, il est donc nécessaire de travailler sur des animaux vivants. Le rat est un animal très utilisé pour comprendre le rôle des astrocytes dans la communication entre neurones et dans la plasticité du cerveau, qui est la base de la mémoire. Pour ces raisons, il n’est pas possible de remplacer les expériences animales par d’autres méthodes.

Réduction

Nous utilisons des tests statistiques pour déterminer le nombre d’animaux minimal nécessaire . Ce nombre permet de garantir des résultats fiables tout en limitant l’utilisation d’animaux. Nous avons aussi pris en compte les risques liés aux interventions, afin d’assurer la qualité des données. Au total, 625 rats sur cinq ans seront utilisés, ce qui correspond au minimum nécessaire pour atteindre nos objectifs scientifiques.

Raffinement

Des mesures de RAFFINEMENT seront mises en place durant toute la durée du projet. Des points-limites ont été établis entraînant une prise en charge de l’animal afin d’anticiper toute souffrance et réduire au mieux l'inconfort des animaux suite à la chirurgie (anesthésie, analgésie, gel oculaire lubrifiant pour protéger la cornée tapis chauffant) jusqu’à leur récupération complète.

Choix des espèces

Le rat est classiquement utilisé pour comprendre le rôle des astrocytes dans la communication neuronale et la plasticité synaptique à long terme et présente donc une bibliographie importante permettant de réduire le nombre d'animaux. Les questions que nous posons concernent le stade adulte, c’est pourquoi les rats seront réceptionnés à l’âge de 6 semaines, injecté à 7 semaines minimum puis les expériences seront réalisées à l'age de 11 à 16 semaines.

Pour tester un vaccin peptidique contre les coxsackievirus, soupçonnés dans le diabète de type 1, 348 souris sont utilisées dans des procédures classées en souffrance modérée, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent trois injections sous la peau ou dans l'abdomen, puis des prélèvements de sang à la queue sous anesthésie locale pour mesurer les anticorps produits. Les effets attendus sont un stress de contention, des inflammations et des ulcérations aux points d'injection et des saignements aux sites de prélèvement. Le RNT conclut qu'aucun modèle in vitro ne peut évaluer une protection vaccinale et affirme la "nécessité" de recourir à la souris.

Objectifs

Les objectifs du projet consistent à induire la production d’anticorps contre les coxsackievirus B chez la souris à l’aide d’un peptide viral et déterminer si cette immunisation protège les animaux de l’infection virale.

Bénéfices attendus

La finalité du projet est de valider le choix d’un candidat vaccin contre les coxsackievirus B. Le projet s'inscrit dans la conception d'une stratégie de lutte originale à base de peptides qui induisent une immunité protectrice de l'hôte vis-à-vis des coxsackievirus B et des pathologies liées à ces virus et notamment le diabète de type 1.

Procédures

Les interventions seront des vaccinations et des prélèvements sanguins qui seront réalisées sous anesthésie gazeuse ou locale. Les vaccinations se feront sous forme de trois injections à J0, J21 et J35 par voie intrapéritonéale et/ou sous-cutanée (30 secondes par inoculation). De faibles quantités de sang seront prélevées au niveau de la queue à J34 et J49 (5 minutes environ par prélèvement) afin d'évaluer la présence d’anticorps chez les animaux immunisés. En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés entre J55 et J60 sous anesthésie gazeuse afin de récupérer le sang et les organes (pancréas, coeur, rate, intestin).

Impact sur les animaux

Les procédures d’immunisation peuvent notamment conduire à un stress (contention de l’animal), gêne légère, douleur légère, et inflammation localisée/ulcération aux sites d’injections liés à des injections répétées par voie sous-cutanée d’antigènes et d’adjuvants. Par ailleurs, les prélèvements sanguins répétés à J34 et J49 au niveau de la queue sous anesthésie local peuvent induire un stress (contention de l’animal), saignements + perte de poids et/ou inflammations localisés aux sites de prélèvements.

Devenir

Le projet vise à déterminer si notre immunisation protège les animaux de l’infection virale. Pour le savoir, il faut évaluer la quantité d’anticorps produite dans le sang ainsi que la quantité de virus dans les organes (pancréas, coeur, rate, intestin). Une mise à mort de tous les animaux sera donc réalisée à la fin des procédures.

Remplacement

La production d’anticorps suivie de l’évaluation de la protection vis-à-vis d’une infection correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire d’un organisme vivant. Il n’existe pas de modèle in vitro ou de méthodes alternatives capables de répondre à cette problématique.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est prévu pour avoir un effectif minimum permettant d’avoir des résultats significatifs. De plus, le protocole établi prend en compte le suivi régulier des animaux et des prélèvements répétés sur les mêmes animaux plutôt que sur plusieurs groupes distincts afin de recueillir un maximum d'informations, tout en limitant le nombre d’animaux à utiliser.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux et les conditions d'hébergement seront améliorées (enrichissement, alimentation, soins) afin d'augmenter au mieux le bien-être animal. L’état général des animaux (évolution du poids, comportement, apparence) et les sites d’injection seront observés chaque jour afin d’arrêter si besoin l’expérimentation ou mettre en place une procédure ou un traitement pour réduire la souffrance et/ou la détresse des animaux. Les prélèvements sanguins se feront au niveau de la queue après désinfection et sous anesthésie locale ou gazeuse. Les volumes de sang prélevés seront faibles avec une période de récupération de deux semaines entre deux prélèvements afin de respecter la réglementation. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisés que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’inoculation) et à usage unique. Une désinfection/cicatrisation et une analgésie seront mises en place en cas d’inflammation localisée aux sites d’injections. En cas de souffrance/détresse sévère avérée, les animaux seront mis à mort immédiatement sous anesthésie générale gazeuse.

Choix des espèces

Les souris sont infectables par les coxsackievirus B (qui sont des virus des êtres humains). Les animaux seront utilisés à un âge entre 3 et 5 semaines car les souris jeunes sont davantage infectables par les entérovirus (et notamment les coxsackievirus B) contrairement aux souris plus âgées.

Les souris chez qui la sonde de gavage part dans la trachée sont mises à mort sur-le-champ. 260 souris sont utilisées dans des procédures classées en souffrance modérée, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Elles sont infectées par le parasite Giardia puis gavées chaque jour pendant douze jours au maximum, pour tester un traitement à base de probiotiques. Le RNT décrit l'infection comme asymptomatique et spontanément résolutive, l'essentiel des atteintes venant alors des gavages répétés eux-mêmes.

Objectifs

Giardia intestinalis est un parasite de l’intestin de nombreuses espèces de mammifères dont l’Homme. Il est à l’origine d’infections intestinales souvent chroniques se traduisant par des diarrhées et parfois des signes de malabsorption. Le nombre croissant de cas de giardiose liés à la contamination de l’eau potable, aux effets secondaires des traitements, ainsi qu’à l’émergence de souches résistantes aux médicaments, fait de la giardiose un sujet d’actualité de plus en plus préoccupant qui nécessite le développement de traitements alternatifs. Il est établi que la microflore intestinale et certains probiotiques, tels que les bactéries Lactobacillus johnsonii, jouent un rôle important dans la protection contre cette parasitose. Des résultats obtenus in vitro et in vivo montrent que ces bactéries agissent en produisant des composés toxiques pour le parasite, permettant de réduire les signes de la maladie. Une souche de L. johnsonii a également fait l’objet d’un essai clinique chez le chiot, au cours duquel ses propriétés anti-Giardia ont pu être confirmées. À partir de ces résultats encourageants, cinq nouvelles souches de probiotiques présentant des propriétés anti-Giardia augmentées comparativement à la souche d’origine in vitro ont été obtenues au laboratoire. Afin de déterminer quelle souche sera utilisée chez l’espèce hôte cible (le chien), et afin d’étudier in situ dans l’intestin les mécanismes à l’origine de ces effets, il est nécessaire de valider les résultats obtenus in vitro par des essais in vivo d’infection à Giardia sur des modèles rongeurs. L’objectif est de proposer une méthode de lutte novatrice de la giardiose chez le chien fondé sur la biothérapie.

Bénéfices attendus

La majorité des traitements humains ou vétérinaires actuels reposent sur l’emploi d’antibiotiques, qui provoquent d’importants effets secondaires et sont de moins en moins efficaces en raison de l’émergence de souches résistantes. Ce contexte préoccupant impose le développement de traitements alternatifs innovants, ainsi que des avancées majeures dans la compréhension des interactions hôte/Giardia/microbiote, qui constituent la base de nombreuses thérapies nouvelles. Giardia est un parasite présentant une prévalence importante pour l’élevage en Europe et dans le monde. La diminution de l’utilisation des antibiotiques dans les traitements des animaux constitue un enjeu majeur compte tenu de l’apparition de nombreuses souches résistantes. Le développement de traitements alternatifs est donc essentiel, en particulier dans ce secteur. La réduction des souches résistantes aux antibiotiques ainsi que la diminution des résidus d’antibiotiques dans l’alimentation humaine et animale sont au cœur des enjeux sociétaux et environnementaux actuels et futurs. Ce projet permettra, à court terme, le développement et la mise sur le marché vétérinaire de probiotiques anti-Giardia, puis à plus long terme une application potentielle chez l’Homme. Il contribuera à élargir l’éventail thérapeutique, à améliorer la prise en charge et le traitement de la maladie, et in fine à améliorer la qualité de vie des individus concernés. Il permettra également de faire progresser les connaissances fondamentales relatives à l’application de souches probiotiques produisant des BSH, notamment dans leur action synergique avec le microbiote. Le microbiote est au centre de découvertes majeures en médecine vétérinaire et humaine depuis plus de 20 ans. Ce projet vise à en comprendre les mécanismes clés, ouvrant ainsi la voie à l’identification de nouveaux axes de recherche fondamentaux et appliqués.

Procédures

Au cours des études et pour l’ensemble des animaux rentrant en procédures, les interventions seront : - Pesée et gavage oesogastrique quotidiens pendant 12 jours maximum (5 min maximum par animal) - Deux gavages oesogastriques quotidiens espacés d’une demi-journée : 1 fois - Mise à mort

Impact sur les animaux

L’infection à Giardia duodenalis est asymptomatique et auto-résolutive en une dizaine de jours chez la souris. Les potentiels effets indésirables seront les erreurs de gavage (fausse route avec passage de la sonde dans la trachée, détectable par présence de sang sur la sonde). Dans ce cas les animaux concernés seront mis à mort immédiatement.

Devenir

A l’issue de l’ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort afin de procéder au prélèvement des différents organes nécessaires à la quantification de la giardiose et aux traitements des données expérimentales.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est nécessaire pour confirmer les observations faites in vitro. En effet, le test in vitro ne permet d’apprécier que l’efficacité du surnageant de culture bactérienne sur Giardia. Il est donc nécessaire de vérifier l’efficacité de ces stratégies thérapeutiques dans des conditions physiologiques. De plus, il n’existe pas de modèle in vitro envisageable qui permet l’étude des interactions hôte/Giardia/microbiote. L’ensemble des souches de probiotiques qui seront administrées in vivo auront fait l’objet d’études préliminaires in vitro et seront le fruit d’une première sélection visant à ne garder que les souches ayant un réel intérêt anti-Giardia. Des tests en laboratoire auront d’abord été effectués afin d’évaluer l’efficacité des différentes souches et de ne retenir que les plus prometteuses avant les essais in vivo. Pour chaque formulation, des études de faisabilité, de stabilité de l’activité sont réalisées. Ainsi les formulations qui seront étudiées in vivo seront également issues d’un processus de sélection afin de limiter le nombre de groupes et donc le nombre d’animaux entrant dans cette étude.

Réduction

Pour le modèle de souris âgés de 3 semaines, une publication récente a démontré qu’un effectif de 10 souris par groupe étaient suffisants. Aussi, le choix d’un effectif de 10 souris par groupe repose sur des modèles précédemment publiés, dans lesquels des groupes de 10 animaux ont été utilisés pour évaluer la charge parasitaire et les réponses immunitaires en réponse à un traitement. Le nombre d’animaux inclus dans cette étude a été déterminé en amont à l’aide d’outils méthodologiques reconnus, afin de garantir un équilibre entre la robustesse scientifique des résultats et le respect du principe de réduction du nombre d’animaux utilisés. Chaque expérience comprendra quatre groupes distincts, avec un effectif équilibré entre les groupes, pour un total de 40 individus. L’organisation des animaux (notamment leur répartition par cage) a été prise en compte afin de limiter les biais potentiels liés aux conditions d’hébergement. Cette précaution permet d’assurer une interprétation rigoureuse des résultats. Les données recueillies feront l’objet d’analyses statistiques adaptées à leur nature et à leur distribution, conformément aux standards méthodologiques en vigueur.

Raffinement

Un suivi quotidien du bien-être des animaux sera assuré à l’aide d’un cahier de suivi renseigné chaque jour par des animaliers et les expérimentateurs. Les points limites, fondés sur des critères objectifs et facilement mesurables, tels que la perte ou l’absence de gain de poids entre deux prises, les troubles de mobilité et la posture des animaux, permettront de détecter précocement toute altération de l’état général et d’éviter aux animaux l’apparition d’une souffrance inutile. Les gavages œsogastriques seront réalisés par des expérimentateurs formés et entraînés, conformément à une procédure dédiée, ce qui contribuera au raffinement de l’ensemble des manipulations prévues dans le projet. Un enrichissement du milieu d’hébergement sera également mis en place afin d’améliorer le confort des souris, notamment par l’ajout de maisons, de roues, de tubes transparents, de cellulose déchiquetée et de bâtons à ronger

Choix des espèces

Deux espèces de Rongeurs sont habituellement utilisées pour les études expérimentales de la giardiose : la souris et la gerbille de Mongolie qui est beaucoup plus difficile à manipuler et très sensible au stress et qui n’est utilisée que lorsque le modèle souris ne peut pas être utilisé notamment pour étudier la giardiose chronique. Deux espèces de Rongeurs sont utilisées pour les études expérimentales de la giardiose : la souris et la gerbille de Mongolie qui est beaucoup plus difficile à manipuler et très sensible au stress et qui n’est utilisée que lorsque le modèle souris ne peut pas être utilisé notamment pour étudier la giardiose chronique. Les modèles souris sont des modèles reproductibles. Ils correspondent aux modèles les plus utilisés pour tester des traitements contre la giardiose. L’infection par Giardia n’est possible que chez le souriceau avant sevrage et jusqu’à l’âge de 4 semaines. Après cet âge, l’infection est inconstante ou nécessite un traitement préalable des animaux (immunosuppression ou antibiothérapie pour détruire la flore digestive). La variabilité de l’infection est plus faible avant sevrage.

Soumises à une irradiation de quatre minutes puis à des injections répétées, jusqu'à vingt-et-une par animal, 898 souris vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance modérée. Ce volet d'un projet mené sur trois établissements provoque deux formes d'arthrite pour en étudier les mécanismes inflammatoires. Les atteintes attendues sont des douleurs articulaires, une baisse de mobilité et un stress lié aux manipulations, à l'imagerie et aux transports entre sites. La plupart des souris sont tuées pour prélever sang, organes lymphoïdes et pattes, quelques reproducteurs au bon génotype étant gardés pour les lignées.

Objectifs

La polyarthrite est une pathologie très fréquente et invalidante qui représente un enjeu de santé publique. Cette maladie auto-immune provoque une inflammation durable des articulations, ce qui peut endommager les os et le cartilage, entraînant des déformations irréversibles. Nous voulons étudier les mécanismes inflammatoires mis en jeu en modifiant leur expression dans deux modèles de souris d’arthrite induite. Ce projet se déroulera dans 3 EU différents.

Bénéfices attendus

Ce travail nous permettra de mieux comprendre les mécanismes pathogènes à l'origine de la maladie et pourrait ainsi contribuer au développement de thérapies efficaces.

Procédures

Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l'élévage dans l’établissement 1, le suivi clinique et traitement dans l’établissement 2, l’imagerie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à : 1) contention et 2 injections d'une durée de 10 secondes ou injections 3 fois par semaine pendant 1 semaine ou 7 semaines, soit au final: respectivement 3 ou 21 injections d’une durée de 10 secondes; 2) une irradiation d’une durée de 4 min, une injection unique d'une durée de 40 secondes, un prélèvement sanguin de 15 sec (5 au total). Les animaux anesthésiés seront soumis à 2 injections d'une durée de 10 secondes et à un acte d'imagerie (au total 6 actes d'imagerie de 15 minutes)

Impact sur les animaux

L’irradiation va induire un stress et une faible perte de poids temporaire. Les injections vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. Les prélèvements sanguins vont induire du stress. Le développement de l'arthrite va induire des douleurs au niveau des articulations, et une diminution de la mobilité. Les anesthésies gazeuses sont des actes stressants. Le transport des animaux entre les différents sites peut aussi être stressant pour les animaux.

Devenir

La majorité des souris seront mises à mort pour prélèvement de tissus spécifiques : sang, organes lymphoides et pattes afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte articulaire et inflammatoire par différentes techniques. Certains animaux de l'élevage avec le bon génotype seront conservés pour le maintien des lignées.

Remplacement

Bien que nous menions en parallèle des études de culture cellulaire pour tester nos hypothèses, le recours à l'animal est indispensable car la réponse inflammatoire et le développement de l’arthrite résultent d’interactions complexes entre plusieurs organes, qui ne peut être étudiée de façon complète que sur des animaux entiers.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. les animaux feront l’objet d’une surveillance continue, pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être et des anti-douleurs pourront être administrés si nécessaire. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale et permettra d’avoir un suivi longitudinal du développement inflammatoire et articulaire pour l'ensemble des animaux ainsi qu’une mise à mort de chaque animal au moment le plus informatif. Les souris seront transférées dans des cages de transport agrées, bords opaques, sans visibilité de l’extérieur.Tout au long de la procédure,

Choix des espèces

La souris développe des réactions immunitaires proches de celles observables chez l’homme. Les atteintes articulaires développées dans ces modèles induits sont similaires à celles observées chez l’homme. Les souris adultes seront âgées de 6 à 17 semaines pour évaluer l’efficacité thérapeutique des études.

Mises à mort pour la plupart afin de prélever sang, organes lymphoïdes et pattes, 898 souris vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance modérée pour étudier deux formes d'arthrite provoquée. Elles reçoivent jusqu'à vingt-et-une injections, une irradiation de quatre minutes, cinq prélèvements sanguins et six séances d'imagerie sous anesthésie, réparties entre trois établissements. Le développement de l'arthrite provoque des douleurs articulaires et une perte de mobilité, et le transport entre sites ajoute une source de stress. Une partie des animaux d'élevage porteurs du bon génotype est conservée pour entretenir les lignées.

Objectifs

Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs différents. La polyarthrite est une pathologie très fréquente et invalidante qui représente un enjeu de santé publique. Cette maladie auto-immune provoque une inflammation durable des articulations, ce qui peut endommager les os et le cartilage, entraînant des déformations irréversibles. Nous voulons étudier les mécanismes inflammatoires mis en jeu en modifiant leur expression dans deux modèles de souris d’arthrite induite.

Bénéfices attendus

Ce travail nous permettra de mieux comprendre les mécanismes pathogènes à l'origine de la maladie et pourrait ainsi contribuer au développement de thérapies efficaces.

Procédures

Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l'élévage dans l’établissement 1, le suivi clinique et traitement dans l’établissement 2, l’imagerie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à : 1) contention et 2 injections d'une durée de 10 secondes ou injections 3 fois par semaine pendant 1 semaine ou 7 semaines, soit au final: respectivement 3 ou 21 injections d’une durée de 10 secondes; 2) une irradiation d’une durée de 4 min, une injection unique d'une durée de 40 secondes, un prélèvement sanguin de 15 sec (5 au total). Les animaux anesthésiés seront soumis à 2 injections d'une durée de 10 secondes et à un acte d'imagerie (au total 6 actes d'imagerie de 15 minutes)

Impact sur les animaux

L’irradiation va induire un stress et une faible perte de poids temporaire. Les injections vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. Les prélèvements sanguins vont induire du stress. Le développement de l'arthrite va induire des douleurs au niveau des articulations, et une diminution de la mobilité. Les anesthésies gazeuses sont des actes stressants. Le transport des animaux entre les différents sites peut aussi être stressant pour les animaux.

Devenir

La majorité des souris seront mises à mort pour prélèvement de tissus spécifiques : sang, organes lymphoides et pattes afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte articulaire et inflammatoire par différentes techniques. Certains animaux de l'élevage avec le bon génotype seront conservés pour le maintien des lignées.

Remplacement

Bien que nous menions en parallèle des études de culture cellulaire pour tester nos hypothèses, le recours à l'animal est indispensable car la réponse inflammatoire et le développement de l’arthrite résultent d’interactions complexes entre plusieurs organes, qui ne peut être étudiée de façon complète que sur des animaux entiers.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. les animaux feront l’objet d’une surveillance continue, pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être et des anti-douleurs pourront être administrés si nécessaire. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale et permettra d’avoir un suivi longitudinal du développement inflammatoire et articulaire pour l'ensemble des animaux ainsi qu’une mise à mort de chaque animal au moment le plus informatif. Les souris seront transférées dans des cages de transport agrées, bords opaques, sans visibilité de l’extérieur.Tout au long de la procédure,

Choix des espèces

La souris développe des réactions immunitaires proches de celles observables chez l’homme. Les atteintes articulaires développées dans ces modèles induits sont similaires à celles observées chez l’homme. Les souris adultes seront âgées de 6 à 17 semaines pour évaluer l’efficacité thérapeutique des études.

Pour tester si une immunothérapie anticancéreuse agit mieux le matin, 430 souris sont utilisées dans des procédures classées en souffrance modérée, toutes mises à mort pour prélèvement. Une tumeur est greffée sous la peau, puis les animaux reçoivent le traitement, des séances d'échographie sous anesthésie tous les deux ou trois jours, un accès à la nourriture limité à huit heures par jour et trente minutes d'activité physique imposée trois fois par semaine. Le RNT décrit les douleurs possibles de la tumeur, pression sur les tissus, nécrose, posture voûtée, vocalisations. L'hypothèse de départ vient d'études rétrospectives et d'un essai déjà menés chez l'humain, que le modèle murin est censé conforter.

Objectifs

L’immunothérapie, un traitement qui stimule le système immunitaire pour combattre le cancer, pourrait être plus efficace si elle est administrée le matin plutôt que l’après-midi. Cette découverte, issue d’études rétrospectives et d’un essai clinique mené en Chine, s’explique par le rôle de notre "horloge circadienne", un mécanisme naturel qui régule de nombreux processus biologiques, comme le sommeil ou l’immunité, en fonction des cycles jour-nuit. Pour renforcer cette synchronisation, deux facteurs clés entrent en jeu : une alimentation limitée à des plages horaires précises (comme manger uniquement entre 8h et 18h) et la pratique régulière d’une activité physique. Les objectifs du projet sont triples : évaluer si une alimentation temporellement limitée améliore la réponse au traitement matinal, déterminer si cette approche permet d’étendre les bénéfices du traitement à d’autres moments de la journée en synchronisant les organes périphériques, et analyser si l’activité physique apporte un avantage supplémentaire. Pour étudier ces interactions complexes entre organes, nous utiliserons des souris, dont l’horloge circadienne et la réponse aux traitements sont comparables à celles des humains. Cette recherche ouvre des perspectives prometteuses car en optimisant l’heure d’administration des traitements et en les combinant avec l’alimentation et l’exercice, il pourrait être possible d’améliorer significativement leur efficacité pour les patients.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet vise à vérifier si, chez l’animal, on peut augmenter l’efficacité de l’immunothérapie contre le cancer en améliorant la synchronisation de l’horloge interne. Si cette hypothèse se confirme, à plus long terme, ces résultats pourraient servir de base pour concevoir de nouveaux essais cliniques chez l’humain. Ces essais combineraient l’immunothérapie avec des méthodes naturelles pour renforcer l’horloge circadienne, comme administrer le traitement le matin, limiter les horaires des repas ou pratiquer une activité physique régulière. Chacune de ces approches (traitement matinal, alimentation ciblée, exercice) a déjà prouvé ses bienfaits séparément. On pense donc que leur combinaison pourrait amplifier les effets positifs de l’immunothérapie classique, qui ne tient pas compte des horaires optimaux. En somme, ce projet pourrait conduire à modifier l’utilisation des immunothérapies en les rendant plus efficaces, simplement en adaptant leur administration au rythme naturel du corps.

Procédures

Implantation de cellules tumorales : 1 injection (la tumeur se développe pendant 15 jours ensuite). Traitement antitumoral : 1 injection au jour 5. Anesthésie : tous 2 ou 3 jours à partir du jour 6. Echographie : tous 2 ou 3 jours à partir du jour 6. Accès à la nourriture pendant 8 heures : chaque jour pendant 15 jours. Activité physique : 30 minutes 3 fois par semaine pendant 15 jours.

Impact sur les animaux

Quand une tumeur se développe sous la peau, elle peut provoquer des effets indésirables tant au niveau local qu’à l’échelle de l’organisme entier. Localement, la tumeur peut exercer une pression sur les tissus environnants, entraînant des douleurs, des inflammations, voire une nécrose (dégénérescence des tissus). À un niveau plus général, elle peut causer des douleurs diffuses, des troubles métaboliques, une perte de poids, une réduction de la mobilité et un état de stress. Chez un animal porteur d’une telle tumeur, ces douleurs peuvent se traduire par des comportements agressifs, des vocalisations, un manque de soin personnel et une posture voûtée. L'alimentation limitée temporellement et l'activité physique améliorent la santé métabolique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever des échantillons nécessaires au projet.

Remplacement

Pour étudier l’effet combiné de l’heure d’administration de l’immunothérapie, d’une alimentation limitée à des horaires précis et de l’activité physique, il est impossible de se contenter d’expériences en laboratoire (in vitro) ou de simulations numériques. En effet, ces trois facteurs interagissent de manière complexe et impliquent des mécanismes qui ne peuvent être observés que chez un organisme vivant (in vivo) : ils font intervenir plusieurs types de cellules immunitaires, les effets métaboliques de l’alimentation, les impacts globaux de l’exercice physique sur le corps, ainsi que la synchronisation de multiples horloges biologiques internes, présentes dans différents organes. C’est pourquoi on utilise un modèle animal déjà éprouvé dans des études similaires. En parallèle, nous travaillons avec des mathématiciens et informaticiens à la création d’un modèle numérique de l’horloge circadienne. L’objectif est de disposer, à terme, d’outils de simulation performants. Pour affiner ces modèles, nous nous appuyons sur des données expérimentales déjà collectées dans des projets antérieurs, ainsi que sur celles obtenues dans le cadre de cette étude. L’approche adoptée est donc double : réutiliser au maximum les connaissances existantes pour éviter de répéter des expériences déjà réalisées, et préparer le terrain pour des simulations futures en intégrant les nouveaux résultats dans des modèles mathématiques. Cela permettra, à long terme, de mieux comprendre et optimiser ces traitements combinés.

Réduction

L'objectif de réduction est abordé selon plusieurs approches complémentaires. Afin de n'utiliser que le strict minimum d'animaux nécessaire, des calculs statistiques sont réalisés pour définir l’effectif nécessaire pour chaque condition expérimentale. Nous utilisons une méthode statistique d'analyse des rythmes biologiques qui ne nécessite que 4 horaires de traitement. Plusieurs prélèvements d'organes et de tissus seront réalisés post-mortem afin d'éviter le recours à des animaux supplémentaires pour les analyses histologiques et moléculaires ultérieures.

Raffinement

Les souris vivront en groupe de 3 ou 4 dans un espace adapté, avec des jouets et des cachettes pour leur bien-être. Avant les expériences, elles s’habitueront aux manipulations et au matériel (tapis roulant, distributeur de nourriture). Les cellules cancéreuses leur seront injectées en fin de journée, un moment où la croissance des tumeurs est moins rapide. Leur poids sera vérifié trois fois par semaine, et une équipe surveillera leur état, même le week-end. Un complément alimentaire sous forme de gel pourra être donné aux souris pour améliorer leur état de santé. Aucun anti-inflammatoire ne sera utilisé, car cela pourrait fausser les résultats. En revanche, si une souris perd plus de 10 % de son poids, montre des signes de souffrance (pelage négligé, blessures, apathie) ou développe une tumeur trop grosse ou abîmée, elle sera euthanasiée. La croissance des tumeurs sera suivie par échographie sous anesthésie douce. Pour l’exercice, on privilégiera des encouragements tactiles plutôt que des chocs électriques, afin d’éviter tout stress.

Choix des espèces

1 - La souris est un modèle scientifiquement pertinent (modèle préclinique adapté à la cancérologie, son système circadien est très conservé par rapport à l'humain, les effets bénéfiques des protocoles d'alimentation limitée temporellement et d'activité physique en termes de santé métabolique ont déjà été documentés par des études antérieures). 2 - Les protocoles d'implantation sous-cutanée de cellules tumorales chez la souris sont largement éprouvés et robustes. 3 - Dans le cadre de la poursuite du projet, nous pourrions être amener à l'avenir à utiliser des modèles génétiquement modifiés disponibes uniquement chez la souris. Des souris adultes d'un âge compris entre 8 et 12 semaines seront utilisées. Cet âge garantit un système immunitaire pleinement mature et permet d'avoir une taille et un poids des animaux suffisant pour limiter les effets indésirables de la tumeur lorsqu'elle grossit. Cet âge a aussi été utilisé dans d'autres expériences similaires avec lesquelles nous souhaitons faire des comparaisons.