Recherche fondamentale

1 600 souris se voient greffer des cellules cancéreuses puis traiter par chimiothérapie et immunothérapie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles sont tuées lorsque la tumeur dépasse 1 500 mm³ ou s'ulcère, faute de quoi la masse au flanc gêne leurs déplacements. Le projet cherche à comprendre pourquoi certains cancers résistent aux traitements combinés, via une molécule de l'inflammation. Le porteur annonce n'attendre aucun effet secondaire sévère, ces traitements ayant déjà été largement administrés à des souris.

Objectifs

Les cancers du côlon, du pancréas et du poumon figurent parmi les cancers les plus fréquents et les plus létaux. Leur prise en charge repose en grande partie sur l’utilisation de chimiothérapies qui, en particulier aux stades avancés, ne permettent pas toujours d’obtenir une rémission complète. Il est désormais bien établi que le système immunitaire joue un rôle déterminant dans la réponse aux traitements chimiothérapeutiques. Dans ce contexte, des approches combinant chimiothérapie et immunothérapie ont été développées afin d’en améliorer l’efficacité. Toutefois, ces stratégies combinées restent peu efficaces dans certains cancers, notamment le cancer du pancréas et certains cancers colorectaux et pulmonaires. Il est donc essentiel d’identifier les mécanismes responsables de ces résistances thérapeutiques. L’inflammation peut influencer la façon dont les traitements contre le cancer fonctionnent. Le but du projet est d’évaluer l’impact de l’inflammation sur l’efficacité antitumorale des chimio-immunothérapies utilisées en clinique. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de NLRP3, un acteur important de l’inflammation, dans l’efficacité des traitements associant chimiothérapie et immunothérapie utilisés contre le cancer. En étudiant des cellules tumorales et des souris avec ou sans NLRP3, nous pourrons déterminer si cette molécule agit principalement au niveau des cellules cancéreuses ou des cellules de l’organisme dans la réponse aux traitements. Ce travail permettra également de mieux comprendre comment NLRP3 influence le fonctionnement du système immunitaire au sein des tumeurs, notamment en analysant les cellules immunitaires présentes et leur activité après traitement. Les résultats obtenus permettront d’identifier les mécanismes expliquant pourquoi certains cancers répondent mal aux traitements actuels. À plus long terme, ce projet pourrait contribuer à l’identification de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à améliorer l’efficacité des traitements, en particulier dans les cancers pour lesquels les options actuelles restent limitées.

Procédures

3 interventions : - Injection des cellules cancéreuses murines : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une seule injection par animal - Durée : 5 minutes - Nombre de souris : 1600. - Traitements par chimiothérapie ou soluion contrôle : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 1600. - Traitements par immunothérapie ou solution contrôle : - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 1600.

Impact sur les animaux

- L’injection sous-cutanée de cellules tumorales entraînera le développement d’une masse tumorale au niveau du flanc, susceptible d’induire une gêne locomotrice à mesure de sa croissance. Afin de limiter cette contrainte, la taille des tumeurs sera suivie régulièrement et des critères d’arrêt stricts seront appliqués. Les animaux seront euthanasiés en cas d’ulcération tumorale, de volume tumoral supérieur à 1500 mm³ (~250mm2), ou si la tumeur entrave significativement les déplacements. Une altération de l’état général des animaux est possible en lien avec la progression tumorale. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique régulière incluant le suivi du poids, de l’activité, de la posture (notamment signes de douleur), de l’aspect du pelage et du comportement (toilettage, interaction). Tout animal présentant des signes de détresse ou atteignant un point limite prédéfini sera euthanasié sans délai. Les traitements anticancéreux administrés (chimiothérapies et immunothérapie anti-PD-1) peuvent induire des effets indésirables modérés, tels qu’une perte de poids transitoire ou une altération de l’état général. Ces traitements ayant déjà été largement utilisés chez la souris, aucun effet secondaire sévère n’est attendu dans les conditions expérimentales prévues. Une surveillance rapprochée sera néanmoins mise en place afin de détecter précocement tout effet indésirable. Les souris déficientes pour Nlrp3 (Nlrp3-/-) ne présentent pas de phénotype dommageable en conditions basales. Aucune nuisance spécifique liée à ce génotype n’est donc attendue dans le cadre de ce projet.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure, c’est-à-dire lorsque le volume tumoral excèdera 1500 mm³ (~250mm2).

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

Les expériences ne seront réalisées que deux fois ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude tout en en conservant la puissance statistique nécessaire. Le test statistique utilisé sera celui de Kruskal-Wallis en raison de la présence de nombreux groupes. Les différents modèles (cancers du pancréas, du poumon et du colon) utilisés dans ce projet sont nécessaires. En effet, selon l’organe d’origine, les mutations intrinsèques des cellules cancéreuses utilisées, le microenvironnement tumoral sera différent et affectera par conséquent la réponse aux traitements. De plus, selon le type de cancers, les régimes de chimiothérapies seront différents afin de se rapprocher de la clinique. Ces traitements affecteront également de manière différentielle les cellules du microenvironnement. Les expériences de croissances tumorales seront réalisées en premier. Si aucune différence entre les différents groupes n’est observée pour un ou plusieurs modèles, les expériences d’immunomonitoring ne seront pas réalisées sur ces mêmes modèles.

Raffinement

Les animaux seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Une anesthésie et une analgésie, seront réalisées pour chaque opération. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Durant toute l’expérience, suivi du poids et évaluation de la NEC (Note d’Etat Corporel) au minimum trois fois par semaine. L’apparition d’éventuels points limites sera recherchée.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvements présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

Rasées et sensibilisées à répétition par patch ou grattage de l'abdomen sous anesthésie, 260 souris subissent ensuite un gavage déclenchant la réaction allergique, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour analyser organes et fluides. Le protocole compare la graine de chanvre à la noisette et à l'épinard, et peut provoquer démangeaisons, irritations, tremblements et chute de la température corporelle. Le porteur justifie le recours aux souris par l'absence de modèle in vitro reproduisant la réaction allergique.

Objectifs

Les allergies alimentaires sont un problème de santé publique qui connait une augmentation en termes de prévalence et de sévérité ces dernières années. Les allergies sont répandues et ont été classées comme la quatrième pathologie en termes de morbidité par l’Organisation Mondiale de la Santé. Ce projet prend part dans un contexte de transition de régime alimentaire visant à utiliser de nouvelles sources de protéines comme la graine de chanvre. Il est possible de rentrer en contact avec la graine de chanvre par le biais de deux voies majeures : orale et cutanée. La consommation de la graine de chanvre est en plein essor de par son fort intérêt nutritionnel et peut se faire au travers de la farine, de barres énergétiques, de pâtes, de biscuits, de boissons ou encore de yaourts. D’autre part, un contact cutané est possible à travers l’huile ou des crèmes à base de graine de chanvre, utilisées en cosmétiques. La recherche sur les allergies à la graine de chanvre est essentielle, d’une part car les allergènes déjà connus dans les fleurs et le pollen de chanvre peuvent se retrouver dans la graine et d’autre part par la présence de protéines de stockage dans la graine, connues pour leur fort potentiel allergène. Afin de prévenir les possibles allergies qui pourront être liées à la graine de chanvre, il est alors nécessaire d’évaluer son potentiel allergique par rapport à un allergène fort, ici la Noisette ainsi qu’un allergène faible, l’épinard. Dans le cadre de l’allergie, deux manifestations majeures peuvent avoir lieu, i) une sensibilisation de novo, ce qui veut dire devenir allergique à la graine elle-même ou ii) une réaction dite croisée par le biais d’une similarité entre les protéines de la graine de chanvre et d’autres protéines allergènes. La connaissance de la capacité de sensibilisation de novo des protéines est importante pour appréhender et anticiper les risques allergiques futurs. Actuellement, il n'existe aucune connaissance sur la capacité de sensibilisation de novo de la graine de chanvre dans une population générale Non Allergique, malgré l'exposition croissante de la population à la graine de chanvre par le biais des aliments et des cosmétiques. Ce projet sera donc tourné sur le potentiel de sensibilisation de novo de la graine de chanvre.

Bénéfices attendus

[MODIFICATION] [Ce projet a pour objectif d’évaluer le potentiel allergénique et plus précisément de sensibilisation de novo de la graine de chanvre (nature ou grillée) en comparaison avec un allergène fort, la Noisette connue pour induire des allergies et un allergène faible, l’Epinard qui n’est pas connu pour induire beaucoup d’allergies. Ceci permettrait de pouvoir prédire ou bien d’avoir une indication du niveau de risque encouru par les consommateurs de graine de chanvre ou de produits contenant des graines de chanvre et ainsi de prédire le risque de voir une personne devenir allergique à la graine de chanvre par la suite. De plus, ce projet permettra une compréhension plus approfondie des mécanismes immunologiques associés à une sensibilisation à la graine de chanvre.

Procédures

Toutes les souris seront anesthésiées et rasées au préalable de chaque sensibilisation. Les souris seront sensibilisées quotidiennement avec la pose d’un patch, ou 1 fois par semaine pendant 6 semaines avec la pose d’un patch pendant 3 jours ou bien par grattage et application transdermale de l’allergène sur l'abdomen. Le déclenchement des symptômes de l'allergie sera effectué par un gavage, respectivement 3, 10 ou 7 jours après la dernière sensibilisation. Pour un gavage oral, la durée des interventions correspond au temps d’administration (soit environ 10 secondes). Pour les applications épicutanées avec la pose du patch ou transdermale avec le grattage sur l’abdomen, la durée d’intervention correspond au temps d’anesthésie soit 15 à 20 minutes environ. Selon la procédure, les souris auront également un prélèvement d'une goutte de sang à l'extrémité de la queue 1 fois par semaine (de la sensibilisation 3 à la sensibilisation 6) soit 4 prélèvements au total. Ce geste dépend du débit sanguin et dure environ 30 secondes. Pour l’étude principale, les mêmes interventions que pour l’une des procédures de l’étude pilote seront réalisées et les temps d’interventions seront donc similaires.

Impact sur les animaux

Lors de ce protocole, il est possible que les souris aient des effets indésirables suite aux gestes pratiqués : les méthodes de sensibilisation peuvent provoquer certaines nuisances en raison de la répétabilité des gestes (14 jours consécutifs ou 1x par semaine pendant 6 semaines) mais aussi de par la présence d’un patch sur le dos, des démangeaisons dues au rasage et des irritations dues au patch, un inconfort abdominal suite au grattage lors de la sensibilisation transdermale, des symptômes liés à la mise en place de l’allergie provoqués par le gavage oral (tremblements, chute de la température corporelle, douleurs stomacales), ainsi que les anesthésies gazeuses répétées. La prise de température par voie rectale peut également entrainer un inconfort pour les souris.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de l’expérimentation. Leurs organes et fluides biologiques seront analysés pour mesurer les biomarqueurs de l’allergie et ainsi valider nos modèles.

Remplacement

Dans le cas de l’allergie alimentaire, les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire efficacement les systèmes biologiques complexes et en particulier le système immunitaire. Dans l’allergie, de multiples types cellulaires peuvent être impliqués et leurs interactions peuvent avoir un rôle dans la physiopathologie. De plus, l’allergie alimentaire est caractérisée par des symptômes que seuls des modèles animaux et en particulier les souris peuvent adéquatement reproduire.

Réduction

[MODIFICATION] Des protocoles d’allergie alimentaire sont régulièrement réalisés au sein du laboratoire, mais aucun protocole utilisant la graine de chanvre ou la Noisette n’a encore été fait. De ce fait, il est impossible de faire un test de puissance. Néanmoins, en se basant sur des tests statistiques et sur la variabilité individuelle lors des anciens protocoles, le nombre de souris pour l’étude principale avec un allergène fort et un allergène faible a été déterminé à 12 souris par groupe soit 60 souris au total par sexe. Cette procédure sera répétée une deuxième fois avec les mêmes 5 groupes de 8 souris par sexe pour s’assurer de la reproductibilité du protocole. Pour l’étude pilote, le nombre de souris a été réduit à 10 par procédure soit 30 souris au total par sexe. Nous anticipons des écarts nets entre les différentes procédures testées, avec des réponses contrastées de type "tout ou rien". Cette amplitude attendue des effets justifie le recours à un effectif réduit, tout en permettant d’identifier le protocole le plus prometteur dès cette première phase. Pour l’étude principale, ce nombre d’animaux permettra d’obtenir des résultats statistiquement exploitables pour la réalisation d’analyses statistiques.

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place des procédures expérimentales d’analgésie (avec notamment l'injection d'anti-inflammatoire) et d’anesthésie permet de minimiser l’inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront hébergées avec au moins 3 enrichissements (dôme, tube et coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Aussi une étude pilote sera effectuée sur un nombre de souris restreint pour appréhender les méthodes de sensibilisation, l’effet de l’application du patch et l’utilisation du papier de verre et afin d’affiner et de choisir au mieux, le protocole qui sera appliqué par la suite ainsi que pour appréhender la prise en charge de la douleur le cas échéant. Une attention particulière sera portée à la détection précoce des signes de douleur ou de mal-être chez les animaux. Des points limites adaptés ont été définis pour garantir que tout changement significatif d’état de santé d’un animal déclenche une réévaluation. Un arbre décisionnel encadre les actions à mener : surveillance renforcée, tentative de soulagement, puis prise de décision, avec le responsable du bien-être animal et le vétérinaire si l’état de l’animal ne s’améliore pas. En cas de souffrance persistante ou jugée irréversible, l’animal sera retiré du protocole et mis à mort. Cette approche vise à limiter la souffrance et à respecter les principes éthiques de l’expérimentation animale.

Choix des espèces

La souche de souris utilisée constitue un modèle de choix, reconnue dans le cadre d’étude du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de cette souche. Aujourd'hui, il n’existe pas de méthodes alternatives pour étudier efficacement et dans son ensemble la réaction allergique. De plus, l’allergie est caractérisée par des symptômes que seuls des modèles animaux peuvent pour le moment reproduire adéquatement. Ainsi, le modèle animal ici est un élément nécessaire pour modéliser efficacement la réponse physiologique globale du système lors d’une allergie. Les souris auront 3 semaines de vie à la réception et 4 semaines de vie en début de procédure. Quatre semaines est l’âge idéal correspondant à des souris sevrées et adultes ayant un système immunitaire mature.

4 620 souris subissent une chirurgie crânienne provoquant l'occlusion d'une artère cérébrale, pour reproduire un AVC ischémique, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie reçoit d'abord des injections de streptozotocine pour induire un diabète, puis passe des IRM répétées sous anesthésie et une batterie de tests comportementaux. Le protocole se termine par une ouverture du thorax et de l'abdomen et une ponction cardiaque. Les molécules testées viennent de partenaires industriels visant une mise sur le marché, un débouché que le porteur qualifie de recherche "indispensable".

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique causée par la formation d’un caillot (thrombus) entraînant l’occlusion partielle ou totale d’une artère cérébrale. Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA et de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Bénéfices attendus

Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA et de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Procédures

MODIFICATION Pour l’étude 3/ de cette DAP, les animaux seront soumis à une injection intrapéritonéale de streptozotocine permettant d’induire une hyperglycémie chronique. Une injection par jour, pendant 5 jours est prévue. Cette injection dure quelques secondes. Un prélèvement d’une gouttelette de sang sera également réalisé 2 fois par semaine pour ces animaux permettant de contrôler la glycémie sanguine. Ce prélèvement ne durera pas plus d’une minute. La mise à jeun des souris pour une durée de 4 heures sera nécessaire avant chaque prélèvement. Les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin de pouvoir injecter de la thrombine murine, provoquant ainsi l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne. Cet acte chirurgical, se déroulant à J0, durera 15 à 20 minutes et l’animal restera endormi environ 1 heure. La pose d’un cathéter dans la veine caudale sera nécessaire pour tous les animaux afin d’administrer un ou plusieurs traitements en intraveineux ainsi que les agents de contraste nécessaires à la réalisation de séquences IRM. La pose de cathéter prendra environ 5 minutes. À J0, J1, J2, J5 et J14, les animaux seront soumis à l'IRM-7T sous anesthésie générale, pour une durée variant de 15 à 45 minutes en fonction des séquences réalisées. Les animaux passeront également une batterie de test comportementaux jusque 7 jours avant l’induction de l’AVC pour déterminer l’activité basale, puis à J1, J2, J3, J5, J7, J14 et J21. Chaque animal passera moins de 10 minutes pour chacun des trois tests. Ajout de prélèvements répétés à la veine saphène ou à la veine submandibulaire pour récolter du sang veineux, dans le but de récolter du plasma. Chaque veine ne subira qu’un seul prélèvement, la voie et le côté du prélèvement sera alterné entre le côté gauche et droit. Les animaux seront sous couverture analgésique à H+2 suivant le stroke, une seconde injection leur sera délivrée à H+6 et une injection à D1 avant le troisième prélèvement sera réalisée. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au cœur et faciliter le prélèvement sanguin par ponction cardiaque. Viendra ensuite soit une perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant son prélèvement soit un prélèvement du cerveau frais. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC ischémique, à savoir des déficits sensorimoteurs induits par les lésions cérébrales au niveau du cortex somatosensoriel et prémoteur. Les déficits fonctionnels sont considérés comme léger à court et moyen terme dans ce modèle d’AVC, mais peuvent occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion chez l’animal. MODIFICATION "A long-terme les déficits fonctionnels ne sont plus que légèrement perceptibles. Aucun test comportemental n’est voué à induire volontairement un stress ou une angoisse chez les souris. Les expérimentateurs sont formés et habitués à ces évaluations fonctionnelles, et prendront toutes les dispositions nécessaires à la bonne réalisation de celles-ci (limitation du bruit et des vibrations, manipulation des animaux avec soin, vérification des points limites, etc..)." Tout au long de l’étude l’animal peut aisément continuer à s’alimenter, s’abreuver et se fabriquer un nid avec les enrichissements mis à disposition dans la cage.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse

Remplacement

Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations réalisées in vitro par les PARTENAIRES INDUSTRIELS. Actuellement il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font de la souris le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, mus musculus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ischémique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.

Réduction

Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées surtout à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 18 par groupes dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux dues à des erreurs techniques ou à de la mortalité, l’augmentation de l’effectif de 22 par groupes expérimentaux est obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 18 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les souris arriveront au laboratoire en groupes sociaux puis seront stabulés à une par cage le temps de l’expérimentation pour éviter les conflits entre les souris et faciliter la phase de récupération post-opératoire. Au sein de chaque cage, les animaux auront accès à divers types d’enrichissements : sizzle-dri kraft, BUCHETTE EN BOIS et demi-sphère de cellulose ainsi qu’accès illimité à la nourriture et à l’eau. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Les animaux seront pesés 2 fois par semaine au minimum. Le jour de l’induction de l’AVC (J0), les animaux seront pesés et installés dans une armoire ventilée permettant de maintenir leur rythme nycthéméral. Pendant l’opération chirurgicale induisant l’AVC ischémique, l’animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique à base de buprénorphine administrée en s.c ENTRE 30 MINUTES ET 1 HEURE AVANT LA PREMIERE INCISION CHIRUGICALE. L’ADMINISTRATION SERA REPETEE EN FIN DE JOURNEE DE FACON A PROLONGER LA DUREE D’ACTION JUSQU’AU LENDEMAIN MATIN OU UNE TROISIEME ADMINISTRATION SERA REALISEE. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. Chaque site d’incision sera précédé d’une tonte du pelage et d’une désinfection à la CHLORISEPTINE ET D’UNE INJECTION EN SOUS CUTANEE DE LUROCAINE (5mg/kg). La température corporelle de l’animal sera maintenue à 37.5 ± 0.5°C grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée et à une couverture isothermique placée sur le dos de la souris EN CAS d’HYPOTHERMIE. Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une plus grande résistance que le surjet par exemple, et limitant le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. MODIFICATION : AJOUT PARAGRAPHE Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil et pendant les jours suivant l’opération chirurgicale. En cas de constatation post-opératoire de dépassement des points limites de souffrance ou de stress fixés en amont de l’étude, l’animal sera mis à mort par dislocation cervicale.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) occupe une place prépondérante dans la recherche sur les maladies neurodégénératives, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs, notamment les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et la souris, ainsi que la facilité de manipulation génétique, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font de la souris un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Dans le contexte spécifique de l'AVC ischémique, l'utilisation de la souris devient incontournable. En effet, elle offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats obtenus avec ceux de la littérature, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. MODIFICATION "Les animaux utilisés seront âgés d’environ 10 semaines le jour de l’induction de l’AVC pour un poids moyen de 45g Nous effectuerons notre modèle sur des jeunes adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles déjà disponible dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine."

Pour reproduire la maladie de Parkinson, 2 112 souris reçoivent des injections répétées d'une substance chimique neurotoxique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie est dépourvue d'une protéine par modification génétique. Le porteur affirme que cette substance n'affecte pas le bien-être des souris dans ses conditions, tout en listant prostration, dos voûté, poils ébouriffés et perte de poids parmi les signes de détresse surveillés. L'objectif reste de mieux comprendre la mort des neurones, sans retombée directe annoncée.

Objectifs

La maladie de Parkinson est aujourd’hui l’une des principales causes de troubles du mouvement, juste après les accidents vasculaires cérébraux. C’est aussi la maladie neurologique qui progresse le plus rapidement dans le monde. Elle touche le cerveau et perturbe le contrôle des mouvements. Les personnes atteintes peuvent présenter des tremblements, des gestes plus lents ou une raideur musculaire. Mais la maladie ne se limite pas aux problèmes moteurs : elle peut aussi affecter le sommeil, l’humeur et parfois la mémoire ou la concentration. La maladie de Parkinson est complexe et évolue avec le temps. Il est donc essentiel de mieux la comprendre pour pouvoir, à terme, améliorer les traitements. Notre projet de recherche consiste à développer un modèle expérimental de la maladie chez la souris en utilisant une substance chimique, qui a été associée à un risque accru de développer la maladie de Parkinson. Ce modèle nous permet de reproduire certains mécanismes de la maladie et d’étudier plus précisément la mort des cellules du cerveau, c’est-à-dire leur disparition progressive. Grâce à ces travaux, notre objectif est de mieux comprendre les mécanismes à l’origine de la maladie de Parkinson, afin d’ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre le rôle d’une protéine essentielle au bon fonctionnement du cerveau. En étudiant des animaux chez lesquels cette protéine est absente, nous cherchons à mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la maladie de Parkinson. Ces recherches permettront également de définir les meilleures conditions expérimentales pour étudier cette maladie en laboratoire, afin d’obtenir des résultats fiables et utiles pour la recherche biomédicale.

Procédures

Une partie des animaux subira 2 injections (100 microlitres / injection - 10 secondes) par semaine pendant 2 semaines. L'autre partie des animaux subira 2 injections (100 microlitres / injection - 10 secondes) par semaine pendant 3 semaines.

Impact sur les animaux

D'après les données de la littérature notre substance chimique n'affecte pas le bien-être animal dans les conditions expérimentales de notre étude. Néanmoins, les principaux signes de détresse sont une position recroquevillée, le dos voûté, les poils ébouriffés, les yeux fermés, une respiration accélérée et une perte de poids.

Devenir

A l'issue de cette procédure, tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des analyses nécéssaires au projet scientifique.

Remplacement

L’étude de la maladie de Parkinson nécessite un organisme entier. Notre étude doit nécessairement se faire sur l’animal pour comprendre l'effet de notre substance chimique. Cependant nous menons en parallèle des études sur cellules.

Réduction

Les animaux sont élevés au sein de notre établissement utilisateur et l’élevage est dimensionné afin de limiter la production du nombre d’animaux au strict nécessaire pour leur utilisation dans les procédures. Nous utiliserons des tailles d’échantillons garantissant une puissance statistique suffisante tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés dans le respect éthique de la règle des 3R (remplacement, réduction et raffinement). Le nombre de souris pour chaque procédure est déterminé avec un logiciel.

Raffinement

Les souris sont hébergées collectivement dans la zone de production de l’animalerie dans des cages comportant une maisonnette ainsi que de la ouate favorisant la nidification avec un cycle d’éclairage normal. Elles sont nourries et abreuvées ad libitum. Les animaux sont régulièrement manipulés et observés par les animaliers lors du change ou par les expérimentateurs. Selon les observations suivantes : perte de poids chez les animaux en croissance et les adultes, état du pelage, état de la litière, posture/mobilité et comportements indésirables, des moyens de raffinement seront utilisés pour réduire, éviter ou atténuer toute forme de souffrance. Compte tenu de la toxicité connue de la substance administrée, les animaux traités seront surveillés quotidiennment même si, d'après la littérature, le bien-être n'est pas affecté dans nos conditions.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence dans les études de la maladie de Parkinson, nous pouvons donc bénéficier d’un grand nombre de ressources et de données préliminaires existantes. Nous disposons d'une lignée murine dépourvue d'une protéine pour effectuer des analyses nécécessaires au projet scientifique et le traitement des animaux par la substance chimique sert de modèle de la maladie de Parkinson. Nous utiliserons des souris adultes de 3, 6, 9 et 12 mois pour développer le modèle.

Rendues obèses par un régime riche en graisses puis, pour une partie, opérées pour créer une plaie cutanée, 670 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Elles subissent des prélèvements sanguins répétés à la queue sans anesthésie et une excision de peau sous anesthésie, pour tester des molécules libératrices de monoxyde de carbone censées agir sur le poids et la cicatrisation. Les souris qui perdent plus de 15 % de leur poids en une semaine sont mises à mort. Le porteur indique avoir d'abord trié vingt composés sur des cellules en culture, ce qui n'a pas écarté le recours final à des centaines de souris.

Objectifs

Le monoxyde de carbone (CO) est un gaz produit par les cellules à de très faibles concentrations. Il a été démontré qu'il régule d'importants processus physiologiques chez les mammifères, y compris les humains. Plusieurs études ont mis en évidence les actions pharmacologiques polyvalentes du CO et les scientifiques ont donc commencé à exploiter ce gaz pour des applications thérapeutiques. Dans ce contexte, une nouvelle génération de composés capables de libérer du CO a été développée. Le grand avantage de ces composés est que la quantité de CO qu'ils libèrent peuvent être mieux contrôlés en comparaison au CO gazeux. En fait, dans des expériences utilisant des rongeurs, il a été rapporté que ces composés exerçaient des actions thérapeutiques prometteuses contre diverses maladies telles que l’infarctus du myocarde, l’inflammation et les dysfonctionnements métaboliques. Plus récemment, il a été publié que l'administration orale de ces composés qui libère du CO avec une très grande efficacité chez des souris nourries avec un régime riche en graisses mène à une réduction significative du gain de poids corporel associée à une amélioration de la glycémie et à une diminution de la résistance à l'insuline. Le présent projet consiste à utiliser le même modèle d'obésité pour tester l'effet de nouvelles molécules développés récemment et qui ciblent plus efficacement le tissu adipeux. L'objectif principal est d'évaluer l'action thérapeutique de ces nouvelles molécules chez les jeunes souris et les souris âgées, puis d'évaluer si le CO possède également un effet thérapeutique sur l'obésité au cours du vieillissement. De la même manière, seront étudiés les effets protecteurs de ces nouvelles molécules, mais aussi une nouvelle technique générant localement du gaz CO dans le traitement des plaies cutanées. En effet, il est bien connu que la cicatrisation cutanée est altérée dans les maladies affectées par un dysfonctionnement métabolique tel que le diabète.

Bénéfices attendus

Il s'agit d'un projet visant à tester les effets pharmacologiques de composés novateurs. Les résultats de cette étude nous fourniront des notions importantes sur le mécanisme d'action et l'applicabilité thérapeutique de ces molécules dans le contexte du dysfonctionnement métabolique et des plaies cutanées.

Procédures

Dans les modèles de régime riche en graisses, les animaux seront soumis à plusieurs reprises (0, 7 et 14 semanines) à un prélèvement de sang sans anesthésie (cela ne prend que 5 minutes) au niveau caudale, en tant qu'intervention invasive. Dans le modèle de plaie cutanée, les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie pour retirer un morceau de peau afin de créer la plaie. Cette chirurgie est très rapide, modérément invasive et ne nécessite pas plus de 20 à 30 minutes.

Impact sur les animaux

Le modèle de régime riche en graisses est un modèle largement utilisé, il est sans douleur pour les animaux et n'implique pas de procédures invasives. Le degré de sévérité de la procédure de plaie de la peau, bien maîtrisée, est considéré de classe modérée. Cette procédure est réalisée sous anesthésie et les animaux se rétablissent complètement avec peu ou pas de douleur puisque la cicatrisation de la peau est très rapide. Concernant le prélèvement sanguin sans anesthésie, nous recueillerons un très faible volume et l’adéquation volume/méthode permet de respecter le bien-être animal.

Devenir

Comme nous avons besoin de collecter les organes pour une analyse fonctionnelle, génique et biochimique, tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Avant de finaliser et d'optimiser les protocoles expérimentaux pour ce projet, nous avons initialement synthétisé et testé 20 composés pour déterminer leurs effets bénéfiques sur le métabolisme dans des adipocytes en culture remplaçant ainsi l'utilisation de milliers de souris. Tous les 20 composés avaient la capacité de libérer efficacement du CO et d'exercer un effet positif sur la respiration mitochondriale et la glycolyse mais seulement 4 composés sur 20 n'ont montré aucun effet cytotoxique aux concentrations utilisées précédemment pour des composés similaires. Ces tests in vitro nous ont permis de sélectionner les 4 meilleurs en fonction également de leur structure chimique diversifiée. Pour les études sur des souris nourries avec un régime riche en graisses, nous devons évaluer l'effet comparatif de nos composés sur des souris jeunes et âgées. Par conséquent, des souris de 8 semaines et des souris de 12 mois seront utilisées pour démarrer nos protocoles. Pour les études concernant le modèle de plaie cutanée, nous utiliserons également des souris de 8 semaines car nous devons évaluer l'effet sur de nouveaux composés et les comparer avec des données antérieures utilisant des souris au même stade de développement.

Réduction

Pour chacun des groupes étudiés (groupes contrôles vs groupes traités) dans les procédures (souris jeunes), nous utiliserons 10 souris, en raison de la variabilité entre les différents animaux, et ce afin d’obtenir des données significatives. Chaque protocole nécessite son propre contrôle. Nos résultats seront comparés à certains résultats de la littérature, ce qui contribuera à éviter la réitération de certains essais déjà réalisés avec d’autres molécules aux mêmes propriétés. Après collecte des résultats, nous analyserons les données avec des tests statistiques. Notez que la stratégie expérimentale implique l'administration par voie orale ou i.p. de différentes doses aux souris, suivi par le prélèvement de tissus. Et ce, dans le but d’effectuer des mesures de paramètres fonctionnels et biochimiques et de déterminer quelle voie d'administration et quelle dose fournit les effets thérapeutiques les plus efficaces. Pour les experiences sur des souris jeunes et âgées, nous avons besoin d'un minimum de 30 souris par groupe pour obtenir une puissance significative afin d’étudier la longévité et la survie de souris âgées.

Raffinement

En optimisant les protocoles expérimentaux, nous avons privilégié des approches peu invasives afin de minimiser la douleur, la souffrance et la détresse des animaux. Nous avons déjà montré que le régime riche en graisses pendant 14 semaines et le traitement avec l’une de nos molécules n’induisent ni stress ni impact sur leur santé. Si les animaux perdent plus de 15 % de leur poids en une semaine, nous procéderons à leur mise à mort. Pour le protocole de plaie cutanée, une mise à mort compassionnelle sera pratiquée en cas de surinfection ou de signes de détresse tels que : prostration, dos voûté, pelage terne et hérissé, refus de se nourrir ou de s’abreuver, et perte de poids >15 %. Nous avons limité le nombre de composés et de doses utilisées. Le logement et l’élevage tiendront compte du bien-être animal. Des anesthésiques appropriés, et si nécessaire des analgésiques, seront utilisés pour minimiser la douleur. Les souris seront logées par groupes de trois, avec nettoyage hebdomadaire des cages et accès à la nourriture et à l’eau ad libitum.

Choix des espèces

Le modèle de souris est un modèle largement utilisé pour étudier l’effet des régimes alimentaire riche en graisse (« High Fat Diet », HFD). De manière analogue, les modèles de cicatrisation de la peau chez la souris ont été établis et bien décrits dans la littérature. Les souris diabétiques et les souris avec un régime alimentaire riche (HFD) ont été largement utilisées pour déterminer l’effet des drogues et des réponses inflammatoires suite à des désordres métaboliques liés au diabète et á l’obésité. Le choix de cette espèce de souris se justifie par le fait que nous devons également comparer nos données avec les nombreuses études présentes dans la littérature utilisant exactement les mêmes modèles. Pour les études sur des souris nourries avec un régime riche en graisses, nous devons évaluer l'effet comparatif de nos composés sur des souris jeunes et âgées. Par conséquent, des souris de 8 semaines et des souris de 12 mois seront utilisées pour démarrer nos protocoles. Pour les études concernant le modèle de plaie cutanée, nous utiliserons également des souris de 8 semaines car nous devons évaluer l'effet sur de nouveaux composés et les comparer avec des données antérieures utilisant des souris au même stade de développement.

Les procédures se limitent à quelques injections brèves, mais elles concernent 2 016 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Après leur mise à mort, neuf à quatorze organes sont prélevés sur chaque animal, des glandes mammaires et salivaires à la prostate ou au vagin. L'étude porte sur les cellules souches qui redeviennent multipotentes lors de la réparation des tissus, un mécanisme réactivé dans certains cancers. Le RNT fonde ce total de plus de 2 000 souris sur la seule littérature, sans autre justification de l'effectif.

Objectifs

Certaines cellules adultes peuvent, dans des contextes particuliers, retrouver des caractéristiques qu’elles n’avaient plus depuis le stade embryonnaire. C’est ce qu’on observe notamment dans le développement de certains cancers. L’une de ces caractéristiques est la multipotence, c’est-à-dire la capacité d’une cellule à se transformer en plusieurs types de cellules différents. Nous nous intéressons à plusieurs types de tissus glandulaires : les glandes mammaires, salivaires, lacrymales et prostatiques. Chez l’adulte, ces tissus sont composés de cellules spécialisées qui ne produisent qu’un seul type cellulaire. Mais lors de la réparation d’un tissu endommagé, certaines cellules retrouvent temporairement cette capacité à se diversifier. Or, dans les cancers de ces tissus, les cellules tumorales semblent réactiver ce programme de manière incontrôlée. Notre objectif est de mieux comprendre comment ces tissus se régénèrent après une blessure. En étudiant les mécanismes qui contrôlent le passage d’un état cellulaire flexible (multipotent) à un état plus stable et spécialisé, nous espérons identifier ce qui, lorsqu’il est déréglé, peut favoriser l’apparition ou la progression de tumeurs.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’étudier le comportement des cellules souches et leur état de différentiation pendant la régénération tissulaire dans les épithéliums stratifiés (à plusieurs couches) chez la souris. Nos résultats aideront à identifier les mécanismes régulant le destin des cellules souches. Ces mécanismes étant déstabilisés lors de la formation de tumeurs, nous pensons qu’à long terme nos recherches contribueront à une meilleure compréhension du processus tumoral dans les tissus épithéliaux étudiés.

Procédures

Les animaux recevront une ou un maximum de 5 injections (durée de chaque injection inférieure à 10 secondes) Maximum 1 injection/jour pendant 5 jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection elle-même (gène de courte durée). Suite à l’injection des traitements, une perte de poids, ou de la diarrhée pourraient être observés pendant quelques jours.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Au fil des années, beaucoup d'efforts ont été déployés pour développer des modèles 3D in vitro, comme les organoïdes, qui soient physiologiquement pertinents pour analyser le comportement dynamique des cellules souches au cours du développement et de la régénération tissulaire. Cependant, les cellules épithéliales modifient leur comportement lorsqu’elles sont cultivées in vitro sous forme d'organoïdes et détachées de leur niche tissulaire physiologique, ce qui nous empêche d'utiliser cette technique pour toutes les questions concernant le potentiel de différenciation des cellules souches De plus, les animaux seront essentiels pour suivre les cellules souches lors de la régénération tissulaire, étant donné qu’il n’existe actuellement aucun modèle in vitro qui puisse récapituler le processus global de régénération. L’absence de structure similaire aux épithéliums étudiés dans des modèles de vertébrés non mammifères rend l’utilisation de la souris nécessaire à notre étude.

Réduction

Le nombre de souris utilisées sera réduit au minimum possible. Pour réduire au minimum le nombre d’animaux et exploiter au mieux les prélèvements, des informations seront obtenues au niveau des organes, cellules et molécules à partir du même animal. Des schémas de reproduction des souris transgéniques seront réalisés afin d’obtenir efficacement les cohortes de souris avec le génotype souhaité. . Pour chaque souris 9 organes seront collectés (glande lacrymale, salivaire, épiderme, muqueuse orale, trachée, cornée, œsophage, thymus, vessie + 2 organes chez les mâles: prostate et urètre + 3 organes chez les femelles: glande mammaire, vagin, col de l’utérus. Le nombre d'animaux de notre étude est initialement fondé sur les données de la littérature.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions réglementaires. Pour l’injection des traitements, les animaux seront observés quotidiennement. En cas de diarrhée aigue, une solution de réhydratation sera apportée. Les signes de mal être ou de déshydratation ou de perte de poids visibles seront observés avec vigilance.

Choix des espèces

L'organisation générale, le développement et le fonctionnement glandes étudiées ici sont très similaires chez la souris et chez l’Homme. Le modèle souris est donc très utilisé dans la communauté scientifique afin d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement normal du tissu ainsi que de la régénération. De la même manière, les évènements cancéreux survenant chez l’homme et chez la souris suivent les mêmes étapes dans les différentes glandes étudiées ; perte d’identité cellulaire, activation de traits embryonnaires, prolifération non contrôlée. Les animaux utilisés pour l’étude de la régénération tissulaire seront âgés de 8 à 16 semaines. Les glandes de ces animaux sont alors constituées de progéniteurs qui réactivent la multipotence après différents dommages cellulaires

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Chacune subit deux chirurgies des reins à une semaine d'intervalle pour induire une maladie rénale chronique, puis un gavage quotidien pendant quatre semaines qui peut irriter l'œsophage. Le porteur juge le modèle animal "indispensable", aucune étude sur cellules ou chez l'humain ne pouvant selon lui explorer la fonction rénale. L'objectif reste d'évaluer trois molécules issues du tryptophane, un bénéfice pour les patients n'étant avancé qu'au conditionnel.

Objectifs

La maladie rénale chronique touche environ 3 millions de personnes en France. Elle correspond à un mauvais fonctionnement des reins, qui ne filtrent plus correctement le sang. Cela entraîne une accumulation de substances que l’organisme n’arrive plus à éliminer normalement. Certaines de ces substances peuvent devenir toxiques et participer aux complications associées à la maladie. Parmi ces substances, certaines proviennent de la transformation des protéines de l’alimentation, et en particulier d’un acide aminé appelé tryptophane. Des études récentes réalisées chez l’humain ont montré que certaines molécules issues de la dégradation du tryptophane sont associées à une aggravation de la maladie rénale chronique. En revanche, leur effet direct sur le fonctionnement des reins n’a jamais été étudié. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’effet de ces molécules, appelées molécules XANA, KYNA, AAN, sur les reins de souris. Le projet se déroulera en deux parties : 1/ Déterminer les doses auxquelles ces molécules peuvent être administrées. 2/ Évaluer l’effet de ces molécules chez des souris atteintes de maladie rénale chronique. Plusieurs paramètres seront analysés afin de mesurer leur impact sur le fonctionnement des reins et sur le métabolisme général.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment les molécules issues de la dégradation du tryptophane affectent la progression de la maladie rénale. Si ces molécules sont liées à une aggravation des problèmes rénaux, il serait possible d'utiliser des inhibiteurs pour réduire leur production. Cela pourrait offrir de nouvelles options de traitements pour ralentir la progression de la maladie chez les humains.

Procédures

Les 90 animaux seront identifiés une fois par une perforation de l’oreille (≈1 mm, 20 sec avec contention). Induction de la maladie rénale : – 1ère étude (modèle chirurgical) : 36 souris recevront une anesthésie gazeuse (15 min) + 1 locale à chaque chirurgie,

Impact sur les animaux

L’identification des animaux par une petite perforation de l’oreille peut provoquer une douleur légère et de très courte durée. Les deux opérations nécessaires dans le modèle chirurgical peuvent entraîner une douleur après l’intervention, du stress temporaire et un risque classique de complications liées à la chirurgie ou à l’anesthésie. Dans nos expériences précédentes, la mortalité associée à cette procédure était inférieure à 5 %, et survenait surtout dans les 24 à 48 h suivant la seconde chirurgie. Les molécules doivent être administrées par gavage, ce qui nécessite une contention quotidienne des animaux pendant 4 semaines (sauf samedi et dimanche). Cette manipulation peut être stressante, même si elle dure moins d’une minute. Les gavages répétés peuvent irriter l’œsophage et provoquer une douleur. Les mesures de composition corporelle nécessitent de placer brièvement la souris dans un petit tube pendant moins de deux minutes ; cela peut provoquer un stress léger. L’évaluation de la fonction du rein implique une courte anesthésie gazeuse pour l’injection du produit et la pose du capteur, puis le port du capteur pendant environ une heure. Cela peut entraîner un inconfort temporaire. La période de jeûne de six heures, indispensable pour étudier le métabolisme du glucose, peut générer un inconfort modéré. La petite prise de sang au niveau de la queue provoque une gêne brève et légère. Aucun comportement anormal n’a été observé lors de protocoles similaires dans notre laboratoire. Toutes les procédures sont réalisées par un personnel formé, avec une surveillance adaptée, afin de réduire au maximum la douleur et le stress des animaux.

Devenir

Les 90 animaux de ce projet seront mis à mort à l’issue du prélèvement sanguin terminal afin de collecter les tissus et répondre aux questions scientifiques.

Remplacement

Les mécanismes des molécules issues de la dégradation du tryptophane sont complexes et impliquent plusieurs organes. Ni la modélisation informatique ni les études in vitro ne permettent de répondre à cette question. Une étude chez l’Homme est impossible à ce stade, car il n’existe pas de moyens non invasifs pour étudier en détail la fonction rénale et le métabolisme. L’utilisation d’un modèle animal est donc actuellement indispensable pour évaluer l’impact de ces molécules sur la progression de la maladie rénale chronique.

Réduction

Les molécules étudiées dans ce projet n’ont jamais été testées dans le cadre de la maladie rénale chronique (MRC). Un nombre minimal de 12 souris a été choisi pour la première étude. Pour la seconde étude, le nombre de souris par groupe a été déterminé à l’aide d’un logiciel, sur la base de données issues de protocoles précédents utilisant des souris atteintes de MRC. Un effectif de 12 souris par groupe est nécessaire pour obtenir des résultats significatifs, tandis que 6 souris suffisent pour le groupe contrôle non malade. Un maximum de tissus sera collecté lors de la mise à mort et conservé afin de répondre à d’éventuelles nouvelles questions et d’éviter la répétition inutile des expériences. Ces échantillons pourront également être partagés avec d’autres équipes.

Raffinement

Toutes les manipulations seront réalisées par trois expérimentateurs expérimentés afin de garantir des gestes rapides et précis. Les animaux seront manipulés avec douceur, dans un environnement calme, et observés 7x/semaine. La prise alimentaire et hydrique sera mesurée 2x/semaine par cage, et le poids individuel suivi deux fois par semaine. Les chirurgies rénales seront réalisées par du personnel expérimenté. L’anesthésie générale sera adaptée au poids et surveillée en continu, complétée par une anesthésie locale. Des analgésiques seront administrés avant et après l’intervention. Au réveil, les animaux seront placés au chaud et surveillés jusqu’à récupération complète, puis feront l’objet d’un suivi post-opératoire renforcé. La planification en deux étapes réduit la sévérité de chaque chirurgie et permet une induction progressive de la maladie. L’administration des métabolites se fera par gavage, uniquement en semaine, afin de limiter le stress et l’irritation œsophagienne. Les animaux seront surveillés 5 jours/7. Pour la mesure de la fonction rénale, une anesthésie gazeuse légère et brève facilitera l’injection du produit et la pose du capteur ; un collyre anesthésique sera appliqué. Pendant l’enregistrement (≈60 min), les animaux resteront vigiles, dans leur cage, sous surveillance rapprochée. Pour la mesure de la composition corporelle, un apprentissage préalable sera effectué une fois, une semaine avant afin d’habituer les souris à entrer dans le tube de mesure. Cet entraînement vise à réduire le stress pendant la séance de mesure, qui dure moins de deux minutes. En fin d’étude, les animaux seront anesthésiés pour un prélèvement de sang, puis mis à mort par dislocation cervicale. Des points limites précis permettront une détection précoce de toute souffrance ou dégradation de l’état général.

Choix des espèces

Bien que la souris présente certaines différences par rapport à la physiologie humaine, elle constitue un excellent modèle pour étudier la maladie rénale et l’effet de molécules spécifiques. Sa physiologie est suffisamment proche de celle de l’humain pour reproduire les altérations de la fonction rénale observées chez les patients. Des souris âgées de 10-18 semaines seront utilisées. À cet âge, les animaux sont sortis de la phase de croissance ce qui garantit une meilleure homogénéité des réponses expérimentales. Les manifestations cliniques de la MRC induite à cet âge sont reproductibles et bien caractérisées.

Pour savoir si la chaleur aggrave la toxicité d'une mycotoxine présente dans près de la moitié des céréales, 96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Elles sont exposées quatre semaines à cette toxine par l'alimentation et placées dans une armoire chauffée à 32-35 °C, avec des mesures de glycémie après douze heures de jeûne. Le RNT décrit une baisse de poids, une respiration accélérée et une activité réduite sous l'effet combiné de la chaleur et du contaminant. La mise à mort sert à prélever le foie et l'intestin pour comparer les réponses des mâles et des femelles.

Objectifs

Tout au long de sa vie, l’Homme est exposé à un large éventail de contaminants alimentaires d'origines diverses. Les mycotoxines sont produites par certaines moisissures et sont les contaminants naturels les plus fréquents présents dans nos assiettes. La mycotoxine étudiée se retrouve dans près de 50 % des céréales et environ 80 % des individus y sont exposés. Le changement climatique qui implique une hausse des températures, bouscule le rythme naturel des cultures et modifie les périodes où les champignons peuvent les infecter, ce qui peut, selon les régions, augmenter ou réduire la présence de cette mycotoxine. Elle perturbe le fonctionnement de l'intestin notamment en provoquant une inflammation qui pourrait jouer un rôle dans l'apparition et la gravité des maladies inflammatoires de l'intestin. Le corps garde normalement une température assez stable, même si elle peut un peu varier. Quand il fait très chaud, il subit un stress thermique: cela perturbe son fonctionnement interne et modifie l’activité de nombreuses cellules. Pour se protéger, l’organisme déclenche une réaction de défense, qui se traduit par une hausse de la température corporelle, une plus forte sollicitation du cœur et une utilisation accrue du sucre comme source d’énergie. Même si plusieurs études montrent que le changement climatique peut faire varier la présence de cette toxine, aucune ne s’est encore penchée sur la façon dont elle pourrait devenir plus ou moins dangereuse pour les organismes vivants. L’objectif de ce projet est d’étudier les effets de cette toxine dans un contexte de forte chaleur et de caractériser ces effets sur différents paramètres physiologiques au niveau du foie et de l’intestin. Nous chercherons à vérifier l'hypothèse que, dans des conditions réalistes d’exposition, ces effets seront différents entre les mâles et les femelles.

Bénéfices attendus

Certains consommateurs sont quotidiennement exposés à des aliments contaminés par la mycotoxine étudiée présente dans les aliments à base de farine de blé, de maïs, etc. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons in vivo chez la souris si l’exposition chronique à la chaleur potentialise les effets de cette mycotoxine. Les données expérimentales permettront d’évaluer l’impact d’une exposition combinée à la chaleur et à la mycotoxine sur le métabolisme général, ainsi que sur la santé digestive et hépatique. Les résultats attendus de ce projet présentent un enjeu important pour la santé publique, compte tenu de l’exposition chronique des consommateurs à cette toxine et de l’augmentation continue des températures associées au réchauffement climatique. Si les hypothèses sont confirmées, les données produites feront l’objet de publications scientifiques et pourront être prises en compte dans l’évaluation du risque d’exposition chez l’Homme.

Procédures

L’objectif de ce projet est d’étudier l’exposition chronique à une mycotoxine lors d’un stress thermique. Les animaux seront exposés à la mycotoxine via l’alimentation pendant 4 semaines et/ou à une chaleur plus élevée que lors d’un hébergement standard (20-24°C) dans une armoire chauffante entre 32-35°C. Les animaux seront pesés une fois par semaine, ce geste dure 15 secondes. Une mesure de la glycémie et de la cétonémie sera réalisée 2 fois au cours de la procédure après 1 et 4 semaines d’exposition. Pour cela, les animaux sont mis à jeun pendant 12h, puis une goutte de sang sera prélevée. Ce prélèvement ne nécessite pas de contention mais uniquement une prise en main de la queue et prend moins de 5 secondes. A la fin de la procédure, un prélèvement de sang sera effectué puis les animaux seront euthanasiés et des organes prélevés pour analyses.

Impact sur les animaux

La consommation d’un aliment contaminé par la mycotoxine peut entrainer une réduction de la prise de poids des animaux. L’exposition à une température ambiante de 32-25°C est susceptible d’induire une augmentation de la fréquence respiratoire, une diminution de l’activité locomotrice, une modification de la prise alimentaire ainsi qu’une augmentation de la consommation d’eau. Une légère perte de poids transitoire lors des 2 premiers jours ou des modifications du comportement peuvent également être observées. Les prélèvements sanguins peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention (15s) et une douleur ponctuelle liée à la piqure de l’aiguille.

Devenir

A l’issue de la procédure tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever des organes destinés à être analysés pour répondre à la question scientifique.

Remplacement

Des études précédentes ont permis de montrer que la mycotoxine étudiée entraîne des perturbations intestinales et hépatiques, tandis que l’exposition à la chaleur induit un stress thermique pouvant altérer le métabolisme du foie. . En effet, des tests in vitro sur cellules ont déjà été réalisé par le laboratoire pour étudier les effets des mycotoxines. Cependant ces modèles présentent des limites car ils ne reproduisent pas la complexité d’un organisme entier avec les interactions entre organes, ne permettent pas d’évaluer correctement la métabolisation des mycotoxines et ne reflètent pas les effets globaux ou à plus long terme. Lorsqu’elle est ingérée par un organisme vivant, son devenir et ses effets dépendent notamment de son absorption intestinale et de sa métabolisation, processus qui peuvent être perturbés par un stress thermique. Ce projet nécessite donc l’utilisation d’animaux de laboratoire pour étudier les conséquences d’une exposition alimentaire à la mycotoxine dans un environnement plus chaud sur un organisme entier, impliquant l’interaction de différents tissus (foie, tissu adipeux, intestin, cerveau, muscle) et les réponses physiologiques globales du aux adaptations de l’organisme. Il est impossible de reproduire ces interactions complexes en utilisant uniquement des méthodes alternatives, telles que des cultures cellulaires.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Le nombre d'animaux a été limité au maximum (n=12 animaux/groupe). Cet effectif a été déterminé en utilisant des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Lors du suivi quotidien des animaux, nous serons attentifs à d'éventuels signes de souffrance et nous utiliserons une grille d'évaluation de leur état général portant sur l’apparence générale, le comportement, les signes cliniques et l’alimentation. Le cumul du score de chacun de ces critères permettra de décider d’un éventuel arrêt de la procédure. Les souris seront hébergées en groupe pour respecter leurs comportements sociaux et un enrichissement de type abri en inox ou un élément de nidification sera ajouté dans la cage. Une habituation à la préhension par l'expérimentateur sera réalisée avant le début de l'expérimentation pour diminuer ce stress.

Choix des espèces

Les lignées de souris sont largement utilisées dans la recherche sur le métabolisme. Il est connu que la lignée utilisée dans cette étude développe des maladies hépatiques. La souris présente des similitudes avec l’espèce humaine pour ce qui est des maladies et de leurs effets sur le corps. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte car nous avons besoin d’avoir un tractus digestif et un système immunitaire mature. Les souris sont adultes à partir de 8 semaines.

Soumises à une batterie de tests moteurs et cognitifs, labyrinthe, force de préhension, suspension et tapis roulant, 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. La mise à mort suit un prélèvement sanguin terminal d'un volume incompatible avec la survie, complété par le prélèvement d'organes. L'étude porte sur le rôle des plaquettes sanguines au cours du vieillissement, sur des souris de 6, 12 et 18 mois. Le RNT évoque des stimulations électriques pour forcer la marche sur le tapis tout en les qualifiant ailleurs de douces et non douloureuses, sans trancher.

Objectifs

Les maladies du cœur et des vaisseaux sanguins, dans lesquelles les plaquettes jouent un rôle important, sont très fréquentes chez les personnes âgées. Pourtant, nos connaissances sur le fonctionnement des plaquettes avec l’âge restent limitées. La plupart des données disponibles proviennent d’études menées chez des adultes d’âge moyen, et leurs résultats sont souvent simplement appliqués aux personnes âgées. Or, chez les personnes plus âgées, le contexte est très différent : elles présentent souvent plusieurs maladies chroniques et prennent de nombreux traitements, qui peuvent modifier le fonctionnement des plaquettes sans que l’on en comprenne bien les effets. Il est donc essentiel de mieux comprendre comment les plaquettes se dérèglent au cours du vieillissement et d’identifier de nouveaux moyens de les surveiller ou de les cibler. Ces recherches pourraient aider à mieux prévenir les complications plaquettaires chez les personnes âgées et à améliorer leur prise en charge médicale.

Bénéfices attendus

Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle des plaquettes sanguines lors du vieillissement. Ces résultats apporteront donc des informations à la fois fondamentales dans la connaissance de la physiopathologie du vieillissement et aideront à évaluer l’intérêt thérapeutique de cibler les plaquettes pour un vieillissement en bonne santé.

Procédures

Les animaux seront évalués à l’aide d’une série de tests comportementaux et moteurs couramment utilisés en recherche, répartis sur quatre jours consécutifs, et réalisés sur animaux vigiles, dans des conditions contrôlées et avec une surveillance constante. • Fonctions cognitives (mémoire spatiale à court terme) Les capacités d’exploration et de mémoire spatiale sont évaluées dans un dispositif de type labyrinthe, dans lequel chaque animal se déplace librement pendant environ 8 minutes. • Fonction motrice – force de préhension La force des membres est mesurée à l’aide d’un dispositif standardisé, au cours de trois essais courts espacés d’une heure. La durée de chaque essai est limitée, pour un temps total d’environ 5 minutes par mesure. • Coordination et équilibre La coordination motrice est évaluée par un test de suspension sur câble, réalisé au-dessus d’une surface amortissante afin de prévenir tout risque de blessure. Le temps de maintien est mesuré avec une durée maximale limitée et trois essais espacés d’une heure. • Activité locomotrice et comportement exploratoire L’activité spontanée est observée pendant 10 minutes dans une arène dédiée, permettant à l’animal d’explorer librement l’environnement. • Endurance physique Les capacités d’endurance sont évaluées à l’aide d’un tapis roulant automatisé, avec une augmentation progressive de l’effort. La durée du test est adaptée aux capacités individuelles des animaux. Les encouragements à la marche reposent exclusivement sur des stimulations douces et non douloureuses, calibrées au niveau minimal nécessaire, et le test est interrompu dès l’apparition de signes de fatigue. Afin de limiter la fatigue globale et les interactions entre les différentes évaluations, les tests de mémoire spatiale, de force de préhension et de coordination motrice sont réalisés à des jours distincts, tandis que les évaluations de coordination motrice et d’endurance sont regroupées le même jour. Dans le cadre du protocole, les animaux pourront également faire l’objet de procédures de courte durée, incluant des injections d’environ 15 secondes, un prélèvement sanguin périphérique réalisé jusqu’à l’obtention de l’hémostase, ainsi qu’un prélèvement sanguin terminal de 1 à 2 minutes, effectué sur animal anesthésié.

Impact sur les animaux

Les tests expérimentaux utilisés pour cette étude génèrent un certain niveau de stress : préhension de une à cinq minutes lors de la mise en place des animaux dans les dispositifs de comportement ainsi que des stimulations électriques.

Devenir

La mise à mort de tous les animaux fait suite au prélèvement sanguin terminal de grand volume nécessaire à la caractérisation des plaquettes (volume incompatible avec la survie de l'animal) et est nécessaire pour le prélèvement d'organes.

Remplacement

Dans ce projet, nous utilisons des souris pour mieux comprendre comment les plaquettes sanguines agissent lorsque l’on vieillit. Les plaquettes sont de très petits éléments du sang qui servent à arrêter les saignements, mais qui jouent aussi un rôle important dans certaines maladies fréquentes chez les personnes âgées, comme les maladies du cœur et des vaisseaux. D’autres animaux utilisés en recherche, comme la mouche ou le poisson zèbre, ne conviennent pas pour cette étude, car leur sang fonctionne d’une manière très différente de celui des humains. Les cellules qui remplacent les plaquettes chez ces espèces ne se comportent pas de la même façon, ce qui ne permet pas de faire des parallèles fiables avec la santé humaine. En revanche, les plaquettes des souris fonctionnent presque comme celles des humains. C’est pourquoi les souris sont le meilleur modèle pour étudier l’impact du vieillissement sur les plaquettes sanguines. Ces recherches permettront de mieux comprendre certaines maladies liées à l’âge et, à terme, d’aider à mieux les prévenir afin de favoriser un vieillissement en meilleure santé.

Réduction

Plusieurs résultats seront obtenus à partir d’un seul animal. Nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. Le nombre de souris utilisées sera réduit au minimum sur la base des études précédentes déjà réalisées au laboratoire et d’analyses statistiques permettant d’obtenir des résultats fiables. Les paramètres mesurés seront analysés à l’aide d’une analyse de variance.

Raffinement

Les tests expérimentaux utilisés pour cette étude génèrent peu de stress (préhension lors de la mise en place des animaux dans les dispositifs de comportement). Une habituation aux gestes de manipulation sera effectuée avant chaque lot de tests pendant 5 minutes par souris pendant 3 jours avant le début des tests pour limiter le stress généré par l’expérimentateur. Les animaux seront également acclimatés à la salle d’expérimentation pendant la phase d’habituation. Des éléments d’enrichissement seront mis en place dans la cage d’hébergement afin d’assurer leur bien-être et réduire le stress : animaux placés en groupe dans les cages et papier pour faire un nid. Si l’animal présente des signes de détresse ou une agressivité inhabituelle ou une prostration, l’animal sera placé en surveillance rapprochée. Des mesures de renforcement de l’enrichissement peuvent être mis en place comme la nourriture liquide, nidification supplémentaire. Si les signes persistent ou s’aggravent, l’animal sera temporairement exclu de l’étude et recevra si nécessaire des soins adaptés. Si l’animal présentent des signes cliniques critiques ou irréversibles comme l’apathie, une perte de poids inhabituel, difficultés de déplacements, alors l’animal sera mis à mort. Toutes les procédures utilisent des analgésiques/anesthésiants locaux ou généraux.

Choix des espèces

Dans ce projet, nous utilisons des souris pour mieux comprendre le rôle des plaquettes sanguines lors du vieillissement. D’autres modèles animaux, comme la mouche (drosophile) ou le poisson zèbre, ne sont pas adaptés à cette étude, car leur système sanguin est très différent de celui de l’être humain. Chez ces espèces, les cellules équivalentes aux plaquettes n’ont ni la même structure ni les mêmes fonctions, ce qui empêche de tirer des conclusions pertinentes pour la santé humaine. En revanche, les plaquettes des souris sont très proches de celles de l’Homme, tant par leur mode de formation que par leur fonctionnement. C’est pourquoi le modèle murin est aujourd’hui le plus approprié pour étudier comment le vieillissement modifie l’action des plaquettes et comment ces changements peuvent influencer la santé, notamment le risque de maladies liées à l’âge. Pour étudier la fragilité et les processus de vieillissement, des souris de 6, 12 et 18 mois seront utilisées