Recherche fondamentale

Hébergées seules pendant environ quatre mois pour protéger leurs implants, 197 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Elles subissent une chirurgie cérébrale de quatre heures, l'implantation de fibres optiques et d'électrodes, puis des tâches de navigation dont un labyrinthe aquatique, sous restriction alimentaire pour les motiver. Le RNT reconnaît que l'isolement contrarie une espèce qui vit normalement en groupe et que la nage induit stress et légère hypothermie. La mise à mort permet d'analyser leur cerveau et de vérifier la position des dispositifs implantés.

Objectifs

Le cervelet a été classiquement considéré comme une structure impliquée dans le contrôle, la synchronisation et l'apprentissage des habiletés motrices. Cependant, un ensemble de preuves récentes ont également mis en évidence son rôle dans les processus cognitifs par ses interconnexions avec les régions du cerveau impliquées dans la cognition, notamment l'hippocampe. L'hippocampe est consideré comme le siége de la navigation, une fonction fondamentale qui permet aux individus de se repérer dans l'environnement et de la mémoire spatiale, la composante de la mémoire responsable de l'enregistrement des informations sur notre environnement et notre orientation. Des études menées sur des souris ont révélé que le cervelet est crucial pour l'activité neuronale de l'hippocampe et l'efficacité des comportements de navigation. Cependant, les voies reliant le cervelet à l'hippocampe et les mécanismes sous-jacents restent inconnues. Notre projet vise à caractériser les projections cérébelleuses vers l'hippocampe, tant sur le plan anatomique que physiologique, chez des souris au comportement libre. Nous sollicitons une demande de modification car compte-tenu des premiers résultats obtenus, nous souhaitons réaliser un test comportementale complémentaire sans modification du nombre total d’animaux.

Bénéfices attendus

Les fonctions cognitives, telles que la navigation et la mémoire spatiale, sont des processus complexes qui impliquent l'intégration d'informations provenant de différentes régions du cerveau. L'étude des connexions entre ces régions permet d’appréhender non seulement les bases neuronales de ces processus, mais contribue également aux domaines plus vastes des neurosciences et de la psychologie cognitive. Elle fournit une base pour développer et tester des théories sur la façon dont le cerveau traite les informations et décide du comportement. La navigation et la mémoire spatiale sont souvent altérées dans divers troubles neurologiques et psychologiques, tels que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson et la schizophrénie. Comprendre les circuits neuronaux en conditions normales, peut aider à détecter et à comprendre les altérations et les dysfonctionnements cérébraux qui surviennent dans ces conditions pathologiques. En étudiant les interactions entre le cervelet et l’hippocampe, ce projet permettra donc de mieux comprendre le réseau cérébral qui soutient la navigation et la mémoire spatiale en conditions normales, avec des applications potentielles dans les pathologies associées.

Procédures

Dans cette étude, trois groupes d’animaux seront soumis à des interventions distinctes. Premier groupe: Les animaux subiront une chirurgie cérébrale comprenant une injection de solution, réalisée sous anesthésie générale et analgésie. La durée maximale de cette intervention est de 4 heures. Après un délai maximal d’un mois, les animaux seront de nouveau anesthésiés puis euthanasiés au cours d’une procédure chirurgicale, sans réveil intermédiaire, afin d’éviter toute souffrance en fin d’expérience. Deuxième groupe – MODIFICATION: Les animaux subiront une chirurgie cérébrale avec injection de solution et implantation de dispositifs, sous anesthésie et analgésie, pour une durée maximale de 4 heures. Après une période de récupération d’une semaine, ils participeront à des séances d’exploration comportementale dans une arène, à l’état éveillé, pendant 60 minutes maximum par jour durant deux semaines. Des tests comportementaux seront ensuite réalisés pendant 120 minutes maximum par jour sur une période de trois mois. Ces tests incluront l’observation du comportement, l’enregistrement de l’activité cérébrale et l’utilisation de l’optogénétique, permettant la stimulation ciblée de zones cérébrales par la lumière. Une légère restriction alimentaire sera appliquée certains jours afin de motiver l’exploration de l’environnement. À la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie lors d’une procédure chirurgicale, sans réveil. Troisième groupe: Les animaux subiront une chirurgie cérébrale avec injection de solution et implantation de dispositifs, sous anesthésie et analgésie, d’une durée maximale de 4 heures. Après une semaine de récupération, ils participeront à une expérience de navigation impliquant un labyrinthe aquatique. Ils passeront environ 15 minutes par jour dans l’eau pendant 15 jours, avec des sessions de nage limitées à 2 minutes maximum, entrecoupées de périodes de séchage et de repos. Cette expérience inclut l’utilisation de l’optogénétique. À l’issue de l’étude, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie lors d’une procédure chirurgicale, sans réveil, selon la même méthode que pour les autres groupes.

Impact sur les animaux

Dans cette étude, certains effets indésirables peuvent survenir pour les animaux à différents moments du processus : Premièrement, les effets liés aux chirurgies : Les interventions chirurgicales, comme celles réalisées au niveau du cerveau, peuvent provoquer des effets indésirables tels que la perte de poids, une baisse de la température corporelle, de la déshydratation, ainsi que des douleurs ou un inconfort. Deuxièmement, le stress dû à l'hébergement en cage individuelle : Après les chirurgies, les animaux seront hébergés dans des cages individuelles pour protéger les implants fragiles placés lors des chirurgies. Bien que ces cages permettent des contacts visuels, auditifs et olfactifs entre eux, les souris sont des animaux qui vivent habituellement en groupe. Cette séparation peut donc provoquer un certain stress ou de l'angoisse, car elles se retrouvent privées de la compagnie de leurs congénères. Troisièmement, les expériences comportementales : Les animaux sont motivés soit par une récompense alimentaire, associée à une légère restriction alimentaire avant certaines séances, soit par la recherche d’une plateforme dans des expériences aquatiques. Ces situations peuvent induire un stress temporaire ou de l’anxiété. MODIFICATION certains animaux réaliseront une tache comportementale aquatique qui peux provoquer un stress et une légère hypothermie.

Devenir

L’ensemble des animaux sera euthanasié à l’issue des procédures. Des prélèvements seront réalisés après la mort afin d’analyser le cerveau. Ces analyses permettront d’identifier les connexions cérébrales étudiées, de vérifier la position des dispositifs implantés (fibres optiques et électrodes) et de réaliser des analyses biologiques complémentaires (notamment immunologiques).

Remplacement

L’étude des bases neurales qui sous-tendent les capacités de navigation requiert de manière indispensable l’utilisation d’animaux capables de telles performances de manière à en étudier les mécanismes sous-jacents. Étant donné que les études in vitro et les animaux invertébrés ne permettent pas l'investigation de comportements complexes, le rongeur demeure donc l'espèce la plus appropriée. La souris est un animal explorateur, ce qui se prête parfaitement à notre sujet de recherche. Ainsi, des travaux précédents de l’équipe ont montré la validité de ce modele animal dans l’étude de la navigation spatiale.

Réduction

Le projet impliquera un total de 197 animaux. Ce nombre est inspiré du nombre d’animaux utilisé dans des travaux précédents de l’équipe et réduit au maximum pour nous permettre de générer des données statistiques solides. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Ce projet utilisera des implants permettant des enregistrements électrophysiologiques simultanés d'une grande population de neurones localisés dans différentes structures cérébrales, permettant de collecter des données en plus grande quantité par souris, réduisant ainsi le nombre total d'animaux requis. L’analyse des données électrophysiologiques et comportementales s’effectuera avec des tests statistiques en ajustant des modèles à effets mixtes généralisés avec des effets aléatoires imbriqués pour tenir compte de la variabilité entre les souris ou les sessions au sein des souris.

Raffinement

À leur arrivée dans l’animalerie les animaux ont une periode d’adaptation d’au moins 5 jours. Ils sont ensuite manipulés et surveillés quotidiennement par les mêmes experimentateurs et les procédures nécessaires seront mises en place pour garantir leur bien-être (Grille de scoring). Les souris subissant une chirurgie seront anesthésiées par inhalation d’un gaz anesthesiant et receveront une injection d'analgésique et d'un anesthésique local au lieu de l’incision chirurgicale. De plus, un anesthésique local sous forme de créme est appliqué au niveau des oreilles où les barres sont fixées. Les souris sont placées sur un tapis chauffant et une solution physiologique est injectée au debut et à la fin de l’intervention afin d’éviter une hypothermie et une déshydratation. Afin d’éliminer tout risque d’inflammation et de douleur post opératoire, les souris recevront à la fin de la chirurgie et pendant 48 heures une injection d’anti-inflammatoire non stéroïdien. Pour éviter tout risque de déterioration de l'implant des souris par leurs congénères après la chirurgie les animaux seront isolés pendant environ 4 mois. Néanmoins pendant cette période un nid végétal ainsi qu’un jouet d'exploration (cube, tunnel ou abri) est placé dans chacune des cages de manière à offrir aux animaux plus d’enrichissement. De plus, les cages utilisées sont transparentes, fermées par une grille et placées les unes à côté des autres dans la pièce de stabulation. Ainsi les informations visuelles, auditives et les odeurs peuvent circuler entre les souris. Pour obtenir un comportement optimal, nous régulons la quantité de nourriture disponible pour les animaux durant les jours d’enregistrement (environ 3 mois) afin qu’ils soient plus motivés pour trouver les miettes de céréales au chocolat qui sont disposées aléatoirement dans l’environnement. Nous diminuons donc la quantité de nourriture d’ad libitum à quelques grammes afin de provoquer une légère perte de poids. Les souris sont pesées chaque jour et nous surveillons que leur perte de poids ne soit pas excessive. Pendant le weekend les souris ont de la nourriture ad libitum ce qui leur permet de retrouver leur poids de référence.AJOUT: Pour les tests de comportement aquatique, des mesures de raffinement supplémentaires sont mises en place : durée limitée des essais, séchage et repos entre chaque session, et surveillance continue pour minimiser stress et hypothermie.

Choix des espèces

La souris est le modèle traditionnellement utilisé au laboratoire. Nous disposons donc de tout le matériel réglementaire et nécessaire à son hébergement. Il s’agit d’un mammifère explorateur, qui est le plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants en termes de performance de navigation qui est notre sujet de recherche. L'équipe a développé de nombreux tests de comportement pour cet animal au cours de travaux antérieurs, parmi lesquels ceux qui servent de fondement à nos hypothèses de travail. Le projet porte sur l'étude des réseaux neuronaux à l'âge adulte. Comme les procédures d'enregistrement électrophysiologique combinées à l'optogénétique prennent plusieurs semaines, elles ne peuvent être effectuées que sur un cerveau dont le développement est stable. Nous utiliserons des souris âgées de 3 à 8 mois maximum.

Vaccinés à deux reprises, puis infectés deux fois par le virus de la maladie d'Aujeszky par voie oro-nasale, 4 porcs subissent sur onze semaines treize ponctions sanguines totalisant près de 300 ml de sang. Les procédures sont classées en souffrance modérée, avec fièvre, perte d'appétit et possibles troubles respiratoires ou nerveux après l'infection. Le porteur retient quatre animaux comme effectif minimal pour avoir 94 % de chances de détecter les anticorps recherchés. Tous sont tués à la fin pour prélever leurs organes.

Objectifs

Le système immunitaire de chaque individu est conçu pour détecter des microbes et apprendre à les combattre. Cela conduit l’organisme à notamment produire des anticorps qui vont neutraliser ces microbes. Parmi ces anticorps, certains sont communs à plusieurs individus. Identifier et étudier des anticorps communs à plusieurs individus est particulièrement intéressant car cela permet de cibler des réponses immunitaires communes et efficaces contre un microbe, facilitant ainsi la conception de vaccins et le développement de tests de diagnostiques des maladies. La maladie d’Aujeszky est une maladie virale qui touche les porcs et qui se caractérise par des troubles nerveux chez les jeunes, et des troubles respiratoires et de la reproduction chez les adultes. C’est un modèle expérimental souvent utilisé en immunologie pour l’étude des anticorps. Il a été montré que des porcs vaccinés contre le virus de la maladie d’Aujeszky produisaient des anticorps ciblés contre ce virus et que ces anticorps peuvent être communs à plusieurs porcs. De nouvelles techniques permettent aujourd’hui de les caractériser. L’objet de la présente étude consiste à immuniser un groupe de porcs contre le virus de la maladie d’Aujeszky. Il s’agit de caractériser, directement dans les cellules, les anticorps produits contre ce virus en apportant une attention particulière aux anticorps susceptibles d’être communs à plusieurs individus.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet sont multiples. Tout d’abord, il permettra de mettre au point la méthode de séquençage des anticorps produits par chaque lymphocyte chez le porc. Cette méthode, qui sera mise en oeuvre dans le modèle d’infection par le virus de la maladie d’Aujeszky (VMA) pourra également être appliquée à d’autres modèles infectieux. De plus, les résultats obtenus dans ce projet permettront de caractériser les anticorps capables de reconnaitre des souches de VMA. Ces connaissances peuvent être utiles pour étudier plus finement les interactions virus/anticorps, développer de nouveaux vaccins ou des kits de diagnostic.

Procédures

Tous les actes prévus sur les animaux se feront sur animaux vigiles. Les animaux seront vaccinés à deux reprises avec un vaccin inactivé. Ils recevront donc 2 doses de 2ml en intra-musculaire dans le cou. La vaccination prend moins d’1 minute. Ensuite, à deux reprises, ils recevront 5ml par voie oro-nasale de virus de la maladie d’Aujeszky. L’inoculation oronasale prend moins d’1 minute. Tout au long de la procédure expérimentale, les animaux seront soumis à des ponctions sanguines, 1 à 2 fois par semaine. C’est un total de 13 ponctions sanguines (volume total de sang : 296ml) qui sera réalisé au cours des 11 semaines d’expérimentation. Du fluide oral individuel sera également collecté (0,5 ml de salive) à onze reprises au cours de la procédure. Tous ces actes sont réalisés par un personnel expérimenté et sont effectués le plus rapidement possible (les prélèvements prennent environ 1 min. et 30 sec.). A l’issu de ces actes, les animaux sont récompensés par la distribution d’une friandise type sirop de grenadine.

Impact sur les animaux

La vaccination avec le vaccin inactivé peut provoquer de la fièvre pendant les 24h suivant l’injection du vaccin. Suite à l’inoculation du VMA, les animaux vaccinés peuvent aussi présenter de la fièvre de J2 à J8, une baisse d’appétit et une perte de poids. Les animaux pourront également présenter des troubles respiratoires (ex : toux) et neurologiques (ex : tremblement). Aucun symptome sévère n’est attendu, les animaux étant vaccinés avec un vaccin ayant une bonne efficacité. Toutefois, un soin particulier sera apporté au suivi clinique quotidien de chaque porc. Un suivi rapproché sera mis en œuvre dès que l’évolution de l’état de santé d’un animal le nécessitera. L’animal concerné sera observé le matin, en début d’après-midi et en fin de journée (y compris le week-end) afin d’évaluer l’évolution de son état de santé et de procéder à sa mise à mort en cas d’atteinte de l’un des points limites. Enfin, les prélèvements multiples peuvent engendrer un stress chez l’animal. Pour limiter ce stress, les prélèvements sont réalisés par du personnel expérimenté afin de minimiser au maximum leur durée et l’inconfort qu’ils peuvent provoquer.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récolter les organes d’intérêts pour analyses.

Remplacement

Pour répondre aux objectifs de ce projet, il n’y a aucune possibilité de remplacement du modèle animal par une étude in vitro ou in silico. En effet, nous avons besoin d’un organisme entier capable d’induire la production d’anticorps suite à la vaccination et à l’infection virale. Ce mécanisme immunitaire est complexe et ne peut pas être reproduit par d’autres modèles (in vitro, ex vivo et in silico).

Réduction

Le nombre de 4 porcs est l’effectif minimal pour avoir une forte probabilité (93,8%) d’atteindre notre objectif de détecter dans au moins 1 porc les anticorps d’intérêt pour les caractériser finement (données obtenues sur la base de nos connaissances préalables et en utilisant la loi binomiale).

Raffinement

L’expérimentation sera conduite dans le respect de l’éthique et du bien-être des animaux. Les animaux seront répartis dans 1 animalerie contenant deux parcs. Du début à la fin de la procédure, chaque parc accueillera 2 animaux. Les porcs seront alimentés et abreuvés à volonté. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes et des plaques de couchage dans les jours qui suivent le sevrage. Ils auront accès à des jouets type "mordille", "tourniquet", etc. Après chaque prélèvement, une récompense type grenadine leur sera distribuée. Une attention particulière sera apportée au suivi clinique de chaque animal pendant toute la durée de la procédure expérimentale. Des points limites précoces ont été définis et seront appliqués.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible du virus de la maladie d’Aujeszky. Il est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de cette procédure. Les porcs seront sevrés à 4 semaines d’âge. Ils seront vaccinés à 8 semaines d’âge puis à 11 semaines, ce qui correspond à l’âge préconisé par le fabricant de vaccin. Les animaux seront ensuite inoculés par le virus de la maladie d’Aujeszky à 13 semaines d’âge, soit 2 semaines après le rappel vaccinal afin de s’assurer que la réponse immunitaire post-vaccinale soit bien établie. Enfin, la deuxième inoculation de virus aura lieu à 16 semaines d’âge. Les 3 semaines d’intervalle entre les deux inoculations sont nécessaires pour laisser le temps au système immunitaire de mettre en place une réponse post-challenge.

Des seuils d'alerte déclenchent le retrait de l'étude et la mise à mort des animaux qui se dégradent trop. 64 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Dès le sevrage, elles reçoivent un régime pauvre en protéines pendant une à cinq semaines pour reproduire une malnutrition infantile, avec trois injections et un retard de croissance attendu. Le projet, présenté comme pilote, cherche à décrire comment ce régime modifie la multiplication des cellules de l'intestin, en comparant mâles et femelles.

Objectifs

La malnutrition chez l’enfant est un problème majeur dans le monde. Elle peut provoquer des troubles durables de la croissance, de la gestion de l’énergie et du développement. Des études récentes montrent que les garçons semblent plus touchés que les filles. L’intestin, qui absorbe les nutriments et joue un rôle central dans de nombreux processus du corps, est au cœur de cette problématique. Pourtant, on connaît encore mal la façon dont il réagit à une alimentation pauvre en protéines. Nos premiers résultats suggèrent que ce type de régime pourrait altérer le développement des cellules qui contribuent à l’absorption des nutriments. Le but de ce projet est de mieux comprendre comment un régime pauvre en protéines influence le fonctionnement de l’intestin, essentiel à la digestion et à la communication entre les organes. Nous utiliserons une procédure pilote qui guidera le protocole pour la procédure complète, l’idée étant de comprendre à quel rythme les cellules intestinales se divisent en fonction du régime, celui-ci étant un indicateur important de la santé du système digestif. Ce projet aidera à mieux comprendre l’effet de l’alimentation sur l’intestin, en tenant compte des différences entre sexes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment le fonctionnement intestinal est affecté par la malnutrition protéique juvénile, en tenant compte du sexe. Cette description de la multiplication des cellules dans l’intestin permettra à terme d’éclairer de nouvelles pistes de prévention ou d’intervention en santé humaine, où les enfants en malnutrition sont généralement sujets à des symptômes intestinaux associé à un mauvais fonctionnement intestinal (comme le transit).

Procédures

64 souris seront utilisées dans le projet. Tous les animaux seront nourris soit avec un régime contrôle, soit avec un régime pauvre en protéines (modèle de malnutrition infantile) pendant 1 ou 5 semaines. Chaque animal sera injecté avec 3 produits différent (30 secondes / injection) : un jour et demi avant, un jour avant, et juste avant la fin de la procédure. A 28 jours, 36 souris seront anesthésiées (3 minutes). A 56 jours, 28 souris seront anesthésiées (3 minutes).

Impact sur les animaux

Les trois injections de produits peuvent entraîner un gonflement ou un oedème, dont l’apparition sera surveillée après la procédure. Le régime faible en protéines a pour conséquence un retard de croissance en taille.

Devenir

L'ensemble des animaux mis en procédure seront mis à mort en vue du prélèvement des organes d’intérêt.

Remplacement

Pour comprendre comment le corps réagit à différents types d’alimentation, en particulier en cas de manque de protéines, il est nécessaire d’étudier l’organisme dans son ensemble. Aucun modèle en laboratoire (sans animal) ne permet aujourd’hui de reproduire la complexité du corps humain, où plusieurs organes communiquent entre eux et influencent ensemble l’état nutritionnel. C’est pour cette raison que l’utilisation d’animaux est indispensable dans ce projet. La souris a été choisie car elle représente un bon modèle pour étudier les effets d’une alimentation pauvre en protéines dans des conditions proches de la physiologie humaine. L’objectif est de mieux comprendre ce qui se passe dans l’intestin. Ce type d’étude ne peut pas être réalisé chez l’humain.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été limité autant que possible tout en permettant d’obtenir des résultats fiables. Nous avons choisi d’inclure 7 animaux par groupe, sur la base d’un calcul statistique garantissant la solidité des conclusions. Ce calcul s’appuie sur des données que nous avons déjà pour la mesure de la prolifération chez les souris adulte. La mesure de plusieurs paramètres sur chaque souris permet d’éviter la multiplication des cohortes. Les analyses prévues permettront de comparer les effets du régime alimentaire et du sexe.

Raffinement

L’étude commencera uniquement avec des animaux suffisamment développés, pesant plus de 7 g au moment du sevrage. La nourriture sera mise à portée des plus jeunes pour qu’ils puissent y accéder facilement. Des seuils d’alerte seront définis à l’avance : si un animal les atteint, il sera retiré immédiatement de l’étude pour éviter toute souffrance. Le régime pauvre en protéines et les méthodes utilisées sont déjà bien maîtrisés au laboratoire et ne provoquent pas de signes de souffrance.

Choix des espèces

La souris, un animal omnivore comme l’humain, est couramment utilisée pour les recherches en nutrition. Son microbiote est bien connu et de nombreux outils scientifiques existent déjà, ce qui en fait un modèle préclinique idéal pour étudier le fonctionnement de l’intestin lors de changements alimentaires. Les animaux seront suivis pendant 1 ou 5 semaines après le sevrage, c’est-à-dire de 3 à 8 semaines d’âge. Le but du projet est de comprendre comment un manque de protéines dans l’alimentation influence l’intestin durant la période juvénile. Il est important de commencer l’étude dès le sevrage, car l’intestin joue un rôle essentiel dans l’absorption des nutriments dès les premiers stades de la vie et peut ainsi influencer de nombreux aspects du développement, comme la croissance.

912 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Selon les groupes, ils subissent l'implantation chirurgicale d'une sonde respiratoire, cardiaque ou cérébrale portée sept jours, puis reçoivent de la cocaïne et du fentanyl avant des enregistrements pouvant durer jusqu'à 48 heures. L'étude vise à mieux comprendre la surmortalité des overdoses associant les deux drogues et à optimiser un antidote, application renvoyée à l'humain. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou informatique ne peut remplacer le rat, dont le fonctionnement cardio-respiratoire serait proche du nôtre.

Objectifs

Le fentanyl est un antidouleur puissant dont le surdosage entraîne une difficulté à respirer pouvant rapidement entrainer la mort, parfois associée à une rigidité musculaire. Les données récentes montrent que les surdosages impliquant le fentanyl sont fréquemment associés à des drogues stimulantes, notamment la cocaïne. Les mécanismes d'interactions entre les drogues sur leur distribution dans le corps, sur leurs effets physiques ou comportementaux, ainsi que leur contribution à la surmortalité observée, demeurent toutefois mal caractérisés. Par ailleurs, l’efficacité d'un antidote pourrait être altérée en contexte de prise des 2 drogues en meme temps. Cette étude analysera différents effets du traitement sur l'organisme, notamment la respiration, le système nerveux et le cœur. Elle examinera également la façon dont la substance se répartit dans le corps et est éliminée, ainsi que ses effets sur le comportement. Enfin, elle évaluera son efficacité et la possibilité d'inverser ses effets a l'aide d’une antidote. L’objectif final est d’améliorer la compréhension des mécanismes de la toxicité combinée fentanyl- cocaïne et d’optimiser la prise en charge aiguë chez l’humain.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront d’apporter une analyse intégrée et mécanistique de la toxicité combinée du fentanyl et de la cocaïne, depuis les interactions de distribution et d'élimination jusqu’aux conséquences respiratoires, neurologiques et comportementales. En effet, les co-intoxications fentanyl- stimulant et leur surmortalité sont une problématique de santé publique majeure à l’heure actuelle. L’identification précise des déterminants de la synergie toxique et de la surmortalité associée à cette co-intoxication contribuera à une meilleure compréhension de la physiopathologie. Ces données expérimentales constitueront une base nécessaire pour optimiser l’utilisation d'un antidote en contexte d'utilisation simultanée de plusieurs drogues, affiner les stratégies de prise en charge aiguë des overdoses et, à plus long terme, orienter le développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblées.

Procédures

Une première partie des animaux aura : une chirurgie sous anesthésie générale pour l’implantation d’une sonde (10 minutes), + port de cette sonde pendant 7 jours, puis une injection de drogue et une mise en enceinte de mesure respiratoire pendant 6 heures. Une deuxième partie des animaux subira : une chirurgie sous anesthésie générale (40 minutes) avec implantation d’un cathéter veineux et d’une sonde cérébrale+ port d’un cathéter et d’un guide pendant 7 jours, puis une injection de drogue et des prélèvements répétés sur animal vigile pendant 7 heures. Une troisième partie des animaux (si nécessaire en fonction des expériences précédentes) subira : une chirurgie sous anesthésie générale (35 minutes) pour l’implantation d’une sonde au niveau du diaphragme et port d’une sonde pendant 7 jours, puis une injection de drogue et un enregistrement musculaire respiratoire pendant 24 heures. Une quatrième partie des animaux (si nécessaire en fonction des expériences précédentes) subira : une chirurgie sous anesthésie générale (35 minutes) pour l’implantation d’une sonde cardiaque, + port d’une sonde et d’un cathéter de 7 jours, puis une injection de drogue et un enregistrement cardiaque sur 24 heures. Une cinquième partie des animaux (si nécessaire en fonction des expériences précédentes) subira : une chirurgie sous anesthésie générale (35 minutes) pour l’implantation d’électrodes cérébrales, port d’une sonde pendant 7 jours, puis une injection de drogue et un enregistrement de l’activité cérébrale sur 48 heures. Une sixième partie des animaux subira des administrations quotidiennes, ainsi que des taches comportementales de locomotion, perception du danger et impulsivité, avec observation seule.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront être soumis à un stress transitoire lors des manipulations et des injections. Les études fonctionnelles nécessiteront un isolement temporaire des rats dans des dispositifs expérimentaux (enceintes pour l'enregistrement respiratoire ou pour les prélèvements sanguins) pendant plusieurs heures, susceptible d’induire une contrainte environnementale modérée. Les rats seront hébergés en cage individuelle à la suite de la chirurgie jusqu'à la fin de l'experience. Un faible risque de complications locales est attendu, notamment thrombose ou infection du site d’implantation. L'administration de fentanyl pourra induire une sédation, une réduction de l'activité motrice, des modifications de la régulation de la température, une raideur des muscles, ainsi qu'une modification de la respiration. L'administration de cocaïne pourra induire une agitation, des problèmes neurologiques ou cardiaques. L’intensité et la durée de ces effets indésirables sont susceptibles de varier en fonction de la molécule administrée, des doses utilisées et des associations testées. Les taches comportementales peuvent également etre accompagnées de modifications comportementales (activité motrice augmentée avec cocaine et sédation avec fentanyl).

Devenir

Pour l’ensemble des expériences la réutilisation des animaux est impossible en raison de la récupération après le décès des appareillages de mesure, l'atteinte d'un point limite qui requiert la mise à mort des animaux et pour les taches comportementales en raison du prélèvement cérébral prévu en fin d'experience.

Remplacement

L’ensemble des expériences ne sont pas remplaçables par des expériences sur des modèles mathématiques ou sur des cellules. Le rat constitue un modèle nécessaire à cette étude en raison d’une étude des conséquences sur le système cardio-respiratoire comparable à celle de l’être humain. De plus, il offre la possibilité de caractériser le comportement en termes de distribution et d'élimination par le corps des diverses molécules, dont les différentes phases ne peuvent être pleinement évaluées qu'en utilisant des rats dont le volume sanguin est compatible à une étude longitudinale sur le même animal. Pour les études respiratoires, cardiaques et neurologiques, la pose des sondes est plus aisée sur le rat et donc les résultats seront plus reproductibles.

Réduction

Les effectifs ont été determinés selon les expériences comme nécessitant 10 à 14 rats par groupe à l’aide de tests statistiques permettant une analyse des résultats obtenus adaptée. De plus, si aucun effet ventilatoire significatif n’est observé à la suite des associations de drogues, la suite des expériences ne seront pas réalisées dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

L’ensemble des expériences sont réalisés par un personnel compétent. Pour améliorer leur bien-être, les animaux sont hébergés en groupes sociaux dans des cages contenant de l’enrichissement. La surveillance quotidienne des animaux sera assurée par un personnel qualifié, et des points limites spécifiques adaptés aux différentes experiences seront mis en place pour détecter et réduire toute souffrance ou douleur. Si nécessaire, des analgésiques seront administrés, tout en veillant à ne pas perturber le déroulement de l'expérience. En cas de besoin, des méthodes réglementaires de mise à mort anticipée seront appliquées. Toutes les interventions chirurgicales prévues dans ce projet seront réalisées sous anesthésie générale et accompagnées d'une gestion adéquate de la douleur pendant la période périopératoire. De plus, une ouate en silicone sera utilisée après la chirurgie pour favoriser une meilleure cicatrisation et une prise en charge plus rapide en cas de saignement.

Choix des espèces

Le rat, est un modèle de référence dans notre champ d’étude du fait de son fonctionnement cardio-respiratoire très proche de l'humain. En plus de sa taille adéquate qui permet une facilité et une répétition des prélèvements, son métabolisme est très semblable à celui de l’humain, ce qui facilitera la translation des données. L’objectif de ce projet étant d'appliquer les résultats à l'etre humain, les modèles animaux doivent représenter au mieux les patients auxquels s’appliqueront les résultats de celui-ci. Les données en vie réelle montrent que les intoxications aiguës aux opioïdes concernent dans la grande majorité des cas des sujets masculins et d’âge jeune inférieur à 30 ans. Des rats jeunes adultes (7 à 8 semaines) sont utilisés dans ce projet afin de disposer d’animaux ayant atteint une maturité complète, tout en conservant un fonctionnement respiratoire, cardiovasculaire et métabolique stable. Ce choix permet de limiter la variabilité liée à l’immaturité biologique observée chez les animaux plus jeunes, ainsi que les altérations de fonctionnement et les maladies chez des animaux plus âgés.

197 souris vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance modérée, pour étudier le rôle d'un neuropeptide, la kisspeptine, dans le traitement cérébral des odeurs sociales. Chaque animal subit une neurochirurgie d'environ cinquante minutes, les femelles une ovariectomie, des frottis vaginaux et des prélèvements d'urine répétés, plus six injections avant des tests olfactifs. La chirurgie peut provoquer hémorragies, baisse de température et douleurs pendant deux à trois jours, et l'isolement sept jours avant les tests ajoute un stress. Les souris ayant reçu un traitement sont tuées pour prélever le cerveau, celles servant aux prélèvements d'urine étant tuées ou remises à d'autres chercheurs.

Objectifs

Chez la plupart des animaux, les odeurs sont cruciales pour communiquer des informations sur leur identité, leur organisation sociale, leur maturité sexuelle et leur territoire. Ces odeurs sociales sont perçues, intégrées et codées par des voies cérébrales spécifiques, afin de déclencher des comportements sociaux appropriés. Il a été montré que la kisspeptine, un neuropeptide déterminant dans le contrôle de la reproduction, ou son récepteur, sont exprimés dans deux structures cérébrales connectées participant au relai des informations olfactives. Récemment, une de ces deux régions cérébrales participant à l'apprentissage à partir d'expériences aversives, a été impliquée dans la régulation des comportements sociaux et reproducteurs chez les mammifères. Les lésions de cette structure chez les rongeurs entraînent une altération de la sensibilité aux stimuli olfactifs et provoquent une diminution de la réactivité sexuelle et un évitement des contacts sexuels. Cependant, le rôle de la Kisspeptine dans les deux structures cérébrales d’intérêt comme centres de traitement olfactif régulant les comportements sociaux reste peu compris à ce jour. L'objectif de ce projet est donc de déterminer le rôle de la Kisspeptine dans la modulation du traitement des odeurs d'attraction sexuelle par le cerveau.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de montrer que la Kisspeptine n'est pas seulement un régulateur clé de l'axe « cerveau-appareil génital » mais qu’il peut aussi agir en amont dès la transmission des odeurs. Les résultats issus de ce projet pourront potentiellement permettre d'ouvrir la voie vers l'utilisation de la Kisspeptine en voie intranasale pour la modulation des comportements sexuels chez les rongeurs de manière non invasive.

Procédures

Les neurochirurgies seront d'une durée moyenne de 50 minutes par animal. Une seule neurochirugie sera effectuée par animal. Les ovariectomies sont d'une durée de 15 minutes environ par animal. Pour déterminer le stade du cycle sexuel, les femelles auront 4 à 8 frottis vaginaux, prélévement de quelques secondes. Ces femelles seront vigiles et maintenues pendant le prélèvement. Selon les résultats des tests comportementaux, l'urine sera prelevée entre 4 à 8 fois pour chaque animal, en maintenant la souris et en massant délicatement son ventre afin de favoriser la miction dans le tube et ainsi récolter l'urine. Quelques secondes suffisent pour récolter l'urine. Chaque souris recevra au total 6 injections de traitement (Kp10, Kp54 ou contrôle) (1 fois/semaine) juste avant le test olfactif. Chaque test olfactif durera 10 minutes. Toutes les injections sous cutanées ne dureront que quelques secondes.

Impact sur les animaux

La chirurgie nécessaire à l'injection des traitements ou du retrait des ovaires peut entrainer des diminutions de la température corporelle et des hémorragies. Elle peut induire une douleur post opératoire pendant 2-3 jours essentiellement localisée au niveau du site d’incision du crâne ou des flancs. Un stress dû à la manipulation des animaux pour récolter leurs urines ou réaliser les administrations intranasales est possible. Il s’agira d’un stress aigü de quelques minutes n’induisant pas d’effet à long terme. Les animaux expérimentaux isolés 7 jours avant les tests de comportement sexuel pourront présenter du stress lié à leur hébergement solitaire.

Devenir

Tous les animaux test recevant un traitement intranasal ou dans la LHb seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études ultérieures. Les animaux utilisés pour les prélévements d'urine seront euthanasiés par le personnel animalier ou mis à disposition d'autres chercheurs pour d'autres études.

Remplacement

A ce jour aucune méthode alternative non animale (in vitro et/ou de modélisation) ne peut être utilisée pour ce projet qui est dépendant de l'interconnectivité de neurones appartenant à plusieurs structures olfactives et cérébrales. Il est donc impératif d’utiliser un animal entier pour comprendre les mécanismes de transmission et de régulation interconnectant l’olfaction et les fonctions comportementales des mammifères.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum compte tenu des techniques utilisées et pour maintenir la possibilité d'une mise en évidence statistique. La taille des échantillons est définie à partir des résultats obtenus lors d'expériences précédentes effectuées par notre groupe dans le cadre de tests similaires ainsi que des tailles d'effet observé dans la littérature. Nous avons aussi tenu compte de la variabilité entre les expériences, de la prévalence comportementale, de la survie post-opératoire, et de l'efficacité des injections. Le nombre d’individu défini par groupe permet d'assurer une puissance statistique suffisant pour obtenir des résultats robustes. Dans l'optique de réduire la quantité de souris nécessaires, nous réutiliseront les mêmes animaux pour l’étude comportementale d’évitement et de préférence sexuelle. Enfin la significativité des résultats sera testée en utilisant les tests statistiques appropriés. Dans le détails, nous aurons donc besoin de 197 animaux au total, 65 animaux stimuli (15 mâles pour les comportements sexuels et collecte d'urine, 30 femelles pour la collecte d'urine et 20 femelles pour le comportement sexuel); 60 animaux pour la procédure 1 : 10 animaux pour chacun des 3 groupes et pour les 2 sexes; 72 animaux pour la procédure 2 : 12 animaux par groupe pour chacun des 3 groupes et pour les 2 sexes

Raffinement

Lors des chirurgies, les souris recevront une sédation analgésique suivi d’une anesthésie. Les animaux recevront un traitement analgésique post-opératoire par injection sous cutanée d’un anti-inflammatoire non stéroidien. L’administration d'anti-inflammatoire sera poursuivie pendant 2 à 3 jours post-opératoires si nécessaire. Les yeux de l'animal seront protégés au moyen d'une pommade ophtalmique pendant les chirurgies pour éviter le dessèchement. Durant la procédure et la période de réveil, les animaux seront maintenus sur un matelas chauffant et leur température sera monitorée afin d'éviter une hypothermie. La fréquence respiratoire sera également monitorée pendant la procédure. Si une hypothermie et/ou une détresse respiratoire est observée (diminution fréquence respiratoire d’au moins 50%), l’animal recevra un antagoniste de l'anesthésique et la procédure sera interrompue. Si l’état de santé de l’animal le permet, une nouvelle tentative sera effectuée après 7 jours de récupération. Dans le cas contraire, l’animal sera euthanasié conformément aux points limites définis dans nos procédures. De plus, une surveillance quotidienne des animaux ayant subi la chirurgie sera effectuée tout au long de l'expérimentation.

Choix des espèces

Notre recherche porte sur la mise en évidence des régulations des comportements socio-sexuels induits par l’olfaction chez les mammifères. La souris est un excellent modèle animal de référence. La souris est une espèce sociale présentant des comportements socio-sexuels innés et bien décrits majoritairement régulés par les signaux olfactifs. Nous utiliserons des souris mâles et femelles adultes qui seront âgés de 8 semaines, âge minimum de la maturité sexuelle, nécessaire à notre étude.